OBJETIVOS

• Aplicar algunos de los métodos utilizados para la esterilización de medios de cultivo, materiales, y accesorios utilizados en el laboratorio de Microbiología.

• El estudiante explicará verbalmente la forma de preparar el material de vidrio para esterilizar.

• Enumerara los diferentes métodos que existen para realizar los procedimientos de esterilización usados en microbiología.

• Siguiendo las indicaciones del tutor de laboratorio el estudiante preparara el material asignado para esterilizar.

• El estudiante deberá aprender el correcto manejo del autoclave. • Finalmente realizará los procedimientos de esterilización.

INTRODUCCIÓN El éxito en el diagnóstico microbiológico y la confiabilidad de lo resultados dependen, en gran parte, del proceso de lavado y esterilización del material utilizado, por consiguiente es importante seguir las recomendaciones establecidas para este propósito. La destrucción completa de todos los microorganismos presentes sobre cualquier material o dentro de él, es indispensable en todos los procedimientos analíticos como la preparación de medios de cultivo y otros materiales. Para trabajar en microbiología, el material que se utiliza debe estar completamente libre de células microbianas vivas, por lo tanto éste debe ser lavado rigurosamente con detergentes, enjuagado repetidamente, secado, envuelto en papel kraft y tapado el orificio de entrada de los recipientes con algodón en rama para luego ser sometido a esterilización, de acuerdo con las características de cada elemento. MARCO TEÓRICO Esterilización es la destrucción o la eliminación de todas las formas de vida; puede llevarse a cabo por medio de un proceso físico o químico. Desinfección es la eliminación de todos los microorganismos vegetativos, pero no de esporas bacterianas o micóticas, de un objeto inanimado. Otros términos relacionados son de uso común y merecen mencionarse. Un germicida es un agente que destruye microorganismos, en especial patógenos, en tejidos vivos u objetos inanimados. Un antiséptico es una sustancia aplicada en la piel u otro tejido vivo que previene o detiene el crecimiento o la acción de microorganismos por inhibición de su actividad o por su destrucción. La pasteurización se refiere al proceso de exponer un objeto a agua caliente (77°C) durante 30 minutos. Su propósito consiste en destruir todos los microbios patógenos, excepto las esporas bacterianas. Un saneador es una sustancia aplicada sobre objetos inanimados que reduce el número de bacterias hasta niveles considerados seguros por los departamentos de salud pública.

PRÁCTICA N°2 ESTERILIZACIÓN

LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

La limpieza es la eliminación de material extraño (en especial orgánico) de los objetos. La descontaminación es la eliminación de microorganismos patógenos de los objetos de modo que sea seguro manipularlos. La esterilización puede llevarse a cabo por medio de calor húmedo y calor seco, gases (en especial óxido de etileno), glutaraldehído, irradiación (ionizante, ultravioleta o con microondas) y filtración. MÉTODOS FÍSICOS CALOR SECO: El calor seco produce desnaturalización de proteínas, efectos tóxicos por desecación de la célula alcanzando niveles elevados de solutos, procesos oxidativos irreversibles, fusión y desorganización de las membranas. Estos efectos de deben a la transferencia de calor desde los materiales a los microorganismos que están en contacto con éstos. El horno de aire caliente es el equipo utilizado en los laboratorios para esterilizar por calor seco, se requiere mayor temperatura y tiempo de exposición que los métodos por calor húmedo. La temperatura varia entre 120º y 180ºC, requiriéndose distintos tiempos de exposición. A 140º C se necesitan por lo menos 5 horas de exposición, mientras que de 160ºC A 180ºC se requieren al menos 2 horas de exposición, sirve para esterilizar material de vidrio. Se recomienda no olvidar NO abrir la puerta del horno inmediatamente después del tiempo de esterilización, ello puede ocasionar rotura del material de vidrio. El papel y algodón no pueden ser esterilizados a mas de 160ºC. Ventajas del calor seco: • No es corrosivo para materiales e instrumentos. • Permite la esterilización de sustancias en polvo y no acuosas, y sustancias viscosas no volátiles. Desventajas: • Requiere mayor tiempo de esterilización, respecto al calor húmedo, debido a la baja penetración del calor. FIGURA 2.1. UN TIPO DE HORNO DE ESTERILIZACIÓN PARA MICROBIOLOGÍA.

