PRÁCTICA 2B LECTINAS

8/17/2019 PRÁCTICA 2B LECTINAS

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PRÁCTICA 2B

LECTINAS

OBJETIVOS

− Adquirir los conocimientos teórico-prácticos para la obtención decompuestos proteicos con la actividad hemoaglutinante a partir de extractosvegetales.

− Determinar la actividad hemoaglutinante de los extractos obtenidos− Investigar el método de conservación no destructivo para las lectinas

obtenidas (LI!ILI"A#I$%&− #on'irmar las caractersticas reportadas en las re'erencias para los

compuestos obtenidos) tales como pesos moleculares.

INTRODUCCIÓN

Las moléculas que tienen la capacidad de desci'rar la in'ormación contenida enlos carbohidratos son las lectinas. Las lectinas (del latn legere * seleccionar oescoger& son protenas que unen a mono- + oligosacáridos espec'icamente +de manera reversible) no son en,imas + en contraste con anticuerpos) no sonproducto de una respuesta inmune. Las lectinas tpicamente contienen uno omás sitios de combinación de carbohidratos por moléculas) esto es) sondivalentes o polivalentes. or lo tanto) la unión de una lectina a carbohidratosen la super'icie celular) por eemplo eritrocitos) puede causar una unióncru,ada de las células + su subsiguiente precipitación) 'enómeno que se re'ierecomo aglutinación celular. La aglutinación de eritrocitos o hemaglutinación) es

una caracterstica principal de estas protenas + sirve para su detección +caracteri,ación rutinaria. De hecho) gracias a esta actividad 'ue que sedetectaron por primera ve,) a principios del siglo /I/ en extractos de plantas.or lo que se les denominó por mucho tiempo) 0'itohemaglutininas1 (2haron +Lis)3454 3446) 7883&.

2e sabe que las lectinas se encuentran presentes en todos los organismosinclu+endo virus) bacterias) plantas hongos + animales) aunque eldescubrimiento de lectinas en animales se reali,ó con el descubrimiento de lasselectinas) a 'inales de los 34589s .

La gran importancia de las lectinas radica en el reconocimiento + comunicacióncelular) como se ilustra en la 'igura.

Interacciones entre lecitinas de super'icie + carbohidratos.

Las lectinas son el medio de 'iación de di'erentes tipos de células) bacterias)virus o toxinas. :n algunos casos las lectinas de super'icie de las células seunen a glicoprotenas) mientras que en otros casos los carbohidratos en lasuper'icie de las células que se pueden encontrar solos o acoplados a


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protenas (glicoprotenas& o lpidos (glicolpidos&) 'uncionan como sitios deunión a lectinas. Las interacciones de estas lectinas con células pueden ser inhibidas en muchos casos por carbohidratos) lo que ha proporcionado ;tilesmarcadores celulares que son empleados en técnicas histoqumicas + en lamicroscopa electrónica para estudiar la estructura + 'unción de la membranaplasmática (2haron + Lis) 788


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• Fundamento De La Electo!oe"#".

La electro'oresis se de'ine como el movimiento de partculas cargadas en uncampo eléctrico. La movilidad de las partculas está determinada de 'ormaproporcional al voltae aplicado + la carga neta de la molécula + de 'ormainversamente proporcional a la 'ricción de la molécula? esta ;ltima depende de la'orma + el tama>o de la misma.

Durante una electro'oresis el voltae se mantiene constante por lo que la movilidadde la molécula dependerá de su carga) 'orma + tama>o@ a ma+or carga neta) lamolécula migrará más rápido? a su ve,) a ma+or 'ricción) la movilidad será menor.

