Interacción materno fetal: el líquido amniótico como ...
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1 Los esfuerzos realizados para prevenir el trabajo de parto prematuro en la población general no han tenido un impacto significativo sobre la morbimortalidad neonatal. Estas limitaciones terapéuticas son consecuencia del desconocimiento de los mecanismos íntimos del inicio del trabajo de parto a termino y pretérmino ya que los tratamientos actuales actúan sobre el músculo uterino el cual es solamente un efector de un proceso patológico no bien identificado. Las membranas corioamnióticas (MF) son una entidad anatómica compleja y dinámica, capaz de secretar diferentes sustancias hacia el líquido amniótico en respuesta a estímulos recibidos tanto de la madre como del feto. Durante el trabajo parto a término y pretérmino, se produce un dramático incremento en la liberación de mediadores proinflamatorios como citoquinas y prostaglandinas (PGs). Las PGs son sintetizadas a partir del ácido araquidónico por la vía de la ciclooxigenasa (COX) la cual existe en dos isoformas: COX-1 y COX-2. En particular, el amnios es la principal fuente de producción de prostaglandina E2 (PGE2), la cual ejerce sus efectos vía la unión a receptores de membrana acoplados a proteína G (EP). Las membranas corioamnióticas expresan 4 subtipos de EPs (EP1-4). Por unión a EP2 o EP4, PGE2 estimula la actividad de adenilato ciclasa (AC) y promueve relajación, mientras que uniéndose a EP1 o EP3, inhibe AC con la subsiguiente disminución de los niveles de AMPc que favorecen la contracción. Un rasgo sobresaliente de las prostaglandinas es la naturaleza transitoria de su existencia. La 15- hidroxiprostaglandina dehidrogenasa (PGDH) cataliza la oxidación del grupo 15-hidroxilo de las prostaglandinas y las convierte en metabolitos inactivos que posteriormente son excretados por la orina. INTRODUCCIÓN INTRODUCCIÓN INTRODUCCIÓN INTRODUCCIÓN Laboratorio de Fisiopatología de la Laboratorio de Fisiopatología de la Laboratorio de Fisiopatología de la Laboratorio de Fisiopatología de la Preñez y el Parto Preñez y el Parto Preñez y el Parto Preñez y el Parto OBJETIVO OBJETIVO OBJETIVO OBJETIVO TÉCNICAS TÉCNICAS TÉCNICAS TÉCNICAS Interacción materno fetal: el líquido amniótico como modulador de procesos vinculados al inicio del trabajo de parto Leguizamón GF, Wolfson ML, Franchi AM, Farina MG Laboratorio de Fisiopatología de la Preñez y el Parto-CEFyBO-CONICET CEMIC RESULTADOS RECOLECCIÓN DE MUESTRAS RECOLECCIÓN DE MUESTRAS RECOLECCIÓN DE MUESTRAS RECOLECCIÓN DE MUESTRAS Cultivo de Explantos: Las MF fueron lavadas exhaustivamente con solución fisiológica estéril y cortadas en discos de 8 mm de diámetro. Los explantos obtenidos se cultivaron en placas de 12 wells (Costar, USA) y se colocaron en 1 ml de medio RPMI 1640 suplementado con 5% de suero fetal bovino y antibióticos/antimicóticos (penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 g/ml, anfotericina B 0.25 g/ml) y se incubaron por 24 h a 37 o C en una atmósfera húmeda con 5% CO 2 y 95% O 2 para estabilizar los tejidos. Posteriormente, el medio fue removido y los explantos fueron incubados por 24 horas más con liquido amniótico de término o de pretérmino con y sin trabajo de parto Para analizar la viabilidad tisular explantos de membranas fetales fueron sometidos a un estímulo (LPS, 10ug/ml). La producción de PGE2 fue posteriormente cuantificada por RIA. Western Blot: En las MF se determinó por western blot la expresión de la COX-2, del receptor EP1, y de la PGDH. Para ello, las muestras fueron separadas por electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) y transferidas a una membrana de nitrocelulosa. Las membranas fueron bloqueadas y posteriormente se incubaron con el primer anticuerpo: COX-2 Cayman (dil 1:500), EP1 Cayman (dil 1:250), y PGDH (D. Tsai) (dil 1:500). Posteriormente las membranas fueron incubadas durante 1 hora con anticuerpo secundario conjugado a peroxidasa. Las bandas fueron obtenidas por quimioluminiscencia (ECL). Radioinmunoanálisis: Se cuantificó la producción de PGE2 liberada al medio de cultivo luego de la co-incubación con LA de término y pretérmino con y sin trabajo de parto . 