UST UNIVERSIDAD SANTO TOMÁS

Genes y caracteres de interés agronómico

Javiera González Cruz

Transformación Genética

Transformación Genética

200 Kb

25 Kb

Transformación Genética

Hasta 150 Kb

Plasmidio Ti desarmado

Opinas: (aminoácido de bacteria)

25nt 25nt

Transformación Genética

Vector Co-integrado Vector Binario

Genes vir para la transferencia: vir A, vir B, vir D y vir G Genes vir para eficiencia de transformación: vir C, vir E

Gen de selección en E.coli Origen de replicación en E- coli

T-DNA Origen de replicación en A.tumefasciens

Mejoramiento Genético

Plantas Transformadas con métodos directos e indirecto:

(raps)

Mejoramiento Genético

Transgénicos comercializados:

Transgénicos

Generaciones de Transgénicos: Primera Generación de OGMs: Cultivos utilizados en alimentación animal y humana, que contienen uno o dos genes para mejorar tolerancia a herbicida y resistencia a insectos y patógenos. Segunda Generación de OGMs: Cultivos modificados en un carácter fenotípico, que involucra más de un gen, para mejorar la calidad del cultivo. (QTL) Tercera Generación de OGMs: Para la elaboración de productos biotecnológicos como bioreactores llamados nutraceúticos o biofármacos. Se pretende producir drogas con acción farmacéutica para el hombre.

Genes de Interés

¿Como Identificar un gen de interés?

• Estudios de genómica análisis de secuencia de DNA Modelo Arabidopsis (120 Mbp)

análisis de patrones de expresión génica Abundancia de transcritos en respuesta a estímulos Base de dato de microarreglos Base de dato de ESTs

Cuidado: Abundancia de RNAm no refleja necesariamente el nivel o actividad de la proteína codificada.

Ideal contar con base de datos de proteínas acompañados de secuencias de DNA o expresión génica.

Bioinformática

Caracteres a mejorar

Las más comunes: 1) Tolerancia a herbicidas Herbicidas: Uno de los insumos más usado y de mayor costo Uso de herbicidas selectivos (mas caros) Inhiben algún paso metabólico que es vital para la planta. Estrategias: Alta expresión de proteína blanco de herbicida Alterar sitio de acción del herbicida sin alterar en sitio catalítico de la enzima Introducir genes que permitan detoxificar. a)Glifosato (N-fosfonometilglicina)Gen EPSPS de Agrobacterium tumefaciens cepa CP4 (Plantas Round Up Ready-Monsanto) Gen gox glifosato oxidoreductasa de Achromobacter sp. cepa LBAA b)Glufosinato (L-fosfinotricina)Genes bar y pat (fosfoinotricina acetil transferasa) de Streptomyces higroscopicus (Plantas Liberty Link- Avertis-BASTA) c)Bromoxinilgen de bxn (nitralasa) de Klebsiella pneumoriae

Caracteres a mejorar

Las más comunes: 2) Resistencia a Insectos Insecticidas gran gasto en agricultura son altamente tóxicos para el hombre. Endotoxina de Bacillus thuringensis (1902) proteínas de inclusión en forma de cristal durante la esporulación. Usado en cultivos orgánicos. No tóxico a mamíferos ni insectos benéficos. Codificadas por genes cry (+ de 400 genes) Algunas especie específicas. cry I Lepidoptera cry II Lepidopteras y Dipteros cry III Coleopteros cry IV Dipteros Cultivos BT100 especies de plantas expresión elevada en todo el tejido (0,2-0,3% proteína totales)

Otros: Inhibidores de proteasas de origen vegetal y de α-amilasa, Lectinas, quitinasas

Las más comunes: 3) Resistencia a Patógenos (Virus, Hongo, Bacteria) • Expresión de genes de resistencia R que activan la respuesta de la planta cuando reconoce

la presencia del factor de virulencia. • Genes de respuesta (quitinasas Glucanasas, lipooxigenasas) • Síntesis de Fitoalexina (hongo y bacteria) • Expresión de secuencias virales (proteína de la capside, replicasa) • Silenciamiento génico PTGS (virus) siRNA (100 pb gen blanco) miRNA artificial (20 pb gen blanco)

Caracteres a Mejorar

Caracteres a Mejorar

Las más comunes: 4) Mejorar la calidad alimenticia: Golden Rice 3 genes para la síntesis de β caroteno Plantas con proporción de ácidos grasos modificados Aceite de soya con alto contenido de oleico, bajo en polinsaturados Canola rica en C12-C14 Gen Tioesterasa de Laurel de california fad2 desaturasa

Genes Marcadores y Promotores

Además de gen de interés se requieren otras secuencias de DNA 1) Marcadores Seleccionar planta transgénica o monitorear la expresión del transgen.