INCINERACIÓN: Se utiliza para destruir el material descartable contaminado. Eje. horno de incineración hospitalario, muflas, etc. ACCIÓN DIRECTA DE LA LLAMA: se lleva al rojo el material de metal como asas, lancetas, agujas de disección, etc. CALOR HÚMEDO: el calor húmedo produce desnaturalización y coagulación de proteínas. Estos efectos se deben principalmente a dos razones.

a. El agua es una especia química muy reactiva y muchas estructuras biológicas (DNA, RNA, Proteínas, etc) son producidas por reacciones que eliminan agua. Por lo tanto reacciones inversas podrían dañar a la célula a causa de generación de productos tóxicos. Además las estructuras secundarias y terciarias de las proteínas se estabilizan mediante puentes de Hidrogeno intramoleculares que pueden ser reemplazadas y rotos por el agua a altas temperaturas.

b. El vapor de agua posee un coeficiente de transferencia de calor mucho mas elevado que el aire. Por lo que los materiales húmedos conducen el calor más rápidamente que los materiales secos debido a la energía liberada durante la condensación.

El autoclave es el aparato mas comúnmente utilizado en los laboratorios para esterilizar cultivos y soluciones que n formen emulsiones con agua y no se desnaturalicen a temperaturas mayores a 100ºC. una temperatura de 121ºC (una atmósfera de sobrepresión) con un tiempo de exposición mayor a 15 minutos sirve para destruir microorganismos formadores de esporas. Es necesaria la acción combinada del calor, tiempo y presión para conseguir la destrucción celular. Ventajas del calor húmedo:

• Rápido calentamiento y penetración. • Destrucción de formas vegetativas y esporas en corto tiempo. • No deja residuos tóxicos. • Hay un bajo deterioro del material expuesto. • Es posible por este método esterilizar materiales que no resisten el calor seco.

(material plástico). Desventajas:

• No permite esterilizar soluciones que formen emulsiones con el agua. • Es corrosivo sobre ciertos instrumentos metálicos.

(VER CUADRO 1. MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN)

CUADRO 1 . MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN CALOR SECO

Acción directa de la llama Esterilización al rojo Flameado Incineración.

Acción directa por los generadores de calor

Estufa de calor seco

CALOR HÚMEDO

Acción del agua caliente Baño de Maria hirviente Calentamiento repetido Ebullición directa

Acción del vapor de agua Autoclave. RADIACIONES

Ionizantes Ultravioleta Rayos Gamma y rayos X

INSTRUCCIONES PARA EL USO DEL AUTOCLAVE 1. Colocar agua en la olla hasta cubrir la resistencia (no colocar agua en la camisa), el

nivel del agua debe mantenerse en cada ciclo de esterilización. 2. Colocar el material a esterilizar dentro de la camisa, colocando previamente la rejilla

en el fondo. 3. Introducir la camisa. 4. Tapar la olla haciendo coincidir las flechas impresas en la tapa y la olla, insertando

el tubo flexible en el canal dispuesto en la pared interior de la camisa. 5. Apretar los tornillos haciendo cierre lateral simultáneo y uniforme. No use llaves para

apretar y mantenga las superficies de contacto de la tapa y el borde interno de la olla perfectamente limpio y lubricado.

6. Abrir la válvula de seguridad colocándola en posición vertical. El vapor generado en la base del esterilizador, pasa hacia arriba y por fuera del recipiente y luego hacia abajo a través del tubo flexible de escape y la válvula de seguridad, es importante que la corriente de vapor elimine por completo el aire de la cámara de lo contrario la temperatura alcanzada es mucho menor. cuando el vapor escapa vigorosamente se debe colocar la válvula en posición horizontal.

7. A partir de entonces la presión y la temperatura empezaran a aumentar, los cual se vera indicado en la aguja del manómetro.

8. Permitir que la aguja llegue a 121ºC y 15 libras de presión, es a partir de este momento que se empieza a contabilizar el tiempo de esterilización.

9. De 10 a 15 minutos para material limpio. 10. De 30 a 40 minutos para material contaminado. 11. Al finalizar el periodo de esterilización, apagar el autoclave y permitir que el

manómetro baje a cero, levante la válvula para que escape el vapor restante y proceda a destapar la olla desenroscando los tornillos de manera enfrentada.

RADIACIONES La energía se transmite a través del espacio en gran variedad de formas, generalmente llamadas radiaciones. Su acción depende de:

• El tiempo de radiación. • El tiempo de exposición. • La dosis de radiación.

