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NORMA CUBANA NC ISO 7889:2009

(Publicada por la ISO en 2003)

YOGURT — ENUMERACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS CARACTERÍSTICOS — TÉCNICA DEL CONTEO DE COLONIAS A 37 ºC (ISO 7889:2003, IDT)

Yogurt — Enumeration of characteristic microorganisms — Colony count technique at 37 ºC

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Prefacio La Oficina Nacional de Normalización (NC), es el Organismo Nacional de Normalización de la República de Cuba y representa al país ante las organizaciones internacionales y regionales de normalización. La elaboración de las Normas Cubanas y otros documentos normativos relacionados se realiza generalmente a través de los Comités Técnicos de Normalización. Su aprobación es competencia de la Oficina Nacional de Normalización y se basa en las evidencias del consenso. Esta Norma Cubana: • Ha sido elaborada por el Comité Técnico de Normalización NC/CTN 35 de Leche y Productos

lácteos integrado por representantes de las siguientes entidades.

- Centro Nacional de Inspección de la Calidad (CNICA) - Laboratorios CUBACONTROL S.A. - Instituto de Nutrición e Higiene de los Alimentos (INHA) - Instituto de Investigaciones en Normalización – ONN - Centro nacional de higiene de los Alimentos (IMV) - Oficina Nacional de Normalización - Ministerio de la Agricultura - Alimport - MINCEX - Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA) - Ministerio de Comercio Interior - MINCIN - Unión Láctea – MINAL y sus empresas lácteas. - Instituto de Investigaciones de la Industria Alimenticia (IIIA)

• Es una adopción idéntica por el método de traducción de la Norma Internacional ISO 7889:

2003 Yogurt. General guidance for the enumeration of characteristics microorganisms. Colony count technique at 37 ºC.

© NC, 2009 Todos los derechos reservados. A menos que se especifique, ninguna parte de esta publicación podrá ser reproducida o utilizada en alguna forma o por medios electrónicos o mecánicos, incluyendo las fotocopias, fotografías y microfilmes, sin el permiso escrito previo de: Oficina Nacional de Normalización (NC) Calle E No. 261, Vedado, Ciudad de La Habana, Habana 4, Cuba.

Impreso en Cuba.

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YOGURT — ENUMERACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS CARACTERÍSTICOS — TÉCNICA DEL CONTEO DE COLONIAS A 37ºC

1 Objeto La presente norma especifica un método para la enumeración de los microorganismos característicos del yogur mediante el conteo de colonias a 37 ºC. El método es aplicable al yogur, donde se encuentran viables los microorganismos Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus. 2 Referencias normativas Las siguientes normas contienen disposiciones que, al ser citadas en este texto, constituyen disposiciones de esta Norma Cubana. Las ediciones indicadas estaban en vigencia en el momento de esta publicación. Como toda norma está sujeta a revisión, se recomienda a aquellos que realicen acuerdos sobre la base de ellas que analicen la conveniencia de usar ediciones más recientes de las normas citadas seguidamente. La Oficina Nacional de Normalización posee en todo momento la información sobre las normas internacionales, regionales y cubanas en vigencia. NC ISO 6887-1:2002, Microbiology of food and animal feeding stuffs-Preparation of test simples, initial suspensions and decimal dilutions for microbiological examination- Part 1: General rules for the preparation of the initial suspensions and decimal dilutions. ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs- General rules for microbiological examinations. ISO 8261/ IDF 122, Milk and milk products- General guidance for the preparation of test samples, initial suspensions and decimal dilutions for microbiological examination 3 Términos y definiciones Los siguientes términos y definiciones se aplican para los propósitos de este documento. 3.1 Microorganismos característicos del yogur El Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y el Streptococcus thermophilus, son detectados bajo las condiciones especificadas en esta Norma Estándar Internacional.

3.2 Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus Microorganismo termófilo, que forma colonias lenticulares y frecuentemente aguzadas de diámetro desde 1 mm a 3 mm en el medio MRS acidificado, bajo las condiciones especificadas en esta norma.

