Andrés Bello Universidad

Facultad Ciencias Biológicas

Departamento de Ciencias Biológicas

Laboratorio de Microbiología

GUIA DE TRABAJOS PRÁCTICOS

MICROBIOLOGÍA

BIO 050

CARRERA: ENFERMERÍA

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NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN LOS TRABAJOS PRÁCTICOS DE

MICROBIOLOGÍA

Durante el desarrollo de las actividades prácticas se debe mantener una serie de normas,

cuyo propósito fundamental es la preservación de la salud del alumno, sus familias y la

comunidad.

1. Cada alumno debe usar delantal blanco abrochado para evitar la contaminación de sus

ropas.

2. Al comenzar y al terminar las actividades, cada alumno debe lavarse las manos.

3. El alumno debe ingresar al laboratorio con el pelo tomado.

4. Está estrictamente prohibido comer, beber, comer, fumar, masticar chicle, o llevarse

cualquier objeto a la boca, por el riesgo de contagio.

5. No ingresar bolsos o chaquetas a la sala de trabajos prácticos.

6. Las asas de platino deben ser esterilizadas antes y después de su uso. Al enfriarla, evite

salpicar, los aerosoles son muy contagiosos.

7. Toda pipeta Pasteur utilizada debe ser sellada y desechada en las cajas de material

cortopunzante.

8. Las placas de Petri sólo deben abrirse en el momento de siembra y a una distancia menor

a los 30cm del mechero Bunsen encendido.

9. Los tubos deben flamearse antes y después de ser utilizados.

10. Frente al derrame de un medio de cultivo o muestra debe informar al profesor, esto

también se recomienda frente a cualquier accidente como quemaduras, cortaduras o contacto

con material contaminado.

TRABAJO PRÁCTICO N°1

PROCEDIMIENTOS BÁSICOS

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11. Es de primordial importancia el cuidado del microscopio. Éste sólo debe encenderse al

momento de la observación de la preparación. La que debe retirarse terminada la

observación, para limpiar el lente de inmersión con Xilol y papel tissue.

12. Las superficies de trabajo deben ser descontaminadas antes y después de realizado el

trabajo práctico

El estudio de bacterias, virus, parásitos y hongos potencialmente patógenos para el hombre,

animales u otros seres vivos, involucra riesgos dependientes del agente infecciosos y los

procedimientos empleados. Las normas de bioseguridad buscan reducir a un nivel aceptable

el riesgo asociado a su manipulación. Deben considerarse para lograr que el personal que

manipula estos agentes infecciosos en el ámbito hospitalario esten mínimamente expuestas a

adquirir una enfermedad infecciosa o de otro tipo.

BIOSEGURIDAD: corresponde al conjunto de medidas protectivas, destinadas a proteger

la salud de las personas frente a los posibles riesgos asociados a los agentes biológicos,

físicos o químicos en el laboratorio, como también indirectamente al ambiente.

AGENTE INFECCIOSO: todo microorganismo, incluidos los genéticamente modificados,

presentes en forma latente y los portados por el personal de salud, capaces de originar

cualquier infección, alergia o toxicidad.

CONTROL DE LA CONTAMINACIÓN EN EL LABORATORIO

El laboratorio tiene importancia central en el diagnóstico etiológico, de modo que resulta

fundamental evitar la contaminación de las muestras, ya sea desde el operador como desde

las otras muestras (contaminación cruzada).

Con este fin, se debe trabajar con TÉCNICA ASÉPTICA y utilizando material ESTÉRIL.

Algunos conceptos que debemos conocer y manejar son:

DESINFECCIÓN: proceso que busca eliminar la mayoría de los microorganismos

patógenos, excepto esporas y algunos virus, en objetos inanimados.

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ASEPSIA: proceso que utiliza agentes químicos para impedir infección de piel, mucosas u

otros tejidos en seres vivos. Los antisépticos actúan provocando muerte de los

microorganismos patógenos o impidiendo su multiplicación.

SANITIZACIÓN O HIGIENIZACIÓN: Proceso que utiliza lavado mecánico o agentes

químicos para REDUCIR el número de patógenos presentes en un objeto hasta niveles

aceptables para la salud pública.

ESTERILIZACIÓN: proceso físico o químico destinado a destruir TODA vida microbiana,

incluyendo esporas, en materiales u objetos inanimados.

TÉCNICAS DE ESTERILIZACIÓN

1.- Métodos Físicos

a) Calor

Es el método más usado, económico y fácil de controlar. Proceso rápido al cual la totalidad

de los microorganismos resulta sensible.

Pasteurización: uso para prevenir infecciones asociadas a productos lácteos (Tuberculosis,

Brucelosis, Salmonelosis) y retrasar descomposición de la leche.

Autoclave (vapor saturado a presión): Entre los métodos de esterilización, es el más efectivo

y de menor costo; es el método de elección para instrumental médico de uso repetido.

Llama y flameado: utilizado para esterilizar asas de siembra en el laboratorio. A través del

flameado se evita la contaminación de tubos y matraces., al someterlos directamente a la

llama.

b) Radiaciones

Rayos ultravioleta (U.V): lesionan el DNA bacteriano, inhibiendo la correcta replicación

del DNA durante la replicación celular.

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Se usa principalmente en ambientes de quirófanos, sala de prematuros, esterilización de

superficies.

Radiaciones ionizantes: los rayos gamma principalmente, son utilizados para esterilización

en frío de materiales desechables como: jeringas, bisturís, catéteres, prótesis, guantes de

cirugía y equipos de transfusión.

2.- Métodos Mecánicos

Ondas sónicas y ultrasónicas: afectan el metabolismo bacteriano, produciendo

desnaturalización de proteínas y muerte celular.

Filtración: usado en el control de microorganismos presentes en sustancias líquidas o gases,

mediante su paso a través de sustancias porosas denominadas filtros. Su utilidad principal es

la esterilización de sueros o líquidos que contengan proteínas o metabolitos termolábiles.

3.- Métodos Químicos (antisépticos y desinfectantes)

La penetración de estos agentes es más rápida en bacterias Gram positivas, debido

principalmente a la presencia protectora de la membrana externa en las bacterias Gram

negativas.

Los agentes químicos pueden causar ocasionalmente infecciones nosocomiales al

encontrarse contaminados con bacterias, siendo el género Pseudomonas el más habitual.

Esto es de suma importancia y para evitarlo es imprescindible que el personal de salud

cuente con un acabado conocimiento del tema.

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El siguiente cuadro resume los principales agentes químicos y su utilidad

AGENTE ACCIÓN APLICACIÓN Alcoholes 70% Sobre formas vegetetivas

(no esporas). Desnaturaliza proteínas

Piel y superficies inertes

Cloro Bactericida. Actúa oxidando grupos sulfhidrilos libres

Útiles de cocina, chatas, patos, baños, unidades de diálisis

Yodo/povidona yodada Bactericida. Actúa sobre formas vegetativas y esporas, hongos y algunos virus. Interfiere procesos de oxido – reducción y fosforilación bacterianos.

Piel heridas, material quirúrgico

TÉCNICAS BÁSICAS DE MICROBIOLOGÍA

El objetivo principal del práctico es la adquisición de conocimientos básicos en lo que

respecta a la manipulación de cultivos bacterianos. Esto incluye manejo del concepto de

esterilidad, siembra en medios líquidos, en medios sólidos (diferenciales, selectivos, etc) y

siembra en condiciones anaeróbicas.

El cumplimiento de las tareas en microbiología clínica exige la realización de tres

actividades: la primera de ellas, aislamiento e identificación de microorganismos, se inicia

con el cultivo de las muestras de distinto origen, en medios específicos y en condiciones

definidas, y va seguido de examen microscópico y pruebas bioquímicas al microorganismo

aislado; la segunda actividad, involucra el conocimiento de la resistencia o sensibilidad a

antibióticos, biotipificación y serotipificación; y por último, la tercera actividad involucra la

identificación epidemiológica o comparación de los aislamientos de la misma especie con el

fin de hacer el control de la infección o análisis de población.

Para poder realizar la primera de estas actividades, es imprescindible contar con un cultivo

puro que debe ser mantenido en condiciones de laboratorio, para esto es necesario e

indispensable emplear material completamente estéril (Tabla Nº 1).

Para poder mantener las bacterias en condiciones de laboratorio se utiliza otro procedimiento

importante en el área de la microbiología que es la siembra o cultivo. Esta consiste en

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colocar a los microorganismos en un ambiente adecuado para que se desarrollen y

multipliquen. En el laboratorio este medio ambiente lo constituyen los medios de cultivo

corrientes o básicos y especiales, operación que debe realizarse en forma aséptica.

Generalmente las muestras contienen una flora mixta, que se manifiesta por el desarrollo de

distintas especies bacterianas: algunas son saprófitas (flora normal) o contaminantes del

proceso de muestreo y otras son las que tienen un rol patógeno.

Obtener una cepa bacteriana aislada significa, por lo tanto, obtener un cultivo en estado de

pureza, condición indispensable para poder estudiar sus características morfológicas y

bioquímicas y lograr así su identificación correcta.

Si en la placa de agar ha crecido más de un tipo de bacterias, se debe realizar el aislamiento

de UNA colonia a otro medio de cultivo semejante o a medios selectivos.

En el caso de los medios líquidos, una vez obtenido el crecimiento bacteriano, se debe

realizar un aislamiento de UNA gota o UNA asada del cultivo a un medio sólido para

obtener colonias aisladas y puras (Tabla Nº 2).

Si fuese necesario las colonias se someterán a uno o más re-aislamientos, hasta obtener

cultivos puros, es decir que todas las colonias sean similares, presenten la misma morfología

y microscópicamente correspondan a un solo tipo de bacteria.

Sólo en este momento se puede proceder a la identificación de la especie bacteriana

mediante el traspaso de UNA sola colonia a una batería de medios de identificación.

MORFOLOGÍA BACTERIANA: ANÁLISIS MACROSCÓPICO

Una etapa importante y básica en el estudio de las características de una bacteria, es la

observación de su morfología. Como consecuencia del pequeño tamaño que presentan no es

posible distinguirlas a simple vista y, debido a esto es que tenemos que estudiar poblaciones

bacterianas, llamadas colonias. Para obtener estas colonias es necesario proporcionarles a las

bacterias los requerimientos necesarios de materia orgánica, iones inorgánicos y factores de

crecimientos entre otros a través de un medio de cultivo. Cada colonia corresponde en su

origen a una sola bacteria que se ha multiplicado y desarrollado en un medio de cultivo

sólido, hasta formar una población que se represente como una colonia visible. Por lo tanto

una colonia esta formada por millones de bacterias.

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El crecimiento de las bacterias en medios líquidos, no da origen a la formación de colonias.

El desarrollo se evidencia mediante la turbidez del caldo, sedimento y otras características.

Cabe destacar que la morfología macroscópica de las colonias (análisis macroscópico)

permite un acercamiento en la identificación de los géneros bacterianos que poseen

características propias de desarrollo de sus colonias, según su forma, elevación, margen,

superficie, brillo, color y hemólisis (en agar sangre).

Muchas especies bacterianas presentan colonias que son muy parecidas lo que hace

imposible diferenciarlas solo con la observación macroscópica de estas por lo que se hace

necesario además una observación microscópica de las células que conforman estas colonias.

Esto datos proporcionan una orientación sobre las pruebas bioquímicas para la

identificación definitiva de las colonias.

En la siguiente figura se observan algunas características macroscópicas de colonias

bacterianas, frecuentemente utilizadas para la descripción de una bacteria o microorganismo.

Figura Nº 1: Criterios macroscópicos para la descripción de una colonia bacteriana.

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de uso común en el Laboratorio de Tabla Nº 1 : Material Microbiología

Esterilización

Material Tipo esterilización

Antes de ser utilizada Después de ser utilizada

Tipo de material

Asa de platino Directo a la llama del mechero Sí Sí Re-utilizable

Pipetas aforadas de vidrio*

Directo a la llama del mechero Sí Sí Re-utilizable

Pipetas aforadas de plástico Química No No Desechable

Pipetas Pasteur de vidrio* Autoclave No Si Desechable

Tubos estériles** Autoclave

Llama Mechero Si Si Re-utilizable

Placas Petri de vidrio Autoclave Si Si Re-utilizable

Puntas de Papel Absorbente Autoclave No No Desechable

Placas Petri de plástico Química No Si Desechable

* Este material se pueden encontrar en cilindros metálicos o envueltas en papel, ya estériles. En el primer caso, se debe poner el cilindro en forma horizontal, destaparlo

y sacar una pipeta sin tocar con los dedos las otras, en el segundo caso se debe desenvolver la pipeta, de manera de no tocar su extremo inferior.

** Cada vez que se destape un tubo estéril, se debe flamear su boca y repetir la operación inmediatamente antes de volver a cerrarlo. Este procedimiento pretende evitar

la entrada de microorganismos del aire al interior del tubo.

ACTIVIDADES PRÁCTICAS

1. De medios Sólidos a medios Sólidos.

1.1. Desde placa Petri a tubo con Agar tendido:

a. Rotular el tubo de agar con los datos correspondientes (Nombre del microorganismo, Grupo y Fecha).

b. Flamear el asa para su esterilización. c. En la placa Petri con la muestra, enfriar el asa en las zonas del agar donde no

existan colonias. d. Tomar una muestra con el asa desde el medio sólido con la bacteria en estudio

(Con solo tocar la colonia estará tomando la cantidad de bacteria suficiente para poder sembrar).

e. Destapar el tubo con agar tendido y flamear la boca del tubo. f. Introducir el asa hasta el fondo. Posteriormente, en un sólo movimiento,

deslizar el asa con movimientos en zig-zag ascendentes por la superficie del medio de cultivo.

g. Flamear y tapar la boca del tubo. h. Flamear el asa para su esterilización. i. Incubar el tubo recién sembrado a la temperatura adecuada.

A B

C D

Figura Nº 1: Siembra desde agar en placa Petri a Tubo con agar tendido.

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2. De medios Sólidos a medios Líquidos.

2.1. Desde placa Petri a tubo con medio de cultivo líquido: a. Rotular el tubo de caldo con los datos correspondientes (Nombre

microorganismo, Grupo, Fecha). b. Flamear el asa para su esterilización. c. Enfriar el asa en las zonas del agar donde no existan colonias. d. Tomar una muestra con el asa desde el medio sólido con la bacteria en estudio

(Con solo tocar la colonia estará tomando la cantidad de bacteria suficiente para poder sembrar).

e. Flamear la boca del tubo con medio líquido. f. Introducir el asa dentro del tubo con caldo y agitar vigorosamente. g. Flamear la boca del tubo y el asa para su esterilización. h. Tapar el tubo e incubar a la temperatura adecuada.

Figura Nº 2: Siembra desde agar en placa Petri a Tubo con caldo de cultivo.

A B

C D

18 – 24 Hrs.

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3. De medios Líquidos a medios Sólidos

3.1. Desde tubo con cultivo bacteriano líquido a placas de Petri:

a. Rotular la placa en el reverso (por donde se encuentra el agar) con los datos correspondientes.

b. Flamear el asa para su esterilización (hasta que se ponga rojo). c. En la placa Petri con la muestra, enfriar el asa en las zonas del agar donde no

existan colonias. d. Destapar el tubo que contiene el cultivo bacteriano, flamear la boca del tubo e

introducir el asa hasta el fondo. Posteriormente, agitar suavemente el asa y retirarla.

e. Flamear y tapar la boca del tubo. f. Colocar la tapa de la placa sobre el mesón cerca del mechero. g. Tomar la placa por su base y realizar la siembra mediante estrías, para ello:

i. Deslizar el asa con la muestra en forma de zig – zag en un pequeño sector de la placa. Flamear el asa.

ii. A partir del sector ya sembrado en la placa, deslizar el asa hacia el sector contrario de la placa nuevamente en forma de zig – zag. Flamear el asa.

iii. A partir de las últimas líneas realizadas, deslizar el asa hacia el sector contrario de la placa en forma de zig-zag. Flamear el asa.

iv. Repetir el procedimiento descrito en iii.) hasta completar la placa. Tener cuidado de que cuando se hacen las estrías en ii.) y iii.) no tocar las que ya se encuentran en la placa.

h. Tapar la placa y flamear el asa para su esterilización. i. Incubar la placa a la temperatura adecuada.

Figura Nº 3: Siembra desde cultivo bacteriano líquido a agar en placa Petri.

A B C

D

18 – 24 Hrs.

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4. Técnicas de esterilización

4.1. Flameado

a. Dividir una placa por la mitad. b. Tomar un asa y abrir una placa de agar nutritivo y deslizarla suavemente por

una mitad del agar. Cerrar la placa. c. Flamear el asa para su esterilización, enfríela en la tapa y deslícela suavemente

por la otra mitad del agar. d. Cerrar la placa. e. Incubar la placa a 37ºC.

5. Desinfección y Asepsia

5.1. Cloro

a. Dividir una placa de agar nutritivo en dos. b. Tomar una tórula estéril y humedecerla en suero fisiológico. c. Deslizarla rápidamente por un sector del mesón de trabajo, alejado del mechero (más de 30 cm). d. Deslizarla suavemente sobre una mitad del agar nutritivo (Zig-Zag). e. Humedecer la misma tórula con la solución de cloro, espere tres minutos. f. Ahora pasar la tórula por la otra mitad del agar (Zig-Zag). g. Incubar la placa a 37ºC por 24hr.

5.2.Yodo

a. Dividir una placa en dos, por una mitad deslizar suavemente uno de sus dedos por el agar.

b. Tome un trozo de algodón con yodo y aplíquelo en el dedo que utilizó, espere unos segundos.

c. Pasar el dedo suavemente por la otra mitad de la placa. d. Incubar la placa a 37ºC.

5.3.Alcohol a. Repita los pasos realizados para la actividad del cloro. b. Escoja otro lugar del laboratorio de amplia exposición. c. Incubar la placa a 37ºC.

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ACTIVIDADES PRÁCTICAS (Continuación)

OBJETIVOS

1. Comparar colonias bacterianas desarrolladas en distintos medios de cultivo sólido

(Placas de Agar).

2. Describir colonias de acuerdo a criterios macroscópicos.

3. Practicar preparación de frotis bacterianos y el uso correcto del microscopio.

En la siguiente sesión de trabajo práctico Ud. debe: 1. Observar y describir las colonias desarrolladas en la placa de agar, considerando los siguientes aspectos: forma, borde, elevación, superficie, características físicas (textura, color y brillo). 2. Observar el crecimiento bacteriano en los medios de cultivo líquidos y sólidos sembrados en la primera sesión. Describa lo observado. 3. Observar las placas de agar sometidas a los procesos de: esterilización, desinfección y asepsia. Describa lo observado en ambas mitades del agar. 4. Realizar análisis de morfología microscópica 4.1 Preparación de frotis bacteriano a partir de una colonia.

a. Colocar con el asa una gota de agua en el centro de la lámina (del tamaño de una

arveja).

b. Flamear el asa para su esterilización.

c. Enfriar el asa en un sector del agar donde no exista crecimiento bacteriano.

d. Obtener una pequeña muestra desde la placa.

e. Mezclar la muestra con la gota de agua y esparcirla por la superficie del portaobjeto,

suavemente, formando una capa delgada.

f. Fijar el frotis exponiéndolo a la llama del mechero hasta que se seque.