La luz ultravioleta (UV tiene limitantes como: no penetrar el vidrio, la suciedad, el papel, la pus, etc. Su efecto destructor se cumple cuando los rayos UV tienen contacto directo con los microorganismos. Se usa para reducir la población microbiana del aire de los quirófanos, pabellones hospitalarios, laboratorios, etc. En microbiólogía, es usada en cámaras de repiques de cultivos y proceso de muestras. Su mecanismo de acción es el daño del ADN, siendo entonces bactericida. Las radiaciones ultravioleta afectan a las moléculas de ADN de los microorganismos debido a que forman dímeros adyacentes que inducen a errores en la duplicación y por lo tanto la pérdida de la viabilidad de las células. RADIACIONES IONIZANTES Producen iones y radicales libres que alteran las bases de los ácidos nucleicos, estructuras proteícas y lipídicas y componentes esenciales para la viabilidad de los microorganismos. Tienen gran penetrabilidad y se les utiliza para esterilizar materiales termolábiles (termosensibles), como jeringas, sondas, etc. Se utilizan a escala industrial por sus costos. No se utilizan para medios de cultivo o soluciones proteicas por que producen alteraciones de los componentes. FILTRACIÓN En algunas ocasiones es necesario esterilizar soluciones como cultivos de medios líquidos, soluciones de sustancias sensibles al calor como azúcares, aminoácidos, antibióticos, sales y similares sin someterse a temperaturas de esterilización. Para esto se utiliza la técnica de filtración, que consiste en pasar las soluciones por filtros con poros de diámetro finos a escala de micras que retienen por tamaño a los microorganismos. Este método permite obtener productos solubles como toxinas, antigenos, antibióticos, etc. Filtro de profundidad. Consiste en placas de papel, asbesto, o fibra de vidrio, cuyas fibras se superponen y en ellas quedan atrapadas las partículas. Filtro de membrana. Elaborados especialmente de acetato o nitrato de celulosa, conocidos como filtros Milipore. Pueden obtenerse con dimensiones de poros muy diversos, que van desde 0.45 hasta 0.01 micras. Las membranas porosas se colocan dentro del recipiente, en el cual se pone el líquido que se va a esterilizar y éste pasa a través del filtro, recogiéndose en una fiola con presión negativa para acelerar el paso del líquido a través filtro. (Véase figura 2.3).

FIGURA 2.3. FILTROS DE MEMBRANA.

Filtro de huella de enucleación. Elaborados con delgadas películas de policarbonato de 10u de espesor, tratadas con radiación nuclear y después grabadas con una sustancia química. La radiación causa daños localizados en la película y la sustancia grabadora amplia estos sitios causando agujeros. El tamaño de estos se pueden graduar dependiendo del tiempo que se deja actuar el grabado y de la fuerza de la solución de grabado. Esos filtros son empleados especialmente en microscopía electrónica. TABLA 2. TIPOS DE FILTROS. FILTROS BERKEFELD Constituidos por tierra de Diatomeas, poros:

Intermedio (N), fino (W) y ordinario (V). Después de utilizarlo se cepilla y se hierve en agua estéril.

FILTROS CHAMBERLAND

Constituidos por porcelana sin vidrio. Varios tamaños de poro, el poro más fino retiene los virus de mayor tamaño.

FILTROS SEITZ Constituidos por filtros de asbesto insertados en un recipiente metálico conectado a un erlenmeyer. Retienen bacterias.

FILTROS DE VIDRIO Constituidos por filtros de vidrio insertados en un recipiente metálico conectado a un erlenmeyer.

FILTROS DE MEMBRANA

Constituidos de nitrato de celulosa, acetato de celulosa y politetrafluoretileno. Los poros varían de 8 a 0.001 micras. Normalmente se trabaja con presión positiva o negativa a 100 o 200 mm de Hg.

ESTERILIZACION EN FRIO: Utilizando óxido de etileno, formaldehído o peróxido de hidrógeno, en cámaras especiales. (Veáse figura 2.3).

FIGURA 2.3. AUTOCLAVE PARA OXIDO DE ETILENO

LIMPIEZA Y LAVADO DE MATERIAL. Material de vidrio nuevo. Los recipientes de vidrio que no se han utilizado anteriormente son ligeramente alcalinos. Para neutralizarlos se deben sumergir en una solución al 2% de ácido clorhídrico, durante 24 horas, después se enjuagan abundantemente con agua del chorro y luego con agua desmineralizada, para, finalmente, secarlos y esterilizarlos. Material de vidrio usado. Cuando los recipientes de vidrio contienen medios de cultivos contaminados se deben esterilizar en autoclave con las tapas flojas, para que pueda circular el vapor dentro de los recipientes.

§ Dejar en remojo, en agua con detergente, de 2 a 3 horas, luego cepillar. § Enjuagar abundantemente con agua del chorro, dejar durante 30 minutos en un

recipiente con agua limpia para quitar cualquier resto de detergente y hacer el enjuague final.