100 150 200 250 g de PGE2 / ml 40 80 120 160 g de PGE2 / ml * * Luego de obtener consentimiento informado, pacientes cursando un embarazo entre 24 y 41 semanas con membranas fetales (MF) íntegras, sin evidencia de infección, ni de complicaciones médicas; fueron invitadas a participar en el estudio. Diferentes muestras fueron obtenidas según la edad gestacional: 1) PRETERMINO (24-37 semanas) : LA de pacientes con y sin trabajo de parto. 2) TERMINO (37-41 semanas): se obtuvo LA de pacientes con y sin trabajo de parto y membranas fetales provenientes de pacientes con cesáreas programadas sin trabajo de parto. Membrana AA PGs AA COX PGDH Metabolitos Líquido quido amni amniótico tico EPs Acción biológica Membrana AA PGs AA COX PGDH Metabolitos Líquido quido amni amniótico tico EPs Acción biológica En el presente trabajo analizamos la relevancia del líquido amniótico (LA) en la modulación de las enzimas involucradas en la síntesis, acción y degradación de las prostaglandinas en las membranas corioamnióticas humanas. Para ello, investigamos el efecto del líquido amniótico proveniente de mujeres con y sin trabajo de parto a término y pretérmino sobre la producción de PGE2, y la expresión de COX-2, del receptor EP1, y de la enzima PGDH en las membranas corioamnióticas COX-2 10 20 50 75 100 CONCLUSIONES CONCLUSIONES CONCLUSIONES CONCLUSIONES - El líquido amniótico modula el sistema prostanoide (COX/EPs/PGDH) diferencialmente según el trabajo de parto sea a término o pretérmino. El LA proveniente de mujeres con trabajo de parto prematuro induce la expresión proteica de la COX-2 y disminuye la de PGDH mientras que no modifica la expresión de EP1 en las membranas corioamnióticas. Por otro lado el LA proveniente de mujeres con trabajo de parto a término disminuye la expresión de PGDH e induce la del receptor EP1. -Los elevados niveles proteicos de PGDH con LA de pacientes sin trabajo de parto es persistente tanto en término como en pretérmino y podría estar vinculado con el mantenimiento de la quiescencia uterina. Expresión de COX-2 en membranas fetales incubadas con concentraciones crecientes de LA. Incubamos explantos de MF con diferentes concentraciones de LA pretérmino proveniente de mujeres con trabajo de parto y observamos un incremento en los niveles proteicos de COX-2 a partir del 50% de LA. COX-2 actina C PsTP PcTP 0 50 Control LPS pg EP1 EP1 + Bloq C PsTP PcTP actina PGDH C PsTP C PcTP actina 0 0,25 0,5 0,75 1 Control PsTP PcTP DO relativa (PGDH/actina) Expresión proteica de COX-2 (A), EP1 (B), y PGDH (C) en membranas fetales (corioamnióticas) coincubadas con líquido amniótico obtenido a partir de pacientes pretérmino con y sin trabajo de parto. D- Cuantificación de la densidad óptica de las bandas obtenidas para PGDH La coincubación con LA pretérmino de trabajo de parto se asocia con incremento en los niveles proteicos de COX-2 y disminución en los de PGDH mientras que la expresión del receptor EP1 permanece constante. C TsTP TcTP COX-2 EP1 C TsTP TcTP Bloq PGDH C TsTP TcTP actina 0 0,25 0,5 0,75 1 Control TsTP TcTP DO relativa (PGDH/actina) A B C D A B C D Expresión proteica de COX-2 (A), EP1 (B), y PGDH (C) en membranas fetales (corioamnióticas) coincubadas con líquido amniótico obtenido a partir de pacientes con y sin trabajo de parto a término. D- Cuantificación de la densidad óptica de las bandas obtenidas para PGDH Los resultados muestran que el LA de trabajo de parto incrementa los niveles proteicos de EP1 y disminuye la expresión de PGDH. Ensayo de viabilidad Analizamos la producción de PGE2 a partir de explantos de membrana fetal sometidos a un estímulo de LPS (10ug/ml) durante 24hs. Observamos un incremento significativo en la síntesis de PGE2 lo cual demuestra que los explantos son metabolicamente activos durante 48hs 0 40 Control PsTP PcTP TsTP TcTP pg Analisis por RIA de la producción de PGE2 a partir de explantos de membranas fetales incubados con LA pretérmino y término, con y sin trabajo de parto. Lla síntesis de PGE2 aumentó significativamente cuando las membranas fueron incubadas con LA pretérmino y término, ambos provenientes de pacientes con trabajo de parto. Pretérmino Término