4.2 Tinción simple

a. Cubrir un frotis bacteriano con Azul de Metileno al 1%

b. Dejar reposar 2 minutos para permitir la difusión del colorante

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c. Lavar suavemente con agua.

d. Secar con papel absorbente

e. Observar al microscopio con aumento de 100X oil

f. Describa lo que observa: forma, agrupación, color.

MICROSCOPIO OPTICO:

• Sistema óptico o OCULAR: Lente situada cerca del ojo del observador. Amplía la imagen

del objetivo. o OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparación. Amplía la imagen de

ésta. o CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la

preparación. o DIAFRAGMA: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador. o FOCO: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador.

• Sistema mecánico o SOPORTE: Mantiene la parte óptica. Tiene dos partes: el pie o base y el

brazo. o PLATINA: Lugar donde se deposita la preparación. o CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser

monocular o binocular. o REVÓLVER: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar,

cambiar los objetivos. o TORNILLOS DE ENFOQUE: Macrométrico que aproxima el enfoque y

micrométrico que consigue el enfoque correcto.

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USO CORRECTO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO CON ACEITE DE

INMERSIÓN

1. Colocar la preparación sobre la platina del microscopio

2. Verificar que el condensador esté arriba y el diafragma abierto, ya que el objetivo de

inmersión requiere mucha más luz que los objetivos secos.

3. Enfocar primero con los objetivos secos en orden creciente (4x, 10x, 40x), eligiendo la

zona de interés.

4. Colocar el revólver a mitad de camino, entre el objetivo 40x y el de inmersión 100x

(línea negra)

EVITE CUALQUIER CONTACTO DE LOS OBJETIVOS SECOS CON EL

ACEITE DE INMERSIÓN.

5. Colocar una gota de aceite de inmersión sobre la preparación

6. Cuidadosamente colocar el objetivo 100x en contacto con el aceite, el objetivo deberá

estar prácticamente tocando el portaobjetos, y el aceite deberá ocupar este pequeño

espacio

7. Observe con los oculares, y ajuste el foco utilizando sólo el micrométrico

8. Una vez terminada la observación microscópica, LIMPIAR CUIDADOSAMENTE

EL OBJETIVO, RETIRANDO EL ACEITE CON UN PAPEL LIMPIALENTES

(PAPEL SUAVE) IMPREGNADO EN XILOL.

9.- Una vez terminado el trabajo práctico su microscopio debe quedar limpio y apagado,

con la platina abajo y el revólver puesto con el objetivo menor (4x)

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TRABAJO PRÁCTICO N°2

MORFOLOGÍA BACTERIANA MEDIOS DE CULTIVO

Un medio de cultivo es una preparación sólida o líquida hecha específicamente para el

crecimiento, almacenamiento o transporte de bacterias. Los medios líquidos pueden ser

usados en tubos de ensayo o en botellas de vidrio. Los medios sólidos se obtienen de una

solución de nutrientes solidificada con agar (polisacárido obtenido de ciertas algas

marinas que actúa como agente gelificante) o gelatina y se usan en placas de Petri. El

agar es el agente gelificante más comúnmente usado ya que no es atacado por la mayoría

de las bacterias y no se funde a 37ºC (Tº usada para la incubación de las bacterias).

Los componentes esenciales, cualquiera sea el medio de cultivo y la variedad de

microorganismos que se desea cultivar, son: agua, componentes nitrogenados (proteínas,

aminoácidos y/o sales inorgánicas que contengan nitrógeno) y fuentes de energía

(carbohidratos, proteínas o sales inorgánicas).

Algunos Medios de cultivo muy utilizados en clínica:

- Agar nutriente (corriente): Es un medio básico usado con propósitos generales para el

cultivo de muchos tipos de bacterias. Puede enriquecerse o hacerse selectivo por la

adición de sustancias adecuadas.

- Agar sangre: Es un medio en base a agar nutriente enriquecido con 5-10% de sangre.

Es usado para el cultivo de bacterias nutricionalmente exigentes, como Bordetella

pertussis (agente causal de tos convulsiva) y también para detectar hemólisis. Al calentar

el agar sangre a 70-80ºC hasta obtener un color café se obtiene otro medio de cultivo

denominado agar chocolate, que es más apropiado que el agar sangre para el crecimineto

de ciertos patógenos, como por ejemplo Neisseria gonorrhoeae.

- Agar McConkey: Es un medio selectivo y diferencial, ya que contiene sales biliares y

cristal violeta para inhibir el crecimiento de Gram + (selectivo) y lactosa para distinguir

aquellas bacterias que la fermentan de las que no (diferencial). En agar McConkey las

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bacterias entéricas que utilizan lactosa (tales como E. coli) forman colonias rojas debido a

que los productos acídicos que se forman a partir de lactosa afectan el indicador de pH

del medio (rojo neutro); en cambio, las especies entéricas que no usan lactosa (por

ejemplo muchas cepas de Salmonella) forman colonias incoloras.

Clasificación de los medios de cultivo

1.- Según estado físico:

a. Sólidos (solidificados por adición de agar al medio líquido o de alguna proteína

coagulada).

b. Líquidos

c. Semisólidos

2.- Según contenido nutricional:

a. Corrientes: bajo contenido nutricio (ej.: caldo de carne, agar, gelatina).

b. Mejorados (o enriquecidos): por adición al medio corriente de: sangre, proteínas,

hidratos de carbono, extracto de órganos o levadura.

c. Sintéticos y mínimos: Los primeros son medios de fórmula perfectamente conocida,

en la cual se emplean concentraciones exactas de sus componentes. Obedecen a

propósitos bien definidos. Los segundos son también sintéticos, pero a su fórmula que no

permite el crecimiento bacteriano se le adiciona uno o dos sustratos o elementos, sobre

los cuales se desea conocer la actividad de una bacteria en estudio, sin interferencia de

otro elemento. Al adicionar el sustrato, la bacteria crecerá sólo si esa sustancia es

utilizada.

3.- Según su empleo con propósitos de diagnóstico o taxonómicos.

a. Selectivos: Son aquéllos que permiten, a la vez que evitan o retardan, el crecimiento de

otros microorganismos. La selección se efectúa mediante el control de los ingredientes

del medio. ej.: cristal violeta es selectivamente bacteriostático para las bacterias Gram

positivas, por lo tanto este colorante puede ser incorporado a un medio para examinar

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patógenos entéricos que son predominantemente bacilos Gram negativos. ej.: Agar sangre

con azida de sodio, agar Petragnani.

b. Diferenciales: Son medios nutricios que contienen un sustrato y un indicador de pH

que permiten apreciar si fue o no metabolizado este compuesto, lo cual permite con un

conjunto de pruebas de este tipo clasificar una bacteria, es lo que se llama "Taxonomía

sobre base de pruebas bioquímicas".

Muchos de estos medios sólidos diferenciales contienen uno o más hidratos de carbono

fermentables y un indicador adecuado para la determinación de la producción de ácidos o

compuestos alcalinos. ej.: citrato (Simmons), agar triple azúcar hierro (TSI). Los cambios

producidos en el medio por un organismo o grupo de organismos son característicos,

diferenciándolos de este modo de otras cepas o grupos. Los medios diferenciales

permiten identificar reacciones de fermentación de los cultivos puros de bacterias o su

capacidad para utilizar productos nutritivos. ej.: Voges-Proskauer, caldo urea.

c. Selectivo-diferencial: Contienen en una sola fórmula los elementos de los medios

selectivos y diferenciales. De esta forma es posible observar el proceso de aislar y

clasificar.

Ej.: Medio Nº 110 para Staphylococcus, éste contiene 7.5% de NaCl, en circunstancias

que la concentración salina de la mayoría de los medios es 0,25 a 0,5 g%. Este

ingrediente evita el desarrollo de casi todas las demás bacterias.

Además, las pruebas de la gelatina y la fermentación del manitol permiten diferenciar las

diversas cepas de Staphylococcus.

Otro medio selectivo-diferencial es el agar McConkey.

En la figura Nº 1 se observa algunas características macroscópicas de colonias

bacterianas, frecuentemente utilizadas para la descripción de microorganismos.

MORFOLOGÍA BACTERIANA: ANÁLISIS MACROSCÓPICO

La observación al microscopio de las bacterias nos permite conocer una serie de

características complementarias a la morfología de colonia entre las que encontramos:

forma, disposición o agrupación, presencia o ausencia de estructuras (cápsulas, esporas,

flagelos), movilidad, etc.

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Existen numerosas técnicas para la observación microscópica de los microorganismos.

En el laboratorio son fáciles de realizar las siguientes:

1. Observación de bacterias vivas: Para observar las bacterias vivas, sin teñir, se utiliza

el microscopio de fase contrastada. Este tipo de microscopio se desarrolló para hacer

posible observar células pequeñas sin teñir. Se basa en utilizar y aumentar la pequeña

diferencia de índice de refracción que existe entre las células y el medio que las circunda.

Esta diferencia puede ser usada para crear una imagen con mucho mayor contraste que la

que se obtiene en el microscopio de campo claro. Este microscopio usa un lente objetivo

especial y en el condensador se inserta un diafragma especial; además para aumentar el

contraste se insertan filtros verdes o azules.

a. En fresco: Este método de examen permite observar el microorganismo al estado vivo

y evita las deformaciones artificiales de su morfología que producen las técnicas de

coloración. Su aplicación más importante se refiere al estudio de la movilidad de los

microorganismos.

b. Con fondo oscuro: Se basa en el fenómeno de Tyndall, de reflexión luminosa. Para la

observación se sustituye el condensador de Abbé por el condensador de fondo oscuro, o

de ultra. Se ilumina la preparación en forma oblicua, incidiendo los rayos luminosos

directamente sobre los microorganismos sin penetrar en el objetivo del microscopio. Se

emplea para la observación de bacterias muy pequeñas o de aquellas que difícilmente se

observan al microscopio de campo claro por su falta de contraste con el medio.

c. Gota colgante: Consiste en suspender el microorganismo a observar en un líquido y

depositar una gota de la suspensión sobre un cubreobjeto el cual se coloca sobre un

portaobjeto, luego se procede a la observación microscópica.

2. Observación de bacterias muertas:

a. Tinción simple: Se utiliza un sólo colorante para revelar la presencia de

microorganismos y su forma en general. Son de poco uso en bacteriología.

b. Tinción negativa: Se tiñe el fondo mientras que las células permanecen sin teñir

(transparentes), observándose como entidades claras sobre un fondo oscuro. Ejemplo de

este tipo de tinción es la tinción de cápsula en la que se usa tinta china.

c. Tinciones especiales: Se utilizan para observar alguna estructura en particular como

nucleoide, flagelo, esporas, etc.

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d. Tinciones diferenciales: Las bacterias son diferentes entre sí, tanto en su estructura

física como en su composición química, de modo que reaccionan en forma diferente

frente a los colorantes. Estas tinciones se utilizan para diferenciar los distintos grupos de

bacterias. La Tinción de Gram es la tinción diferencial más importante usada en

bacteriología. Otra muy utilizada es la Tinción de Ziehl Neelsen.

Algunas estructuras bacterianas que pueden ser diferenciadas por métodos de

tinción son esporas y cápsula:

a. Observación de esporas: Esta tinción es un ejemplo de tinción especial. Algunos

géneros bacterianos como Bacillus y Clostridium, producen endosporas como una forma

de resistencia a condiciones ambientales adversas, por ejemplo sequedad o falta de

nutrientes. Las endosporas o esporas se caracterizan por ser altamente resistentes al calor,

a las radiaciones y a la desecación. La resistencia de la espora se debe a la estructura

proteica (rica en aminoácidos azufrados) de sus capas externas, lo que también las hace

resistentes a tinción. Por este motivo las esporas se tiñen en caliente.

b. Observación de cápsula: se trata de una tinción negativa usando tinta china que

permite determinar la presencia de cápsulas polisacarídicas.

El estudio macro y microscópico de una muestra bacteriana permite obtener una

orientación preliminar de su identidad y dirige al desarrollo de pruebas bioquímicas

específicas que permitirán una identificación más certera y precisa.

La técnica de mayor importancia en el área de la microbiología, es la tinción de Gram

(Figura Nº 2), pues divide a las bacterias en dos grandes grupos: Gram positivo y Gram

negativo. Además permite diferenciar forma (cocos, bacilos) y la disposición bacteriana

(pares, cadenas, racimos).

La tinción Gram consiste en teñir un frotis de bacterias con cristal violeta, y luego

tratarlas con una solución mordiente (fijadora) de Yodo-Ioduro. Todas las bacterias se

tiñen en estas condiciones. Sin embargo, sólo algunas son capaces de retener el colorante

al tratarlas con un agente decolorante como etanol o una solución decolorante de etanol-

acetona. Las bacterias que retienen el colorante son Gram positivo; las que se

decoloran son Gram negativo y para observarlas deberán teñirse con un colorante de

contraste (safranina). Por lo tanto, las Gram positivo se verán de color violeta y las

Gram negativo de color rojo o rosado.

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La diferencia en la reacción frente a la tinción de Gram se debe a la diferencia en

la composición química de las estructuras externas de las bacterias. Las bacterias Gram

positivo tienen una capa gruesa de peptidoglicán o mureína, mientras que las Gram

negativo tienen menor cantidad de peptidoglicán y tienen una membrana externa

(además de la membrana citoplasmática). La explicación más aceptada es que, luego de

la acción de la solución decolorante, las bacterias Gram positivo son capaces de

retener el colorante gracias al peptidoglicán. En cambio, las Gram negativo, pierden

parte de los lípidos de su membrana externa por acción del decolorante (un solvente

orgánico como por ejemplo alcohol), lo que sumado a la menor cantidad de

peptidoglicán, hace que se decoloren. Es importante destacar que la etapa crítica en la

tinción es la de decoloración, por lo que se debe tener especial cuidado en realizarla en

forma adecuada.

También es importante señalar que las bacterias Gram positivo pueden observarse como

Gram negativo en algunas condiciones: en cultivos viejos (de más de 24 ó 48 horas), a

pH ácido y en condiciones de decoloración muy prolongada.

Un género bacteriano que representa una excepción a la tinción de Gram (no se tiñen)

es Mycobacterium (bacilos ácido-alcohol resistentes), cuyas especies, como M.

tuberculosis (Bacilo de Koch) y M. leprae (Bacilo de Hansen) deben ser teñidos con la

tinción de Ziehl Neelsen.

Son bacterias que se tiñen con dificultad, pero una vez teñidas, el colorante no se libera,

aún por acción de decolorantes enérgicos como una solución de alcohol y ácido

clorhídrico. Esta resistencia se debe a la gran cantidad de lípidos que tiene su cubierta,

incluyendo ácidos grasos de alto peso molecular que constituyen entre el 20 y 40% del

peso seco de la bacteria. El contenido inusualmente alto en lípidos le confiere a este

grupo propiedades como: hidrofobicidad (las bacterias tienden a formar grumos en medio

líquido), resistencia a la acción de anticuerpos y complemento, crecimiento lento debido

a la dificultad de absorción de nutrientes a través de esta pared celular lipídica.

23

Figura Nº 2: Técnica Tinción Gram. 1 Cubra el frotis con Cristal violeta por 2 minutos

2 Agregue solución de lugol por 1min.

3 Decolore con alcohol-acetona y lave con agua

4 Cubra con safranina 1% por 1min. Lave con agua y seque con papel

24

TABLA Nº 1: Cuadro Resumen Tipo de Tinciones

TINCIÓN REACTIVOS PRINCIPIO UTILIDAD

Gram Cristal Violeta, Lugol,

Alcohol – Acetona, Safranina

Gram positivo retienen cristal violeta (azul)

Gram negativo se tiñen con contraste (rojo)

Clasificación bacteriana clásica:

Gram Positivo y Negativo

Tinción de esporas Verde de malaquita, Safranina Tiñe la espora (verde) Esporas de bacilos

Gram Positivo

Kinyoun Fucsina, Acido Sulfúrico, Azul

de Metileno

Unión ácido resistente de fucsina a escasos

ácidos micólicos de la pared (fucsia) Nocardia (BAA lábiles)

Anaranjado de acridina Naranja de Acridina

(fluorescencia)

Tiñe el DNA bacteriano

(fluorescencia naranja) Bacterias Gram lábiles

Giménez Fucsina, Verde de Malaquita Tiñe la pared de Bartonella (fucsia)

Bartonella spp,

corpúsculo elemental

de Chlamydia

Ziehl-Neelsen Fucsina, Alcohol – Acido, Azul

de Metileno

Unión ácido-alcohol resistente de fucsina a

ácidos micólicos de pared (fucsia) Micobacterias (BAAR*)

Auramina / rodamina Auramina – Rodamina

Permanganato de Potasio

Unión de auramina-rodamina al ácido

micólico de la pared (fluorescencia amarilla)

Micobacterias

(mayor sensibilidad que

Ziehl Neelsen)

25

Utilidad clínica de la tinción de Gram:

Este examen permite al clínico sospechar el agente causal de una infección, que muchas

veces sirve de base para el inicio de terapia antibiótica.

La sensibilidad analítica (número mínimo de bacterias que la técnica puede detectar) es de

100.000 bacterias /ml de muestra.

La sensibilidad clínica (probabilidad que un paciente que tenga una infección tenga un test

positivo) varía según tipo de muestra:

Líquido cefalorraquídeo (meningitis) : 75 %

Líquido pleural (empiema pleural) : 50-80%

Líquido peritoneal (peritonitis) : 25-50%

Líquido articular (artritis séptica) : 50%

Se debe solicitar en toda muestra clínica

De gran importancia en infecciones mixtas por bacterias aeróbicas y anaeróbicas, pues si

bien los anaerobios no crecen en los medios habituales, sí se observan en la tinción de Gram.

ACTIVIDADES PRÁCTICAS

OBJETIVOS

1. Sembrar y describir colonias bacterianas desarrolladas en medios de cultivo sólido (Placas

de Agar) de acuerdo a criterios macroscópicos.

2. Practicar diferentes tinciones de frotis bacterianos: tinción de Gram, tinción de cápsula y

tinción de esporas.

3. Observar endosporas y su disposición en formas vegetativas de Bacillus spp.

4. Observar la presencia de cápsula en Klebsiella spp.

5. Observar diferentes preparaciones fijadas y describirlas

OBSERVACIONES MACROSCÓPICAS

1.- Siembre mediante técnica de aislamiento dos de las muestras disponibles en el

laboratorio tanto en agar sangre como en agar McConkey y deje incubar a 37ºC por 24hrs.