Además) la electro'oresis permite la determinación experimental de propiedadescomo el punto isoeléctrico + el peso molecular (& de una protena. Laelectro'oresis de protenas se reali,a generalmente sobre matrices tipo gel) la máscom;n es la poliacrilamida.Los geles de poliacrilamida poseen propiedades tales como transparencia)elasticidad) porosidad controlable + compatibilidad con una gran variedad decompuestos qumicos que los hace un excelente medio de soporte para

separaciones electro'oréticas.Los geles de poliacrilamida son el resultado de la polimeri,ación del monómeroacrilamida y la bis-acrilamida (N N’-metil bisacrilamida) en presencia de

persulfato de amonio y la tetrametiletiléndiamina (TEMED). :l persulfato deamonio activa al TEMED) el cual a su ve, activa al monómero de acrilamida paraque polimerice. Las cadenas de poliacrilamida son entrecru,adas al a,ar por labis-acrilamida) 'ormándose as una red de porosidad uni'orme. Bariasmodi'icaciones pueden reali,arse para obtener geles con caractersticasespec'icas seg;n sea necesario. 2i se requieren geles con poros grandes) sepuede disminuir la cantidad de acrilamida +Co bis-acrilamida en la reacción depolimeri,ación + viceversa. :l tama>o del poro de la matri, de poliacrilamida a

utili,ar dependerá de las di'erencias en tama>o de los componentes proteicos quese desean separar.

PAE por sus siglas del inglés) (!Polyacrylamide "el electrop#oresis$ & máscom;nmente utili,ado para la determinación de pure,a de una muestra o del de una protena es el A: en presencia del detergente aniónico duodecilsulfatode sodio (%D%) o %D%-PAE .or lo tanto) durante la corrida electro'orética las protenas con ma+or migrarán más lento que las protenas con un menor . #uando se compara lamovilidad electro'orética de una protena en particular con la movilidadelectro'orética de protenas de conocido (marcadores de &) se puede

estimar el de la protena en cuestión. Ena ve, 'inali,ada la corridaelectro'orética) las protenas son visuali,adas mediante la adición de un colorantecomo el a,ul de #oomassie) (#


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E$u#%o&Se utilizará como modelo para la práctica el equipo MiniProtean para larealización de la electroforesis de proteínas. (ver gura 3.)

F#'ua (. odelo #ámara electro'orética inirotean.

Ta)la (& Heactivos + soluciones para la preparación del gel.

elseparador

el separador 2D2-A:

38

elconcentrador

2D2-A:


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*ele" de Co#da + A%#lam#ento

La técnica de separación com;nmente utili,ada se denomina electro'oresisdiscontinua. :n la electro'oresis discontinua se preparan 7 geles) el gel separador)donde se separan las protenas) + el gel de apilamiento o gel concentrador (stacNing& que como su nombre lo indica) concentra la me,cla.

:l gel de separador 2D2-A: que separará las muestras debe tener una ma+or concentración (38& + pF más básico (5.8& de manera que o're,ca ma+or resistencia en la corrida a los polipéptidos.:l gel de concentrador posee baa concentración (


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F#'ua -.el separador antes de polimeri,ar

=. Luego de a>adido el gel separador) + previo a la polimeri,ación) a>adir suavemente agua destilada para evitar que el borde del gel polimerice demanera irregular.

J. :sperar unos 3= min para una polimeri,ación total del gel.

PREPARACIÓN DEL GEL CONCENTRADOR SDS-PAGE 4%

3. Luego de polimeri,ado el gel separador) descartar el agua de la super'iciedel mismo + preparar el gel concentrador.

7. Berter suavemente el contenido del gel concentrador sobre el gel separadopolimeri,ado + colocar el peine cuidadosamente para que no se 'ormenburbuas ('igura


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Fundamento A/ul B#llante de Cooma""#e0 :ste método constitu+e una 'ormarápida + con'iable para la determinación de protenas. 2e basa en la cuanti'icaciónde la unión del colorante A,ul Krillante de #oomassie a una protena desconocida+ la comparación de esta unión con la de di'erentes cantidades de una protenaestandard. :l compleo colorante - protena presenta un máximo de absorción a=4= nm.

