Técnicas de aislamiento Mantenimiento y preservación de cultivos puros

El cultivo puro representa las condiciones artificiales para el desarrollo de las bacterias y otros microorganismos y las condiciones impuestas a los microorganismos mediante el manejo del laboratorio.

Para determinar las características de especies concretas de microorganismos, es imperativo que el organismo se aislé y se desarrolle en el laboratorio como un cultivo libre de otras especies.

¿Qué condiciones requiere el crecimiento microbiano?medio de cultivo: Una solución acuosa con los nutrientes y factores de crecimiento necesarios.

Los μorganismos crecen en unmedio de cultivo artificial se requieren condiciones como:temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno asi como un grado correcto de acidez o alcalinidad

.

CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Según su estado físico LíquidosUsualmente se denominan caldos ya que contienen los nutrientesdisueltos en agua. Permiten obtener suspensiones con un elevadonúmero de microorganismos. Ej. Caldo nutritivo. SólidosSe pueden preparar a partir de medios líquidos a los cuales se lesañaden agentes solidificantes como agar, gelatina o sílica gel. Seutilizan con frecuencia en el aislamiento y mantenimiento de losmicroorganismos en el laboratorio. Ej. Agar nutritivo.

Según la naturaleza de sus constituyentes

Medios naturales o complejos (Indefinidos) Están constituidos por sustancias complejas de origen

animal o vegetal y usualmente se complementan con el añadido de minerales y otras sustancias. No se conocen todos los componentes del medio de cultivo, ni las cantidades exactas en que están presentes.

Ej. Extracto de carne, extracto de levaduras.

Medios sintéticos (químicamente definidos) Se preparan a partir de ingredientes químicamente puros y

por lo tanto, Se puede conocer exactamente su composición cuali y

cuantitativa. Por su costo sólo se emplean en procedimientos

especiales.

E. coli

Medio definido Medio Complejo

K2HPO4 7 g Glucosa 15 g

KH2PO4 2 g Extracto de levadura

5 g

(NH4)2SO4 1 g Peptona 5 g

MgSO4 0.1 g K2HPO4 2 g

CaCl2 0.02 g Agua destilada 1000 ml

Glucosa 4-10 g pH 7

Elementos traza (Fe, Co, Mn, Zn, Cu, Ni, Mo)

2-10 µg

Agua destilada 1000 ml

pH 7

3. Según sus propósitos de uso

Medios de enriquecimiento Al cultivo en medio líquido que resulte en un

incremento en el número de un tipo dado de μorganismo en relación con el número de otros tipos de μorganismos que puedan estar en el inoculo.

Puede contener sustancias que favorezcan el crecimiento del μorganismo que nos interesa o que inhiban el crecimiento de los otros tipos de microorganismos presentes.

La selectividad de un cultivo de enriquecimiento no está determinada únicamente por la composición química, sino que puede ser variada significativamente modificando otros factores tales como: temperatura, pH, fuerza iónica, iluminación, aireación etc.

Adición de sangre, suero o extracto de tejidos de animales y plantas.

Medios selectivos Se diferencian de los enriquecidos por ser medios

sólidos y están diseñados para el aislamiento de microorganismos específicos.

Ej. CO2 como fuente de carbono es selectivo para autótrofos, la adición de cristal violeta se inhibe el crecimiento de los Gram+, utilizando maltosa como única fuente solo crecerán los que usen maltosa.

Ej. Caldo tetrationato utilizado para el enriquecimiento de las especies del género Salmonella provenientes de muestras de heces, orina, agua o alimentos

Medios diferenciales Son aquellos destinados a facilitar la

discriminación de microorganismos de una mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento en dichos medios.

contienen indicadores de productos derivados de la actividad metabólica de los μorganismos sobre algunos de los componentes del medio.

Ej.: Agar base rojo fenol utilizado para detectar fermentación de carbohidratos.