26

2.- En la siguiente sesión de trabajo práctico observe y describa las colonias desarrolladas en

los distintos medios, según sus características macroscópicas (figura 1).

OBSERVACIONES MICROSCÓPICAS

1. Observación de muestras fijas.

Observar en el microscopio óptico con un aumento de 100X (usando aceite de inmersión), la

serie de preparaciones teñidas fijas (colección en caja) e identificar la forma, agrupación y

afinidad tintorial.

2. Tinción de Esporas.

Procedimiento :

a. Con el asa, colocar una gota de agua (del tamaño de una arveja) sobre el portaobjeto.

b. Esterilizar el asa y obtener una pequeña muestra desde la placa de Bacillus sp.

c. Mezclar la muestra con la gota de agua y fijar en el mechero hasta que se seque

completamente (sin hervir).

d. No olvidar esterilizar el asa después de usarla.

e. Poner 4 capas de papel sobre el frotis y, a continuación agregar solución colorante Verde

de malaquita. El colorante tiene que atravesar las 4 capas de papel y ponerse en contacto con

el frotis bacteriano.

f. Esta tinción se realiza en caliente: con una pinza de madera debe colocar la muestra

encima de la llama del mechero hasta observar emisión de vapor durante 3 min. No

sobrecaliente para evitar que se queme su muestra o se rompa el portaobjeto.

g. Si la emisión de vapor desde la muestra cesa, hay que reponer el colorante nuevamente.

h. Lavar con agua de tal manera que escurra suavemente todo el colorante Verde de

malaquita y el papel.

i. Cubrir el frotis con el colorante de contraste Safranina, durante 1min.

j. Lavar con agua.

k. Secar cuidadosamente con papel absorbente y observar con lente de inmersión.

27

NOTA: Las bacterias se observan rosadas mientras que las esporas (de menor tamaño que

las bacterias) son pequeñas esferas verdes. Es posible observar esporas libres y esporas

intracelulares. En estas últimas se determina si se encuentran al centro o hacia un extremo de

la célula y, si la espora deforma o no al bacilo.

A B

Papel Absorbente

Verde Malaquita Safranina

E F G

C D

Figura Nº 3: Procedimiento Tinción de Esporas.

Localización y morfología de las esporas en Bacillus

28

3. Tinción de Cápsula.

Procedimiento:

a. En una esquina del portaobjeto colocar una gota de Tinta china del tamaño de una arveja.

b. Esterilizar el asa y tomar parte del cultivo de la bacteria Klebsiella spp.

c. Mezclar la tinta china con la bacteria, esterilizar el asa y repetir 3 ó 4 veces (sólo agregar

la bacteria). La Tinta china impide ver si la solución tiene o no suficiente bacteria, por lo

mismo es necesario mezclar con suficiente cultivo.

d. Tenga cuidado de no ensuciar su cultivo bacteriano con Tinta china; asegúrese de

esterilizar el asa previamente y de enfriar ésta en las paredes del tubo.

e. Realizar un frotis extendiendo la suspensión de manera que quede una capa delgada. Esto

se realiza tomando un cubreobjeto y, esparciendo la mezcla a lo largo del portaobjeto que

contiene la mezcla Tinta china-bacteria. Ver figura.

f. Fijar suavemente en el mechero.

g. Durante 3 min cubra completamente con colorante de contraste, Fucsina.

h. Lave con agua, seque con papel absorbente y observe con lente inmersión.

29

B

C D

A

E

Fucsina

Bacterias

Cápsula

F

Figura Nº 4: Procedimiento Tinción de Cápsula.

30

4. Análisis Microscópico mediante tinción de Gram

1. Realice tinción de Gram a las muestras que Ud. sembró y observe al microscopio.

Preparación de frotis bacteriano a partir de una colonia.

a. Flamear el asa para su esterilización.

b. Colocar con el asa una gota de agua en el centro de la lámina (aprox. 0,5 cm de diámetro).

c. Flamear el asa para su esterilización.

d. Enfriar el asa en un sector del agar donde no existan colonias.

e. Obtener una pequeña muestra desde la placa.

f. Mezclar la muestra con la gota de agua y esparcirla por la superficie del portaobjeto.

g. Fijar el frotis exponiéndolo a la llama del mechero hasta que se seque.

Tinción frotis mediante Gram

a. Verificar, con el dorso de la mano, que el vidrio no esté demasiado caliente.

b. Cubrir el frotis completamente con cristal violeta y dejar en reposo por 2 min.

c. Dejar escurrir el cristal violeta y agregar sobre la muestra una solución de Lugol. Dejar

con Lugol por 1 min.

d. Lavar el lugol alternativamente con alcohol-acetona y agua dejando escurrir suavemente,

hasta que se decolore completamente. (Debe primero lavar con el decolorante alcohol-

acetona y luego con agua)

e. Cubrir con colorante de contraste, Safranina al 1%, por 1 min.

f. Lavar con agua, dejar escurrir y secar suavemente con papel absorbente.

2. Observar en el microscopio óptico con aumento de 100X y aceite de inmersión.

Caracterizar según criterios microscópicos (afinidad tintorial, morfología y agrupación) los

microorganismos.

31

TRABAJO PRÁCTICO N°3

FLORA NORMAL Y MUESTRAS CLÍNICAS DE

BACTERIAS GRAM POSITIVO

Como en la mayoría de los animales, el organismo humano posee lugares que

normalmente se mantienen estériles y otros donde cohabitan, también normalmente, una

gran diversidad y una cantidad sorprendente de microorganismos, aún en las personas más

sanas. La sangre, el líquido cefalorraquídeo, la médula ósea y las vías aéreas inferiores

(bronquios y alvéolos), entre muchos otros, carecen de microorganismos debido a los

mecanismos de defensa que presentan. Pero en la boca, faringe, intestinos, vagina, oídos,

piel, nariz o conjuntivas residen diversos microorganismos que conforman la flora normal

del ser humano.

La colonización microbiana del individuo, comienza con el nacimiento. Los primeros

microorganismos en establecerse son aquellos transferidos desde la vagina materna y del

área perineal, hacia la piel, la boca, la nariz y región faríngea del niño. Las biotas

características de éstas y otras áreas, se desarrollan posteriormente y probablemente se

derivan y seleccionan de diversas fuentes ambientales.

Zona del intestino inferior: Rico en gran cantidad de substancias alimenticias, que favorecen

el crecimiento de saprófitos.

Zona boca, región orofaríngea y vulva: Con substancias provenientes del exterior o

acumulación de restos celulares, o bien gran cantidad de pliegues que favorecen la existencia

de anaerobios.

Zona de la piel: Que difiere de los otros ambientes por su menor humedad y alto contenido

lipídico, que tiende a seleccionar una biota algo diferente.

Se debe enfatizar que los anaerobios estrictos exceden en número a las formas facultativas y

aerobias por un factor de 10 a 100 o más. Existe una interacción permanente entre los

componentes de la flora y el hospedero, que provoca fluctuaciones en la biota, tanto

cualitativas como cuantitativas. Los efectos de estas fluctuaciones incluyen los beneficiosos,

inaparentes, hasta los perjudiciales.

32

Algunos de los microorganismos más frecuentemente encontrados en los cultivos de las

diferentes regiones del cuerpo y, que se consideran integrantes de la flora normal, son:

Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Streptococcus mitis, Streptococcus

salivarius, Streptococcus mutans, Enterococcus faecalis, Streptococcus pneumoniae,

Streptococcus pyogenes, bacterias coliformes como Escherichia coli, Proteus mirabilis,

Pseudomonas aeruginosa, bacteroides, espiroquetas, lactobacilos y, clostridios como

Clostridium tetani.

La flora transitoria de la piel se encuentra representada principalmente por bacterias Gram

positivo, como Streptococcus del grupo A, Staphylococcus aureus y, flora fúngica como

Candida albicans.

Innumerables bacterias son filtradas a medida que el aire que los transporta pasa a través de

la nasofaringe, la tráquea y los bronquios; la mayoría de estos microorganismos son

atrapados en la secreciones mucosas y deglutidos. Así, los senos nasales, la tráquea, los

bronquios y los pulmones son habitualmente estériles. La nasofaringe es el hábitat natural de

bacterias y virus patógenos que causan infecciones en la nariz, garganta, bronquios y

pulmones.

Algunas personas se convierten en portadores nasales de estreptococos y estafilococos

descargando estos microorganismos en grandes cantidades desde la nariz hacia el aire.

Normalmente existe un equilibrio entre los microorganismos de la flora y el hospedero; sin

embargo este equilibrio puede romperse por:

- Aumento de la masa crítica

- Traslado desde el sitio original

- Ruptura de barreras mecánicas por traumatismos.

Esto produce una proliferación e invasión de los microorganismos, dando origen a una

infección endógena. Por lo general, se requieren algunos determinantes para que se

produzcan estas enfermedades, como son:

- Deficiencia en el estado inmunitario del huésped.

- Tratamiento inmunosupresor o con corticoides.

- Cirugías.

- Uso de antibióticos.

Como ejemplos de infección endógena se pueden mencionar:

33

- Infección urinaria por Enterobacterias.

- Endocarditis bacteriana por microorganismos de la boca (Streptococcus grupo viridans)

- Diarrea por sobreinfección de Clostridium difficile, debido al uso prolongado de

antibióticios.

ETAPAS DEL DIAGNÓSTICO BACTERIOLÓGICO

Para llegar a la identificación de una bacteria es necesario seguir una serie de pasos. El

primero implica la toma de muestra, siguiendo los procedimientos adecuados según la

sospecha clínica.

El segundo paso corresponde al examen microscópico directo, con o sin tinción.

El tercer paso es el aislamiento del agente, para lo cual se debe disponer de medios de

cultivo adecuados donde la muestra y las bacterias, que ésta pudiese o no contener, puedan

encontrar los nutrientes y factores adecuados para propiciar su crecimiento y desarrollo.

El cuarto paso consiste en identificar el agente, para ello se recurrirá a determinar su

morfología bacteriana como su posible agrupación, y se aplicará distintas pruebas

bioquímicas y fisiológicas destinadas a conocer sus características metabólicas.

Por último se debe realizar las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana.

TOMA DE MUESTRA

EXAMEN MICROSCÓPICO DIRECTO (Gram o Ziehl-Neelsen)

AISLAMIENTO DEL AGENTE

IDENTIFICACIÓN FISIOTAXONÓMICA DEL AGENTE

Tinción: Morfología y agrupación; Pruebas Bioquímicas

SUSCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA

INFORME

34

SELECCIÓN, RECOLECCION Y TRANSPORTE DE MUESTRAS PARA

ESTUDIOS MICROBIOLOGICOS.

En la recuperación del o los microorganismos causantes de la infección, lo más importante

es la correcta recolección de una muestra para su estudio microbiológico.

Esta recolección comprende cuatros pasos importantes:

1. Seleccionar el sitio anatómico más adecuado para tomar la muestra.

2. Usar la técnica más apropiada.

3. Poner la muestra recolectada en un envase que favorezca la viabilidad de los

microorganismos causantes del proceso infeccioso, y que además impida la

filtración o derrame de la muestra, como medida de protección para el personal

que posteriormente la manipula.

4. Enviar la muestra en forma rápida y expedita al laboratorio, y en el caso de que

esto no sea posible, asegurarse que sea almacenada a la temperatura y en los

medios de transporte adecuados.

Una muestra mal recolectada puede inducir a error en el aislamiento del microorganismo

etiológico real, y la recuperación de contaminantes puede llevar a indicar una

antibioticoterapia incorrecta y a veces incluso perjudicial. Debe recordarse entonces, que “la

calidad del trabajo realizado en el laboratorio no puede ser superior a la calidad de la

muestra recibida”.

Ya que el proceso de toma de muestra se inicia al lado del paciente siendo éste parte activa,

es necesario explicarle el porqué del procedimiento y el tipo de técnica a realizar, para lograr

así su colaboración y participación, lo que lleva a la obtención de la muestra en óptimas

condiciones.

Recolección y transporte de la muestras:

Preparación del sitio. En todos aquellos casos en que la muestra se obtenga con aguja o por

aspiración, se debe desinfectar la piel. Esto se logra limpiando la piel con alcohol al 70%,

seguido por povidona yodada, la que se deja actuar un minuto (esperando que se seque). Si

el paciente presenta hipersensibilidad al yodo, se debe usar solo alcohol.

Volumen. Si es posible obtener muestras líquidas (mediante aguja o aspiración) no debieran

usarse tórulas. El volumen de muestra que se envía al laboratorio es generalmente menor de

lo requerido. No existe consenso sobre los volúmenes mínimos para cada tipo de muestra.

35

Envase y aparatos recolectores. Existen diferentes métodos de recolección, desde la tórula

hasta aparatos recolectores de muestra.

Las tórulas deben ser de un material que no inhiba el crecimiento bacteriano (alginato de

calcio o polyster). Éstas, luego de tomada la muestra, se introduce en un envase estéril con

un medio de transporte. Para muestras líquidas, lo más adecuado es usar envases plásticos

estériles, o tubos con tapa rosca.

Técnicas de recolección. Con el fin de obtener una muestra óptima para la recuperación del

agente etiológico es necesario seguir las instrucciones dadas más adelante.

Medio de transporte. No deben usarse tórulas sin medio de transporte (excepto para ciertas

técnicas específicas) porque esto lleva a la desecación de la muestra y a la pérdida de la

viabilidad bacteriana. Los medios de transportes recomendados cuando se usan tórulas, en el

caso de las secreciones, son del tipo tampón (Stuart, Amies). Contiene tioglicolato de sodio,

el cual provee un ambiente reducido y es útil para suprimir cambios oxidativos en el medio

de transporte,. De esta manera se favorece la viabilidad de los microorganismos durante su

envío al laboratorio.

PROCEDIMIENTOS DE ENFERMERIA EN LA TOMA DE MUESTRAS

MICROBIOLOGICAS DE DISTINTAS ZONAS ANATOMICAS

INFECCION TRACTO URINARIO (ITU) (Orina, secreción uretral y prostática) UROCULTIVOS

Muestra Miccional: Realizar aseo perineal prolijo, separando los labios en la mujer y

retrayendo el prepucio en el varón durante el procedimiento. Eliminar el primer chorro de

orina, a fin de arrastrar mecánicamente la flora externa del tracto genitourinario.

Recibir 2 a 3 ml del segundo chorro en receptáculo estéril y sin interrumpir la micción.

Tener presente de poner un tapón vaginal en la mujer a fin de evitar contaminación con la

flora vaginal.

Con el objeto de no alterar el recuento bacteriano la muestra debe ser sembrada dentro de las

primeras dos horas de tomada. Debe mantenerse refrigerada a 4º C y trasladarla manteniendo

la cadena de frío.

36

Muestra por punción de catéter urinario: Desinfectar el sitio de punción del segmento

proximal del catéter con alcohol 70%, aspirar con jeringa estéril entre 2 a 5 ml de orina,

vaciar en tubo estéril y transportarla al laboratorio de la misma forma que la muestra

miccional.

Muestras por punción suprapúbica: Antisepsia de la piel en el sitio de punción, aspirar

con técnica aséptica entre 2 a 5 ml de orina y proceder a su traslado al laboratorio de igual

forma que los casos anteriores.

Secreción uretral: Previo aseo genital, exprimir uretra y recibir la secreción en tórula

estéril, colocar en medio de transporte y enviar a estudio. La muestra debe tomarse a primera

hora de la mañana o después de una hora de orinar.

Secreción prostática:

La técnica de recolección es exprimir la próstata a través de un masaje prostático por vía

rectal e impregnar una tórula estéril con el fluido obtenido. Colocar en medio de transporte.

INFECCION RESPIRATORIA INFERIOR (IRI)

(Neumonía, TBC)

TOMA DE MUESTRAS NO INVASIVAS

Previo a la toma de muestra, realizar aseo bucal y posterior a tos voluntaria profunda recoger

la muestra en receptáculos estériles o placa de Petri, Enviar de inmediato al laboratorio, si no

es posible mantenerla refrigerada transitoriamente a 4º C por no más de dos horas. Es

recomendable facilitar la expectoración con kinesiterapia respiratoria o drenaje postural. En

pacientes intubados realizar la aspiración endotraqueal con sonda estéril y técnica aséptica,

introducirla evitando su contaminación con gérmenes exógenos y aspirar depositando el

contenido en tubo estéril para su estudio que puede ser cualitativo o cuantitativo. Este último

tiene mejor perfil de especificidad, por cuanto se debe de rigor al momento de realizar el

diagnóstico etiológico en pacientes conectados a ventilación mecánica.

TOMA DE MUESTRAS INVASIVAS

Cuando se trata de identificar el agente etiológico de neumonía nosocomial, las muestras que

tienen mejor rendimiento; pero también mayores riesgos para el paciente, son aquellas

tomadas por broncoscopías (lavado broncoalveolar, aspirado telescopado protegido),

Toracocentesis y Biopsia.

37

Lavado bronqueoalveolar: Realizar el procedimiento a través de broncoscopía y con

técnica aséptica aspirar entre 15 a 50 ml de lavado. Transportarlas de inmediato en tubo

estéril al laboratorio para su estudio.

Aspirado telescopado protegido: Por broncoscopía introducir cepillo a través del catéter

protegido frotar la zona alterada y enviar en tubo estéril de inmediato al laboratorio para

estudio semicuantitativo. *

Toracocentesis: Realizar el procedimiento con técnica aséptica, aspirar 10 ml si es posible.

Transportar de inmediato al laboratorio para su estudio.

Biopsia pulmonar: realizar el procedimiento con técnica aséptica, enviar un trocito de tejido

en tubo estéril o en medio de transporte con caldo específico. Trasladar la muestra de

inmediato para su estudio.

*Corte recomendado para cultivos cuantitativos en secreciones respiratorias para neumonía es: Con recuento > 10 elevado a 6 UFC/ml en muestra por aspirado traqueal Con recuento > 10 elevado a 3 UFC/ml en muestra por cepillado protegido Con recuento > 10 elevado a 4 UFC/ml en muestra por lavado bronqueoalveolar

INFECCION RESPIRATORIA ALTA (IRA)

Secreción faríngea: Deprimir la lengua y frotar con tórula estéril amígdalas, pilares

anteriores y pared posterior de la faringe. Colocar en el medio de transporte y enviar de

inmediato al laboratorio, si no es posible la muestra se mantiene transitoriamente a

temperatura ambiente.

Secreción nasal: Introducir tórula estéril más o menos 2,5 cms en mucosa nasal, rotar y

colocar en medio de transporte. Enviar al laboratorio de inmediato o mantener la muestra

transitoriamente a temperatura ambiente

INFECCION DE HERIDA OPERATORIA (IHO)

(Superficial, profunda abscesos cerrados)

Infección superficial: son aquellas que comprometen dermis, epidermis y celular

subcutáneo.