Nota: Al microscopio, estos microorganismos aparecen como bacilos, generalmente cortos, en ocasiones alargados. No forman esporas, son Gram positivos, no mótiles y catalasa negativos.

3.3 Streptococcus thermophilus Microorganismos termófilos que forman colonias lenticulares de diámetro desde 1 mm a 2 mm en el medio M17, bajo las condiciones especificadas en esta Norma Estándar Internacional.

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Nota: Al microscopio, estos microorganismos aparecen como células ovoides o esféricas (de diámetro 0,7 μm a 0,9 μm), en pares o en cadenas largas. Son Gram positivos y catalasa negativos.

4 Principio Diluciones decimales de la muestra se inoculan en:

a) Medio MRS acidificado, seguido de una incubación anaeróbica a 37 ºC ±1 ºC por 72 horas para el conteo de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus.

b) Medio M17 completo seguido por una incubación a 37 ºC ± 1 ºC por 48 h para el conteo de

Streptococcus thermophilus. 4.2 Las colonias son contadas y confirmadas mediante las pruebas apropiadas.

4.3 El número de microorganismos característicos por gramo de muestra es calculado a partir del número de colonias obtenidas en las placas cuyos niveles de dilución muestren un resultado significativo.

5 Medios de cultivo, diluentes y reactivos Usar solo los reactivos de grado analítico reconocido especificados y agua destilada o desmineralizada o agua con pureza equivalente. Ver también ISO 6887-1 e ISO 8261 / IDF 122. 5.1 Diluentes Ver ISO 6887-1 e ISO 8261/ IDF 122 5.2 Medio de cultivo Usar los medios M17 y MRS frescos, los cuales no deberán exponerse directamente a la luz del sol.

Si el medio de cultivo preparado no es usado inmediatamente, debe ser enfriado y almacenado de 2 a 4 ºC, no más de una semana y bajo condiciones que no produzcan cambios en su composición.

En el caso de los reactivos ver las condiciones de almacenamiento en ISO 7218.

5.2.1 Medio MRS acidificado (Ver bibliografía [7])

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5.2.1.1 Composición

Peptona 1 (digestión tríptica de caseína) 10,0 g Extracto de malta 10,0 g Extracto de levadura (seco) 5,0 g Glucosa (C6 H12 O6) 20,0 g Tween 80 (sorbitan mono-oleato) 1,0 ml Ortofosfato hidrógeno de dipotasio (K2HPO4) 2,0 g Acetato de sodio trihidratado (CH3CO2Na 3H2O) 5,0 g Citrato de diamonio [C6H6O7 (NH4)2] 2,0 g Sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4 7H2O) 0,2 g Sulfato de manganeso tetrahidratado (MnSO4 4H2O) 0,05 g Agar 9,0 g a 18,0 g 1)

Agua hasta 1000 ml 1) Dependiendo de la fuerza de gel del agar, acorde con las instrucciones del elaborador. 5.2.1.2 Preparación Disolver cada componente por separado en un baño de agua hirviendo (6.7). Enfriar en otro baño de agua a 50 ºC. Ajustar pH, tal que después de la esterilización esté en 5,4 ± 0,1 a 25 ºC ± 1 ºC por adición de ácido acético (5.3.3) chequeando con el pH-metro (6.8). Transferir porciones de 100 ml de medio en frascos de 150 ml (6.10) o porciones 200 ml en frascos de 250 ml. Esterilizar 15 min en autoclave a 121 ºC ± 1 ºC. Nota 1. El MRS es altamente sensitivo al calor, el cual puede causar diferencias de acuerdo a la autoclave usada. Las pruebas comparativas han demostrado que el medio MRS comercial puede mostrar conteos más bajos que los que muestra el medio MRS preparado acorde con esta norma. Esto puede causar problemas a los productores de yogur, por lo que las autoridades investigan el conteo celular mínimo en este producto. Antes del comienzo del examen bacteriológico, mezclar completamente la cantidad del medio requerida en un baño de agua hirviendo (6.7). Enfriar en otro baño de agua (6.7). 5.2.2 Medio M17 (Ver bibliografía [8] 5.2.2.1 Medio Básico