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Los esfuerzos realizados para prevenir el trabajo de parto prematuro en la población general no han tenido unimpacto significativo sobre la morbimortalidad neonatal. Estas limitaciones terapéuticas son consecuencia deldesconocimiento de los mecanismos íntimos del inicio del trabajo de parto a termino y pretérmino ya que lostratamientos actuales actúan sobre el músculo uterino el cual es solamente un efector de un procesopatológico no bien identificado.Las membranas corioamnióticas (MF) son una entidad anatómica compleja y dinámica, capaz de secretardiferentes sustancias hacia el líquido amniótico en respuesta a estímulos recibidos tanto de la madre como delfeto.Durante el trabajo parto a término y pretérmino, se produce un dramático incremento en la liberación demediadores proinflamatorios como citoquinas y prostaglandinas (PGs). Las PGs son sintetizadas a partir delácido araquidónico por la vía de la ciclooxigenasa (COX) la cual existe en dos isoformas: COX-1 y COX-2. Enparticular, el amnios es la principal fuente de producción de prostaglandina E2 (PGE2), la cual ejerce susefectos vía la unión a receptores de membrana acoplados a proteína G (EP). Las membranas corioamnióticasexpresan 4 subtipos de EPs (EP1-4). Por unión a EP2 o EP4, PGE2 estimula la actividad de adenilato ciclasa(AC) y promueve relajación, mientras que uniéndose a EP1 o EP3, inhibe AC con la subsiguiente disminuciónde los niveles de AMPc que favorecen la contracción.Un rasgo sobresaliente de las prostaglandinas es la naturaleza transitoria de su existencia. La 15-hidroxiprostaglandina dehidrogenasa (PGDH) cataliza la oxidación del grupo 15-hidroxilo de lasprostaglandinas y las convierte en metabolitos inactivos que posteriormente son excretados por la orina.
INTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓN
Laboratorio de Fisiopatología de la Laboratorio de Fisiopatología de la Laboratorio de Fisiopatología de la Laboratorio de Fisiopatología de la Preñez y el PartoPreñez y el PartoPreñez y el PartoPreñez y el Parto
OBJETIVOOBJETIVOOBJETIVOOBJETIVO
TÉCNICASTÉCNICASTÉCNICASTÉCNICAS
Interacción materno fetal: el líquido amniótico como modulador de procesos vinculados al inicio del trabajo de parto
Leguizamón GF, Wolfson ML, Franchi AM, Farina MGLaboratorio de Fisiopatología de la Preñez y el Parto-CEFyBO-CONICET
CEMIC
RESULTADOS
RECOLECCIÓN DE MUESTRASRECOLECCIÓN DE MUESTRASRECOLECCIÓN DE MUESTRASRECOLECCIÓN DE MUESTRAS
Cultivo de Explantos:Las MF fueron lavadas exhaustivamente con solución fisiológica estéril y cortadas en discos de 8 mm dediámetro. Los explantos obtenidos se cultivaron en placas de 12 wells (Costar, USA) y se colocaron en 1 ml demedio RPMI 1640 suplementado con 5% de suero fetal bovino y antibióticos/antimicóticos (penicilina 100 U/ml,estreptomicina 100 g/ml, anfotericina B 0.25 g/ml) y se incubaron por 24 h a 37 oC en una atmósfera húmedacon 5% CO2 y 95% O2 para estabilizar los tejidos. Posteriormente, el medio fue removido y los explantos fueronincubados por 24 horas más con liquido amniótico de término o de pretérmino con y sin trabajo de parto
Para analizar la viabilidad tisular explantos de membranas fetales fueron sometidos a un estímulo (LPS, 10ug/ml). La producción de PGE2 fue posteriormente cuantificada por RIA.
Western Blot:En las MF se determinó por western blot la expresión de la COX-2, del receptor EP1, y de la PGDH. Para ello,las muestras fueron separadas por electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) y transferidas a unamembrana de nitrocelulosa. Las membranas fueron bloqueadas y posteriormente se incubaron con el primeranticuerpo: COX-2 Cayman (dil 1:500), EP1 Cayman (dil 1:250), y PGDH (D. Tsai) (dil 1:500). Posteriormentelas membranas fueron incubadas durante 1 hora con anticuerpo secundario conjugado a peroxidasa. Lasbandas fueron obtenidas por quimioluminiscencia (ECL).
Radioinmunoanálisis:Se cuantificó la producción de PGE2 liberada al medio de cultivo luego de la co-incubación con LA de término ypretérmino con y sin trabajo de parto .
100
150
200
250
pg d
e P
GE
2 / m
l
40
80
120
160
pg d
e P
GE
2 /
ml *
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Luego de obtener consentimiento informado, pacientes cursando un embarazo entre 24 y 41 semanas conmembranas fetales (MF) íntegras, sin evidencia de infección, ni de complicaciones médicas; fueron invitadas aparticipar en el estudio. Diferentes muestras fueron obtenidas según la edad gestacional:
1) PRETERMINO (24-37 semanas) : LA de pacientes con y sin trabajo de parto.