Infección profunda: son aquellas que incluyen fascia y músculo, pudiendo comprometer o

no cavidades u órganos.

38

Toma de muestra superficial: Limpiar la herida con suero fisiológico o Ringer, frotar con

tórula estéril el centro y los bordes internos de la superficie cruenta, colocar en medio de

transporte y enviar al laboratorio para su siembra y estudio

Toma de muestra profunda: Limpiar la superficie cruenta con suero fisiológico o Ringer,

tomar la muestra con tórula de la parte más profunda de la herida, colocar en medio de

transporte y enviarla al laboratorio.

Si se sospecha anaerobios: Desinfectar con antisépticos la superficie y los bordes de la

herida, aspirar de la zona profunda de la herida 0,5 ml de secreción y enviar en la misma

jeringa sellada al laboratorio, teniendo la precaución de eliminar toda burbuja de aire de su

interior.

Si no es posible aspirar material, introducir tórula en lo más profundo de la herida y

colocarla en tioglicolato. De mayor rendimiento que lo anterior es tomar un trocito de tejido

(6 mm) con pinza estéril y dejarlo caer en el tioglicolato o en suero fisiológico e incluso en

tubo estéril sin ningún preservante.

Abscesos cerrados: Desinfectar el sitio de punción con antiséptico, aspirar material en lo

posible 10 ml y vaciar a tubo estéril para enviar al laboratorio. Si se sospecha de anaerobios

enviar en la misma jeringa sellada, eliminando todo el aire remanente.

COMENTARIO

Las muestras de pus tienen muy mal rendimiento, ya que el pH ácido de este material

destruye rápidamente los microorganismos, siendo difícil su aislamiento posterior a la

siembra.

INFECCIONES SUPERFICIALES DE PIEL Y MUCOSAS

Secreción conjuntival: Limpiar la superficie externa del ojo con suero estéril, frotar con

tórula humedecida el borde interno de la conjuntiva y colocarla en el medio de transporte

para su envío al laboratorio.

Secreción ótica: Limpiar el canal auditivo con jabón antiséptico, tomar la muestra con

tórula estéril y colocarla en el medio de transporte para su envío al laboratorio.

39

Secreción umbilical RN: Tomar muestra directa de la zona umbilical sin previa limpieza,

colocar en medio de transporte y enviar al laboratorio.

COMENTARIO.

Las muestras tomadas por punción ocular u ótica deben ser enviadas en la misma jeringa o

en caldo de cultivo tioglicolato.

INFECCIONES GINECO – OBSTETRICAS

Endocervix: Previo aseo genital, introducir tórula hacia el canal cervical y rotar, colocar la

tórula en medio de transporte y enviar al laboratorio. Si se sospecha de Neisseria

gonorrhoeae (gonococo), inocular en placa de Thayer Martin en Z la que debe ser solicitada

previamente al laboratorio para su siembra inmediata. Enviar al laboratorio en receptáculo

con una fuente que consuma oxigeno.

Endometritis: A través de especulo y previo aseo genital, aspirar muestra con jeringa con

catéter protegido. Enviar de inmediato en la misma jeringa tapada o dejar caer el exudado en

tioglicolato. NO REFRIGERAR.

Douglas: Aspirar por punción del fondo de saco vaginal previo aseo genital. Enviar en la

misma jeringa tapada como para estudio de anaerobios.

Secreciones vaginales: Para estudio bacteriológico y de hongos. A través de un especulo

frotar con tórula estéril la mucosa vaginal e impregnarla de flujo de los fondos de saco,

colocar en medio de transporte y enviar al laboratorio.

Para Trichomonas, introducir suero fisiológico tibio, recoger y vaciar en tubo estéril de 3 a 5

ml. Enviar de inmediato al laboratorio.

Líquido Amniótico: Obtener por punción, previa desinfección con antiséptico y enviar al

laboratorio en la misma jeringa o en tubo estéril entre 5 a 10 ml de muestra.

Placenta y tejidos fetales: Durante el acto quirúrgico, obtener tejido o aspirados. Enviar en

tubo estéril o caldo tioglicolato como para estudio de anaerobios.

Trompas y ovarios: Obtener muestra durante la cirugía y enviar tejido o aspirado de la

misma forma que para estudio de anaerobios.

COMENTARIO

40

En caso de Endometritis Puerperal, los cultivos microbiológicos no son necesarios para su

notificación ya que es suficiente el criterio clínico, por otra parte la etiología es

polimicrobiana y predecible.

En caso de brotes de endometritis puerperal, los cultivos se realizan a fin de detectar

Streptococcus beta hemolitico grupo A u otro agente no habitual.

MUESTRAS DE FLUIDOS, CAVIDADES NORMALMENTE ESTERILES Y

CATETERES

Líquido cefalorraquídeo

Previa desinfección de la zona con antiséptico y con técnica aséptica, obtener entre 2 a 3 ml

de muestra y en tubo estéril enviar de inmediato al laboratorio, si no es posible enviarla al

momento, transitoriamente debe mantenerse a temperatura ambiente. NO REFRIGERAR.

Líquido ascítico

Aspirar idealmente 10 ml de muestra a través de punción abdominal con técnica aséptica,

vaciar a frasco de hemocultivo y simultáneamente 1 ml en tubo estéril seco para tinción en

laboratorio.

Lecha Materna

Limpiar el pezón previo a extracción de la muestra, descartar los primeros ml y recoger entre

2 a 5 ml en tubo estéril. Enviar de inmediato al laboratorio.

Cateter

La cateterización venosa se define como la inserción de un catéter biocompatible en el

espacio intravascular, central o periférico, con el fin de administrar soluciones,

medicamentos, nutrición parenteral, medios de contraste y realizar pruebas diagnósticas,

entre otros.

Para cultivar catéteres vasculares, existen 2 técnicas.

1.- Cortar de forma aséptica la punta del catéter e introducirla en un tubo con caldo corriente.

Esta técnica tiene la desventaja de que no es posible realizar el recuento de colonias, y por lo

cual, no se puede asegurar que en un cultivo positivo en estas condiciones, no corresponda a

una contaminación con flora de piel.

41

2.- Cortar de forma aséptica la punta y el segmento intracutáneo del catéter. Introducir en un

frasco o tubo estéril y enviar al laboratorio antes de 2 horas. En el laboratorio y usando una

pinza estéril, hacer rodar el catéter sobre una placa de agar sangre, al menos 4 veces hacia

adelante y hacia atrás (técnica de Maki). Es una técnica semicuantitativa que permite realizar

el recuento de colonias y, basándose en este recuento, determinar con mayor exactitud si un

cultivo positivo corresponde a contaminación con flora de piel o a infección relacionada con

el catéter.

Catéter venoso central tunelizado. Catéter venoso central implantable. INFECCION GASTRO INTESTINAL (IGI)

Coprocultivos

Introducir tórula limpia en la zona más alterada de las deposiciones recién emitidas (mucus o

sangre) y colocarlas en el medio de transporte (tubo tapa roja). Las muestras pueden tomarse

directamente del recto, del pañal o receptáculo limpio.

Para leucocitos fecales: Enviar deposiciones frescas en tubo limpio y seco sin medio de

transporte. Las muestras tomadas por rectoscopía o colonoscopías tienen mayor rendimiento,

por cuanto de ser posible es recomendable obtener las muestras de esta forma.

Para Clostridium difficile: Enviar 5 a 10 ml de deposiciones recién emitidas en tubo o

frasco limpio y seco.

Aspirado gástrico en RN

Aspirar por sonda nasogástrica de 1 a 3 ml de contenido y colocar en tubo estéril. Sólo se

justifica esta muestra en las primeras 24 horas de vida.

42

FISIOTAXONOMÍA DE BACTERIAS GRAM POSITIVO

La fisiología bacteriana estudia el comportamiento de las bacterias vivas a través de

las alteraciones que se producen en el medio de cultivo. Estas manifestaciones han permitido

establecer diferencias entre ellas, las que han sido utilizadas en su clasificación en diferentes

géneros y especies.

Las técnicas de identificación bioquímica de las bacterias diferencian géneros y especies

bacterianos en base a la detección de:

a. Utilización de fuentes de carbono: Glucosa, Lactosa, Sacarosa, Manitol, Sorbitol,

Citrato.

b. Formación de productos finales o intermediarios del metabolismo microbiano: Indol,

CO2, Ácido sulfhídrico (H2S), Acetilmetilcarbinol.

c. Presencia de enzimas: Catalasa, Ureasa, Oxidasa, Coagulasa.

d. Sensibilidad a compuestos químicos o antibióticos: Bacitracina, Optoquina,

Novobiocina.

Para cocáceas Gram positivo se utilizan fundamentalmente los dos últimos métodos, en

cambio para bacilos Gram negativo se emplean los tres primeros.

En este trabajo se analizarán dos de las Familias de Bacterias Gram positivo más

importantes, como son las Micrococcaceae y Streptococcaceae (figura 1).

La Familia Micrococcaceae comprende los géneros Micrococcus, Staphylococcus y

Planococcus. Son bacterias Gram positivo, esféricas (cocos) agrupadas en racimo. Son

catalasa positivo, reacción que diferencia la Familia Micrococcaceae de otros cocos Gram

positivo como Streptococcus.

43

Las especies del género Micrococcus son saprófitas, se encuentran habitualmente en la piel

de mamíferos, en el suelo y el agua. Tienen metabolismo estrictamente aerobio, a diferencia

de las especies del género Staphylococcus que son aerobios o anaerobios facultativos. Otra

característica que diferencia ambos géneros, es la propiedad de Staphylococcus de fermentar

glucosa en anaerobiosis, no así los Micrococcus que no tienen esta propiedad (Tabla 1).

Las principales especies del género Staphylococcus son: Staphylococcus aureus y

Staphylococcus epidermidis.

Staphylococcus aureus es patógeno para el hombre. Produce una variedad de toxinas y

enzimas responsables de su patogenicidad. Algunas enzimas son:

a. Hialuronidasa: Rompe el cemento celular facilitando la invasión de los tejidos por las

bacterias.

b. Fibrinolisina: Disgrega coágulos de fibrina.

c. Coagulasa: Secretadas al medio extracelular y otras permanecen unidas a membrana,

coagulando el plasma.

d. Nucleasas: Hidrolizan DNA.

Las toxinas producidas por S. aureus causan los síntomas asociados a las enfermedades

estafilocócicas. Estas toxinas son:

a. Alfa toxina: hemolisina que produce lisis total de los glóbulos rojos. Es una proteína

antigénica de peso molecular 30.000.

Agrupación de algunas cocáceas Gram +

44

b. Leucocidina o toxina de Panton - Valentine. Causa desgranulación de los leucocitos y

macrófagos.

c. Exfoliatina: producida por algunas cepas. Causa el síndrome de piel quemada.

d. Enterotoxinas: producida por algunas cepas. Causan intoxicaciones alimentarias.

Aislamiento y Caracterización:

El medio de cultivo utilizado para el aislamiento de S. aureus depende de si la muestra es un

alimento o una muestra clínica.

Para muestras clínicas como pus, heridas, secreciones, etc. se utiliza:

a. AGAR SANGRE: medio enriquecido y diferencial que contiene sangre desfibrinada de

cordero o conejo. Permite el abundante desarrollo de las especies de Staphylococcus y

además visualizar la producción de hemolisinas, por lisis de los glóbulos rojos alrededor de

las colonias (figura 2).

S. aureus: produce halos de hemólisis completa alrededor de las colonias, producida por la

alfa toxina.

S. epidermidis : no produce hemólisis o lo hace débilmente.

Micrococcus: no produce hemólisis.

Tipos de hemólisis en agar sangre

45

TABLA DE IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS GRAM POSITIVO

Cocaceas

Catalasa

Positivo

Test de Bacitracina

Test de Coagulasa Micrococcus

Staphylococcus aureus Staphylococcus

Coagulasa negativo

Test de Novobiocina

S. Coagulasa negativo

No saprophyticus

Staphylococcus

saprophyticus

Hemólisis

Gamma

Bilis Esculina

NaCl 6,5 %

Enterococcus

Negativo

Streptococcus

Observar Hemólisis

Hemólisis

Beta

Test de Latex

Streptococcus

Grupo A, B, C,

D, F, G

Hemólisis

Alfa

Optoquina

resistente

Streptococcus

grupo viridans

Optoquina

sensible

Streptococcus

pneumoniae

Bilis positivo

NaCl positivo

Enterococcus

Bacilos

Catalasa positivo

Aspecto Tinción Gram

Bacilos Grandes

Esporulados

Bordes netos

Bacilo en empalizada

Bacilos finos

Bacillus sp

Corynebacterium sp

Listeria

S R

(+) (-)

R S

Cocaceas

Catalasa

Cocaceas

Catalasa

Positivo

Test de Bacitracina

Test de Coagulasa Micrococcus

Staphylococcus aureus Staphylococcus

Coagulasa negativo

Test de Novobiocina

S. Coagulasa negativo

No saprophyticus

Staphylococcus

saprophyticus

Positivo

Test de Bacitracina

Test de Coagulasa Micrococcus

Staphylococcus aureus Staphylococcus

Coagulasa negativo

Test de Novobiocina

S. Coagulasa negativo

No saprophyticus

Staphylococcus

saprophyticus

Hemólisis

Gamma

Bilis Esculina

NaCl 6,5 %

Enterococcus

Hemólisis

Gamma

Bilis Esculina

NaCl 6,5 %

Enterococcus

Negativo

Streptococcus

Observar Hemólisis

Hemólisis

Beta

Test de Latex

Streptococcus

Grupo A, B, C,

D, F, G

Hemólisis

Alfa

Optoquina

resistente

Streptococcus

grupo viridans

Optoquina

sensible

Streptococcus

pneumoniae

Bilis positivo

NaCl positivo

Enterococcus

Negativo

Streptococcus

Observar Hemólisis

Hemólisis

Beta

Test de Latex

Streptococcus

Grupo A, B, C,

D, F, G

Hemólisis

Beta

Test de Latex

Streptococcus

Grupo A, B, C,

D, F, G

Hemólisis

Alfa

Optoquina

resistente

Streptococcus

grupo viridans

Optoquina

sensible

Streptococcus

pneumoniae

Bilis positivo

NaCl positivo

Enterococcus

Hemólisis

Alfa

Optoquina

resistente

Streptococcus

grupo viridans

Optoquina

sensible

Streptococcus

pneumoniae

Bilis positivo

NaCl positivo

Enterococcus

Bacilos

Catalasa positivo

Aspecto Tinción Gram

Bacilos Grandes

Esporulados

Bordes netos

Bacilo en empalizada

Bacilos finos

Bacillus sp

Corynebacterium sp

Listeria

Bacilos

Catalasa positivo

Aspecto Tinción Gram

Bacilos Grandes

Esporulados

Bordes netos

Bacilo en empalizada

Bacilos finos

Bacillus sp

Corynebacterium sp

Listeria

S R

(+) (-)

R S

46

b) AGAR MANITOL SALADO O MEDIO DE CHAPMAN: medio selectivo y diferencial

que contiene manitol, NaCl al 7,5% y el indicador de pH rojo de fenol. Micrococcus y

Staphylococcus son halotolerantes, es decir, son capaces de crecer en esta concentración de

NaCl. Además se evidencia la fermentación de manitol, la que se observa por el viraje del

indicador a amarillo.

S. aureus: da colonias amarillas cremosas rodeadas de una zona amarilla (producto de la

fermentación)

S. epidermidis: generalmente no fermenta el manitol

Micrococcus: no fermenta el manitol.

En ambos medios (Agar Sangre y Agar Manitol Salado) se debe confirmar mediante tinción de

Gram la presencia de cocos Gram positivo en racimo, ya que otras especies pueden dar

colonias semejantes.

Una vez aisladas las colonias y habiendo observado su aspecto y características en medios

selectivos se realiza las pruebas bioquímicas para confirmar el diagnóstico. Si se sospecha que

la colonia corresponde a Staphylococcus aureus, se realiza la prueba de COAGULASA.

La enzima es un activador del fibrinógeno a fibrina, además, la pared de Staphylococcus

aureus posee receptor de fibrinógeno lo que permite la formación de puentes entre bacteria y

bacteria, formándose un coágulo.

Diferencia Staphylococcus aureus de otros Staphylococcus coagulasa negativo.

Ésta es una prueba de PATOGENICIDAD, la cual se puede realizar de dos formas, según el

tipo de enzima:

a) Técnica en tubo: detecta la coagulasa libre. Consiste en incubar plasma de conejo con

gotas de cultivo líquido de Staphylococcus. La reacción positiva se observa como la aparición

de un coágulo a las 4 horas.

b) Técnica en portaobjeto: detecta la coagulasa unida a membrana. A partir de un cultivo de

Staphylococcus en medio sólido, se hace una suspensión abundante sobre una gota de agua.

Esta suspensión debe ser lo más homogénea posible. Sobre ésta se coloca una o dos gotas de

plasma de conejo y se homogeniza. La reacción positiva se observa como aglutinación de las

bacterias a los 20 segundos. Comercialmente, existe un kit de aglutinación, que será empleado

en el laboratorio.

Test comercial de aglutinación: sirve para diferenciar Staphylococcus aureus de otros

Staphylococcus. La metodología consiste en poner una gota de un reactivo latex sobre un

círculo de la tarjeta; a continuación se emulsiona sobre ésta la colonia sospechosa, se agita

47

durante unos segundos y si hay formación de grumos visibles se considera positiva. Siempre se

debe realizar un control negativo incluído en el kit (figura 3).

Partículas de latex

con anticuerpo Bacterias Aglutinación de las partículas

Anticuerpo (Antígeno específico) = reconocen el antígeno bacteriano.(proteína A)

A su vez el Género Streptococcus corresponde a cocos Gram positivos, anaerobios facultativos

que se disponen en pares o cadenas y son catalasa negativo reacción que los diferencia de la

Familia Micrococcaceae. Bajo ciertas condiciones de cultivo las células son ovoides o

alargadas. Se encuentran en diferentes superficies y mucosas del hombre y de algunos animales

como cavidad oral, faringe, piel, tracto intestinal. Algunas especies son utilizadas en la

industria lechera para la elaboración de quesos, leches fermentadas y yoghurt (Streptococcus

lactis).

Los miembros del género Streptococcus se clasifican de acuerdo a:

1.- ACTIVIDAD HEMOLÍTICA: según el tipo de hemólisis que presenten al ser cultivadas

en placas de agar sangre de conejo o de cordero.

a) Beta hemolíticos: producen halos limpios de hemólisis alrededor de las colonias.

b) Alfa hemolíticos: producen halos de hemólisis incompleta de color verdoso (S. viridans)

alrededor de las colonias.

c) Gama hemolíticos: no producen hemólisis

48

2.-SEGÚN CONSTITUCIÓN ANTIGÉNICA DE LA PARED CELULAR: clasificación

de Lancefield. Se basa en la composición química y antigénica de un hidrato de carbono

presente en la pared celular y permite clasificar a los estreptococos en grupos serológicos que

van desde la A hasta la U.

