UNIVERSIDAD ANDRS BELLO FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLGICAS

LABORATORIO DE BIOLOGA CELULAR BIO-131

GUA n 5: ORGANIZACIN SUBCELULAR

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INTRODUCCIN

Las clulas aparecieron sobre la tierra hace 3,5 billones de aos, probablemente debido a la agregacin espontnea de molculas. Las primeras clulas eran relativamente simples y pequeas, similares a los organismos que actualmente conocemos como procariontes. Luego aparecieron las clulas eucariontes, ms grandes y de organizacin ms compleja, que hoy forman parte de animales y plantas.

Por definicin, y a diferencia de las clulas procariontes, las clulas eucariontes poseen un ncleo que contiene la mayora del DNA envuelto en una membrana. Esto deja al material gentico en un compartimiento separado del resto de los contenidos de la clula o citoplasma, donde ocurren las reacciones metablicas. En el citoplasma se pueden distinguir varios organelos: cloroplastos, mitocondrias, retculo endoplsmico, aparato de Golgi, ribosomas, peroxisomas, lisosomas, citoesqueleto, los cuales cumplen funciones especficas dentro de la clula.

Fig 1: Clula Eucarionte animal Fig 2:Clula Eucarionte Vegetal

El Ncleo (Fig.3) es el organelo ms grande de la clula y est separado del citoplasma por una envoltura nuclear compuesta por dos membranas, estas membranas aparecen perforadas por poros, a travs de los cuales se comunica con el citosol. El ncleo contiene todo el DNA cromosomal, el que se encuentra empacado en las fibras de cromatina por su asociacin con protenas denominadas histonas.

Fig 3: Nucleo.

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La Membrana Plasmtica (Fig.4) es la envoltura externa de la clula. Corresponde a una bicapa continua de fosfolpidos de 4-5 nm de espesor, en la cual se encuentran embebidas protenas integrales y perifricas. Algunas de estas protenas sirven como bombas y canales para el transporte de molculas hacia el interior de la clula, as como hacia el exterior de ella.

Fig 4: Membrana plasmtica.

Las Mitocondrias (Fig.5) son muy similares a las bacterias tanto en tamao como en forma. Poseen dos membranas una externa y otra interna, que dan lugar a dos compartimentos, el espacio intermembrana y la matriz mitocondrial. Las Mitocondrias contienen su propio DNA, sintetizan protenas y pueden reproducirse al dividirse en dos, por lo que se cree que proviene de la simbiosis de una clula eucarionte primitivo con un organismo procarionte. Este organelo es responsable de los procesos de respiracin celular y produccin de energa.

Fig 5: Mitocondria.

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Los Cloroplastos (Fig.6), al igual que las mitocondrias, tambin tendran un origen simbitico. Se encuentran slo en los organismos capaces de realizar la fotosntesis, como las algas verde-azules y las plantas. Los cloroplastos corresponden a plastidios que contienen clorofila, y estn rodeados de una membrana doble. Los cloroplastos estn compuestos por la envoltura, estroma y los tilacoides.

Fig 6: Cloroplasto.

El Retculo Endoplsmico (R.E.) (Fig.7) corresponde a sacos, tubos y capas de membranas que se extienden a travs del citoplasma y que ocupan un amplio sector de la clula. La membrana del Retculo endoplsmico es una continuacin de la membrana nuclear. Se especializa en la sntesis de lpidos y protenas de membrana, as como tambin de materiales que estn destinados a ser exportados de la clula. El Retculo endoplsmico rugoso (R.E.R.) est asociado a los ribosomas, que se unen en su parte externa y se encargan de la sntesis de protenas. El Retculo endoplsmico liso (R.E.L.) est constituido por un sistema laberntico de tbulos irregulares, ramificados; que no contienen ribosomas y se encarga del metabolismo de lpidos.

Fig 7: Esquema del retculo endoplsmatico y microfotografa.

