Laboratorio de reacción en cadena de la polimerasa pcr y ciclo de secuenciación
7
Laboratorio de Reacción en cadena de la polimerasa PCR y ciclo de secuenciación Dr. Giovanni González DMV, Esp, MsC Area de Biologia Molecular Justificación Pocos descubrimientos del complejo mundo científico actual pueden ser considerados realmente como revolucionarios. Sin embargo cuando ello ocurre, transformamos correctamente el modo en que trabajamos y pensamos. Aunque el progreso en las diferentes ciencias parece ser lento y su evolución resulta una letanía paso a paso, en el caso de la biología molecular ha sucedido lo contrario. Dicha disciplina ha sido afortunada con grandes cambios en tiempo relativamente corto. Uno de los principales cambios tecnológicos citados ocurrió en 1985 gracias al señor Kary Mullis, con la introducción de una de las herramientas moleculares con mayor aplicación en el laboratorio clínico veterinario: la reacción en cadena de la polimerasa, más conocida por siglas en inglés PCR (Polymerase Chain Reaction). Es de mi particular interés dar a conocer las pautas y aspectos generales de las técnicas de PCR y ciclo de la secuenciación, es necesario resaltar que para las dos, se
Transcript of Laboratorio de reacción en cadena de la polimerasa pcr y ciclo de secuenciación
Laboratorio de Reacción en cadena de la
polimerasa PCR y ciclo de secuenciación
Dr. Giovanni González DMV, Esp, MsC
Area de Biologia Molecular
Justificación
Pocos descubrimientos del complejo mundo científico actual pueden ser
considerados realmente como revolucionarios.
Sin embargo cuando ello ocurre, transformamos correctamente el modo en que
trabajamos y pensamos. Aunque el progreso en las diferentes ciencias parece ser
lento y su evolución resulta una letanía paso a paso, en el caso de la biología
molecular ha sucedido lo contrario. Dicha disciplina ha sido afortunada con
grandes cambios en tiempo relativamente corto. Uno de los principales cambios
tecnológicos citados ocurrió en 1985 gracias al señor Kary Mullis, con la
introducción de una de las herramientas moleculares con mayor aplicación en el
laboratorio clínico veterinario: la reacción en cadena de la polimerasa, más
conocida por siglas en inglés PCR (Polymerase Chain Reaction). Es de mi
particular interés dar a conocer las pautas y aspectos generales de las técnicas de
PCR y ciclo de la secuenciación, es necesario resaltar que para las dos, se
necesitan el uso del termociclador, siendo importante conocer su uso de forma
clara y exacta.
Objetivo.
Realizar en la práctica, un laboratorio de biología molecular usando las técnicas de
PCR y ciclo de la secuenciación, además aprender a usar y programar el
termociclador para amplificación de material genético.
Materiales:
Tubos para PCR y secuenciacion
Micropipetas
Puntas
Reactivos
Bandeja de PCR y secuenciacion
Rack para tubos
Papel microfilm
Protocolos para PCR
protocolo
- 16.38 µl de ddH2O.
- 2.5 µl de buffer 10x para PCR (500 mM [milimolar] de KCl, 100 mM de
Tris-HCl, pH 8.5).
- 0.5 µl de 2.5 mM de MgCl2.
- 2.5 µl de dNTP (desoxiribonucleósidos trifosfatados).
- 1 µl de cada cebador a una concentración de 20 µM.
- 0.12 µl de Taq polimerasa (Qiagen).
- 1 µl de ADN genómico.
Segundo protocolo.
- 14.22 µl de ddH2O.
- 2.5 µl de buffer 10x para PCR (500 mM [milimolar] de KCl, 100 mM de
Tris-HCl, pH 8.5).
- 0.5 µl de 2.5 mM de MgCl2.
- 2.5 µl de dNTP (desoxiribonucleósidos trifosfatados).
- 1 µl de cada cebador, a una concentración de 20 µM.
- 0.28 µl de Taq polimerasa (BOEHRINGER MANNHEIM).
- 3 µl de ADN genómico.
Tercer Protocolo
- 12.4 µl de ddH2O.
- 2.5 µl de buffer 10x, para PCR (500 mM [milimolar] de KCl, 100 mM de
Tris-HCl, pH 8.5).
- 3.0 µl de 2.5 mM de MgCl2.
- 2.5 µl de 8 µM de cada uno de los dNTP (desoxiribonucleósidos
trifosfatados).
- 1.25 µl de cada cebador a una concentración de 10 µM.
- 0.1 µl de 2.5 unidades de Ampli Taq (Perkin Elmer)
- 2 µl de ADN genómico.
Para cada uno de los protocolos presentados con anterioridad, se utilizaron
perfiles de amplificación diferentes, los perfiles son los siguientes:
Primer perfil de amplificación
Ciclo Temperatura ( ºC) Tiempo
1 94 2:00
2 94 O:30
3 57 0:40 seg (-0.5 por/ciclo)
4 72 0.3 ºC/seg
5 72 1:10 (+1seg/ciclo)
6 Ir a Ciclo 2 7 veces
7 94 0.30
8 53 0:40
9 72 1.18seg +1segundo por
ciclo
10 Ir a Ciclo 7 26 veces
11 72 10:00
12 10 Permanente
13 Fin Fin
Segundo perfil de amplificación.
Ciclo Temperatura ( ºC) Tiempo
Tercer perfil de amplificación.
Ciclo Temperatura ( ºC) Tiempo
1 94 3:00
2 94 1:10
3 52 1.30
4 72 2:30
5 Ir a Ciclo 2 30 veces
6 72 5:00
7 10 Permanente
8 fin fin
1 93 2:00
2 93 O:30
3 50 0.35
4 72 0.4 ºC/seg
5 72 1:10 (+1seg/ciclo)
6 Ir a Ciclo 2 34 veces
7 72 10:00
8 10 Permanente
9 fin fin
Ciclo de la secuenciación
componentes son:
- 3 µl de ddH2O
- 2 µl buffer 5x
- 1 µl de cada cebador a una concentración (ver Tabla 3)
- 1 µl Big Dye
- 3 µl de ADNmt (gelasa)
El perfil de secuenciación cíclica programado
Ciclo Temperatura ( ºC) Tiempo
1 95 0:15
2 60 0:30
3 60 4:00
4 Ir a Ciclo 1 29 veces
5 10 Permanente
6 fin Fin
El perfil de secuenciación cíclica programado para
Ciclo Temperatura ( ºC) Tiempo
1 96 0:15
2 95 0:10
3 50 0.05
4 60 4:00
5 Ir a ciclo 2 29 veces
6 10 Permanente
7 fin Fin
Nota. Es necesario el uso de bata blanca y guantes es de caracter obligatorio