§ Dejar las pipetas contaminadas en un recipiente con fenol o hipoclorito de sodio al 2%, durante 24 horas, y luego continuar con el procedimiento anterior.

§ Dejar escurrir todo el material con la boca hacia abajo en canastillas metálicas, luego secar ya sea en el horno a 60ºC o en un sitio soleado cubierto con una tela delgada.

§ Taponar la boca de los recipientes con algodón en rama y envolver las cajas y las pipetas en papel kraft, para llevarlos al horno a esterilización.

Precaución. La vidriería debe estar libre de retos de detergente para iniciar el proceso de esterilización. Material de plástico. Debe tenerse en cuenta la clase de plástico con el que están elaborados los elementos, para seguir el proceso de limpieza y esterilización adecuados. Las características del material plástico son las siguientes:

POLIPROPILENO TRANSLÚCIDOS POLICARBONATO CLARO POLIESTIRENO CLARO NITRATO DE CELULOSA CLARO POLITETRAFLUOROETILENO (TEFLÓN)

OPACO

POLIETILENO OPACO NYLÓN OPACO

El material translúcido y claro no se puede autoclavar ni someter a calor intenso. El material opaco, como las pipetas, probetas, tubos de centrífuga y de ensayo, es reutilizable y tolera la esterilización. Los frascos de polietileno pueden utilizarse para guardar en el congelador a menos 50ºC. ELABORACION DE TAPONES

Cortar, presionar y enrollar longitudinalmente la tira de algodón en ramas. Los tapones para recipientes de boca grande como balones y fiolas se envuelven en gasa hasta mayor consistencia, se coloca un trozo de cinta, se cubre con papel kraft y se sujetan. ENVOLTURA DE MATERIAL. Para envolver pipetas de 1 y 5 ml se recortan tiras de papel kraft, de 60cm de largo X 5 cm de ancho y para pipetas de 10ml, tiras de 60cm de largo X 5 cm de ancho. Se comienza a envolver por la punta, las cual debe quedar totalmente protegida. La pipeta se va rotando sobre la tira de papel de manera que éste cubra firmemente la totalidad de la pipeta. Al finalizar, en la boquilla de la pipeta se enrolla el papel para evitar que se desenvuelva. Este mismo proceso se realiza con las baja lenguas y escobillones, cortando tiras de papel de 30cm X 5 cm. (Véase figura 2.5)

FIGURA 2.5. PROCESO DE ENVOLTURA DE PIPETAS. Las cajas de Petri, el material de caucho, el plástico, la tela y demás también deben ser envueltos en papel kraft antes de someterlos al proceso de esterilización, para protegerlos de la contaminación ambiental después de realizado el proceso. PROCEDIMIENTO: Dada una lista de materiales, usted debe indicar qué método de esterilización es adecuado en cada caso. Siguiendo la demostración práctica dada por el profesor, usted preparara el material para su posterior esterilización: cajas de petri, pipetas, erlenmeyers, tubos de ensayo, asas, etc. Lleve a esterilizar de acuerdo con el agente físico adecuado. MATERIALES Y EQUIPOS

• Caja de petri • Tubos de

ensayo. • Pipetas. • Erlenmeyers. • Papel kraft. • Autoclave.

• Horno seco. • Cinta de

enmascarar. • Gasa. • Algodón. • Asa

bacteriológica.

• Mechero de Bunsen.

• Hisopos. • Estufa eléctrica. • Baja lengua

PROCEDIMIENTO Nº1 1. Recorte el papel para envolver material de acuerdo a las necesidades. 2. Tome el material correspondiente y envuélvalo según las instrucciones del

tutor; por último colóquele un trozo pequeño de cinta control de esterilización. 3. Llévelos al horno de aire caliente y encienda en la temperatura adecuada

(180ºC) 350 F , una vez caliente empiece a contabilizar el tiempo de esterilización (2 horas).

4. Finalizado el proceso y luego de bajar la temperatura, verifique la cinta control.

PROCEDIMIENTO Nº2 1. Asegúrese de que el nivel del agua sea el adecuado para el proceso, coloque

la rejilla y sobre ella la canasta y dentro de ella el material a esterilizar (medios de cultivo, cultivos bacterianos, material biológico).

2. Cierre correctamente la olla, encienda y controle las condiciones de esterilización. Observe los colores del manómetro y no deje que la aguja llegue al rojo pues ocurriría una explosión, esto lo puede controlar con el botón giratorio y la válvula de escape de vapor.