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El Aparato de Golgi o Dictiosomas (Fig.8) est constituido por cisternas discoidales aplanadas, paralelas y superpuestas, formadas por membranas lipoproteicas. Se encarga de la modificacin, destinacin, y empaquetamiento de macromolculas de secrecin o que estn destinadas a otros organelos. Alrededor de l se encuentran numerosas vesculas pequeas que transportan sustancias entre el mismo organelo y los diferentes compartimentos de la clula.

Fig 8: Aparato de Golgi.

Los Lisosomas son vesculas membranosas que contienen enzimas hidrolticas requeridas para la digestin de molculas al interior de la clula. De este modo, estas enzimas se mantienen aisladas del resto de los componentes celulares evitando la degradacin de molculas como protenas y cidos nucleicos.

Los Peroxisomas tambin corresponden a vesculas. En ellas se produce perxido de hidrgeno (H2O2) durante la oxidacin por el oxgeno de varios tipos de molculas. Esta

sustancia es peligrosa y gracias a la existencia de los peroxisomas se mantiene aislada al resto de los componentes de la clula.

Los Ribosomas (Fig.9) son grandes complejos de RNA y protenas. Se componen de una subunidad mayor y una subunidad menor que se ensamblan para formar un complejo que se encarga de llevar a cabo el proceso de traduccin en la sntesis de protenas. Los ribosomas procariontes y eucariontes son muy similares, y pueden encontrarse tanto libres en el citoplasma como unidos a membranas formando parte del retculo endoplsmico rugoso.

Fig 9: Esquema del retculo endoplasmatico con ribosomas y microfotografa.

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El Citoesqueleto est constituido por filamentos de protenas que forman un enrejado en el citoplasma. Esta red de filamentos est formada por los microtbulos, filamentos de actina y filamentos intermedios. El citoesqueleto le da a la clula su forma y provee la base de sus movimientos. Generalmente se organiza desde una regin cercana al ncleo donde se encuentran los centrolos y desde ah se extiende al resto de la clula.

Aunque tcnicas avanzadas como la Microscopa Electrnica permiten una visualizacin detallada de la estructura de la clula, esto no es suficiente para definir la funcin de sus componentes. Para esto, ha sido necesario aislar los organelos del resto de la clula para realizar estudios bioqumicos que permitan determinar la funcin exacta de cada uno de ellos.

Objetivo General del laboratorio

Comprender el fundamento de la tcnica de fraccionamiento subcelular por medio del rompimiento de la clula y la separacin de los organelos mediante un campo gravitacional.

FRACCIONAMIENTO SUBCELULAR

As como un tejido puede ser separado en las clulas que lo constituyen, con las tcnicas adecuadas la clula puede separarse en los diferentes organelos y macromolculas que la componen. Una de las tcnicas ms utilizadas para tal propsito es el Fraccionamiento Subcelular, que permite obtener componentes celulares aislados, en grandes cantidades y con alto grado de pureza. Esta tcnica fue desarrollada entre otros por Alberte Claude y Christian Duve entre 1940 y 1950, y consiste en la separacin de los componentes de la clula basndose en su tamao y densidad.

El primer paso a seguir en un fraccionamiento subcelular es la ruptura u homogenizacin de la muestra. Esto se logra a travs de diferentes procedimientos como sonicacin (exposicin a sonidos de alta frecuencia), shock osmtico, o simplemente moliendo las clulas en homogenizadores mecnicos. En esta etapa se rompen muchas de las membranas de la clula, incluyendo la membrana plasmtica y el retculo endoplsmico, los que quedan formando pequeos fragmentos o vesculas que dan origen a la fraccin microsomal. El resto de los componentes celulares (ncleo, mitocondrias, cloroplastos, aparato de Golgi, lisosomas y peroxisomas) permanecen intactos. Las partculas y vesculas as obtenidas conservan la mayor parte de sus propiedades bioqumicas originales y permiten el estudio de la funcin de cada organelo celular por separado.

La suspensin de clulas rotas obtenidas anteriormente es llamada lisado u homogenizado, y es la que se fracciona en la segunda etapa del proceso. Se realiza a travs de una serie de etapas sucesivas de centrifugacin en las que los componentes de la clula se separan en un campo gravitatorio.