5.2.2.1.1 Composición

Peptona 1 (digestión tríptica de caseína) 2,5 g Peptona 2 (digestión peptídica de carne) 2,5 g Peptona 3 (digestión papaina de soya) 5,0 g Extracto de carne 5,0 g Extracto de levadura (seco) 2,5 g β-glicerofosfato (sal disódica) (C3H7O6 PNa2) 19,0 g Sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4 7H2O) 0,2 g Acido ascórbico (C6 H8 O6) 0,5 g Agar 9,0 g a 18,0 g 1)

Agua hasta 950 ml

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5.2.2.1.2 Preparación Disolver cada componente por separado en un baño de agua hirviendo. Enfriar en oto baño de agua (6.7) a 50 ºC. Ajustar el pH tal que después de la esterilización esté en 6,8 ± 0,1 a 25 ºC ± 1 ºC por adición de ácido acético (5.3) chequeando con el pH-metro (6.8). Transferir porciones de 95 ml de medio en erlenmeyers de 150 ml (6.10). Esterilizar 15 min en autoclave a 121 ºC ± 1 ºC. 5.2.2.2 Solución de lactosa 5.2.2.2.1 Composición

Lactosa (C12 H22 O11) 10,0 g Agua hasta 950 ml

5.2.2.2.2 Preparación Disolver la lactosa en agua. Diluir con agua a 100 ml. Esterilizar por 15 min en autoclave a 121 ºC ± 1 ºC. 5.2.2.3 Medio completo M17 5.2.2.3.1 Composición

Medio Básico (5.2.2.1) 95,0 g Solución de lactosa 5,0 ml

5.2.2.3.2 Preparación Inmediatamente antes del uso, mezclar el medio básico en baño de agua hirviendo (6.8). Enfriar en otro baño de agua (6.7) a 50 ºC. Precalentar la solución de lactosa en baño de agua (6.7) a 50 ºC. adicionar la solución de lactosa al medio básico y mezclar agitando). Enfriar el medio en baño de agua entre 44 ºC y 47 ºC.

Nota: El medio completo está disponible en el comercio, pero de manera similar al caso del MRS, los resultados pueden diferir significativamente de un suministrador a otro, esto puede causar problemas a los productores de yogur, por lo que las autoridades investigan el conteo celular mínimo en este producto.

5.3 Reactivos para el ajuste del pH 5.3.1 Solución de hidróxido de sodio: c(NaOH)= 0,1 mol/l aproximadamente. 5.3.2 Acido clorhídrico diluido: c (HCL)= 0,1 mol/l aproximadamente. 5.3.3 Acido acético: (CH3COOH), 100% (glacial). 5.4 Reactivos para tinción: solución etanólica de azul de metileno, 6 g/l. 5.5 Reactivos para limpieza de superficies: etanol 70 %.