Medio de cultivo Tipo de medio Agente bacteriostático

Azúcar fermentable

Sistema Indicador

ALRF (agar lactosa rojo fenol)

diferencial (no selectivo)

----- lactosa rojo fenol

Agar Cetrimide selectivo bromuro de cetiltrimetil amonio

------- --------

Agar Mac Conkey

selectivo y diferencial

cristal violeta, sales biliares

lactosa rojo neutro

SS agar (Salmonella Shigella)

selectivo y diferencial

verde brillante, sales biliares

lactosa rojo neutro, citrato férrico

VRBA (violeta rojo bilis agar)

selectivo y diferencial

cristal violeta, sales biliares

lactosa rojo neutro

Manitol Salt Agar (Chapman)

selectivo y diferencial

cloruro de sodio manitol rojo fenol

EMB agar (eosin methylen blue)

selectivo y diferencial

eosina y azul de metileno

lactosa eosina y azul de metileno

XLD agar (xilosa lisina desoxicolato)

selectivo y diferencial

desoxicolato de sodio

lactosa, xilosa, sacarosa

rojo fenol, citrato férrico amónico y tiosulfato de sodio

BiS agar (bismuto sulfito)

selectivo y diferencial

verde brillante, sulfito de bismuto

glucosa indicador de sulfito de Bi y sulfato ferroso

Baird Parker agar selectivo y diferencial

Cloruro de litio y telurito de potasio

------ yema de huevo, telurito de potasio

TSB + 10% NaCl enriquecimiento selectivo

cloruro de sodio ------ -------

Caldo Tetrationato

enriquecimiento selectivo

Tetrationato, sales biliares

------ ------

CLBVB (caldo lactosa bilis verde brillante)

enriquecimiento selectivo

verde brillante, sales biliares

lactosa producción de gas

Medios de mantenimientoSuelen ser distintos a los de crecimiento

óptimo ya que el crecimiento y prolífico suele ocasionar la muerte rápida de las células.

Ej. Añadir glucosa y utilizarla los microorganismos producen ácidos, acidificándose el medio por lo que es preferible no utilizar glucosa en los medios de mantenimiento

• Métodos especiales de cultivoSiembra en superficie sobre medio sólidoSiembra en profundidad (vertido en placa)Dilución y solidificación en tuboCultivo en células vivasCultivo en animales Mycobacterium leprae

Importancia del cultivo de microorganismos:

•Obtención de cultivos puros.

•Análisis morfológico, fisiológico, genético y otras características.

•Producción.

•Conteo de colonias (UFC)

Siembra por estrías

Dilución en serie

Técnica de las diluciones en serie

Dilución Tipo de microorganismo

10-1 a 10-3 Hongos

10-4 a 10-6 Levaduras

10-7 a 10-10 Bacterias

Para el aislamiento de microorganismos se puede aplicar la técnica de aislamiento por estría o por extensión en superficie (se trasfiere de 0.1 a 0.5 ml.)

Mantenimiento y preservación de cultivos puros.

- Resiembra periódica en medios frescos. Depende de el medio de cultivo Temperatura propia para mantener los

cultivos El tiempo de resiembra.

- Preservación de cultivos con una capa de aceite mineral. Para cultivos en agar inclinado el aceite

deberá cubrir mas o menos 1.5 cm. Del pico de flauta del agar inclinado.

Mantenimiento y preservación de cultivos puros.

- Liofilización. Proceso utilizado para la eliminación de agua, mediante desecación al vacío y a muy bajas temperaturas.

- Almacenamiento a temperaturas

muy bajas en presencia de agentes estabilizantes como glicerol, dimetilsulfóxido, nitrógeno líquido (-196ºC)

CONTROL MICROBIANO

MÉTODOS DE CONTROL

Son técnicas para destruir microorganismos y se dirige hacia la destrucción completa de cualquier área donde puedan hacer daño.

MÉTODOS FÍSICOS Y MÉTODOS

QUÍMICOS

ESTERILIZACIÓN MEDIANTE PRINCIPIOS FÍSICOS

TEMPERATURA: Influyen directamente sobre el metabolismo celular, las proteínas se desnaturalizan al romperse los enlaces de H y S en sus estructuras secundarias y terciarias, bajo estas circunstancias se pierden las actividades funcionales de dichas proteínas como la funcionalidad enzimática .

Mesofílicas: 25ºC – 37ºC

Psicrofílicas: 4ºC – 10ºC

Termofílicas: 80ºC

Clostridium botulinum

endosporas

Clostridium tetani

La aplicación de calor representa uno de los mecanismos más importantes para producir esterilidad.

El ambiente es un factor importante para la destrucción de μorganismos, el calor debe alcanzar al μorganismos. Calor Húmedo: 1.- Desnaturalización de proteínas

2.- Oxidación de proteínas Calor Seco: 1.- desnaturalización de proteínas

2.- Daño oxidativo

3.- Efecto tóxico por alta concentración de

electrolitos.

Efecto del calor

Daño en el inicio de la síntesis de proteínas.