Si dos componentes de distinta masa e igual tamao y forma estn en un mismo medio, el cuerpo de mayor masa sedimentar (se ir al fondo) a mayor velocidad debido a su mayor Peso. El peso es el producto de la masa (m) y la fuerza de gravedad (g), por tanto la fuerza de gravedad se incrementa, la velocidad de sedimentacin tambin aumentar.

Para aumentar el campo gravitatorio se usan las Centrfugas (Fig.10). Estos instrumentos consisten en rotores con cavidades para los tubos, los que se hacen girar a diferentes velocidades, de manera que a mayor velocidad el campo gravitacional obtenido es mayor. Lo mismo ocurre a mayor distancia entre el tubo y el eje de giro del rotor. En otras palabras, el campo gravitacional generado depende directamente del radio de giro y de la velocidad de rotacin. Al trmino de una centrifugacin se pueden distinguir en el tubo dos fases. En el fondo del tubo se obtiene un sedimento o pellet, y sobre l una parte lquida llamada sobrenadante.

Fig 10: Esquema de una centrfuga.

Generalmente, la primera etapa de separacin consiste en una centrifugacin a baja velocidad a la cual sedimentan slo las clulas que permanecen enteras y las partculas subcelulares ms grandes, los ncleos. As, el primer pellet obtenido corresponde a una fraccin enriquecida en ncleos y el sobrenadante contiene al resto de los componentes celulares en suspensin.

El sobrenadante se somete a una segunda centrifugacin que se realiza a velocidades intermedias, en la que sedimentan mitocondrias, cloroplastos, lisosomas y peroxisomas. El nuevo sobrenadante se re-centrifuga a alta velocidad obtenindose un pellet enriquecido en membrana plasmtica y retculo endoplsmico (fraccin microsomal). Una ltima centrifugacin del sobrenadante anterior a velocidades an mayores permite sedimentar finalmente los ribosomas, dejando el sobrenadante slo la porcin soluble del citoplasma, el citosol. Las fracciones que se obtienen por el procedimiento anterior son fracciones enriquecidas, pero no totalmente puras de los diferentes organelos. Existen otras modalidades de centrifugacin en las que se utilizan medios de mayor densidad, que se obtienen con soluciones de sacarosa, polmeros o protena. Permiten realizar el proceso de separacin en gradientes de densidad, obteniendo organelos con mayores grados de pureza.

Generalmente el proceso de fraccionamiento celular se evala mediante el anlisis de la forma en que se distribuyen algunos componentes celulares, de localizacin subcelular conocida en las diferentes fracciones obtenidas. Estas molculas son llamadas marcadores de cada una de las fracciones. Por ejemplo, el DNA es un marcador de la presencia de ncleos, las enzimas del ciclo de Krebs o de la cadena respiratoria son marcadores de mitocondrias, y el proceso de fotosntesis indica la presencia de cloroplastos. De este modo, el anlisis de la distribucin de los diferentes marcadores en todas las fracciones subcelulares obtenidas permite conocer la distribucin y pureza relativa de los distintos organelos, y el nivel y calidad de los componentes contaminantes de cada fraccin.

La obtencin de organelos celulares aislados permite entonces estudiar en forma relativamente especfica algunos procesos celulares que ocurren en compartimentos particulares, aislndolos de las reacciones que ocurren en otros organelos. Por ejemplo, se puede estudiar la sntesis de protenas en ribosomas aislados o asociados a membranas, el transporte de sustancias a travs de la membrana plasmtica, la fotosntesis en cloroplastos, el procesamiento de glicoprotenas en el aparato de Golgi, etc.

Fig 12. Esquema de un fraccionamiento subcelular tpico.