!undamento


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PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL


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CUESTIONARIO

1. Que son las lectinas y cuál es su función.

Las lectinas son proteínas o glicoproteínas de origen no inmune, fijadoras de carbohidratos concapacidad para aglutinar células y precipitar glicoconjugados.5ual!uier definición deberá tener en cuenta los siguientes aspectos"

• Las lectinas son glicoproteínas.

• #o son de origen inmunológico.

• La relación de las lectinas con $arias glicoproteínas !ue contienen sitios de combinación.

http"%%glosario&crohn.espacioblog.com%post%'(()%1'%1*%lectina

'. +onde están presentes las lectinas.

Las lectinas están presentes en casi todo lo $i$o, pues se han encontrado en el reino $egetal, animaly en microorganismos.n las plantas se han detectado, principalmente en los cotiledones y endospermos de las semillas yconstituyen del ' al 1( - del total de las proteínas de éstas. n el reino animal se han encontrado en

in$ertebrados, tales como cangrejos, camarones, caracoles, lombrices y moluscos.stán presentes fundamentalmente en la hemolinfa y órganos seuales.

/. omo act0an las lectinas.

Las lectinas típicamente contiene uno o más sitios de combinación de carbohidratos por moléculasesta es son di$alentes o poli$alentes.

Las lectinas constituyen un interesante grupo de proteínas de origen no inmune !ue comparten encom0n la propiedad de enlaarse de forma específica y re$ersible a carbohidratos, ya sean libres o!ue formen parte de estructuras más complejas.

ontienen al menos ' sitios de unión, de ahí !ue puedan enlaarse en primer lugar a un a0carespecífico y en forma secundaria a una molécula glicosilada. 2oseen interesantes propiedades !uecon$ierten a esta clase de proteínas en herramientas in$alorables en los laboratorios biológicos, porlo !ue se utilian en numerosas in$estigaciones !ue incluyen" estudio de la estructura de lasmembranas, detección de transformaciones malignas, purificación de glicoconjugados, estudioscitogenéticos, así como también en ensayos histo!uímicos, enimáticos y en el tipaje de grupossanguíneos.

3. 4 !ue se refiere el efecto microgénico.

http://glosario_crohn.espacioblog.com/post/2006/12/17/lectinahttp://glosario_crohn.espacioblog.com/post/2006/12/17/lectina


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5. omo se emplean las lectinas y !ue utilidad tienen como reacti$o de diagnostico.

Las lectinas se consideran armas $aliosas en el campo de la enética, la 6iomedicina y la7nmunología. 8u utilidad está basada en la propiedad !ue tienen de combinarse con $arios tipos deglicoconjugados presentes en las superficies celulares y fluidos corporales.8us propiedades mitogénicas permiten !ue se utilicen en estudios !ue tienen como base la

proliferación de linfocitos en culti$os, como son"9 La e$aluación de la producción de cito!uinas :interferón e interleu!uinas; y la epresión de susreceptores en sobrenadantes de culti$os de linfocitos pro$enientes de pacientes con enfermedadesde alto impacto social como el síndrome de inmunodeficiencia ad!uirida :87+4;, la tuberculosis y laleishmaniasis, entre otras.9 La caracteriación de algunos aspectos relacionados con la respuesta inmune y fenómenosasociados con ellas como la inmunosupresión.9 La interacción entre $irus, como por ejemplo entre el $irus de inmunodeficiencia humana :


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Las interacciones de estas proteínas con células pueden ser inhibidas en muchos casos pora0cares, por lo !ue se ha llegado a la conclusión de !ue ellas se enlaan a sacáridos de lasuperficie celular, lo !ue ha pro$isto a los científicos de 0tiles marcadores para emplearlos entécnicas histo!uímicas y en la microscopia electrónica para estudiar la estructura y función de lamembrana plasmática. eneralmente se utilian lectinas conjugadas con marcadores fluorescentescomo la biotina y las más usadas para estos fines son la 2=49L, 2=4 y las pro$enientes de Pisumsativum :284;, Triticum vulgare :?4;, Solanum tuberisum :8AL;, Arachis hypogae :2#4;, Datura