Salida de aa y de iones K+ Autodegradación de ácidos nucleicos Daño en la membrana celular afectando

el paso de solutos al interior y la salida de estos.

Daño en la respiración, el mecanismo reside en la membrana.

Métodos por CALOR SECO: estufas de aire caliente. Estas constan de

una doble cámara, el aire caliente generado por una resistencia eléctrica circula por la cavidad principal y por el espacio entre ambas cámaras, a temperaturas variables, entre 180ºC – 250ºC, ciclos de 1-2 h.

Indicador Biológico: B. Subtilis var. Niger

Tipo de material:• Instrumental quirúrgico (metálico)• Material de vidrio, porcelana y metal• Polvos termoestables• Grasas, aceites, parafinas, ceras....

Llama directa Consiste en colocar el material

directamente al fuego hasta que éste se ponga al rojo vivo. De esta forma se queman los contaminantes hasta reducirlos a cenizas.

microbiología para esterilizar el asa con la llama del mechero..

IncineraciónEl material a esterilizar se coloca en cámaras

especiales que alcanzan elevadas temperaturas. Con este método se queman los contaminantes hasta reducirlos a cenizas.

Es una forma efectiva de esterilizar el material contaminado a descartar tales como

bolsas, papel, uniformes desechables, cadáveres de animales,

CALOR HÚMEDO – Elementos autoclave El vapor bajo presión

es el agente de esterilización más eficiente confinamiento de vapor en un recipiente cerrado, la presión se eleva y la temperatura aumenta en forma correspondiente. Con una presión de 1.05 Kg/cm3, la temepartura del vapor alcanza 121ºC, con una atmósfera libre de aire.

Elementos del autoclave: • Sistemas control de presión y válvulas seguridad• Llave de purga para eliminar el aireIndicador Biológico: Bacillus sterothermophillus

Ventajas Rápido calentamiento y penetración Destrucción de bacterias y esporas en

corto tiempo No deja residuos tóxicos Hay un bajo deterioro del material

expuesto Económico  Desventajas No permite esterilizar soluciones que

formen emulsiones con el agua Es corrosivo sobre ciertos instrumentos

metálicos

Agua en ebullición. El efecto letal aumentará si se le

adiciona carbonato de sodio al 2% o detergentes, las esporas que son resistentes al agua en ebullición x + de 2 h, pueden morir a 98ºC en 10 a 30 min. En sol. De carbonato de sodio al 2%.

PASTEURIZACIÓN

Pasteurización Lenta: 62.9ºC por 30 min., seguido de un enfriamiento rápido a 4ºC.

Pasteurización Rápida: 71.6ºC – 80ºC durante 15 segundos y rápidamente refrigerarla.

Ultrapasteurización: 100 ºC durante fracciones de segundos procediendo a la inmediata refrigeración.

Principales μorganismos patógenos que provocan tuberculosis, brucelosis, fiebre de tifoidea, difteria, escarlatina y la fiebre Q, como la mayor parte de los μorganismos que provocan que la leche se agrie.

Tyndalización: Esterilización por acción discontinua del vapor de agua,

se basa en el principio de Tyndall.

Las bacterias que resisten una sesión de calefacción, hecha en determinadas condiciones, pueden ser destruidas cuando la misma operación se repite con intervalos separados y en varias sesiones.

Se efectúa por medio del autoclave de Chamberland, dejando abierta la válvula de escape, o sea funcionando a la presión normal. Puede también realizarse a temperaturas más bajas, 56º u 80º para evitar la descomposición de las sustancias a esterilizar, por las temperaturas elevadas.

FILTRACIÓN

Este procedimiento es aplicable a la esterilización de líquidos y gases, especialmente los primeros. Cuando el líquido a filtrar no puede resistir, sin descomponerse , la acción del calor, se aplica la técnica de filtración, la que puede efectuarse mediante presión o aspiración.

filtros de porcelana "de Chamberland" y los de tierras infusorias calcinadas "Berkefield"

Esponjas de asbesto “filtros de Sietz” Membrana de ester de celulosa de 8 – 0.25 μ Ej. Vacunas, cuantificación bacterias en agua y

aire, separar toxinas de las bacterias, antibióticos, proteínas, cateter,

RADIACIÓN

Como la transmisión de energía a través del espacio.

Radiaciones ionizantes: ( rayos x, rayos gamma y rayos catódicos) y rayos ultravioleta,

Ej. Artículos farmacéuticos, plásticos como cajas de petri, jeringas, catéteres.