ACTIVIDADES PRCTICAS

ACTIVIDAD n 1: Fraccionamiento subcelular

A) Fraccionamiento Subcelular de Hgado:

El Fraccionamiento Subcelular comprende dos etapas, una primera etapa de ruptura u homogeneizacin, y una segunda etapa de fraccionamiento propiamente tal. El fraccionamiento o separacin de los distintos componentes celulares se realiza mediante una serie de centrifugaciones sucesivas, las que sedimentan los diferentes organelos en un campo gravitacional dependiendo de su masa y tamao.

Al centrifugar una muestra se obtienen dos fases claramente definida: el pellet que corresponde al sedimento propiamente tal y el sobrenadante, que corresponde a la fraccin lquida que permanece sobre el material sedimentado.

Los pellet obtenidos corresponden a los organelos que han sedimentado, stos s resuspenden y se guardan para el resto de los anlisis bioqumicos, mientras que los sobrenadantes se vuelven a centrifugar.

La etapa de ruptura y homogeneizacin de la muestra se realiza colocando el tejido fresco a fraccionar y una cantidad adecuada de solucin tampn, la que deja los organelos en suspensin y sirve para que no se rompan durante el fraccionamiento en un homogeneizador. Todo el proceso se realiza adems en fro (4C) para evitar una posible degradacin de las estructuras celulares y as conservar intactas la mayor parte de las caractersticas funcionales originales del organelo que se pretende aislar.

Procedimientos y observaciones

Usted recibir un homogenizado filtrado, preparado por sus profesores, el cual se obtuvo de la siguiente manera:

1. Tomar un trozo (10 g aprox) de tejido de hgado de pollo frio (mantener siempre en hielo, 4C)

2. Dejar el hgado libre de sangre usando PBS o NaCl 0,9% (suero fisiolgico) fro.

(Usualmente entre 4 y 5 clarificaciones es suficiente)

3. Picar el hgado en pequeos pedazos utilizando tijeras. Esto podra ser realizado

mientras se mantenga el vaso en una fuente con hielo.

4. Descartar el PBS o NaCl 0,9% usado durante picado y reemplazarlo con 5 ml de IBc

fro fresco y transferir la suspensin al tubo de homogenizado (mortero) y operarlo a

1600 RPM mezclndolo de 3 a 4 veces.

Recordar:

A 4C se minimiza la activacin de dao generado por fosfolipasas y proteasas.

El radio ptimo entre el tejido y el buffer de aislamiento es de 1:5 a 1:10 (peso:volumen)

Enfriar el tubo de homogenizado en hielo por 5 minutos antes de iniciar el

procedimiento.

6. Trasferir el homogenizado a un tubo Falcon de polipropileno y centrifugar a 600 g (2500

RPM aprox) por 10 minutos a 4C.

7. Transferir el sobrenadante a tubo de centrifugacin y centrifugar a 7000 g (6000 RPM aprox)

por 20 minutos a 4C.

8. Descartar el sobrenadante y lavar el pellet con 5 ml de PBS o NaCl fro. 9. Centrifugar a 7000 g (6000 RPM aprox) por 20 minutos a 4C. 10. Descartar el sobrenadante y resuspender el pellet conteniendo mitocondrias en 1 ml de PBS o NaCl 0,9 %

11. Trasferir la suspensin mitocondrial en un tubo Falcon y guardar en hielo. Recordar:

Minimizando la exposicin al oxigeno se puede mantener la funcionalidad de la porcin mitocondrial por largo tiempo.

Es recomendable utilizar esta preparacin mitocondrial entre 1 a 3 horas despus del aislamiento.

La concentracin usual de mitocondrias en este tipo de preparacin es de cerca de 80 mg/ml y el volumen total es de 1 ml.

B) Evaluacin del fraccionamiento subcelular mediante marcadores moleculares

Cada organelo contiene enzimas o molculas que lo caracterizan, las que no se encuentran en los otros compartimentos celulares y permiten identificarlos.

El DNA es la molcula marcadora de ncleos. Esta macromolcula puede ser identificada mediante colorantes bsicos que se unen a ella cuando se encuentra ionizada, como el azul de tripn, azul de toluidina y azul B.