Ambas clasificaciones se asocian entre sí, así tenemos por ejemplo estreptococos beta

hemolíticos del grupo A como Streptococcus pyogenes, que es el más patógeno del género.

Streptococcus pyogenes produce varias toxinas y enzimas responsables de su poder patógeno.

Es el agente causal de infecciones locales purulentas como amigdalitis, faringitis, otitis, etc.

Además provoca enfermedades sistémicas como fiebre puerperal y escarlatina.

Streptococcus pneumoniae o pneumococo es otra especie importante de este género, agente

causante de neumonia lobar en el hombre. Es un diplococo no perfectamente esférico, tiene

forma de cabeza de lanza (lanceolado). Su forma virulenta se encuentra rodeada por una

cápsula. Es habitante normal de la faringe del hombre. Para su aislamiento las placas deben

incubarse en un ambiente con 10% de CO2. En agar sangre S. pneumoniae presenta alfa

hemólisis y las colonias son planas con forma de fichas de damas.

Estreptococos fecales o enterococos (por ejemplo Enterococcus faecalis, Enterococcus

faecium). Existen otras especies de Streptococcus que habitan el intestino del hombre y

animales y se les conoce con el nombre de estreptococos fecales o enterococos. Se caracterizan

porque generalmente son no hemolíticos y pueden crecer en condiciones de alta salinidad

(NaCl 6,5%), pH básico (pH 9,6) y presencia sales biliares en que otros estreptococos no

pueden hacerlo. Su presencia en alimentos o agua indica contaminación fecal.

Aislamiento y Caracterización:

El aislamiento de Streptococcus pyogenes se efectúa sembrando la muestra sobre una placa de

agar sangre. Streptococcus pyogenes presenta las siguientes características:

1. Hemólisis en placa de agar sangre. Se observa hemólisis limpia alrededor de las colonias,

las cuales son muy pequeñas.

Se debe confirmar mediante tinción de Gram la presencia de cocos Gram positivo en cadena,

ya que otras especies pueden dar colonias semejantes, por ejemplo Staphylococcus. Una vez

confirmada su presencia se realiza pruebas adicionales para confirmar el diagnóstico.

a) Prueba de sensibilidad a Bacitracina. Los estreptococos beta hemolíticos del grupo A

(Streptococcus pyogenes) son sensibles a Bacitracina, esta prueba se realiza en forma similar a

un antibiograma. Otros estreptococos también son sensibles, sin embargo no son beta

hemolíticos.

49

b) Pruebas serológicas. El diagnóstico de Streptococcus pyogenes se debe confirmar mediante

reacciones serológicas con antisueros específicos para el antígeno superficial.

c) Bilis/Esculina, NaCl 6,5%:

Los Enterococcus crecen en presencia de NaCl 6.5%, toleran las salas biliares y pueden

hidrolizar la esculina. Estas propiedades se pueden usar para distinguir los Enterococcus de

otros cocos gram (+) catalasa-negativo. En la prueba positiva, el tubo donde está el medio se

torna de color chocolate oscuro, característico al desdoblar la bilis esculina.

d) Test de CAMP. La sigla CAMP proviene de Christie, Atkins, Munch y Petersen, los

descubridores del fenómeno

La mayoría de los Streptococcus grupo B producen una proteína extracelular difusible (factor

CAMP), la que actúa sinérgicamente con la beta-hemolisina producidas por algunas cepas de

Staphylococcus aureus causando la hemólisis de los eritrocitos. Sobre una placa de agar sangre

se inocula los Streptococcus en estudio trazando estrías perpendiculares a una estría central de

Staphylococcus aureus. Tras la incubación se observa la presencia de una zona hemolítica en

forma de punta de flecha en el área de intersección, donde el factor CAMP y la beta-hemolisina

han difundido (prueba de CAMP positiva). Aproximadamente el 95% de los Streptococcus del

grupo B y de forma ocasional unas cepas de otros grupos son CAMP-positivos.

Test de susceptibilidad a agentes antimicrobianos:

Método de Difusión en Agar o Kirby-Bauer

Se utiliza para determinar la sensibilidad in vitro de las bacterias a los distintos

antimicrobianos. Este método cualitativo se basa en la inoculación del microorganismo sobre

50

una placa de agar donde se coloca discos de papel filtro estériles impregnados con una

concentración conocida de antibiótico.

Para que los resultados sean confiables y reproducibles es necesario estandarizar algunas

condiciones de laboratorio:

a) Concentración de bacterias que se siembra. Requiere uso de estándares de turbidez: Mac

Farland 0.5

b) Medio de cultivo utilizado: Agar Müller-Hinton o agar Müller-Hinton Sangre para

Streptococcus

c) Concentración del antimicrobiano en el disco: característica para cada antimicrobiano.

d) Temperatura (37°C), tiempo de incubación (16-24 horas) y atmósfera de incubación (en O2)

A partir de una colonia aislada (es absolutamente necesario un cultivo puro), se prepara una

suspensión bacteriana con una turbidez equivalente a un Mac Farland 0.5. La siembra de la

suspensión debe ser homogénea sobre el agar (figura 4).

El antibiótico en los discos difunde radialmente durante la incubación de tal manera que a

medida que se aleja del disco, la concentración disminuye. En un punto determinado, la

concentración del antibiótico no podrá inhibir el crecimiento del microorganismo,

produciéndose entonces una zona circular de inhibición (halo de inhibición) alrededor del

disco. El diámetro del área de inhibición puede ser convertido a las categorías de

“susceptible”, “intermedio” o “resistente” de acuerdo a las tablas publicadas por el

“National Committee for Clinical Laboratories Standars (NCCLS)”.

Figura 4: Antibiograma mediante la técnica de

difusión con discos

Bacitracina: Se siembra una placa de agar sangre homogéneamente. Se coloca un disco de

bacitracina, se incuba 16-24 horas y después se mide el tamaño del halo.

51

Se considera sensible cuando existe un halo de inhibición ≥10 mm de diámetro y resistente

cuando el halo de inhibición es < 10 mm de diámetro.

Micrococcus es sensible a bacitracina.

Staphylococcus es resistentes a bacitracina.

Optoquina: compuesto químico que pone a prueba la fragilidad de la membrana celular

bacteriana. A bajas concentraciones (5g/ml) permite diferenciar Streptococcus pneumoniae

(sensible) de otros Streptococcus hemolíticos. El disco de Optoquina se deposita en una placa

de agar sangre, sembrada homogéneamente con la colonia sospechosa. Se incuba a 37°C por

24 horas. Si el halo es 14 mm, corresponde a Streptococcus pneumoniae.

Novobiocina: antibiótico activo por vía oral. Se utiliza para el tratamiento de infecciones por

S. aureus e infecciones urinarias resistentes a otros fármacos. Es bacteriostática e interfiere con

la síntesis de la pared bacteriana. Este fármaco se utiliza muy poco debido a que su uso está

asociado a una alta incidencia de reacciones adversas y a que frecuentemente emergen cepas

resistentes. Se considera sensible cuando existe un halo de inhibición ≥16 mm de diámetro y

resistente cuando el halo de inhibición es < 16 mm de diámetro.

Amoxicilina / Ácido Clavulánico: esta asociación se indica para el tratamiento a corto plazo

de infecciones bacterianas en las siguientes localizaciones, cuando se sospecha que están

causadas por cepas resistentes a Amoxicilina y productoras de beta-lactamasas. En otras

situaciones, debería considerarse la Amoxicilina sola.

Infecciones del tracto respiratorio superior; en particular sinusitis, otitis media, amigdalitis

recurrente. Estas infecciones son a menudo producidas por Streptococcus pneumoniae,

Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis y Streptococcus pyogenes.

Infecciones del tracto respiratorio inferior, en particular exacerbaciones agudas de

bronquitis crónicas, bronconeumonia. Éstas son a menudo producidas por Streptococcus

pneumoniae, Haemophilus influenzae y Moraxella catarrhalis.

Infecciones del tracto genitourinario e infecciones abdominales, en particular cistitis

(especialmente cuando sea recurrente o complicada, excluyendo prostatitis), aborto séptico,

sepsis pélvica o puerperal y sepsis intraabdominal. Son a menudo producidas por

52

Enterobacterias (principalmente Escherichia coli, Staphylococcus saprophyticus spp. y

Enterococcus spp.)

Infecciones de la piel y tejidos blandos, en particular celulitis, mordeduras de animales y

abscesos dentales con celulitis diseminada que son a menudo producidas por Staphylococcus

aureus, Streptococcus pyogenes y Bacteroides spp. Algunas cepas de estos gérmenes producen

beta-lactamasas, de modo que no responden a Amoxicilina sola.

NOTA: Lea el procedimiento por completo antes de comenzar a trabajar

ACTIVIDADES PRÁCTICAS

Objetivos

1. Conocer la importancia de una buena toma de muestra

2. Conocer y practicar el procesamiento microbiológico de cocáceas Gram positivo aisladas a

partir de muestras clínicas así como de flora normal

3. Realizar pruebas bioquímicas para la identificación de cocáceas Gram positivo

4. Identificar cepas bacterianas Gram positivo, provenientes de muestras clínicas.

5. Realizar estudios de susceptibilidad a agentes antimicrobianos.

I. MUESTRAS CLÍNICAS

1. Observe la placa sembrada con su muestra clínica. Describa macroscópicamente las colonias

bacterianas. Observe si se trata de cultivos puros.

2. Realice una tinción de Gram y describa microscópicamente su muestra. Observe al

microscopio con aumento 100X oil.

Recuerde que en el caso de cocáceas Gram + es de suma relevancia conocer la agrupación

bacteriana y el tipo de hemólisis para el diagnóstico.

53

3. Realice las pruebas bioquímicas correspondientes según la tabla de identificación de

bacterias Gram positivo.

a. Catalasa: Busca la presencia de la enzima catalasa, que descompone el H2O2 en H2O y O2.

La enzima se encuentra en la mayoría de las bacterias que contienen citocromo. La excepción

es Streptococcus que no puede descomponer el H2O2. El test permite diferenciar

Staphylococcus, Micrococcus y Listeria, todos ellos catalasa +, de Streptococcus, catalasa -.

Procedimiento Prueba de la catalasa

a) Ponga sobre el portaobjeto una gota de H2O2

b) Con un palillo desechable tome la colonia en estudio y agréguela a la gota en el portaobjeto.

La aparición rápida y sostenida de burbujas (antes de 20 segundos) indica test (+).

Precauciones: no tocar ni sacar agar sangre al tomar la colonia ni usar asa de platino, ya que

estas sustancias dan falsos positivos.

c) Anote lo observado y compare con su resultado del Gram.

d) Elimine el portaobjeto y el palillo en los recipientes respectivos

b. Coagulasa: Busca la presencia de la enzima coagulasa producida por Staphylococcus

aureus.

Procedimiento Prueba de la Coagulasa:

a) Tome una tira reactiva y agregue una gota de cada reactivo en las zonas marcadas.

b) Con un palillo plástico tome varias colonias desde el agar.

c) Mezcle con la solución de anticuerpos del Test de aglutinación (plasma de conejo).

54

d) Espere unos minutos agitando constantemente con el palillo.

e) Si existe la presencia de coágulos (apariencia de “leche cortada”), la reacción es positiva. Si

se ve siempre homogéneo, la reacción es negativa.

f) Anote lo observado e identifique al patógeno presente en su muestra.

c. Test de CAMP para Streptococcus

Permite confirmar la presencia de Streptococcus tipo B por la producción de una zona de

hemólisis característica cuando crece en la proximidad de Staphylococcus aureus, lo que se

denomina “punta de lanza” (Ver figura adjunta)

Procedimiento Test de CAMP:

a) Sobre una placa de agar Sangre realice con el asa una única estría en el centro a partir de un

cultivo de Staphylococcus aureus.

b) Perpendicular a la estría original, realice con el asa una o más estrías con su muestra clínica.

c) Incubar a 37ºC por 24 horas.

d. Identificación de Streptococcus β hemolítico por aglutinación con látex:

Consiste en la identificación de los distintos grupos de Streptococcus β hemolítico grupo A, B,

C, D, F y G.

Procedimiento prueba de aglutinación con látex:

a) Agregue 1 gota de cada reactivo de látex en cada uno de los 6 pocillos de la tarjeta de

aglutinación.

b) Tome dos a tres colonias β hemolíticas que quiera identificar. Recuerde que deben

pertenecer a un cultivo puro y al Gram ser cocáceas gram (+) en cadenas.

55

c) Mezcle y agite circularmente las colonias en cada pocillo de la tarjeta durante 1MINUTO

4. Realice el Test de difusión por disco. Sensidiscos.

a) Con el asa tome una colonia aislada desde la placa de Agar sangre y siémbrela en el tubo de

suero fisiológico estéril hasta que quede turbio. Compare con el standard 0,5 Mac Farland.

b) Tome la tórula estéril y (sin flamearla!!!!) sumérjala en el caldo recién inoculado. Flamee la

boca del tubo y cierre.

c) Deslice la tórula sobre toda la superficie del agar Müller-Hinton (Staphylococcus) o agar

Müller-Hinton Sangre (Streptococcus). Al terminar elimine la tórula en el recipiente apropiado.

d) Tome la pinza estéril y flaméela brevemente. Tome con cuidado cada uno de los sensidiscos

(5 en total) y distribúyalos homogéneamente en la placa, cuidando de que no queden

demasiado cerca del borde de ella ni demasiado cerca entre sí.

e) Incubar a 37ºC por 24 horas.

RECUERDE que la elección de los sensidiscos dependerá del patógeno que haya identificado

en su muestre clínica.

Nota: Asegúrese de flamear las pinzas cada vez que tome un sensidisco y enfríe en la tapa de

la placa antes de sacar uno. NO FLAMEE los frascos con los sensidiscos.

Trate de no tocar el agar al poner los discos, sólo déjelos caer desde cerca y presiónelos

suavemente contra el agar con la pinza (sin hundirlos!!!).

Lectura e interpretación del Test de Sensidiscos

a) Observe los halos de inhibición y mida el diámetro de estos para determinar si la bacteria es

“susceptible”, “intermedio” o “resistente” con respecto a los antibióticos dispuestos en el agar.

Compare con la Tabla adjunta, según corresponda.

b) Anote sus observaciones.

5. Procesamiento de una muestra clínica de catéter venoso con técnica de Maki

a) En una placa de Agar Sangre, siembre con técnica de Maki la muestra de catéter venoso

entregada.

Utilice pinza estéril e incube a 37ºC por 24 hrs.

b) Describa macroscópicamente las colonias obtenidas.

c) Observe si se trata de un cultivo puro. Realice recuento de colonias bacterianas.

56

d) Realice una tinción de Gram y describa microscópicamente su muestra. Observe al

microscopio con aumento 100X oil.

e) Realice las pruebas bioquímicas correspondientes según la tabla de identificación de

bacterias Gram positivo.

II. FLORA NORMAL

1. Para el estudio de flora normal tómese una muestra bucoranfingea, nasal o de piel con una

tórula estéril previamente humedecida con suero fisiológico y siembrela en agar sangre. Sólo el

primer cuadrante se siembra con la tórula y el resto con asa previamente flameada para poder

obtener colonias aisladas. Incube esta placa a 37ºC por 24 horas.

2. Escoja la colonia aislada y más representativa de su cultivo. Descríbala macroscópicamente

y microscópicamente.

3. Sugiera un posible agente presente en su muestra, dependiendo, por ejemplo de la zona de la

muestra, características de crecimiento y sus observaciones.

Interpretación de los halos de Inhibición para Staphylococcus spp (Agar Mueller –Hinton)

DROGA CONTENIDO DEL DISCO

SENSIBLE (Halo en mm)

INTERMEDIA (Halo en mm)

RESISTENTE (Halo en mm)

Observaciones

Oxacilina 1 µg ≥13 11-12 ≤10 Para S. aureus Eritromicina 15 µg ≥23 14-22 ≤13 Clindamicina 2 µg ≥ 21 15-20 ≤14 Vancomicina 30µg ≥15 - -

Interpretación de los halos de Inhibición para Streptococcus ββββ-hemolíticos y Enterococcus (Mueller-Hinton con sangre de cordero) DROGA CONTENIDO

DEL DISCO SENSIBLE (Halo en mm)

INTERMEDIA (Halo en mm)

RESISTENTE (Halo en mm)

Penicilina 10 unidades ≥ 28 20-27 ≤19 Eritromicina 15 µg ≥21 16-20 ≤15 Clindamicina 2µg ≥19 16-18 ≤15 Vancomicina 30µg ≥17 - -

57

Interpretación de los halos de Inhibición para Streptococcus pneumoniae (Mueller-Hinton con sangre de cordero) DROGA CONTENIDO

DEL DISCO SENSIBLE (Halo en mm)

INTERMEDIA (Halo en mm)

RESISTENTE (Halo en mm)

Penicilina 1 µg de oxacilina ≥20 Eritromicina 15 µg ≥21 16-20 ≤15 Trimet/sulfame 1.25/25.75µg ≥19 16-18 ≤15 Vancomicina 30µg ≥17 - -

58

El grupo de las Enterobacterias, nombre común utilizado para referirse a la Familia

Enterobacteriacea,

incluye a bacilos Gram (-), aerobios y anaerobios facultativos, la mayoría de ellos móviles

mediante flagelos perítricos, que como característica microbiológica fenotípica común tienen la

capacidad de fermentar la glucosa y reducir los nitratos a nitritos.

Tienen como habitat el intestino de animales inferiores y del hombre. Tienen además una

amplia distribución en el ambiente, se encuentran en el suelo, agua, plantas y algunas especies

de esta familia, como Proteus, cumplen una función ecológica importante: inician en el

ambiente la degradación de la materia orgánica y por este comportamiento se relaciona con un

ciclo de vida netamente ambiental, son saprófitos.

Entre las numerosas especies que constituyen esta familia, encontramos algunos grupos que en

su relación con el hospedero humano son comensales, como es el caso de Escherichia coli, un

constituyente importante de la microbiota intestinal normal aerobia, especialmente a nivel de la

porción distal del intestino delgado y fundamentalmente a nivel del intestino grueso. En esta

localización la presencia de E. coli resulta en un beneficio para el hospedero, pues como parte

de su metabolismo se sintetizan vitaminas y también participa en la degradación de ácidos y

sales biliares. Debido a la presencia masiva de E. coli a nivel intestinal, su detección se utiliza

como marcador de contaminación fecal, por ejemplo se ha establecido un Índice coli para

evaluar la calidad microbiológica del agua potable o de alimentos. Si el índice coli sobrepasa la

norma considerada aceptable significa que existe contaminación fecal e indirectamente se

deduce que el agua o el alimento, según sea el caso, puede contener patógenos intestinales.