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6 Equipos y cristalería La esterilización del equipamiento que está en contacto con la muestra, los diluentes, las diluciones o el medio de cultivo se realizará de acorde a los requerimientos de ISO 8261/ IDF 122. La cristalería deberá ser resistente a esterilizaciones repetidas. Se empleará el equipamiento usual de laboratorio microbiológico (ver ISO 7218) para la preparación de las muestras y diluciones, como se especifica en ISO 8261/ IDF 122 y en particular lo siguiente. 6.1 Incubadora: capaz de operar a 37 ºC ± 1 ºC. 6.2 Cabina de incubación anaeróbica o jarra anaeróbica: capaz de mantener la temperatura a 37 ºC ± 1 ºC, una atmósfera de 90 % de nitrógeno y 10 % de dióxido de carbono. 6.3 Mezclador: tipo peristáltico con bolsas plásticas estériles o rotatorio capaz de operar a una frecuencia mínima rotacional de 20 000 min-1, con tubos de centrífuga estériles de fondo redondo de 200 ml de cristal resistente o recipientes de metal con capacidad adecuada. 6.4 Agitador de tubos: por ejemplo un mezclador vortex. 6.5 Equipo contador de colonias: como se especifica en ISO 7218. 6.6 Lupas: aumento x 8 a x 10 6.7 Baños de agua: capaces de operar entre 44 ºC y 47 ºC, a 45 ºC ± 1 ºC, a 50 ºC ± 1 ºC, y de llegar a la temperatura de ebullición. 6.8 pH-metro: preciso a ± 0,1 unidades de pH a 25 ºC ± 1 ºC (ver también ISO7218). 6.9 Frascos de dilución: de capacidad 50 ml a 250 ml o tubos de diámetro y largo de 18 mm por 180 mm, con tapa de goma o material sintético. 6.10 Frascos o recipientes: con tapa de goma o material sintético de capacidad 150 ml a 250ml. 6.11 Tubos de ensayo: con tapas de goma, de capacidad de 20 ml, para conservar el medio de cultivo. 6.12 Pipetas graduadas: para uso bacteriológico, esterilizadas y calibradas con capacidad de descarga de 1ml ± 0,02 ml y 10ml ± 0,2 ml (ver ISO 6887-1). 6.13 Placas petri: de cristal transparente o plásticas, de diámetro 90 mm y 140 mm, de profundidad interna de 10 mm como mínimo. El fondo de las mismas no deberá presentar irregularidades que puedan interferir en el conteo de colonias. 6.14 Espátula: de cristal o metal esterilizadas.

7 Muestreo Es importante que el laboratorio reciba una muestra que sea realmente representativa y no haya sido cambiada o dañada durante el transporte o almacenamiento. El muestreo no es parte del método especificado en esta Norma Estándar internacional, un método

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de muestreo recomendado se encuentra en ISO 707.

8 Preparación de la muestra de ensayo Preparar la muestra de ensayo de acuerdo a ISO 8261. Tomar las precauciones siguientes antes de abrir la muestra de yogur. Limpiar la superficie externa alrededor del área de donde será tomada la muestra, para eliminar cualquier material que pueda contaminarla. El área puede ser higienizada con etanol 70 % (5.5) para prevenir la contaminación adicional. Abrir el recipiente asépticamente. 9 Procedimiento General Para requerimientos generales, ver ISO 8261/ IDF122.

Yogures no afrutados Mezclar cuidadosamente el contenido del recipiente de la muestra usando una espátula (6.14). Pesar 10 g ± 0,1 g de la muestra de ensayo en un recipiente disponible [utilizar un tubo de centrífuga de fondo redondo de cristal resistente de 200 ml, o la concavidad del mezclador rotatorio o el recipiente plástico del mezclador peristáltico (6.3)].

Yogures afrutados Mezclar el contenido completo del recipiente de la muestra por 1 min, usando el mezclador (6.3). Pesar 10 g ± 0,1 g de la muestra de ensayo en un recipiente disponible como se describe en 9.1.2.

Examen microscópico Realizar un examen microscópico preliminar, observando varios campos de un frotis de la muestra (capítulo 8), previamente teñida con azul de metileno (5.4), para estimar la densidad de los dos tipos de bacterias, cocos y bacilos y seleccionar el rango de dilución apropiado que será empleado para el conteo de cada tipo.

Preparación de la dilución primaria Ver ISO 8261/ IDF 122.

Las operaciones descritas en 9.3 a 9.6.4 no deberán realizarse a exposición de la luz solar.

Adicionar el diluente (5.2) a la porción de ensayo (9.1.2 o 9.1.3) hasta una masa de porción de ensayo de 50 g. Mezclar por 1 min con el mezclador (6.3). Diluir a 100 g con el diluente para obtener una dilución de 101.