• Marcador de Selección funcionan además como marcadores genéticos • Marcador Visual o Reportero

No alteran la expresión del transgen. Son dominantes Cambio de codón favorable para la planta

Alteración de crecimiento

Toxico o enzima que causa daño, bajo promotor especifico

Citosina desaminasa

Genes Marcadores y Promotores

-Balance entre crecimiento de transformadas y muerte de no transformada Evitar escapes Antibióticos aminoglicosidos (Kan, Neo, Gen) Inhiben síntesis de proteína. Fosfotransferasa nptII de E. coli Herbicidas fosfoinotricina Toxicidad por Amonio Fosfinotricina N acetil transferasa genes bar y pat de Streptomyces. Manosa Fuente de carbono Fosfomanosa isomerasa manA de E. coli

Marcador de Selección condicional positivo:

Genes Marcadores y Promotores

Marcador de Selección no condicional positivo:

Confiere un crecimiento diferencial sin causar la muerte. Formación de brotes por expresión del gen ipt. Generalmente se pone bajo el control de un promotor inducible (estradiol)

Genes Marcadores y Promotores

Marcador de Selección no condicional negativo:

Barnasa: RNAasa

Β-Glucuronidasa de E.coli -Hidroliza 5-Br-4-Cl-3-indol glucoronido (X-Gluc). -Tinción se corelaciona con nivel de expresión. -No tóxico, sin efecto en crecimiento. -Ensayo destructivo -Sustrato caro -Estable en fusión. -Usado en optimización de sistema de transformación.

GFP de Aequorea victoria No destructivo Sensible

Genes Marcadores y Promotores

Reportero condicional y no condicional :

Genes Marcadores y Promotores

Promotores:

Promotor 35s puede interactuar con promotores vecinos, alterando actividad de un promotor tejido específico Silenciamiento

OGMs de Primera generación

• Principalmente para mejorar tolerancia a Herbicidas y Resistencias a determinados patógenos.

• Más de 100 Millones de Há Soya, Algodón, Tabaco, Papa y Maíz.

• Desarrollados por grandes Multinacionales.

Tolerancia a Glifosato MONSANTO

Glifosato inhibe en plantas la enzima 5-enolpiruvil shikimato 3-fosfato sintetasa (EPSPS), clave en la síntesis de aminoácidos aromáticos (Fenilalanina, Tirosina y Triptofano)

Inhibidor competitivo de PEP

35s: CP4EPSPS de Agrobacterium tumefaciens Con péptido de transito a Cloroplasto de subunidad mayor de Rubisco en extremo 5’.

Tolerancia a Glifosato MONSANTO

Tolerancia a Glufosinato AVENTIS

En asimilación de Nitrógeno, GLUTAMINA SINTETASA: Combina amonio con glutamato con gasto de ATP para sintetizar glutamina.

BASTA MR es un inhibidor competitivo reversible de L-glutamato en el complejo Glutamina sintetasa.

Enzima fosfinotricina acetil transferasa de Streptomyces higroscopicus (bar) y S. viridochromogenes (pat) detoxifican por acetilación.

Plantas Liberty Link: Canola, Arroz, Soya y Maíz.

Tolerancia a Atrazina

Mutación puntual en gen psbA (proteína D1 del PSII) Serina/264/Glicina Isoleucina/219/Valina Serina/264/Treonina Expresión heteróloga de proteína mutada

Beneficios de Tolerancia a Herbicidas: Desventajas: • Menor erosión del suelo - Presión de selección a malezas • Menor gasto de combustibles - Problemas en Salud Humana • No afecta animales - Glifosato y glufosinato se desactivan en

el suelo Mayor aplicación

Plantas BT

Genes de endotoxinas de Bacillus thuringensis con alto porcentaje de A/T, por lo tanto con bajo nivel de expresión en plantas.

Se eliminaron sitios de PoliA y aumentó la expresión

Plantas BT

En plantas son expresadas como protoxinas por genes cry. Son ingeridas por los insectos como cristales dentro de los tejidos. En el intestino (pH > 8) el cristal se solubiliza y proteínas protoxinas son cortadas por proteasas en extremos. Proteína activa se una a receptor de la membrana de microvellosidades del intestino. Proteína se oligomeriza y forma un poro perdida de iones

48 Hr

Cuidado: Mantener población no transgénica para mantener pool de insectos no resistente y evitar presión de selección. Problemas: Expresión de genes cry varía por condiciones ambientales resistencia Expresión reducida por metilación del DNA en promotor.

Plantas BT

9Aa2 G14

Control Control + BT

Plantas BT

Ventajas: Disminución de costos (combustible, Pesticidas) Especificidad (receptor) Ahorro de Agua. Inocuo

Transformación Genética

Resistencia Viral

Expresión de proteínas virales que inducen silenciamiento génico o desarrollo de “anticuerpos”.

Resistencia Viral

e: estado experimental c: en ensayos de campo co: uso comercial

Resistencia a Hongos

Proteína de respuesta a patógeno necrotróficosquitinasa Gen ch5B de Poroto