Rayos x para preservar frutas, vegetales y carne de cerdo.

Luz ultravioleta, longitud de onda corta cubre un espectro que va desde una manera parcial visible hasta una totalmente obscura, longitud de onda desde 390 a 40 nm, con un efecto letal máximo a 260 nm

MÉTODOS QUÍMICOS

AGENTES QUÍMICOS

Son agentes que matan o inhiben el crecimiento de los μorganismos.

Antiséptico Desinfectante Conservadores

ANTISÉPTICO

Agentes microbicidas que pueden aplicarse sobre la piel y mucosas, pero no pueden usarse internamente.

Desinfectantes

Agentes que matan μorganismos pero no necesariamente sus esporas y no deben aplicarse sobre tejidos sino sobre objetos inanimados como mesas, pisos, utensilios, etc.

Ejemplos: cloro, hipoclorito, compuestos clorados, soda, sulfato de cobre, compuestos de amonio cuaternario, etc.

Conservadores

Agentes usados frecuentemente en alimentos pero también en productos farmacéuticos para inhibir el crecimiento de μorganismos Por consiguiente al ser ingeridos no deben ser tóxicos.

Ej: propionato de calcio, benzoato de sodio, formaldehído, nitrato, dióxido de azufre.

Etanol (50-70%)Desnaturaliza proteínas y solubiliza lípidos 

 Isopropanol (50-70%) Desnaturaliza proteínas

y solubiliza lípidos 

Formaldehído (8%) Reacciona con grupos-NH2, -SH y -COOH Desinfectante, mata endosporas

Cloro (Cl2) gas .Forma ácido hipocloroso (HClO), un fuerte agente oxidante Desinfección en general y en particular para agua potable

Detergentes (ej. amonios cuaternarios). Ruptura de membranas celulares Desinfectantes y antiséptico de piel 

Conservadores

Ácido propionico y propionatos0,32% Agente antifúngico en panes, quesos

Acido sórbico y sorbatos0,2% Agente antifúngico en quesos, mermeladas, jugos

Acido benzoico y benzoatos 0,1% Agente antifúngico en margarina, sidra, bebidas gaseosas.

Acido láctico variable Agente antimicrobiano en queso, manteca, yogur.

Dióxido de azufre, sulfitos 200-300 ppm Agente antimicrobiano en frutas secas, uvas.

Nitrito de sodio 200 ppm Agente antimicrobiano en alimentos curados, pescado

Cloruro de sodio variable Previene el deterioro microbiano en carnes, pescado, etc.

Azúcar variable Previene el deterioro microbiano en mermeladas, jugos, jaleas, etc.

Agentes biológicos son sustancias sintéticas,

semisintéticas o producidas por μorganismos capaces de matar o inhibir el desarrollo de otros μorganismos.

Los agentes antivirales, antibacterianos y antifúngicos,  se definen como aquellos agentes biológicos capaces de inactivar virus, bacterias y hongos, respectivamente.

pueden variar según la toxicidad selectiva que presenten, los antibióticos no actúan de manera similar en todos los tipos celulares -por el contrario- presentan una toxicidad selectiva y según se trate de una agente antifúngico o uno antibacteriano, inactivará células fúngicas o bacterianas.

Para el control de las enfermedades infecciosas en plantas, animales y humanos es  indispensable el uso de antibióticos con la capacidad para inhibir las bacterias u otros m.o. sin causar daño al huésped.

Mecanismos de acción 1- Inhibición de la síntesis de peptidoglicano a- Antibióticos beta-lactámicos naturales y semisintéticos

(penicilinas, cefalosporinas, carbapenems, monobactam) b- Vancomicina (natural) c- Bacitracina (natural) 2- Alteración de la membrana citoplasmática a- Polimixina B (natural)

b- Anfotericina B (natural) c- Nistatina (natural) d- Imidazoles (natural)

3- Inhibición de la síntesis proteica Bloqueo de la transcripción (prevención de la síntesis de ARN) a- Rifampicina (natural)

  b- Etambutol (no natural) Bloqueo de la traducción (alteración de ribosomas bacterianos)   a- aminoglicósidos (natural)

  b- tetraciclinas (natural)   c- Lincosamina y clindamicina (natural)   d- macrólidos (naturales y semisíntéticos)

4- Interferencia con la síntesis de ADN a- Fluoroquinolonas (no natural, Ej: ciprofloxacina)

b- Sulfonamidas y trimetroprim (no naturales)