3. Una vez finalizado el tiempo proceda según las instrucción del uso del autoclave.

CUESTIONARIO

1. ¿Qué es esterilización? 2. ¿Dibuje un autoclave con sus partes y describa su función? 3. ¿Qué medidas podría tomar usted para verificar la efectividad de la

esterilización por autoclavado? 4. ¿Qué otros procesos físicos permiten disminuir la carga microbiana? 5. ¿Qué otros tipos de rayos a diferentes longitudes de onda se emplean para

esterilización?

OBJETIVOS

• Preparar un medio de cultivo siguiendo los lineamientos básicos de asepsia y las recomendaciones del fabricante.

• Establecer el papel de cada componente del medio de cultivo en el cubrimiento de las diferentes necesidades nutricionales de los microorganismos.

• Identificar las diferentes clases de medios de cultivo manejados en los laboratorios de diagnóstico.

• Formular adecuadamente las cantidades requeridas de los medios a emplear.

• Esterilizar y disponer en su recipiente final los medios preparados. MARCO TEÓRICO Los microorganismos como todos los seres vivos requieren ciertos nutrientes básicos y factores físicos para el mantenimiento de su vida, estas necesidades varían según el tipo de microorganismo y es necesario conocerlas para cultivar los microorganismos en el laboratorio. Las necesidades nutricionales básicas pueden suministrarse en el laboratorio por la variedad de medios de cultivo; estos en general suministran:

1. Fuente de carbono: el carbono es un componente esencial y central para conformar la estructura celular y permitir a la célula realizar todas sus funciones. Según la fuente de carbono los microorganismos se encuentran en dos grupos: autótrofos y heterótrofos. Los organismos autótrofos pueden cultivarse en medios que contengan únicamente compuestos inorgánicos; usan principalmente dióxido de carbono como carbono inorgánico. Los organismos heterótrofos en su lugar necesitan un suministro de carbono orgánico por ejemplo glucosa. 2. Fuente de nitrógeno: elemento esencial para que la célula construya macromoléculas como proteínas y ácidos nucleicos. Algunos m.o. usan nitrógeno atmosférico, otros emplean sales de nitrato o de amonio como compuestos inorgánicos así como otras requieren compuestos orgánicos que contengan nitrógeno como aminoácidos. 3. Elementos no metálicos: iones no metálicos como el sulfuro y el fósforo. El sulfuro puede encontrarse en proteínas, sulfatos o sulfuro elemental, mientras el Fósforo se adiciona como sales (fosfatos). 4. Elementos metálicos: (Ca, Zn, Na, K, Cu, Mn, Mg, Fe+2 y Fe +3): encontrado en sales inorgánicas y disponibles en concentraciones trazas. Llamados micro nutrientes. 5. Vitaminas: los microorganismos pueden tomarlas del medio ya elaboradas o sintetizarlas. Algunos poseen una variedad de vías para sintetizar vitaminas mientras otros sintetizan un número muy limitado de vitaminas a partir de componentes del medio. 6. Agua

PRÁCTICA N°3 MEDIOS DE CULTIVO

LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA GENERAL

7. Energía: existen dos tipos bioenergéticos de microorganismos, los fotótrofos y quimiótrofos. Los fotótrofos emplean la energía radiante (luz solar) como única fuente de energía. Los quimiótrofos obtienen la energía por oxidación de compuestos químicos, los cuales pueden ser moléculas orgánicas o inorgánicas.

El objetivo principal consiste en satisfacer las necesidades nutricionales ya sea para recuperar la célula de lesiones o para permitir su crecimiento; de manera general éstos pueden ser clasificados como medios no definidos o medios químicamente definidos. Para los químicamente definidos se conocen las cantidades exactas de compuestos químicos puros que lo conforman ya sea de tipo orgánico como inorgánico, mientras los medios no definidos están compuestos de un número ilimitado de sustancias complejas, extractos de plantas, de animales, cuya composición química exacta no se conoce. En los primeros al formular las concentraciones exactas de sus componentes (por lo general, con buen grado de pureza) se debe adicionar cantidades de elementos trazas para suplir los requerimientos, sin embargo en los medios no definidos dado su origen no se requiere llevar a cabo este proceso de manera significativa.

TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO

Existen 3 tipos: 1. NATURALES: son aquellos empleados para el cultivo del microorganismo tal

y como se encuentran en la naturaleza, Ejemplo: Sangre diluida, leche, extractos vegetales.

2. SINTÉTICOS: son aquellos de composición conocida y reproducible como resultado de los requerimientos nutricionales de los microorganismos. Corresponden a los actualmente usados en laboratorios de microbiología o bacteriología.

3. VIVOS: son aquellos que contienen células u organismos vivos. Ejemplo: las células de riñón de mono y huevo embrionario.