Preparación de diluciones decimales Ver ISO 8261/IDF 122

Duración del procedimiento Ver ISO 8261/IDF 122 Inoculación e incubación

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9.6.1 Transferir, por duplicado, 1ml de cada dilución (que contiene el Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus) a placas petri, con una pipeta estéril (6.13). 9.6.2 Para Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, verter 15 ml de medio en placas petri con el medio MRS acidificado (5.2.1) mantenido en baño de agua a 45 ºC (6.7) (6.13). 9.6.3 Para Streptococcus thermophilus, verter 15 ml en placas petri con el medio M17 (5.2.2), calentado en un baño de agua (6.7) a 45 ºC entre 44 ºC y 47 ºC (6.13). 9.6.4 Mezclar cuidadosamente el inóculo con el medio por rotación de las placas petri (9.6.2 o 9.6.3). Colocarlas en una superficie fría horizontal para que se solidifique esta mezcla. 9.6.5 Incubar las placas petri en posición invertida. Colocar no más de 6 por pila. Las pilas de placas deberán ser separadas unas de otras, de las paredes y del techo de la incubadora (6.1). 9.6.6 Las placas incubadas serán usadas para la enumeración de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus en una cabina de incubación anaeróbica o jarra anaeróbica (6.2) en la incubadora (6.1) a 37 º C por 72 h. 9.6.7 Las placas incubadas serán usadas para la incubación de Streptococcus thermophilus en la incubadora (6.1) a 37ºC por 48 h. 9.7 Conteo de colonias 9.7.1 Después del periodo de incubación especificado (9.6.6 y 9.6.7), contar las colonias que muestren los rasgos de los microorganismos característicos [Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (3.2) y Streptococcus thermophilus 3.3)] en las placas que contengan de 15 a 300 colonias (ver anexo A). Nota: Si ocurren problemas con el conteo de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus el medio MRS, el medio LBA desarrollado por NIZO 2), puede ser usado; ver también Anexo A.

2 Nizo Food Research, Kernhemseweg 2, Postbus 20 6710 BA, Ede, The Netherlands. 9.7.2 Examinar las placas bajo condiciones de luz adecuadas, para facilitar el conteo puede emplearse el contador de colonias (6.5). No cometer errores al contar restos de partículas no disueltas o precipitadas de la muestra como colonias. Examinar las colonias dudosas cuidadosamente, empleando una lupa (6.6) del mayor aumento requerido para distinguir las colonias de partículas extrañas. 9.8 Confirmación Seleccionar las colonias de las placas usadas para el conteo tal que el número tomado de las mismas sea igual a la raíz cuadrada del conteo total de colonias. Teñirlas empleando el método de Gram y confirmar que las mismas, no forman esporas, son bacilos Gram positivos y catalasa negativos (en el caso del crecimiento de estas en el medio MRS), y cadenas de cocos Gram positivos, catalasa negativas (en el caso del crecimiento en el medio M17 (ver ISO 7218).

La identificación de cepas dudosas puede ser chequeada acorde a ISO 9232/IDF 146).

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10 Cálculo y expresión de los resultados 10.1 Cálculo 10.1.1 Emplear el conteo de placas que contengan entre 15 y 300 colonias como se refiere en 9.7.1 o 9.7.2. 10.1.2 Calcular el número de cada microorganismo característico en la muestra de ensayo usando la siguiente ecuación: Σ C N= (n1+0,1 n2) d Donde: N es el valor numérico del número de microorganismos característicos por gramo de muestra

de ensayo. Σ C es el valor numérico de la suma de colonias en todas las placas contadas (10.1.1);

n1 es el valor numérico del número de placas contadas usando la primera dilución; n2 es el valor numérico del número de placas contadas usando la segunda dilución; d es el valor numérico de la masa , en gramos, de la muestra de ensayo no diluida en la placa

con la primera dilución Ejemplo: Una dilución factor de 10-2 significa que 10-2 g o 10-2 ml de la muestra de ensayo no diluida (en estado diluido) ha sido puesta en la placa. Nota: La primera dilución es la dilución con el más alto contenido de la muestra de ensayo. En el caso de tres diluciones, calcular el número de cada microorganismo característico en la muestra de ensayo empleando la siguiente ecuación. Σ C N= (n1+0,1 n2+ 0,01 n3) d Donde: n3 es el valor numérico del número de placas contadas usando la tercera dilución. 10.2 Expresión de los resultados 10.2.1 Redondear el resultado obtenido en 10.1.2 a dos cifras significativas. Para un número de tres cifras, redondear la tercera cifra al cero más cercano. Si la tercera cifra es 5 , redondear a una cifra por debajo si la segunda cifra es par, y a la cifra por encima, si la segunda cifra es impar. Ejemplo: Redondear: 234 a 230 235 a 240 225 a 220 245 a 240

