Uji Daya Inhibisi Ektrak Etanol Daun Pacar Kuku (Lawsonia inermis Linn.) terhadap

Aktivitas Enzim Xantin Oksidase

Patrisius Haryanto2443012146

Fakultas FarmasiUniversitas Katolik Widya Mandala

Surabaya

Latar belakangDewasa ini, penyakit gout makin

meningkat. Hal tersebut disebabkan oleh pola makan yang kurang terkontrol terutama makanan dan minuman yang mengandung sumber purin tinggi.

Menurut data penelitian yang telah dilakukan oleh WHO – ILAR COPCORD, dinyatakan bahwa negara Indonesia menjadi negara dengan persen prevalensi gout tertinggi kedua setelah Australia (4 %) dengan angka 1,7 % diikuti Taiwan dengan angka prevalensi 0,67 %.

Oleh karena itu masalah hiperurisemia dan penyakit gout menjadi masalah penting di Indonesia.

Obat sintetik untuk menurunkan kadar asam urat salah satunya adalah Allopurinol.

penggunaan Allopurinol dalam jangka waktu yang panjang dapat menimbulkan efek samping seperti diare, rasa mual dan kemerahan pada kulit yang disertai dengan rasa gatal.

Berdasarkan efek samping yang ditimbulkan maka perlu adanya obat alternatif lain dalam mengobati penyakit asam urat.

Indonesia terletak di daerah tropis dan sangat kaya dengan berbagai spesies flora.

Beberapa tanaman banyak mempunyai khasiat atau manfaat, dimana di dalam tanaman tersebut mengandung zat yang memiliki potensi farmakologi.

Tanaman pacar kuku (Lawsonia inermis Linn.) merupakan salah satu tanaman yang mempunyai banyak manfaat bagi kesehatan.

Berbagai penelitian telah dilakukan menggunakan tanaman pacar kuku salah satunya uji aktivitas antiartritik dari ekstrak hidroalkoholik daun pacar kuku (Lawsonia inermis Linn.). Pada tikus yang diinduksi adjuvan Freund diperoleh hasil pada pemberian ekstrak dengan dosis 400 mg/kg menunjukan daya hambat yang signifikan terhadap pembengkakan (Kore, Shete dan Desai, 2011).

Selain hasil penelitian yang telah dilakukan telah beredar dipasaran sediaan anti gout yaitu “Gout Relief” yang mengandung simplisia pacar kuku sebesar 50 mg ditambahkan dengan beberapa simplisia lainnya. Kapsul “Gout Relief” mengandung 620 mg campuran simplisia.

Rumusan masalah

Berdasarkan latar belakang yang telah diuraikan maka masalah penelitian dapat dirumuskan sebagai berikut:

1. Apakah ekstrak etanol daun pacar kuku (Lawsonia inermis Linn.) dapat menghambat aktivitas xantin oksidase ?

2. Berapa nilai IC50 xantin oksidase ekstrak etanol daun pacar kuku (Lawsonia inermis Linn.) ?

Tujuan penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk : 1. Mengetahui potensi ekstrak etanol daun

pacar kuku (Lawsonia inermis Linn.) dalam menginhibisi enzim xantin oksidase.

2. Menentukan nilai IC50 xantin oksidase ekstrak etanol daun pacar kuku (Lawsonia inermis Linn.).

Hipotesis Penelitian

1. Ekstrak etanol daun pacar kuku (Lawsonia inermis Linn.) memiliki daya inhibisi terhadap aktivitas enzim xanthin oksidase.

2. Nilai IC50 xantin oksidase ekstrak etanol daun pacar kuku (Lawsonia inermis Linn.) sebanding dengan allopurinol sebagai pembanding.

Manfaat penelitianManfaat dari penelitian ini untuk mengetahui lebih lanjut kemampuan ekstrak etanol daun pacar kuku (Lawsonia inermis Linn.) dalam menghambat aktivitas enzim xantin oksidase, sehingga diharapkan dapat menjadi obat alternatif untuk pengobatan asam urat.

Enzim adalah polimer biologik yang mengkatalisis reaksi kimia di dalam tubuh. Adapun enzim mempunyai karakteristik antara lain, hampir semua enzim adalah protein dan mengikuti reaksi fisika dan kimia dari protein, tidak tahan terhadap panas, larut dalam air.

