Prctica de CromatografaObjetivos: Entender el concepto de cromatografa aplicado a la diferenciacin de pigmentos fotosintticos de un vegetal. Diferenciar los diferentes pigmentos de un vegetal que intervienen en la fotosntesis, mediante su separacin por cromatografa.

Conceptos bsicos:- Cromatografa: Tcnica, frecuentemente utilizada en qumica y biologa, de separacin de una mezcla compleja de solutos, basndose en la diferente velocidad con que se mueve cada uno de los solutos a travs de un medio poroso, arrastrados por un disolvente en movimiento. - Fotosntesis: Proceso anablico (ruta anablica) por excelencia mediante el cual los organismos convierten la energa luminosa en energa qumica estable necesaria para fabricar sustancias orgnicas a partir de molculas inorgnicas. Dependiendo de quien sea el dador de electrones que alimenta la cadena transportadora de electrones haciendo posible la formacin de ATP y poder reductor, los procesos fotosintticos se dividen en oxignicos, en los cuales el dador de electrones es el agua desprendindose en el proceso oxgeno, y anoxignicos en los cuales el dador de electrones no es el agua sino el sulfuro de hidrgeno, y por tanto no se desprende oxgeno sino azufre. - Pigmentos fotosintticos: molculas especiales necesarias para que se lleve acabo la fotosntesis ya que estn encargadas de captar la energa luminosa. Los pigmentos fotosintticos son lpidos que se encuentran unidos a protenas transmembrana presentes en algunas membranas plasmticas de clulas vegetales formando los llamados fotosistemas. Existen dos tipos de pigmentos en los fotosistemas: los pigmentos de antena o accesorios, que slo pueden captar energa luminosa y transmitir la energa captada a otro tipo de pigmentos, y los pigmentos diana o centrales a los cuales va a parar toda la energa captada por los pigmentos anteriores. stos pigmentos son capaces de transferir el electrn excitado al primer aceptor de electrones y de reponerlo a partir del primer dador de electrones, es decir son capaces de excitarse e ionizarse. Los pigmentos fotosintticos intervienen en la etapa luminosa de la fotosntesis y la hacen posible captando todas las franjas del espectro electromagntico visible (radiaciones el violeta al rojo). - Tipos de pigmentos presentes en un vegetal: Carotenoides: Son lpidos isoprenoides que absorben una luz de 440 nm y a su vez se diferencian en carotenos de un color rojizo y xantofilas de un color amarillento. Clorofilas: Son lpidos de color verdoso que a su vez se dividen en clorofila , de color verde limn y que absorben luz de 683 nm y clorofila , de un color verde-azulado y que absorben luz e 660 nm. - Etapa luminosa: Primera fase de la fotosntesis oxignica que tiene como objetivo la obtencin de poder energtico y reductor para poder llevar a cabo la etapa oscura y completar as la fotosntesis.

Para que se pueda llevar a cabo es necesario la presencia de fotosistemas (el fotosistema II que presenta clorofila P680 y el fotosistema I con clorofila P700 ), complejos ATP-sintetasas y cadenas transportadoras de electrones. Cuando un pigmento accesorio capta el fotn, se excita y un electrn sube a una rbita ms alejada del ncleo atmico. Al bajar de nuevo el electrn, se desprende calor y energa en forma de radiacin, que excitar al pigmento vecino llegando as hasta el pigmento central (fotosensibilizacin dinmica). Tras sto existen cadenas transportadoras de electrones en las cuales los electrones circularan debido a que los complejos se encuentran ordenados de potencial redox ms negativo a potencial redox ms positivo. El proceso se inicia con la llegada de fotones a la clorofila P680, el fotosistema II se ioniza y cede su electrn al primer aceptor de electrones, la feofitina (Pheo). Para reponer los electrones de la clorofila P680 se produce la fotlisis del agua. Los dos electrones que se libera por cada molcula de agua son transferidos a la plastoquinona (PQ) que al recibirlos capta dos protones del estroma. La PQ transfiere sus electrones al citocromo b-f que a su vez introduce los dos protones en el tilacoide, que sumados a los dos protones producidos por la fotlisis el agua activan las ATP-sintetizas llevando a cabo la fotofosforilacin del ADP, formando ATP. A continuacin inciden los fotones sobre la clorofila P700 del fotosistema I, sta se ioniza y cede dos electrones a la ferredoxina (Fd). Los electrones son repuestos por la plastocianina (PC) que los recibe del complejo citocromo b-f. La Fd pasa los dos electrones a la enzima NADP+reductasa, que se activa, capta dos protones del estroma y se los transfiere, junto con los dos electrones, al NADP+ que se reduce. Esto se llama fotorreduccin del NADP+. As concluye la etapa luminosa acclica que ser completada con una etapa luminosa cclica, donde no hay ni fotlisis del agua, ni reduccin del NADP+, ni se desprende oxgeno; nicamente produce poder energtico para subsanar el dficit de ATP obtenido anteriormente y poder realizar la etapa oscura.