Las mitocondrias pueden ser identificadas por la actividad de la enzima Succinato deshidrogenasa que cataliza la deshidrogenacin estreo especfica de Succinato a Fumarato durante el ciclo de Krebs, segn la siguiente reaccin:

Succinato Succinato DHFumarato + 2 H+ + 2 e-

Los protones y electrones liberados permiten seguir la reaccin a travs de la decoloracin del azul de metileno, que en su estado oxidado es azul y al reducirse se torna incoloro. Sin embargo, el azul de metileno reducido puede fcilmente ser oxidado por el oxgeno del aire, y recobrar su coloracin azul intensa. Para evitar esto, se cubre el medio de reaccin con aceite mineral o vaselina lquida, lo que permite realizar la reaccin en ausencia de oxgeno.

Procedimientos y observaciones

En un portaobjetos limpio y seco coloque una gota de la suspensin de ncleos

P1 obtenida anteriormente y que usted ha mantenido en hielo. Coloque sobre ella un cubreobjetos y observe su preparacin al microscopio usando

para ello el objeto de 40X. Prepare un nuevo portaobjetos limpio y seco con una gota de la solucin de nucleos P1 obtenida anteriormente y agregue el azul de tripn y vuelva a observar su preparacin de ncleos. Qu observa?.

Procedimientos y observaciones

Separe 4 tubos de ensayo, rotlelos en forma adecuada y colquelos en hielo de manera que estn fros.

Agregue a cada uno de los tubos las soluciones que correspondan segn el siguiente esquema:

N

Tubo

Succinato

0,1M

Azul de metileno

Agua

destilada

Fraccin

nuclear

Fraccin

mitocondrial

Fraccin microsomal

1

Blanco

1 ml

1 ml

1 ml

2

Fraccin

nuclear

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

3

Fraccin

mitocondrial

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

4

Fraccin microsomal

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

Agite el contenido de cada tubo y agregue a cada uno de ellos 1 mL de aceite mineral o vaselina lquida.

Coloque los tubos en un bao termorregulador a 37 C y observe si ocurre decoloracin en algunos de los tubos.

BIBLIOGRAFIA

Biologa Celular y Molecular. De Robertis y de Robertis. 11 Ed., 2da impresin, 1998, Ed. El Ateneo, Bs. Aires.

Biologa Celular y Molecular. Lodish y col. (2002) 4Edicin, Ed. Panamericana.

Elementos de Biologa Celular y Gentica. Parte 2: Estructura y Funcin Celulares. Mtodos de Estudio en Biologa Celular. Fraccionamiento Subcelular. Lpez, R. 1 ed., 1985, Departamento de Biologa Celular y Gentica, Facultad de Medicina, Universidad de Chile.

Molecular Biology of de Cell. Alberts, Bray, Lewis, Raff Roberts & Watson. 3ra ed., 1994, Garland Publishing Inc. , New York & London.

The Cell: A Molecular Approach. Cooper, G.M. 1997, ASM Press, Washington, U.S.A.

Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured filroblasts. Christian Frezza, Sara Cipolat & Luca Scorrano. NATURE PROTOCOLS VOL.2 NO.2. 2007.

Materiales Laboratorio. Fraccionamiento Sub Celular

1. Para el homogenizado

Higado de Pollo

Pinzas

Bistur

Tijeras

HomogenizadorEmbudo

Gasa

Centrifuga

Hielo

Buffer PBS o Suero Fisiolgico

2. Para el laboratorio ( p/g = por grupo de 3 alumnos)

Porta objetos.

Cubreobjetos.

1 Lpiz rotulador

Centrifuga.

Bao termorregulador.

Hielo

2 gotarios (p/g)

8 tubos de ensayo (p/g)

Gradilla para tubos de ensayo

3 pipetas 1 ml (p/g)

1 pipeta 5 ml (p/g).

1 vaso precipitado de 50 ml (p/g)

Azul de Metileno.

Succinato 0.1 M.

H2O destilada. (picetas).

Azul de tripan.

Aceite mineral o vaselina.

Tubos para centrifuga (p/g)