Otros integrantes de este grupo en cambio son patógenos intestinales como el género

Salmonella, Shigella, Yersinia y un subgrupo de E. coli con factores de virulencia específicos

que afectan el intestino y por ello se denominan E. coli diarreogénicos. Estos grupos o géneros

bacterianos causan infecciones gastrointestinales que pueden expresarse clínicamente como

diarrea acuosa, diarrea con sangre (también denominada diarrea enterocólica o síndrome

disentérico) y en algunos casos a partir de la infección intestinal estas bacterias pasan al

TRABAJO PRÁCTICO N°4

FISIOTAXONOMÍA DE BACTERIAS GRAM NEGATIVO

59

torrente sanguíneo y se puede producir una infección sistémica o bacteremia, como por

ejemplo la fiebre tifoidea.

En el laboratorio de Microbiología el análisis de una muestra clínica o ambiental sigue, por lo

general, la siguiente secuencia:

a) Toma de muestra

b) Siembra y obtención del microorganismo aislado (cultivo puro)

c) Observación de morfología macroscópica

d) Tinciones y observación de morfología y agrupación microscópica.

e) Identificación fisiotaxonómica (reacciones metabólicas específicas) con batería bioquímica

convencional y Sistema estandarizado API 10S

f) Estudios de sensibilidad a agentes antimicrobianos.

La fisiotaxonomía bacteriana estudia el comportamiento de las bacterias vivas frente a distintos

medios de cultivo a través de las alteraciones que producen en estos medios. Estas alteraciones,

son producidas por enzimas específicas de las diferentes bacterias, ya que no todos los

microorganismos poseen los mismos requerimientos nutricionales y las mismas rutas

metabólicas. De este modo esta técnica taxonómica se basa principalmente en la detección de:

a) Utilización de distintas fuentes de carbono.

b) Formación de productos finales.

c) Presencia de enzimas.

d) Sensibilidad a productos químicos o antibióticos.

La identificación de una cepa bacteriana aislada puede realizarse utilizando diferentes ensayos

bioquímicos que generalmente determinan la actividad de una vía metabólica (conjunto de

reacciones químicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la

bacteria al crecer transforma o no.

Las pruebas o ensayos bioquímicos, son pruebas simples que se han desarrollado para

demostrar en forma clara una característica bioquímica como la presencia o ausencia de una

determinada actividad enzimática, grupo de enzimas o vía metabólica, crecimiento a una

determinada temperatura, crecimiento en presencia de inhibidores, etc. No significan de

ninguna manera un estudio profundo del metabolismo bacteriano.

Para llevarlas a cabo, se puede utilizar diversos sistemas de trabajo (medio de cultivo,

indicador, revelador, etc.) que puede ser diferente aún para el mismo ensayo si se trata de

distintos microorganismos. Por ejemplo, se debe suplir con factores de crecimiento el medio de

60

cultivo para estudiar la fermentación de distintos azúcares cuando se sabe que el

microorganismo en estudio es exigente.

A la determinación de la especie se puede llegar según diversos sistemas (manuales de

identificación, comerciales, etc.). Los sistemas comerciales utilizan modificaciones de las

pruebas bioquímicas convencionales, ya sea sustratos deshidratados, tiras de papel de filtro

impregnadas en reactivos o pequeños compartimentos con medios listos para sembrar. En

todos los casos se emplean códigos numéricos para la interpretación de resultados.

I. Batería bioquímica convencional para diagnóstico microbiológico

1. Agar tendido corriente: medio sólido nutritivo, que permite observar posible pigmentación

en las colonias.

2. Agar Urea de Christensen: medio sólido en el que se puede observar la presencia de la

enzima Ureasa, ya que contiene además de nutrientes básicos:

• Triptona.

• Urea.

• Indicador de pH fenolftaleina.

Esta prueba se basa en la capacidad de algunas bacterias, que poseen la enzima ureasa, de

degradar urea a amoníaco y CO2. Esta reacción es fácilmente evidenciable, porque el pH varía

hacia alcalino debido al efecto del amoníaco. Este cambio se observa por viraje del indicador

de pH como Fenolftaleína (Figura 1)

61

Figura 1: resultados medio Urea Figura 2: resultados

medio Citrato

3.- Agar Citrato: Este medio de cultivo contiene, además de sales minerales:

• Fosfato de amonio.

• Citrato de sodio, como única fuente de carbono.

• Indicador de pH azul de bromo timol (verde a pH neutro, azul a pH alcalino).

62

En este medio sólo pueden desarrollarse aquellas bacterias que poseen la enzima Citrato

Permeasa, la que les permite transportar el citrato a través de la membrana citoplasmática.

Una vez en el interior de la célula, el ión citrato es metabolizado a través del ciclo de los ácidos

tricarboxílicos (Figura 2)

4. Agar TSI: Las bacterias pueden utilizar azúcares (hidratos de carbono) a través de varias

rutas metabólicas. Los productos finales de estas reacciones dependerán de cada bacteria, del

azúcar utilizado y de la ruta metabólica. En general estos productos serán ácidos (fórmico,

pirúvico, láctico, etc.) y gases (CO2, H2). Existen muchos medios de cultivo que se han

diseñado con el objeto de detectar la producción de ácido y gas a partir de distintos azúcares.

El Agar TSI (Triple Sugar Iron) es un medio rico que contiene los nutrientes necesarios para el

crecimiento de las bacterias y que permite visualizar la utilización de azúcares. Contiene

además de nutrientes como extracto de carne, extracto de levadura, peptona, etc:

• Glucosa al 0,1%

• Lactosa al 1,0%

• Sacarosa al 1,0%

• Citrato de amonio.

• Hierro.

• Indicador de pH rojo de fenol (Amarillo pH ácido; Rojo pH alcalino).

a. Si la bacteria inoculada es fermentadora sólo de glucosa usará ésta y se obtiene sólo una

pequeña cantidad de ácido, la que en las primeras 8 a 12 horas de incubación es suficiente para

conventir ambas porciones (tendido y profundo) a un color amarillo. Dentro de las próximas

horas, sin embargo, la glucosa sobrante es completamente agotada y la bacteria comienza la

degradación oxidativa de los aminoácidos en el tendido del tubo, donde hay oxígeno, lo que

lleva a la liberación de aminas que neutralizan las pequeñas cantidades de ácido presente en el

tendido, y en 18 a 24 horas este tendido cambia a pH alcalino y vuelve a color rojo. En la

porción profunda (anaeróbica) del tubo, la degradación de aminoácidos es insuficiente para

neutralizar el ácido formado, y el medio permanece amarillo. Si el TSI es inoculado con un

organismo fermentador de glucosa y lactosa o sacarosa, aún cuando la glucosa se agota en las

primeras 8 a 12 horas, la fermentación continúa ya que el organismo es capaz de usar lactosa o

sacarosa. Así, a las 18 a 24 horas, ambas porciones están amarillas.

63

b. Si se produce gas se observará como quiebres en el agar o separación de la columna de agar

del fondo del tubo.

c. Para la detección de H2S, el cual es incoloro, el medio incluye un indicador. El tiosulfat de

sodio es la fuente de átomos azufre en la mayoría de los medios usados para la producción de

H2S. Sales de fierro (Sulfato ferroso y citrato férrico amoniacal) incorporadas en el medio de

cultivo reaccionan con sulfuro de hidrógeno para producir un precipitado negro insoluble

(sulfuro ferroso) este reacciona con la sal de hierro dando sulfato ferroso, un compuesto

insoluble de color negro. (Figura 3)

Figura 3: resultados medio TSI C: Control negativo 1: Desaminación (+), fermentación glucosa, lactosa y sacarosa (-), producción de H2S (-). 2: Desaminación (+), fermentación glucosa (+), lactosa y sacarosa (-), producción de H2S (-). 3: Desaminación (+), fermentación glucosa (+), lactosa y sacarosa (-), producción de H2S (+). 4: Desaminación (+), fermentación glucosa, lactosa y sacarosa (+), producción de H2S (-). 5: Desaminación (+), fermentación glucosa, lactosa y sacarosa (+), producción de H2S (+).

5. Agar LIA: Las distintas bacterias poseen enzimas inducibles que pueden actuar sobre

algunos aminoácidos, desaminándolos o decarboxilándolos. Ejemplo de estas reacciones

enzimáticas son: decarboxilación de Lisina y desaminación de Lisina.

Otro efecto de las bacterias sobre aminoácidos azufrados es la remoción del grupo -hSH2,

produciendo H2S (reacción que se observa también en el medio TSI).

Este medio contiene además de nutrientes como peptona y extracto de levadura:

• Aminoácido lisina

64

• Aminoácidos azufrados

• Glucosa

• Citrato de hierro y amonio

• Indicador de pH púrpura de bromocresol (Amarillo a pH ácido, morado a pH alcalino).

a. La bacteria primero utiliza la glucosa produciendo ácido por lo que el pH baja y el indicador

vira a amarillo. Si la bacteria NO PRODUCE lisina decarboxilasa se mantendrá esta

coloración amarilla (reacción K/A, negativa). Si la bacteria PRODUCE la enzima lisina

decarboxilasa, la cual remueve el grupo COOH de la lisina dando como producto CO2 y una

diamina (alcalina), entonces el indicador vira nuevamente hacia el lado alcalino y se revierte el

viraje de amarillo a morado (reacción K/K, positivo). Si la bacteria es capaz de desaminar a la

lisina, la superficie se verá roja y el fondo amarillo (reacción R/A).

b. Si la bacteria produce H2S éste reacciona con la sal de hierro formando sulfuro ferroso

(negro). (Figura 4)

Figura 4: resultados medio LIA

6. Medio MIO: Permite observar motilidad.

a. Si el crecimiento bacteriano se observa como el enturbamiento completo del medio, la

reacción es positiva. Si sólo se limita al pinchazo, es negativa.

b. También es posible observar la presencia de la enzima ornitina descarboxilasa, que participa

en el metabolismo de varios aminoácidos en algunas bacterias. La reacción positiva se observa

por el color morado del tubo; en cambio, si la reacción es negativa el medio se torna amarillo

(puede ponerse morado el fondo).

65

c. Además, se puede observar la presencia de indol, para lo cual hay que agregar una gota de

reactivo de Kovacs. En este caso, la reacción positiva será la aparición de un aro rojo sobre la

superficie del medio.(Figura 5)

Figura 5: resultados medio MIO (Los pares están organizados sin y con reactivos de Kovacs)

1: Motilidad (-), ornitina descarboxilasa (-), indol (+) (anillo fucsia)

2: Motilidad (+), ornitina descarboxilasa (+), indol (-) (anillo amarillo)

3: Motilidad (+), ornitina descarboxilasa (+), indol (+).

II. Sistemas comerciales usados en la identificación de Enterobacterias

2.1- API 10S:

Sistema de identificación estandarizado para Enterobacterias y otros bacilos Gram negativos,

como algunos no fermentadores (Pseudomonas, Acinetobacter) que utiliza 11 pruebas

bioquímicas que usan sustratos deshidratados.

2.2- SensIdent

Es un sistema semiautomatizados que permite identificar bacilos gram negativos fermentadores

y no fermentadores de glucosa. La identificación se hace mediante pruebas bioquímicas las que

vienen liofilizadas en placas de microtitulación y se rehidratan con la suspensión bacteriana.

2.3 VITEK

Es un sistema automatizado (Bio-Merieux). La identificación de los bacilos gram negativos

fermentadores y no fermentadores de glucosa se hace a través de pruebas bioquímicas que

66

vienen incluidas en tarjetas de identificación. Los tiempos de incubación varían entre 2 y 15

horas. El sistema vitek determina si cada pocillo es positivo o negativo midiendo la turbidez

mediante un lector óptico. Cuando finaliza el periodo de incubación, las reacciones son

analizadas automáticamente y la identificación es impresa.

3. Oxidasa

Busca la presencia de la enzima citocromo oxidasa y consiste en colocar directamente la

colonia sospechosa en el extremo de una varilla que contiene un reactivo oxidable. La reacción

es positiva cuando aparece un color púrpura después de 1 min.

Esta prueba es positiva para Neisserias y para bacilos Gram negativos no fermentadores y es

negativa para Enterobacterias.

4. Susceptibilidad a Antibióticos

Los antibióticos son agentes terapéuticos producidos por organismos vivos, que inhiben o

destruyen a los agentes infecciosos. Los ensayos de susceptibilidad están indicados para apoyar

la terapia antimicrobiana de tratamiento en procesos infecciosos por bacterias en las que la

identidad del microorganismo no es suficiente para predecir en forma confiable su

susceptibilidad. Estos ensayos son a menudo indicados cuando se piensa que el organismo

causante pertenece a una especie capaz de mostrar resistencia a los agentes antimicrobianos

más comúnmente usados.

Los métodos de susceptibilidad antimicrobiana o antibiogramas son métodos que determinan in

vitro la sensibilidad de los microorganismos a una variedad de agentes antimicrobianos bajo

condiciones específicas y estandarizadas.

67

Actividades Prácticas

Objetivos

1. Realizar pruebas bioquímicas convencionales para la identificación de bacterias Gram

negativo.

2. Reconocer alteraciones producidas en los medios de cultivo, por la presencia de productos

intermediarios o finales, debido a la acción bacteriana.

3. Realizar test comercial API 10S, para la identificación de bacterias Gram negativo.

4. Realizar prueba de susceptibilidad antimicrobiana por difusión en agar.

5. Identificar el agente etiológico (Género y especie) presente en una muestra clínica.

Actividades

1. Observe las placas de Agar Mac Conkey sembradas y describa las colonias bacterianas.

Verifique si se trata de cultivos puros.

2. Realice una tinción de Gram a su muestra. Observe al microscopio y describa.

3. Siembra de Batería Bioquímica Convencional y sistema de identificación comercial API

10S. No olvide anotar el número de muestra.

4. Realice prueba de susceptibilidad (Antibiograma).

3a. Pruebas bioquímicas convencionales

Cada grupo contará con una batería convencional compuesta por 6 tubos. Para sembrar la

batería se debe seguir las siguientes indicaciones:

a. Flamear el asa para su esterilización.

b. Tomar una colonia aislada de la placa de agar MacConkey con la muestra a estudiar.

68

c. Flamear la boca del tubo con caldo estéril o suero fisiológico, sumergir el asa con cuidado y

agitar. Repetir hasta una densidad igual a 0.5 Mac Farland.

d. Flamear el asa para su esterilización. El caldo recién sembrado será utilizado como inóculo

para sembrar toda la batería.

e. Antes de empezar, anotar los colores de los distintos medios. Esto le servirá para hacer una

comparación con el resultado final.

f. Para cada tubo de la batería el asa debe ser esterilizada previamente y enfriada en las paredes

del tubo antes de sumergirla en el caldo inoculado.

Posteriormente siembre en los medios teniendo en cuenta que:

1. Los medios semitendidos (Agar TSI y LIA) se deben sembrar en profundidad y en

superficie, es decir, atravesándolos hasta el fondo con el asa en punta, y luego en zig-zag por la

superficie.

2. Los medios tendidos (Agar Citrato, Agar Urea y Corriente) se siembran sólo en la superficie,

es decir, se realiza un zig-zag con un asa convencional (en argolla).

3. Los caldos se siembran agitando el asa con el inóculo dentro del tubo con el medio.

4. Los medios semisólidos (agar MIO) se siembran sólo en profundidad con un asa en punta,

pinchando el agar hasta la mitad del tubo aproximadamente.

LECTURA E INTERPRETACIÓN DE LA BATERÍA.

Una vez que la batería es sembrada, se incuba a 37ºC para que los microorganismos crezcan y

produzcan los cambios en los distintos medios. Posteriormente los resultados se “leen” y se

comparan con las Tablas de Resultados adjuntas.

Lectura Batería Bioquímica

Agar Urea

Reacción positiva : El agar se torna fucsia.

Reacción negativa : El agar no cambia de color.

Agar Citrato

Reacción positiva : Viraje del indicador de pH a color azul (alcalino).

Reacción negativa : El agar permanece de color verde (neutro).

69

Agar TSI

Utilización de glucosa : Superficie roja (pH alcalino). Se anota K

Fondo amarillo (pH ácido). Se anota A

Utilización de lactosa : Fondo y superficie amarilla (pH ácido). Se anota A/A

Reacción negativa : El tubo no varía de color. Se anota K/K.

Producción de gas : Ruptura de la columna de agar. Indica reacción positiva

Producción de H2S : Ennegrecimiento del agar. Indica reacción positiva

Agar LIA

Decarboxilación de lisina positivo : todo el tubo morado (alcalino). Se anota K/K

Decarboxilación de lisina negativo : superficie morada (alcalina). Se anota como K

fondo amarillo (ácido). Se anota como A

Desaminación de lisina positivo : superficie roja. Se anota R

fondo amarillo. Se anota A

Desaminación de lisina negativo : no hay cambio. Se anota A/A

Producción de H2S : ennegrecimiento del agar. Indica reacción positiva

Medio MIO

Motilidad positiva : crecimiento bacteriano produce opalescencia del medio.

Motilidad negativa : crecimiento bacteriano limitado al pinchazo con el asa.

Presencia de indol : reacción positiva, aparición de un aro rojo en la superficie del medio, al

agregar el reactivo de Kovacs.

Presencia enzima ODC: el medio se observa de color morado, indicando reacción positiva

: el medio se torna amarillo (puede ponerse morado el fondo), indicando

reacción negativa.

Agar Corriente : reacción positiva si existe coloración de las colonias.

70

Resultados mas frecuentes de algunas pruebas bioquimicas para la familia ENTEROBACTERIACEAE

Glucosa Lactosa Sacarosa Manitol Sorbitol Gelatina Citrato H2S Motilidad Indol V-P R-M PigmentoUrea

Escherichia coli AG + V + + - - - +/- + - + - -

Shigella flexneri A - V V - - - - - - - + - -

Shigella dispar - V - - - - - - - + - + - -

Salmonella typhi A - - + + - V + + - - + - -

Salmonella paratyphi A AG - - + + - - - + - - + - -

Salmonella paratyphi B AG - - + + - + + + - - + - -

Salmonella gallinarum A - - + + - + +/- - - - + - -

Citrobacter freundii AG + +/- + + - + +/- + - - + - -

Klebsiella pneumoniae AG + + + + - + - - - + - - +

Enterobacter aerogenes AG + + + + -/+ + - + - + - - -

Enterobacter hafniae AG V V + - - V - + - +/- -/+ - -

Serratia marcescens V - + + + + + - + - + -/+ + V

Serratia rubidae AV + + + - + + - +/- - + -/+ + V

Proteus vulgaris AV - + - - + V + + + - + - +

Proteus mirabilis AG - V - - + (+) + + - -/+ + - +

Pseudomonas

aeruginosa*

- - - - - + + - + - - - + -

Alcaligenes faecalis* - - - - - - V - + - - - - -

* No pertenecen a la familia Enterobacteriaceae

AG = Acido-Gas (utilización del substrato y producción de gas)

V = Variable

(+) = Positivo después de 3 ó 4 días +/- = Generalmente positivo

-/+ = Generalmente negativo

71

TABLA I

Nota : Todos producen gas de glucosa.