Materiales: Hojas verdes de un vegetal. Mortero. Tubo de ensayo. Vaso de precipitados. Filtro o colador. Papel de filtro o papel para cromatografa (Whatmann). CaCO3 Etanol (96%). Acetona.

Procedimiento: Se cogen hojas verdes de cualquier vegetal y se cortan en trozos muy pequeos. En un vaso preparamos una disolucin de 50 cm3 de etanol (96%) y una pizca de CaCO3, para evitar la degradacin de los pigmentos, y la vertemos en un mortero junto con los trozos de la hoja. De esta manera trituramos bien hasta que el disolvente quede del mismo color que la hoja para extraer los pigmentos presentes en la hoja. Una vez triturado, filtramos con un colador la masa resultante y colocamos la disolucin en un tubo de ensayo. Cogemos papel de filtro o papel para cromatografa y cortamos una tira de unos 15 cm de largo con la forma siguiente:

Lugar hasta donde llega el disolvente

Lugar donde comienza la cromatografa

El papel de filtro est formado por numerosas fibras de celulosa (polmero de glucosa con gran cantidad de grupos hidroxilo (-OH) y una microestructura muy complicada) que aportan un cierto porcentaje de humedad. Las partes individuales de cada fibra, junto con su humedad asociada, constituyen hipotticas clulas elementales. La separacin se lleva a cabo al repartirse las sustancias entre la humedad de las clulas y el flujo de disolvente sobre ellas, de tal manera que el agua de las clulas permanece estacionaria mientras que el disolvente circula sobre ellas. En la parte sealada como origen de la cromatografa, colocamos un poco de acetona (CH3-CO-CH3) que actuar como disolvente polar dejando sin disolver a los pigmentos ya que son compuestos lipdicos insolubles en este tipo de disolventes. Introducimos la tira de papel en el tubo de ensayo suspendindola mediante algn artificio colocado en la parte superior del tubo de ensayo. Esperamos unos 20 minutos (en nuestro caso lo dejamos 2 das) para que el papel de filtro se vaya empapando con el disolvente y vaya absorbiendo la disolucin. Colocamos el experimento en un lugar oscuro. Con esta tcnica ascendente, considerando que la atmsfera se encuentra saturada con el vapor del disolvente , el disolvente slo puede ascender hasta el extremo superior del papel, cesando en ese momento el flujo del lquido, as los pigmentos permanecern sobre el papel y la distancia del disolvente es fija.

Resultado:Cuando retiramos el papel del tubo de ensayo observamos una franja coloreada en la parte superior de la tira que presenta diferentes tonos de color, diferenciando as los siguientes pigmentos: clorofila (verde limn), clorofila ( verde azulado) y xantofila (amarillo). sto se debe a la estructura qumica de los pigmentos fotosintticos, ya que al tratarse de compuestos lipdicos y ser apolares son insolubles en acetona, por tanto permanecen junto a ella en su ascenso por el papel de filtro. Los pigmentos se presentarn ordenados debido a la velocidad de difusin de cada pigmento formando una franja en la cual podemos distinguir los distintos colores de los pigmentos al encontrarse separados.