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10.2.2 Si hay solamente conteos menores de 10, reportar el número de microorganismos por gramo como: “menor que 10 x 1/d” (siendo d el valor correspondiente a la dilución más baja”).

10.2.3 Si hay solo conteos que exceden las 300 colonias, hacer un conteo estimado de las placas que tengan un conteo más cercano de 300 colonias y multiplicar por el recíproco del valor correspondiente a la dilución más alta. Reportado como: “número mínimo estimado por gramo” 10.2.4 Los resultados deberán ser expresados como un número de 1,0 a 9,9 multiplicado por la potencia de 10 apropiada.

10.2.5 El número total de microorganismos característicos, N, por gramo de muestra es igual a: N= NL+ NS Donde: NL es el valor numérico del Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus por gramo calculado en 10.1.2; NS el valor numérico del Streptococcus thermophilus, por gramo calculado en 10.1.2. 10.3 Ejemplos de cálculos 10.3.1 Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus Asumir que en un conteo de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus se obtuvieron los siguientes resultados (fueron incubadas dos placas petri por dilución):

Dilución 10 -5: 295 y 245 colonias; Dilución 10 -6: 33 y 44 colonias; entonces Σ C N = _______________ (n1 + 0,1 n2) d 295 + 245 + 33 + 40 613 N = _____________________ = _____________ = 278,6 x 105

(2 + 0,1 x 2) 10-5 2,2 x 10 -5

De acuerdo con 10.2.1, esto es igual a 280 x 10-5 por gramo. El número estimado de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, expresado en acuerdo con 10.2.4, es 2,8 107 . 10.3.2 Streptococcus thermophilus De manera similar para Streptococcus thermophilus, un número estimado de 4,9 x 108 por gramo de yogur fue obtenido.

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En adición al número total de microorganismos característicos es igual a:

N = (2,8x107) + (4,9 x 108)= 5,18 x 108 por gramo

el cual redondeado según 10.2.4 es:

N = 5,2 x108 por gramo de muestra.

11 Precisión 11.1 General Tomando una distribución de los microorganismos en el sustrato, el límite confiable de este método varía de acuerdo al conteo de colonias examinadas de ±16 % a ± 52 %. En la práctica a veces pueden ser encontradas mayores variaciones. En varios estudios de colaboración de acuerdo a IDF 135, la desviación estándar de la repetibilidad (sR) aparece como 0,20 unidades log y la desviación estándar de la reproducibilidad aparece como 0,35 unidades log de acuerdo a ISO 5725-1 e ISO 5725-2.

Más información acerca del límite confiable para la estimación de pequeños números microorganismos se muestra en ISO 7218.

Nota IDF 135 es basada en ISO 5725.

11.2 Repetibilidad Las experiencias indican que si dos ensayos independientes con la misma muestra, frecuentemente excede la más baja en 30 %, los procedimientos deberán ser re-examinados para determinar las fuentes de error.

12 Reporte de ensayo El reporte de ensayo especificará:

a) Toda la información requerida para el examen completo de la muestra; b) El método de muestreo usado, si es conocido; c) El método de ensayo empleado, con referencia a esta Norma Estándar Internacional; d) Todos los detalles de operación no especificados en esta Norma, o considerados como

opcionales, juntos con los detalles de algún incidente, el cual tenga influencia en el resultado (s);

e) El resultado(s) de ensayo obtenido o si la repetibilidad ha sido chequeada, el resultado final de la repetición obtenido.