Todos son Citrato positivo. Excepto E. coli

Todos son Ureasa negativo. Excepto Klebsiella, que puede dar positivo al 2do o 3er día

a : ciertas especies de S. Arizona Fermentan la Lactosa lentamente

b : ciertas especies de E. coli son Lisina Descarboxilasa negativo.

Producción de H2S

Positivo Negativo

Escherichia coli Enterobacter spp.

Klebsiella spp.

Positivo Negativo

Salmonella Arizonaa

Citrobacter freundii

Negativo

Lisina Descarboxilasa Positivob

Indol

Positivo

Indol Negativo

Lisina Descarboxilasa

Fermentación de Glucosa Positivo

Fermentación de Lactosa Positivo

Lisina Desaminasa Negativo

72

TABLA II

Negativo

Citrato

Negativo Positivo

Proteus rettgeri

Providencia spp.

Positiva

Indol

Positivo Negativo

Fermentación de Glucosa Positivo

Fermentación de Lactosa Negativo

Lisina Desaminasa Positivo

Producción de H2S

Indol Positivo

Proteus morganii

Lisina Descarboxilasa Negativo

Proteus vulgaris Proteus mirabilis

Lisina Descarboxilasa Negativo

Nota : P. vulgaris y P. mirabilis pueden o no utilizar Citrato

Todos producen un poco de gas de Glucosa

Todos son Ureasa positivo. Excepto Providencia

73

TABLA III

Negativa

Positivo Negativo

Positiva

Lisina Descarboxilasa

Positivo Negativo

Indol

Positivo Negativo

Citrato Positivo

Citrato

Negativo Citrato

Edwarsiella Negativo Positivo

Indol Serratia

Negativo Positivo

Salmonella Paratyphi A

Shigella spp. Shigella spp.

Yersinia enterocolitica

Citrato Negativo

Producción de H2S

Citrobactera

Salmonella Typhi

Salmonella Arizona

Salmonella Paratyphi B

Indol Negativo

Citrato Positivo

Fermentación de Glucosa Positivo

Fermentación de Lactosa Negativo

Lisina Desaminasa Negativo

Lisina Descarboxilasa

Nota : Todos son Ureasa Negativo. Excepto algunas cepas de Yersinia enterocolitica. No producen gas de Glucosa Shigella, Serratia, Salmonella Typhi y Yersinia enterocolitica. El resto produce gas de

Glucosa a: Ciertas especies de Citrobacter son Lactosa Negativo y pueden ser Indol Positivo o Negativo

74

3b. Siembra y Lectura de API 10 S

1. Prepare una suspensión bacteriana en 5 ml de suero fisiológico, hasta una medida de

densidad igual a 0.5 Mac Farland (estándar)

2. Con una pipeta Pasteur estéril, inocule cada una de las celdas de la galería hasta el menisco,

tal y como se muestra en la figura adjunta (línea azul). Evite la formación de burbujas en los

micropocillos, pues interfiere con sus resultados.

3. Llene la prueba CIT hasta la cúpula

4. En las pruebas LDC, ODC, URE y H2S, después de inocular, llene las cúpulas con aceite

mineral, para crea un ambiente microaerofílico.

5. Coloque la galería en la cámara de incubación, a la que debe colocarle previamente agua

para crear un ambiente húmedo. Que NO quede un exceso

6. Cierre la cámara e incube 18 a 28 horas a 37°C.

7. Después de la incubación, lea aquellos test de reacciones espontáneas:

TEST REACCIONES POSITIVO NEGATIVO

ONPG Beta galactosidasa Amarillo Incoloro

GLU Fermentación

/oxidación glucosa

Amarillo,amarillo/

gris

Azul, azul/verdoso

ARA Fermentación/oxidac

ión arabinosa

Amarillo Azul, azul/verdoso

LDC Enzima lisina

descarboxilasa

Naranja Amarillo

ODC Enzima ornitina

descarboxilasa

Rojo/naranja Amarillo

CIT Utilización del

citrato

Azul/verde, azul verde pálido/amarillo

H2S Producción de H2S Depósito/línea negra Incoloro/gris

URE Enzima ureasa Rojo/naranja Amarillo

75

8. Lea aquellos test que requieren agregar reactivos:

TDA (Triptofano-desaminasa): agregue una gota del reactivo TDA. Coloración marrón oscura

indica positivo.

IND (Producción de indol): Agregue una gota del reactivo de James. Coloración rosa indica

positivo.

NO2 (Producción de nitritos): Agregue una gota del reactivo NIT1 y NIT 2 en el tubo GLU.

Espere 2 a 3 minutos. Una coloración roja indica positivo.

9. Realice aparte el test de oxidasa.

10. Registre todas las reacciones en la hoja de resultados que le entregará su profesor.

11. Codifique el conjunto de reacciones obtenidas en un perfil numérico. Sume los números de

cada grupo si las reacciones son positivas Se obtienen 4 dígitos que corresponden al perfil

numérico. Busque el perfil numérico en el catálogo que tendrá su profesor o en un software.

12. Registre sus resultados en la cartilla y guárdelo para pegarlo en su informe

4. Test de susceptibilidad a los agentes antimicrobianos, método de difusión en agar o

Kirby-Bauer

Se utiliza para determinar la sensibilidad in vitro de las bacterias a los distintos

antimicrobianos. Para que los resultados sean confiables y reproducibles es necesario

estandarizar algunas condiciones de laboratorio:

a) Concentración de las bacterias que se siembran: Requiere uso de estándares de turbidez:

Mac Farland 0.5

b) Medio de cultivo utilizado: Agar Mueller-Hinton

c) Concentración del antimicrobiano en el disco: varía para cada antimicrobiano.

d) Temperatura (37°C), tiempo de incubación (16-24 horas) y atmósfera de incubación (en O2)

76

Una vez que se obtiene una colonia aislada (es absolutamente necesario que no exista

mezcla de bacterias), se prepara una suspensión bacteriana a una concentración conocida (1 a 2

x 108 UFC/mL) llevando a una turbidez equivalente a un Mac Farland 0.5.

a. Tome una tórula estéril y (sin flamearla!!) sumérjala en el caldo con el inoculo. Flamee la

boca del tubo y cierre.

b. Deslice la tórula mojada sobre toda la superficie del agar Müller-Hinton. Una vez que

termine, elimine la tórula.

c. Deje secar la placa con la tapa ligeramente entreabierta.

d. Tome la pinza y flaméela brevemente. Tome con cuidado cada uno de los sensidiscos y

distribúyalos homogéneamente en la placa, cuidando de que no queden demasiado cerca del

borde de la placa ni demasiado cerca entre si.

e. Incube a 37ºC durante 16 hrs.

En este tiempo se produce la difusión del antimicrobiano en el agar y si la bacteria es sensible,

se produce la inhibición del desarrollo en forma de halo. Si la bacteria es resistente habrá

desarrollo hasta el disco mismo (6mm) o con halos de inhibición disminuidos.

Están definidos para cada grupo de bacterias los halos de inhibición que permitirán clasificar a

las bacterias en Sensibles, Intermedias o Resistentes.

f. Observe y mida el diámetro del halo formado alrededor de los sensidiscos.

NOTA: Los diversos tamaños de los halos de inhibición producidos por antibióticos

diferentes para una misma especie bacteriana NO PUEDEN SER COMPARADOS

ENTRE SI. Por ejemplo: un halo de inhibición de 30mm para Penicilina no indica mayor

sensibilidad que un halo de 20 mm para Tetraciclina.

77

OBJETIVOS

1.- Conocer y caracterizar la morfología macroscópica de las colonias de hongos unicelulares

(levaduras) y pluricelulares (filamentosos).

2.- Conocer la morfología microscópica de hongos unicelulares (levaduras) y pluricelulares

(filamentosos).

MARCO TEÓRICO

El ser humano está constantemente expuesto a la propagación de organismos

eucariontes como son los hongos. La mayoría tolera esta exposición sin secuelas, pero algunos

desarrollan una hipersensibilidad alérgica. Esto porque un individuo sano tiene una resistencia

innata a la colonización de hongos y porque la virulencia inherente en estos microorganismo es

muy baja.

Sin embargo, en individuos inmunosuprimidos, la infección puede desencadenar

enfermedades que, si no son debidamente controladas, pueden llevar a un resultado fatal para

el hospedero. A los hongos que se aprovechan de la debilidad del hospedero se les denomina

hongos oportunistas. Hongos como Candida (Candida albicans), Aspergillus (Aspergillus

fumigatus) y varios Zigomicetos (Rhizopus arrhizus) son ejemplos de ellos.

TALO (cuerpo macroscópico)

Unicelular Pluricelular

Levaduras Micelio

Colonias semejantes a las

bacterianas

Sifonado Septado

Colonias algodonosas,

lanosas, aterciopeladas

TRABAJO PRÁCTICO N°5

LEVADURAS Y HONGOS FILAMENTOSOS

78

Tanto las levaduras como los hongos filamentosos se siembran en agar Sabouraud, cuyo

contenido en glucosa es mayor que el de otros medios de cultivo y el pH es ácido (pH 5,6) para

impedir la contaminación bacteriana. Generalmente se incuban a 25-30°C por un tiempo que

depende de la especie fúngica (levaduras y hongos ambientales, 48 horas aproximadamente,

hongos dermatofitos, 15-30 días).

Hongos Unicelulares (Levaduras)

Las levaduras son organismos fúngicos unicelulares que generalmente se reproducen

asexualmente por yemación. Los criterios usados para el diagnóstico son fundamentalmente

morfológicos (macroscópicos y microscópicos).

Las levaduras normalmente prosperan en hábitat con abundante azúcar, tales como frutas,

flores e incluso la corteza de los árboles. Algunas de ellas viven en simbiosis con animales,

especialmente insectos. Las levaduras más importantes desde el punto de vista comercial son

las cepas cerveceras y panaderas de la especie Saccharomyces cerevisiae.

Candida spp.: En ciertas condiciones C. albicans, C. tropicalis, C. kefyr, y otras, son parte de

la flora normal de los humanos. Pueden aislarse de las superficies mucosas sanas de la

cavidad oral, vagina, tracto gastrointestinal y área rectal. Sin embargo, cuando se rompe la

barrera mucosa, los microorganismos pueden llegar a la sangre e invadir pulmones, bazo,

riñones, hígado, corazón y cerebro. Este género se caracteriza por un aspecto macroscópico de

su colonia opaco, de color cremoso y consistencia pastosa (Figura 1)

Figura 1: Observación microscópica de una muestra de esputo en que se ponen de manifiesto

las levaduras en yemación y las pseudohifas de las especies de Candida.

79

Hongos Filamentosos:

Estos pueden ser sifonados (aseptados) o septados. Los hongos sifonados son generalmente

multinucleares (ej. Mucoral) y los hongos septados presentan hifas con tabiques que son

prolongaciones de la membrana citoplasmática (ej. Aspergillus, Dermatophytos).

1) Hongos septados

Estos hongos pueden presentarse como contaminantes ambientales (ej. Penicillium), como

patógenos oportunistas (ej. Aspergillus) y como patógenos (ej. Dermatophytos).

Aspergillus spp.: Los microorganismos que pertenecen a éste género son extremedamente

frecuentes en el medio ambiente y de crecimiento rápido (48 hr). En contraste con la mayoría

de las infecciones producidas por Candida, la aspergilosis se adquiere de fuentes exógenas.

Estos microorganismos se identifican por sus características morfológicas presentando

colonias aterciopeladas, algodonosas o pulverulentas, coloreadas (crema, verde, café y

negras). Microscópicamente presentan hifas septadas de las que nace una prolongación

no septada (conidóforo), el cual se dilata en su extremo distal (vesículas) rodeándose allí

de células conidiogénicas (fiálides). Las fiálides producen conidios los que se disponen en

forma de cadenas. El conjunto vesícula, fiálide y conidios se conoce como “cabeza

aspergilar” (Ver Figura 2).

De las aproximadamente 900 especies de Aspergillus descritas, A. fumigatus y A. flavus

son las que con mayor frecuencia se asocian a enfermedad invasiva. Son ubicuitarios en el

ambiente y no forman parte de la flora normal del ser humano, aunque pueden producirse

colonizaciones transitorias. La aspergilosis está asociada con problemas respiratorios como la

dilatación crónica de la vía aérea hasta un colapso de un segmento pulmonar.

Figura 2: Estructura microscópica de

especies de Aspergillus

80

Penicillium: Estos microorganismos son ubicuitarios en el medio ambiente y suelen aislarse

en muestras de aire y como contaminantes en los cultivos de laboratorio, desarrollándose en 3-

4 días. En 1929, Sir Alexander Fleming observó que una especie de Penicillium había

contaminado su cultivo de Staphylococcus aureus, destruyendo las bacterias que se

encontraban inmediatamente en contacto con el hongo. Esta observación casual llevó al

descubrimiento de la penicilina.

Los hongos que petenecen a este género se caracterizan por la producción de

conodióforos en el extremo de hifas septadas ramificantes. Cuando se alojan en

superficies, como una placa de agar, germinan y crecen rápidamente produciendo

colonias con aspecto polvoriento, de color verde azulado.

P. marnefeii es la única especie patógena de Penicillium y es causa de infecciones espontáneas

del sistema retículoendotelial, afectando vasos linfáticos, pulmón, hígado, bazo y hueso. Ver

figura 3.

Figura 3:Aspecto microscópico de Penicillium.

81

2) Hongos sifonados.

Zigomicetos: Especies de Rhyzopus, Mucor y Absidia han sido implicados en cuadros de

zigomicosis. Macroscópicamente presentan un micelio algodonoso. Microscópicamente,

forman hifas aseptadas y se reproducen asexualmente produciendo esporangios en los

que se desarrollan esporas (Ver figura 4). Las enfermedades asociadas a estos

microorganismos son usualmente la mucormicosis rinocerebral. Esta infección se origina en

los senos paranasales y puede afectar órbita y el paladar, extendiéndose hacia el cerebro. En

pacientes inmunodeprimidos puede afectar el pulmón, el tracto gastrointestinal y los tejidos

subcutáneos.

Figura 4: Aspecto microscópico de hongos sifonados.

I.- Estudio Clínico

El reconocimiento del hongo como agente de infección se inicia por la sospecha clínica del

Médico al orientar su diagnóstico hacia una micosis. Este se sustenta gracias al examen físico,

la historia clínica y en infecciones profundas, se agrega el apoyo de imágenes,

fundamentalmente el Scanner. Frecuentemente, en micosis oportunistas los signos y síntomas

clínicos no son específicos, siendo indistinguibles de una infección bacteriana. Muchas veces,

la presencia de factores predisponentes o de riego y la pobre respuesta al tratamiento

antibacteriano, es señal que índica la posible presencia causal de agentes fúngicos, sospecha

que debe ser indicada en la solicitud de examen para que el profesional de laboratorio oriente

la búsqueda y aislamiento del hongo siguiendo la metodología apropiada.

82

II.- Toma y Transporte de Muestras

La recolección y transporte del material clínico depende en gran parte de la sospecha clínica,

tejido afectado, tipo de lesión y estado general del paciente. Esta etapa es fundamental para el

éxito del diagnóstico. Debe asegurarse una cantidad suficiente de muestra que permita realizar

todos los exámenes de laboratorio. La calidad de la muestra está directamente relacionada con

la sensibilidad y rendimiento del examen en el laboratorio.

Si el paciente se encuentra bajo tratamiento antifúngico, se recomienda suspender el

tratamiento, por lo menos 2 semanas antes de la toma de muestra. Esto se orienta

principalmente a pacientes portadores de micosis superficiales o cutáneas y las consideradas no

graves.

III.- Procedimiento General del Diagnóstico de Laboratorio

En general, el examen microscópico directo (EMD) y el cultivo pueden ser realizados para

todas las muestras clínicas que se reciben. Estos exámenes forman parte del método directo de

identificación de hongos y se recomienda en todas las micosis. La microscopía proporciona

información vital y frecuentemente una inmediata corroboración del diagnóstico presuntivo al

observar el agente fúngico en el material clínico. Los hongos filamentosos se presentan en

parasitismo como hifas que pueden ser cenociticas (poco septadas) o septadas, hialinas o

dematiancias (oscuras) según el tipo de hongo. Algunas levaduras presentan características

microscópicas particulares en parasitismo, lo cual orienta su identificación.

a) El EMD puede ser realizado en frotis, fijándose la muestra al portaobjetos y usando la

tinción de Gram o Giemsa, para poder observar con la objetiva de inmersión (100X).

Lo más frecuente, es la preparación al fresco con soluciones clarificadoras con o sin

colorantes como KOH 10 o 20%. Además, se emplea la tinta de China para observar la

presencia de cápsula en levaduras del género Cryptococcus, observándose con objetivos

83

de 10X y 40X de aumento. En muestras de tejido, además puede solicitarse examen

histopatológico donde se verá además la reacción tisular.

b) El cultivo primario del hongo es realizado en varios tubos o placas de Petri conteniendo los

medios de cultivo según la sospecha clínica. Las micosis causadas por hongos filamentosos

se incuban generalmente a 25ºC y el tiempo de incubación dependerá de la sospecha

clínica. Así, en las dermatofitosis o tiñas los medios se incuban hasta por 30 días, debido a

que estos hongos demoran aproximadamente 20 días en crecer y presentar sus estructuras

micromorfológicas características que permitirán su diagnóstico a nivel de especie. Sin

embargo, los hongos filamentosos oportunistas como Aspergillus spp., Penicillium spp.,

Fusarium spp., mucorales y dematiaceos, entre otros, crecen más rápido, obteniéndose

colonias entre los 5 a 10 días de incubación. Las levaduras crecen mejor a 37ºC y sus

colonias se obtienen entre las 24 y 72hrs dependiendo de la especie.