strmonium :+8L;, Lens culinaris :L4; y de Griffonia simplicifolia :8L;.1+entro de los estudios de membrana se ha reportado en la literatura el uso de lectinas para estudiarcambios estructurales en los glicoconjugados presentes en las superficies celulares'5 y enocasiones de esta forma detectar cambios morfológicos ocurridos, para analiar la distribuciónsubcelular de epitopes y terminales glicoproteicos, además para detectar alteraciones en laepresión de moléculas presentes en la superficie celular.Btra área importante en la cual se emplean las lectinas es la detección de transformacionesmalignas en células, a tra$és de la aglutinación preferencial !ue muestran las lectinas con célulastransformadas.4demás se han realiado in$estigaciones para utiliar las lectinas y polímeros sintéticos enlaados aellas como agentes anticancerígenos in vivo e in vitro, ya !ue se ha $isto !ue disminuyen el

crecimiento de las células tumorales. 8e utilian también para la inmuniación contra $irusproductores de inmunodeficiencia y algunos tumores y como medicamentos para pre$enirmetástasis./5 Las propiedades citotóicas de algunas lectina como la Cicina y 4brina hacen también!ue éstas brinden interés como potenciales armas terapéuticas en el tratamiento del cáncer humano.Las lectinas se emplean igualmente en la caracteriación de grupos sanguíneos humanos, así comoen la identificación de nue$os grupos sanguíneos.4lgunas de las lectinas son específicas en sus reacciones con los grupos sanguíneos 46B, @#, 41y 4' de humanos, por esto han sido utiliadas en la determinación del tipo de sangre de losindi$iduos.La mayoría de las lectinas aglutinan los eritrocitos de todos los grupos sanguíneos en humanos yact0an a similares concentraciones, éstas son lectinas no específicas :no significa !ue no sea

específica a los a0cares;D el resto son lectinas específicas.

http"%%b$s.sld.cu%re$istas%hih%$ol15&'&>>%hih(''>>.pdf

RESULTADOS

http://bvs.sld.cu/revistas/hih/vol15_2_99/hih02299.pdfhttp://bvs.sld.cu/revistas/hih/vol15_2_99/hih02299.pdf


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Tabla 1. Ceacti$os utiliados para la elaboración del 6uffer 268 1 E

ReactivoMasa

(g)

#al F

Gl (.'

#a'=2B3 1.33

G='2B3 (.'3

Tabla . 2rueba de hemoaglutinación.

P!"eba #e $e%oagl"ti&aci'&

1 gota de sangre H 1 gota de lectina endospermodiluido

1 gota de sangre H 1 gota de lectina del epiteliofiltrado

2resencia de aglutinación 2resencia de aglutinación

ig"!a 1.

ig"!a .

1OJA DE CÁLCULO

ste se preparó en F(( mL de ='B, se aforó hasta llegar a 1 Lposteriormente se procedió ajustar el p= hasta llegar a un p= I *.3con una sol. de =l


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ara preparar el ersul'ato de Amonio al 38 se tomo como base el siguientecálculo.

1000µl→100

x µl→10

NH 4¿2S2O

8

x=100µl ¿

1g→1000µg

x g→100µg

NH 4¿2S2O8 x=0.1g¿

or lo tanto preparamos@

NH 4¿2S2O

8+900µldeH

2O

x=0 .1 g¿ para preparar el gel separador 2D2-A:

Nota0 tanto el ersul'ato de Amonio como el M::D se deben preparar usto

antes de hacer el gel.


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ANÁLISIS DE RESULTADOS

F#'ua 2& Mipos de 'riol

ediante esta práctica se anali,aron las propiedades del 'riol peruano ( PhaseolusVulgaris&) este contiene protenas como las lectinas las cuales constitu+en uninteresante grupo de origen no inmune que comparten en com;n la propiedad deenla,arse de 'orma espec'ica + reversible a carbohidratos) +a sean libres o que'ormen parte de estructuras más compleas.#ontienen al menos 7 sitios de unión) de ah que puedan enla,arse en primer lugar a un a,;car espec'ico + en 'orma secundaria a una molécula glicosilada elcual tiene la capacidad de producir una aglutinación.#omo se observa en la Mabla 7. La cual revela que al interactuar las lectinas del

'riol + los eritrocitos de humano se produce la aglutinación) esto nos quiere decir que contiene gran concentración de lectinas) para producir dicha a aglutinación.