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ANEXO A (informativo)

Notas en procedimiento • Cualquiera de los dos medio de cultivos recomendados (MRS acidificado y M17) es completamente selectivo. • La mayoría de las cepas no forman colonias visibles en el medio MRS acidificado en diluciones normalmente usadas para el conteo de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. Sin embargo, cuando el número de lactobacilos en la muestra de yogur es considerado más bajo que el número de estreptococos, diluciones bajas han sido usadas para el conteo de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. • Bajo estas condiciones, algunos S. thermophilus pueden formar colonias muy pequeñas o de puntas de alfiler en las placas con el medio MRS acidificado, estas colonias pueden ser fácilmente diferenciadas a simple vista de las del Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ( por ser de mayor tamaño) y puede chequearse adicionalmente con el microscopio. Además algunas cepas de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus muestran un crecimiento pobre o nulo en MRS, esto dificulta algunas veces el conteo diferencial de este microorganismo. • Cuando cepas de S. thermophilus crecen lentamente o no crecen, se recomiendan algunas condiciones específicas:

-Incubación a temperaturas más altas (39 ºC a 42 ºC por 24 h aeróbicamente); -Disminuir el contenido en β-glicerofosfato; -Modificación del pH; -Mucho cuidado en el proceso de agitación

• Cuando las cepas del Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus crezcan muy lentamente o no crezcan, se recomiendan algunas condiciones específicas:

-Incubación por más de 3 días, hasta 5 o 6 días; -Incubación a temperaturas más altas (40 a 42 ºC y 45 ºC por 48 h anaeróbicamente); -Modificación del pH; -Mucho cuidado en el proceso de agitación Ambiente de gas (CO2 enriquecido, CO2 solo, etc.). • Cuando el Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus crece anaeróbicamente en yogur no puede ser enumerado en MRS. Este problema no ocurre cuando se usa el medio LBA (ver nota 9.7.1) bajo condiciones anaeróbicas a 50 ºC ± 0,5 ºC por 72 h. • Por otro lado el Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, no forma colonias visibles en el medio M17, empleando las diluciones que normalmente se utilizan para el conteo de S. thermophilus. Esto confirma los hechos explicados anteriormente (ver referencia [9]). • Algunas cepas de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, pueden sin embargo formar pequeñas colonias de puntas de alfiler en el medio M17, especialmente en muestras de yogur que presenten un mayo número de lactobacilos comparado con el número de estreptococos. Estas rugosas y pequeñas colonias tienen usualmente un aspecto lanoso y pueden ser fácilmente distinguidas a simple vista (aun mejor con lupa) y chequeada adicionalmente al microscopio de las del S. thermophilus, las cuales son de mayor tamaño. • La selección del medio, la preparación de la muestra, los procedimientos de incubación y el conteo son los puntos más críticos del ensayo. Una vez que los técnicos se familiarizan con los métodos, la precisión aumenta significativamente. • Además cepas de ensayo no apropiadas pueden ser usadas para probar la selectividad de las cepas, a partir de que las empleadas en yogur son numerosas y difieren de aquellas empleadas

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en los ensayos, de forma tal que algunas cepas de determinadas especies por ejemplo S. thermophilus, pueden crecer en medio selectivos para otras especies (por ejemplo Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus).

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Bibliografía

[1] ISO 707:1995 Milk and milk products-Guidance on sampling

[2] ISO 5725-1:1994 Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results-Part

1: General principles and definitions

[3] ISO 5725-2:1994 Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results-Part

1: Basic method for the determination of repeatability and reproducibility of a standard

measurement method.

[4] ISO 9232:2003 IDF 146, Yogur – Identification de characteristic microorganisms (Lactobacillus

delbrueckii subsp. bulgaricus and S. thermophilus).

[5] ISO/TS 111331-1:2000 Microbiology of food and animal feeding stuffs-Guidelines on preparation

and production of culture media-Part1: General guidelines on quality assurance for the preparation

of culture media in the laboratory.

[6] IDF 135, Milk and milk products - Precision characteristics of analytic methods-Outline of

collaborative study procedure.

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