2) TERMINO (37-41 semanas): se obtuvo LA de pacientes con y sin trabajo de parto y membranas fetalesprovenientes de pacientes con cesáreas programadas sin trabajo de parto.
Membrana
AA
PGs
AA
COX
PGDH
Metabolitos
LLííquido quido amniamnióóticotico
EPs
Acciónbiológica
Membrana
AA
PGs
AA
COX
PGDH
Metabolitos
LLííquido quido amniamnióóticotico
EPs
Acciónbiológica
En el presente trabajo analizamos la relevancia del líquido amniótico (LA) enla modulación de las enzimas involucradas en la síntesis, acción ydegradación de las prostaglandinas en las membranas corioamnióticashumanas.
Para ello, investigamos el efecto del líquido amniótico proveniente demujeres con y sin trabajo de parto a término y pretérmino sobre laproducción de PGE2, y la expresión de COX-2, del receptor EP1, y de laenzima PGDH en las membranas corioamnióticas
COX-2
10 20 50 75 100
CONCLUSIONESCONCLUSIONESCONCLUSIONESCONCLUSIONES- El líquido amniótico modula el sistema prostanoide (COX/E Ps/PGDH) diferencialmente según el trabajo de parto sea a té rmino o pretérmino. El LA proveniente demujeres con trabajo de parto prematuro induce la expresión proteica de la COX-2 y disminuye la de PGD H mientras que no modifica la expresión de EP1 en lasmembranas corioamnióticas. Por otro lado el LA proveniente de mujeres con trabajo de parto a término disminuye la expresión de PGDH e induce la del receptorEP1.-Los elevados niveles proteicos de PGDH con LA de pacientes si n trabajo de parto es persistente tanto en término como en pre término y podría estar vinculado conel mantenimiento de la quiescencia uterina.
Expresión de COX-2 en membranas fetales incubadas conconcentraciones crecientes de LA.
Incubamos explantos de MF con diferentes concentraciones deLA pretérmino proveniente de mujeres con trabajo de parto yobservamos un incremento en los niveles proteicos de COX-2 apartir del 50% de LA.
COX-2
actina
C PsTP PcTP
0
50
Control LPS
pg d
e P
GE
2 / m
l
EP1 EP1 + Bloq
C PsTP PcTP
actina
PGDH
C PsTP C PcTP
actina
0
0,25
0,5
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Control PsTP PcTPDO
rela
tiva
(PG
DH
/act
ina)
Expresión proteica de COX-2 (A), EP1 (B), y PGDH (C) en membranas fetales (corioamnióticas) coincubadas conlíquido amniótico obtenido a partir de pacientes pretérmino con y sin trabajo de parto.D- Cuantificación de la densidad óptica de las bandas obtenidas para PGDH
La coincubación con LA pretérmino de trabajo de parto se asocia con incremento en los niveles proteicos de COX-2 ydisminución en los de PGDH mientras que la expresión del receptor EP1 permanece constante.
C TsTP TcTP
COX-2EP1
C TsTP TcTP Bloq
PGDH
C TsTP TcTP
actina
0
0,25
0,5
0,75
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Control TsTP TcTP
DO
rela
tiva
(PG
DH
/act
ina)
AB
CD
AB
C D
Expresión proteica de COX-2 (A), EP1 (B), y PGDH (C) en membranas fetales (corioamnióticas) coincubadas con líquidoamniótico obtenido a partir de pacientes con y sin trabajo de parto a término.D- Cuantificación de la densidad óptica de las bandas obtenidas para PGDH
Los resultados muestran que el LA de trabajo de parto incrementa los niveles proteicos de EP1 y disminuye la expresiónde PGDH.
Ensayo de viabilidad
Analizamos la producción de PGE2 a partir de explantos demembrana fetal sometidos a un estímulo de LPS (10ug/ml)durante 24hs. Observamos un incremento significativo en lasíntesis de PGE2 lo cual demuestra que los explantos sonmetabolicamente activos durante 48hs
0
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Control PsTP PcTP TsTP TcTP
pg d
e P
GE
2 /
ml
Analisis por RIA de la producción de PGE2 a partir de explanto s demembranas fetales incubados con LA pretérmino y término, co n ysin trabajo de parto.
Lla síntesis de PGE2 aumentó significativamente cuando lasmembranas fueron incubadas con LA pretérmino y término, ambosprovenientes de pacientes con trabajo de parto.
Pretérmino Término