1.- HONGOS FILAMENTOSOS

Examen Microscópico de la Colonia

A partir del hongo filamentoso aislado in vitro, se realiza una preparación microscópica para

observar las características morfológicas del organismo, buscando principalmente las

estructuras reproductivas, ya que son éstas las que permitirán identificar el agente. Muchas

veces, como consecuencia de la fragilidad de estas estructuras, se logra aproximar el

diagnóstico a nivel de género o grupo de hongos, por tal motivo se requiere de un cultivo

especial cuyo propósito es estimular la producción de células reproductivas en medios pobres y

conservar su agrupación con respecto a las hifas a partir de un microcultivo. (no se realizará)

2.- IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS

a) Prueba Fisiológica de Producción del Tubo Germinativo

Este examen es realizado para identificar la presencia de C. albicans. En condiciones

determinadas de cultivo “in vitro”, esta levadura desarrolla un tubo fino que no se libera ni

presenta punto de constricción en el punto de unión con la célula madre. Se inocula la levadura

en un tubo conteniendo plasma o suero humano y se incuba a 37ºC por 2 a 3 hrs. Debido a lo

rápida, fácil y barata, esta técnica se encuentra implementada en la gran mayoría de los

laboratorios. Sin embargo, es recomendable acompañarla siempre con estudios en

84

microcultivo, para comprobar la identificación de C. albicans, ya que se han descrito casos de

falsos positivos y negativos.

b) Prueba Fisiológica de Filamentación

Este examen es realizado para identificar la presencia de Candida sp.. En condiciones

determinadas de cultivo “in vitro”, estas levaduras desarrollan filamentos a partir de la célula

madre. Se inocula la levadura en un tubo conteniendo plasma humano y se incuba a 37ºC por

24 hrs.

c) Pruebas Bioquímicas

El estudio bioquímico de levaduras comprende principalmente el análisis de asimilación de

hidratos de carbono conocido como Auxanograma, sometiéndose a la cepa en estudio a

diferentes azúcares dependiendo del género de levadura que se sospeche. Este examen se

complementa con asimilación de fuentes de nitrógeno, fermentación de azúcares denominado

Zimograma e hidrólisis de urea. El auxanograma y la asimilación de nitratos son incubados a

25ºC hasta por 3 días. Entretanto, el zimograma e hidrólisis de urea se incuba a 37ºC.

El perfil bioquímico obtenido será comparado con los datos en las tablas de identificación

respectivas, según el género de levadura sospechado, permitiendo reconocer la o las especies

que presentan el patrón bioquímico determinado.

d) Sistemas Comerciales de Identificación de Levaduras

En virtud de trabajo y experiencia que se requiere para leer e interpretar los resultados

bioquímicos realizados por el método estándar, la industria ha desarrollado progresivamente

nuevos sistemas para facilitar y disminuir el tiempo de identificación de las especies de

levaduras de interés clínico. La mayoría de los sistemas disponibles en el mercado son galerías

que contienen distintos nutrientes y reactivos deshidratados en los pocillos que, al ser

inoculados e incubados correctamente proporcionan lectura de fácil interpretación, las cuales,

en su mayoría generan un código numérico de varios dígitos que son interpretados por registros

propios de cada empresa. El primer inconveniente observado por los laboratorios es la

necesidad de contar con disponibilidad de otra estufa de cultivo, ya que algunos de estos

sistemas se incuban a 30ºC por 24 y 48hr.

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Sistema comercial Productor

- Api Candida BioMérieux

- ID 20C e ID 32C BioMérieux

- Fungichrom I International Microbio

En resumen, a partir del diagnóstico clínico los pasos importantes que favorecen el aislamiento

e identificación del hongo son:

- Apropiada recolección del material clínico y rápido transporte al laboratorio

- Inmediato y oportuno procesamiento de la muestra

- Adecuada elección de la o las soluciones en el examen microscópico directo

- Correcta selección del o los medios de cultivos

- Óptimo procedimiento de inoculación e incubación

- Adecuada realización, lectura, análisis e interpretación de las técnicas de identificación

ACTIVIDADES PRÁCTICAS

1.- Observación y descripción de cultivos de levadura.

1.1.- Procedimientos.

a) Examen macroscópico: Describa, tal como lo hacía para colonias bacterianas, forma,

color, aspecto de la superficie, borde, elevación y brillo de las colonias. Anote lo que

observe.

b) Examen microscópico: Realice una tinción Gram tradicional. Es decir, realice un frotis

con la colonia de levaduras en una gota de agua y continúe con el protocolo por usted.

conocido. Observe con inmersión y dibuje lo que observa.

Nota: La tinción Gram es sólo una técnica de tinción. Las levaduras no son Gram + ni Gram

-. Recuerde que la característica de ser Gram+ o Gram- está relacionada con propiedades que

pertenecen a las membranas bacterianas.

c) Observación de tubo germinativo y filamentación en Candidas:

1. Coloque en un portaobjeto limpio una gota del cultivo de Candida que se le

entragará(*)

2. Cubra con un cubreojeto.

3. Observe al fresco en aumento de 40X y dibuje lo observado

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(*) Para esta prueba la levadura a estudiar se siembra en un tubo con plasma humano y se cultiva a 37°C por 4 horas para observar tubo germinativo y por 24 horas para observar filamentación.

Recuerde que sólo C. albicans presenta tubo germinativo a las 4 horas, mientras que

varias especies de Candida presentan filamentación a las 24 horas.

d) Tinción de cápsula:

1. Coloque en un portaobjeto limpio una gota de agua y una gota de tinta china.

2. Emulsione una colonia de Cryptococcus y extienda la preparación con otro

portaobjeto.

3. Seque suavemente en la llama del mechero

4. Cubra con fucsina y deje reposar 2-3 minutos.

5. Lave con agua, seque y observe al microscopio con aceite de inmersión en 100X

2.- Observación, y descripción de hongos filamentosos.

2.1.- Procedimientos.

a) Examen macroscópico: Color y aspecto (aterciopelada, algodonosa, polvorienta,

lanosa) en anverso y reverso. Anote lo que observe.

b) Examen microscópico: Para esto se realizará un examen al fresco.

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Examen al Fresco:

1.- Coloque una gota de azul de lactofenol sobre un portaobjeto.

2.- Flamee un asa en punta, enfríe cerca del mechero y obtenga un pequeño trozo del

hongo (sin sacar agar). DEBE USAR MASCARILLA.

3.- Mezcle el fragmento del hongo con el azul de lactofenol y cubra con un cubreobjeto.

4.- Observe con aumento de 40X (sin inmersión, ni aplastando la muestra).

5.- Reconozca las estructuras microscópicas reproductivas de cada especie y dibuje.

• Recuerde: el principal criterio para la identificación de estos microorganismos es el

morfológico, por lo tanto, es importante que trabaje con cuidado.

Candida albicans

TUBO GERMINATIVO (+)

Candida albicans

PSEUDOHIFAS O HIFASBLASTOCONIDIAS YCLAMIDOCONIDIAS

ASIMILACIÓN/ FERMETACIÓN DE AZÚCARES

(API 32 U OTRO))

Candida sp.

PSEUDOHIFAS O HIFASCON BLASTOCONIDIAS

API 32, PROBABLETrichosporon o

Geotrichum

HIFAS CON ARTROCONIDIAS

FILAMENTACIÓN (+)

API32, probableRhodotorula o

Torulopsis

CÁPSULA (-)

Cryptococcus sp.

CÁPSULA (+)

FILAMENTACIÓN (-)

TUBO GERMINATIVO (-)

TUBO GERMINATIVO

LEVADURAS

CULTIVOPOSITIVO

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89

90

OBJETIVOS

1.- Reconocer elementos parasitarios frecuentes en muestras clínicas.

2.- Observar las características más importantes de estos parásitos.

MARCO TEÓRICO

Se define como parásito a todo ser vivo, vegetal o animal, que pasa toda, o parte de su

existencia, a expensas de otro ser vivo, generalmente más potente que él (hospedero), del cual

vive causándole o no daño, que puede ser aparente o inaparente, y con quien tiene una

dependencia obligada y unilateral. Existen diversos tipos de parasitismo:

1. Parasitismo obligatorio: los parásitos necesitan para vivir hacer vida parasitaria. Este estado

puede ser permanente, permanente estacionario, periódico o temporario.

2. Parasitismo facultativo: son seres de vida libre que en circunstancias favorables hacen vida

parasitaria.

3. Parasitismo accidental: no son parásitos verdaderos, pero ocasionalmente pueden serlo.

4. Parasitismo extraviado: parásitos de los animales que anormalmente pueden encontrarse en

el hombre.

5. Parasitismo errático: cuando la localización del parásito, en el huésped, no es en el órgano o

tejido habituales.

Ciclos de vida del parásito:

1. Ciclos directos (monoxenicos): son aquellos en los que no es necesaria la presencia de un

huésped intermediario. Pueden ser cortos -donde la forma emitida es la infectante- o largos,

donde la forma emitida necesita un determinado tiempo en el medio (generalmente el suelo)

para transformarse en infectante. En general, los parásitos con ciclos directos cortos son

cosmopolitas y los directos largos están condicionados por las situaciones climáticas.

TRABAJO PRÁCTICO N°6

PARÁSITOS

91

2. Ciclos indirectos (heteroxenicos): son los que necesitan un huésped intermediario para

completar su ciclo. La presencia de estas parasitosis en un área determinada depende de la

existencia de ese huésped intermediario.

Características más importantes de los parásitos:

Resistencia al medio exterior: para enfrentar los factores climáticos y algunos agentes

químicos, los huevos, quistes o larvas se protegen con cubiertas proteicas que los hacen

resistentes.

Patogenicidad: está relacionada con la morbilidad y la mortalidad. Algunos parásitos son

patógenos por sí mismos, y otros lo son, dependiendo de las características del huésped; ésto

hace que un mismo parásito pueda o no producir enfermedad. Por esta razón existen el

portador sano y los parásitos oportunistas, que se manifiestan en pacientes

inmunocomprometidos.

Autoinfección: es la forma para que el parásito permanezca por más tiempo en el huésped.

Puede ser autoexoinfección, en la que está en el exterior un tiempo muy corto; o

autoendoinfección, en la que se multiplica dentro del huésped, y la recontaminación se hace en

el interior del mismo.

Prepatencia: es el tiempo que transcurre entre la entrada del parásito al huésped y la

demostración de éste, o sus formas de desarrollo, ya sea por la observación directa, estudios

bioquímicos, cultivos, etc.

Viabilidad: es importante que las formas emitidas al exterior por el parásito sean viables a

través de estructuras resistentes, tanto al medio como a los huéspedes intermediarios. Se

asegura de esta forma la continuidad del ciclo y su permanencia.

Diapausa: es el estado en que muchas veces las larvas de los parásitos permanecen en el

organismo del huésped en forma latente -encapsuladas o formando quistes- para evadir la

respuesta inmunológica.

Longevidad: la longevidad de un parásito admite dos formas: longevidad verdadera, cuando

permanecen muchos años en un organismo; o perpetuándose -por medio de la autoinfección-

aunque el parásito tenga vida muy corta.

Fecundidad: la capacidad para emitir determinada cantidad de formas parasitarias le sirve al

parásito para perpetuarse. Es útil conocerla, ya que a través de ello (por ejemplo, en los

helmintos, postura diaria de huevos), es posible hacer el cálculo aproximado del número de

parásitos que infectan al huésped.

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Prevención de las parasitosis

La Organización Mundial de la Salud estableció que, dado que las parasitosis son

patologías con alto componente social, podrían ser controladas, pero difícilmente eliminadas.

Las medidas de prevención están vinculadas a la modificación de los hábitos, la educación y el

bienestar de la población. Incluyen:

1. Disminuir el “fecalismo” ambiental a través de medidas de saneamiento básico, como

facilitar el acceso al agua potable, la correcta eliminación de excretas, etc.

2. No utilizar excrementos como abono para el cultivo de hortalizas, ni aguas servidas

para riego.

3. No consumir carnes o verduras crudas.

4. Controlar los vectores mecánicos (moscas, cucarachas) y los vectores biológicos

(vinchuca, mosquitos etc.).

5. Desparasitar periódicamente a los animales domésticos, sobre todo perros y gatos.

6. Prevenir las parasitosis congénitas a través del control de la mujer embarazada.

7. Evaluar parasitosis en dadores de sangre y donantes de órganos.

8. Modificar hábitos de convivencia del hombre con los animales, para evitar el contacto

con las heces de los mismos.

9. Promocionar la lactancia materna, ya que se ha comprobado que ésta protege contra

determinadas parasitosis, principalmente las que originan diarreas.

10. Evitar el hacinamiento, que facilita el contagio persona a persona.

11. Hervir el agua de consumo por un minuto, utilizando esta modalidad como norma,

especialmente cuando la ingieran lactantes y niños.

12. No caminar descalzo o con calzado abierto en suelos de tierra o arena, sobre todo

húmedos.

13. Utilización de guantes y calzado cerrado siempre que se trabaje con la tierra.

14. Antes de utilizar abono o turba de río comercial rociar el material con agua recién

hervida.

15. Tratar de evitar que los niños jueguen en areneros o patios de tierra. Si ello no fuera

factible, establecer un lugar delimitado para ellos, al que se rociará periódicamente, si

es posible en forma diaria, o en los períodos de clima cálido y después de las lluvias,

con agua recién hervida.

16. Colocar los juguetes de los niños al sol las veces que se pueda, ya que la mayoría de las

formas parasitarias no resisten a la desecación y temperaturas superiores a 50ºC.

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LABORATORIO DE PARASITOLOGIA

OBTENCIÓN DE LA MUESTRA

CONDICIONES GENERALES

• Los parásitos intestinales del hombre son protozoarios y/o helmintos, llamados

comúnmente gusanos intestinales (Anexo A). Estos helmintos o gusanos pueden ser

cilíndricos (nemátodes), anillados o segmentados (céstodes).

• Para observar los trofozoítos, quistes u ooquistes de los protozoarios, así como las

larvas y huevos de helmintos, se debe usar un microscopio; en cambio, la mayor parte

de los gusanos o helmintos adultos son macroscópicos y su morfología puede estudiarse

directamente, con ayuda de un estereoscopio o una lupa.

• Los protozoarios intestinales eliminan con las heces sus formas evolutivas (trofozoíto,

quiste, ooquiste y espora), según la especie involucrada.

• Los helmintos intestinales adultos (proglótidos de Taenia sp., Enterobius vermicularis

y Ascaris lumbricoides) pueden salir al exterior espontáneamente o después del

tratamiento.

• Los gusanos intestinales se eliminan con las heces.

• Los métodos de diagnóstico de los parásitos intestinales pueden ser: directo o por

concentración de los elementos parasitarios que se eliminan en las heces.

• En las heces podemos encontrar formas adultas y microscópicas (huevos, larvas,

trofozoitos, quistes, ooquistes y esporas) de los parásitos intestinales; por ello, es

importante obtener una buena muestra fecal, así como la conservación óptima del

espécimen.

• La muestra debe ser obtenida (entre 3 y 6 gramos) lo más fresca posible (máximo 90

minutos, si se busca Entamoeba histolytica), y depositada en un frasco de boca ancha

con tapa rosca y rotulada correctamente con los datos de identificación.

• La muestra debe obtenerse antes del uso de medicamentos antiparasitarios, o hasta 2 a 5

días después de su administración.

• Las heces depositadas en el suelo no son las recomendadas para el diagnóstico, debido

a que pueden contaminarse con formas biológicas, como por ejemplo: larvas similares a

los enteroparásitos del hombre, larvas de nemátodes, huevos de ácaros o insectos, etc.

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• Si el paciente no es regular en la evacuación de sus deposiciones y ha evacuado en la

noche anterior al examen, se recomienda guardar la muestra en una refrigeradora o en

un lugar fresco no expuesto a la luz solar, para que no se alteren las formas parasitarias.

Cuando la muestra va a demorar en llegar al laboratorio varias horas o días, se

recomienda adicionarle líquido fijador y/o conservador (PAF, PVA, formalina 10%,

SAF, acetato de sodio, etc.).

MUESTRA PARA EXAMEN PARASITOLÓGICO

Comprende las siguientes muestras: heces, bilis o jugo duodenal, esputo, secreción, biopsia o

preparaciones histológicas, siendo heces, la más frecuente.

EXAMEN DIRECTO MACROSCÓPICO

Fundamento.

Permite observar directamente las características morfológicas de los parásitos adultos, enteros

o fraccionados, así como los cambios en las características organolépticas de las heces

eliminadas, (color, presencia de sangre y/o moco, consistencia, etc.).

Figura Nº 1. Ascaris lumbricoides macho adulto (der.) y proglótido grávido de Taenia

solium (4X) (izq.), coloración: Tionina EXAMEN DIRECTO MICROSCÓPICO Fundamento.

Buscar, principalmente en muestras frescas, la presencia de formas evolutivas móviles de

parásitos de tamaño microscópico (trofozoítos, quistes de protozoos: Entamoeba histolytica,

Giardia lamblia, Balantidium coli, etc.; así como larvas o huevos de helmintos: Strongyloides

stercoralis, Ancylostoma duodenale, Necator americanus, Trichostrongylus sp., Paragonimus,

Fasciola, etc.).

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Ejemplos

Trofozoito de Giardia lamblia con solución lugol. Huevos operculados de Paragonimus

peruvianus (izq.) y Fasciola hepatica (der.) en muestra fresca

DIAGNOSTICO EN EL LABORATORIO PARASITOLOGÍA

La recolección correcta de las muestras es esencial para un examen de heces confiable.

Se recomienda realizar un seriado coproparasitológico, una muestra fresca en solución

formolsal. Debe entregarse a cada paciente tres frascos o recipientes plásticos de boca ancha

con cierre adecuado, Se puede solicitar al paciente que tres días antes de iniciar la recolección

no ingiera manteca, frutas de hollejo, verduras de hoja y legumbres.Puede ingerir carnes

magras, pastas, dulces, papa. Esta dieta previa no es un requisito estricto. Se debe suspender la

ingesta de purgantes oleosos y sustancias radio opacas.

Recolección de materia fecal en conservantes:

• Seriada coproparasitológica:

Se indica la recolección de un mínimo de una muestra (tamaño de una cucharada de postre) de

cada deposición en tres días alternos. Se le indica al paciente que defeque en una bacinica, o en

un recipiente de boca ancha, limpio y seco, o sobre superficie plástica o papel no absorbente de

donde tomará la porción para colocarla en un frasco grande con formolsal al 5%.

Examen macroscópico de las heces remitidas:

Cuando las heces frescas son recibidas en el laboratorio deben ser examinadas bajo luz lo que

permite observar directamente las características morfológicas de los parásitos adultos, enteros

o fraccionados, así como los cambios en las características organolépticas de las heces

eliminadas, (color, presencia de sangre y/o moco, consistencia, etc.).

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Examen microscópico de heces:

La aplicación de los métodos de concentración permite detectar elementos parasitarios que

estén presentes y se examina una cantidad mayor de heces en menor volumen.

ACTIVIDADES PRÁCTICAS

Las actividades del laboratorio de parasitología consistirán en la observación de

elementos parasitarios conservados en soluciones fijadoras y disecados y/o observación de

diapotecas según disponibilidad de cada laboratorio.

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EJEMPLOS DE ELEMENTOS PARASITARIOS QUE PUEDEN ENCONTRARSE EN

UN SERIADO DE DEPOSICIONES

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