Los microorganismos en general pueden satisfacer sus requerimientos nutricionales de los medios de cultivo ya sea sustancias naturales o artificiales.

CLASES DE MEDIOS DE CULTIVO

1. MEDIOS DE CULTIVO SIMPLE: Contienen los requerimientos nutricionales básicos y mínimos para el crecimiento de bacterias poco exigentes. 2. MEDIOS DE CULTIVO ENRIQUECIDOS: Contienen elementos altamente nutritivos ya sea en forma natural o artificial. 3. MEDIOS DE CULTIVO DIFERENCIALES: Tienen dentro de su composición elementos que permiten poner de manifiesto una propiedad especial de las bacterias. 4. MEDIOS DE CULTIVO SELECTIVOS: Permiten el crecimiento de unas bacterias y suprime el crecimiento de otras.

PROPIEDADES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Humedad: indispensable para el crecimiento de microorganismos, su carencia (desecación) puede llevar a la muerte del microorganismo. Fertilidad: se refiere a los elementos o compuestos básicos que permiten el crecimiento bacteriano. pH: se refiere a los pH óptimos para el desarrollo bacteriano, indispensable para su aislamiento; variaciones ácidas o alcalinas, pueden evitar su crecimiento. Transparencia: permite la observación directa de la morfología. Los medios de cultivo pueden presentar estados líquidos, semisólidos o sólidos. Actualmente vienen en presentación en polvo y granulado. Corresponden a los medios de cultivo sintéticos que preparamos y usamos para el aislamiento y crecimiento bacteriano. ALMACENAMIENTO: Los medios de cultivo sintéticos deben conservarse en un lugar seco, protegido de la luz, a una temperatura entre 15º-30ºC en envase cerrado, inclusive después de su uso. Bajo estas condiciones los medios de cultivo deshidratados conservan sus cualidades durante 5 años como mínimo a partir de la fecha de fabricación. Debe observarse siempre la fecha de caducidad en la etiqueta del envase. Aquellos medios de cultivo ya preparados y esterilizados (listos para su uso) deben utilizarse lo más pronto posible y por lo tanto almacenarlos a corto tiempo a bajas temperaturas (4ºC) en refrigerador; algunos como los que contienen tioglicolato se conservan mejor a temperatura ambiente, siempre protegidos de la luz. Para su empleo se sacan del refrigerador y se atemperan a 37ºC en la incubadora. PREPARACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Es un proceso clave en el trabajo de rutina e investigación dentro de los laboratorios de diagnóstico. Para obtener un producto final de excelente calidad se deberá contar con conocimientos básicos en fisicoquímica y microbiología. 1. DISOLUCIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO DESHIDRATADO: Se debe emplear agua limpia, recién destilada y con pH lo más cercano posible al neutro. Los recipientes a usar deben ser lo suficientemente grandes para que el medio sea agitado con facilidad. Inicialmente se añade la mitad de agua y se agita suficientemente para conseguir una suspensión homogénea; después se incorpora la cantidad de agua restante enjuagando los restos de medio que se adhieran a las paredes del recipiente, se procede a calentar para lograr la disolución de agar confirmándola cuando al agitar el recipiente con movimientos circulares, no se adhiere a la pared interna del recipiente ninguna partícula de agar o medio, la solución debe resbalar libremente presentando generalmente un color traslucido y brillante. Todo tipo de medio de cultivo es sensible al calentamiento, no debe calentarse mas de lo estrictamente necesario, es imprescindible verificar en la etiqueta del envase en caso de que no deba ser sometido a ulterior esterilización en autoclave. Para preparar esta clase de medios se recomienda esterilizar inicialmente el agua destilada, adicionando la