:s una leguminosa resistente a climas áridos + a en'ermedades provocadas por bacterias + virus) esto se debe a que las lectinas de origen vegetal) como las del'riol peruano) son resultado de un proceso de evolución en el sistema de de'ensa)el cual les permite contrarrestar e'ectos nocivos provocados por hongos) bacteriase insectos.


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CONCLUSIONES

− oseen interesantes propiedades que convierten a esta clase de protenasen herramientas invalorables en los laboratorios biológicos) por lo que seutili,an en numerosas investigaciones que inclu+en@ estudio de la estructurade las membranas) detección de trans'ormaciones malignas) puri'icación deglicoconugados) estudios citogenéticos) as como también en ensa+oshistoqumicos) en,imáticos + en el tipae de grupos sanguneos.

BIBILO*[email protected]'b.umich.mxCglicobiologia.htm

[email protected]=O7O44Chih87744.pd'

[email protected]

:n la sesión anterior se dearon en re'rigeración a o del poro quequeramos +a que si lo que bamos a correr era mu+ pesado entonces hacamosuna agarosa más laxa) por eso nosotros al correr un D%A genómico usamos laagarosa al 8.33 + si es más peque>o se utili,a una agarosa más concentradaqueda más dura pero el poro es más cerrado + por lo tanto no se va tan rápido lamuestra dependiendo de lo que queramos correr es como vamos a hacer alporcentae nuestros geles.

:n este caso para correr las protenas vamos a utili,ar dos tipos de geles uno quese le conoce como el 2eparador 2D2-A: 38 el cual va en la parte de abaodel gel este se adiciona un poco mas abao de donde llega el peine) despuésvamos a adicionar un el #oncentrador 2D2-A:


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acrilamida + la poliacrilamida estos dos +a vienen untos por que son altamentetóxicos cuando a;n no han polimeri,ado) + una ve, que polimeri,a el gel pierdensu toxicidad.

La pro'esora mandara los 'undamentos de las soluciones utili,adas en el lab .

La solución de monómeros se encuentra en 'orma lquida) + para que estospolimericen se necesita de la presencia de un catali,ador que en este caso va aser el ersul'ato de Amonio + el M::D el cual es un iniciador de la reacción) deigual manera el M::D es altamente tóxico) al momento de poner el ersul'ato de

Amonio + el M::D en ese momento empie,a la reacción + empie,a apolimeri,ar.

Mambién se puso en nuestra me,cla un bu''er el cual para el separador lleva un pFde 5.8 lo cual produce un gel desnaturali,ado esto quiere decir que la protena queestá en estructura terciaria la vamos a desnaturali,ar para que quede laxa + puedacorrer a través del gel las cuales se separan en base a su carga.

:sta se carga negativamente con el 2D2 para que corra las protenas +a que

tienen di'erentes cargas esto es que tienen un punto isoeléctrico el cual va a llegar a una neutralidad dependiendo del bu''er que pongamos) en este caso para elseparador a un pF * 5 + para el concentrador a un pF * <

ara haces esto tenemos dos vidrios lo cuales lo vamos a empalmar por que por que no esta pareo + por lo tanto nos permite adicionar la solución no va a ser como el gel de agarosa el cual se vació la agarosa en el carrito

:n este caso lo que se hace es el gel el cual tiene un grosor de los empaques quecontienen aproximadamente de 8.7 mm se pone el vidrio abao se pon en los

empaques en los extremos del vidrio en ambos lados + se pegan con un aparatoel cual los dea derechos para evitar que se salga el gel

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