cantidad de agar cuando esta se encuentre a temperatura ambiente, sometiendo luego a un breve calentamiento hasta la disolución del agar. Si la preparación es de más de 2 litros, se recomienda desleír (hidratar) el medio de cultivo en aproximadamente una décima parte de la cantidad prevista de agua y dejarla remojar durante 15 minutos, calentar a ebullición el agua restante, agregar esta agua con constante agitación al medio remojado, y calentar hasta su completa disolución. 2. ESTERILIZACIÓN Antes de su esterilización y después de su completa disolución se debe repartir el medio de cultivo en los recipientes definitivos o en los que ulteriormente se lleve a cabo el trabajo de investigación, excepto si corresponde a cajas de petri. La esterilización, si así lo indica la etiqueta, se lleva a cabo en autoclave a 121ºC obtenidos con 15 libras de presión por 15 minutos. Tras la esterilización y después de haber alcanzado el equilibrio de presiones (válvula abierta) y para evitar la sobrecarga térmica del medio de cultivo, este debe sacarse enseguida del autoclave y enfriar los recipientes rápidamente a temperatura de vertido entre 45-50ºC, así se evitara alterar el medio de cultivo. 3. VERTIDO EN PLACA Previamente remover el medio de cultivo oscilando el recipiente en sentido circular para entremezclarlo de manera uniforme. Verter el medio a las cajas de petri a la temperatura de vertido evitando la formación de humedad en la tapa de la caja de petri. Las burbujas de aire en la superficie de la placa se eliminan abanicando brevemente con la llama no luminosa de un mechero de bunsen o agitando con movimientos circulares. 4. TUBOS DE AGAR INCLINADO Los tubos llenos de medio de cultivo esterilizado, todavía liquido, se colocan en una posición inclinada de tal forma que se forme una placa de aproximadamente 3 cm. Y una superficie inclinada de iguales dimensiones. (Agar inclinado en pico de flauta). POSIBLES DEFECTOS EN LA MANIPULACIÓN Y PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO • Apelmazamiento de los medios de cultivo deshidratados: Se debe a una

conservación en ambiente exclusivamente húmedo, puede ser la causa de envase abierto por tiempo prolongado o dejar mal cerrado el envase después de su uso o por ultimo que el medio de cultivo este pasado de fecha. Se recomienda después de usarlos, cerrarlos muy bien y almacenarlos en posición horizontal.

• Desviación del pH: Causado por utilización de agua no neutra, envase mal cerrado, sobrecalentamiento del medio de cultivo durante su preparación o por vencimiento del medio.

• Turbidez: Precipitación causada por uso de recipientes incorrectamente limpios, sobrecalentamiento, perdida de agua por evaporación del medio.

• Escasa estabilidad del gel. Debido a la proporción inadecuada del medio de cultivo deshidratado, mala disolución, ineficiencia en la agitación o bajo pH (medios con extractos naturales o elaborados por componentes).

• Medios de cultivo contaminados: por esterilización deficiente o contaminación ulterior a su preparación.

• Colonias incorrectas o desleídas: Causada por superficie del medio húmeda y por demasiado inoculo en la siembra.

CLASES DE MEDIOS DE CULTIVO MEDIOS SIMPLES: • Agar nutritivo: Contiene extracto de carne, peptona, agar. • Caldo nutritivo: Contiene extracto acuoso de carne adicionado de peptona al 1% y cloruro de Sodio al 0.5%. Ej: caldo nutritivo (Nutriet broth). • Agar blando: Medio semisólido usado para conservar cepas y estudiar el movimiento de las bacterias. Se prepara con Nutrent broth 100ml y 0.5 g de agar-agar. Se reparte en tubos pequeños, se esteriliza a 15 libras por 15 minutos. • Agar base sangre: medio sólido que contiene peptona. Usado para el desarrollo de todo tipo de bacterias. MEDIOS ENRIQUECIDOS

• Caldo BHI (brain heart infusión), contiene extracto de cerebro y extracto de corazón de animales además de peptonas.

• Agar sangre: al agar base sangre (blood base agar) se le añade sangre de conejo desfibrinada al 7% estéril cuando este tenga una temperatura de 45ºC luego de su esterilización.

• Agar chocolate: consiste en un agar sangre que antes de su solidificación se lleva a 100ºC por 1 minuto(ebullición), así se rompen los glóbulos rojos tomando un color marron. Se usa para el aislamiento de Haemophilus sp. y Neisseria sp.

• Medio de loeffler: medio enriquecido que contiene 75% de suero y 25% de caldo glucosado. Se sirve en tubos en posición inclinada (75ºC) dejándolos 6 horas, después son esterilizados a 90ºC durante 20 minutos en 3 días consecutivos.

• Medio Bordet-Genjou: medio que contiene glicerol y sangre. Uso: aislamiento de Bordetella pertussis.

• Medio tioglicolato: permite los aislamientos de aerobios tolerantes y anaerobios. Debe conservarse en la oscuridad, en tubos tapa rosca, de manera que la anaerobiosis se mantenga en el fondo y la aerobiosis en la superficie.

MEDIOS SELECTIVOS Y DIFERENCIALES • Agar Mac conkey: medio selectivo para el crecimiento de enterobacterias.

Contiene peptona, sales biliares, lactosa y rojo neutro. • Agar SS: contiene sales biliares en mayor concentración que el agar Mac

Conkey y verde brillante que impide el crecimiento de bacterias coliformes pero permite el crecimiento de Salmonella sp. y Shigella sp.

• Agar EMB (eosina azul de metileno): contiene colorante que impide el crecimiento de bacterias Gram positivas. Escherichia coli, crece dando colonias con brillo metálico característico.

• Caldo tetrationato: medio para investigación de bacilos entéricos, favorece el crecimiento de Salmonella sp., inhibe el crecimiento de coliformes hasta por 12 horas. Antes de usar, adicionar 2 gotas de Yodo.

• Medio Selenito: medio que favorece el desarrollo de Salmonella sp. y Shigella sp., ya que el selenito de sodio impide el desarrollo de coliformes durante 8 – 12 horas.

• Agar Bismuto Sulfito: permite observar colonias color negro con brillo metálico característico de Salmonella typhi y otras Salmonellas sp. de color verde.

• Medio de telurito: permite el crecimiento de Corynebacterias, Staphylococcus sp., Listeria sp., el telurito de potasio al 2% es reducido por la Corynebacterias reductoras apareciendo colonias de color gris-negro.

• Agar sabouraud: contiene dextrosa peptona o maltosa agar, pH entre 5 – 5.5 inhibiendo el desarrollo de microorganismos que no sean hongos.

• Medio lowestein.Jensen: contiene fosfatos, minerales, sulfatos, citratos, glicerol, almidón, huevo, verde de malaquita al 1%, se usa para el aislamiento de Mycobacterias.

• Agar sangre con azida: consiste en agar sangre mezclado con azida de Sodio al 1% (100ml de agar sangre mas 2ml. de azida de sodio al 1%). Permite el aislamiento de Gram positivos a partir de muestras muy contaminadas con Gram negativas.

• Medio Thayer-Martin: medio enriquecido con hemoglobina y vitaminas para favorecer el crecimiento de bacterias exigentes, adicionado con antimicrobianos y que son sustancias que impiden el crecimiento de microorganismos diferentes a la Neisseria gonorrhoeae y Neisseria meningitidis.

MEDIOS DE TRANSPORTE Mantienen viables los microorganismos de una muestra antes de que se procesen, permite conservarlos evitando su multiplicación y su muerte.

• Medio de Stuart: se utiliza para transportar muestras de materiales purulentos recogidos con escobillón estéril.

• Medio de buffer glirinado: permite el transporte de muestras de materia fecal para coprocultivos manteniendo la viabilidad de la Shigella sp.

MEDIOS BIOQUÍMICAS DIVERSOS

Son aquellos que demuestran características bioquímicas particulares de las bacterias. Son: medios de fermentación de azucares, algunos como: TSI, Citrato, SIM, Caldo MR-VP, Caldo malonato, etc. Comercialmente pueden encontrarse sistemas multipruebas bioquímicas con 10 o mas parámetros que permiten una mas rápida y precisa identificación de las propiedades metabólicas del microorganismo y su consiguiente identificación. MATERIALES

• Medios de cultivo sintéticos.

• Cajas de petri estériles.

• Tubos tapa rosca.

• Erlenmeyer. • Probetas. • Agua destilada. • Autoclave.

• Cinta control de esterilización.

• Balanza. • Espátulas o

bajalenguas. • Papel filtro.

PROCEDIMIENTO 1. Lea cuidadosamente la etiqueta del medio de cultivo asignado por su tutor 2. Pese las cantidades requeridas acorde con el volumen a preparar teniendo

muy en cuenta el marco teórico presentado anteriormente, para cajas de petri de 10* 100 mm emplee de 15 a 20ml. para cajas de 10* 50 mm emplee 8 a 10ml.

3. Disuelva el agar y en caso de requerirse dispóngalo en su recipiente final (tubos).

4. Esterilice según las indicaciones de la etiqueta y manteniendo estricta observación de las normas de bioseguridad.

5. Permita que el autoclave alcance la presión atmosférica, destape el autoclave y enfríe los medios a dispensar en cajas de acuerdo con las instrucciones de su tutor.

6. Sirva los medios de cultivo siguiendo las indicaciones del tutor en una zona próxima al mechero de Bunsen y almacénelos en el lugar respectivo bajo refrigeración.

7. Puede seleccionar una muestra del lote preparado para realizar análisis de control de calidad.

CUESTIONARIO

1. Identifique las fuentes de bioelementos en los medios de cultivo preparados en el laboratorio.

2. Al preparar el agar sangre, ¿cuál es la razón por la cual usted adiciona sangre después de esterilizar el medio de cultivo?

3. Cite dos ejemplos de medio de cultivo que no se esterilicen en autoclave. 4. Cite dos ejemplos de medios de cultivo listos para su uso. 5. Cómo se realiza el control de calidad de los medios de cultivo después de su

preparación.