Xantin oksidase termasuk dalam kelompok enzim oksireduktase dengan jenis reaksi pemindahan elektron dari suatu senyawa ke suatu akseptor.

TINJAUAN PUSTAKA

Skema pembentukan asam urat dari xantin

XantinMolybdopterin

Molybdopterin Asam urat

Molybdopterin berinteraksi dengan gugus C8 hidroksil dari substrat xantin. Gugus keto dari molybdopterin berikatan dengan gugus C8 dari substrat xantin. Dari interaksi tersebut dengan bantuan H2O terjadi pembetukan gugus keto pada C8 substrat xantin dan menjadi asam urat.

Taksonomi tanaman pacar kukuKingdom : Plantae (Tumbuhan)

Sub Kingdom : Tracheobionta (Tumbuhan berpembuluh)

Super Divisi : Spermatophyta (Menghasilkan biji)

Divisi : Magnoliophyta (Tumbuhan berbunga)

Kelas : Magnoliopsida (Berkeping dua/ dikotil)

Sub Kelas : Rosidae Ordo : Myrtales Famili : Lythraceae Genus : Lawsonia Spesies : Lawsonia inermis

Linn.

Kandungan kimia tanaman

Tanaman pacar kuku (Lawsonia inermis Linn.) memiliki beberapa kandungan kimia antara lain saponin, flavonoid, tanin, lawson, minyak menguap dan naftokuinon.

Metodologi PenelitianJenis penelitian

Jenis metode penelitian yang digunakan adalah penelitian eksperimental dengan variabel-variabel penelitian.

Variabel-variabel penelitian ini antara lain yaitu variabel bebas (konsentrasi ekstrak), variabel tergantung (aktivitas enzim dan % inhibisi) dan variabel terkendali (konsentrasi enzim xantin oksidase, kondisi pengujian enzimatis, metode ekstraksi, pelarut ekstrasi yang digunakan).

Bahan dan alat penelitianBahan Tanaman

Tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah Pacar Kuku atau Henna (Lawsonia inermis Linn.)

Bahan-bahan lainBahan-bahan lain yang digunakan pada

penelitian ini adalah etanol 96%, kloroform, Xantin (Sigma, Germany), Xantin oxidase (Sigma, Germany), Dikalium Hidrogen Fosfat (K2HPO4) (Merck, Indonesia), Kalium Dihidrogen Fosfat (KH2PO4) (Merck, Indonesia), allopurinol dan air steril.

Pembuatan Larutan untuk ReaksiPembuatan larutan Substrat Xantin

15,211 mg xantin + lima tetes NaOH 1 M hingga larut

Dicukupkan menggunakan aqua steril

Dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml(Xantin 1 mM)

Diencerkan menggunakan dapar fosfat 0.05 M pH 7,5

Xantin 0.15 mM

Pembuatan larutan Xantin Oksidase

3,4 mg solid enzim (aktivitas 7,4 U/mg) + 5 ml dapar fosfat 0,05 M pH 7,5

Enzim konsentrasi 5,032 U/ml(Larutan induk)

Diencerkan menggunakan dapar fosfat 0,05 M pH 7,5

Enzim konsentrasi 0,5 U/ml(Larutan kerja)

Desain Penentuan konsetrasi

Perhitungan Aktivitas Enzim

Tabel pengolahan data

Skema penelitian

Hasil dan Pembahasan

Standarisasi simplisia

No Parameter Hasil Pustaka*)1. Organoleptis

-. Bau Tidak berbau

-

-. Tekstur Serbuk agak kasar

-

-. Warna Kecokelatan - -. Rasa Tidak

berasa-

2. Kadar abu 6,04 ± 0,65%

-

3. Susut pengeringan

9,03 ± 0,47 %

≤ 10 %

*) Depkes RI, 1995 & Voigt, 1995.

Hasil standarisasi ekstrakNo Parameter Hasil Pustaka*)1. Organoleptis

-. Warna Hitam kecokelatan - -. Tekstur Semisolid -

-.Bau Berbau aromatis - -. Rasa Tidak berasa -

2. Kadar sari larut etanol

63,00 ± 17,79 % ≥ 18% 3. Kadar sari larut air 42,08 ± 7,14 % ≥ 25% 4. Kadar abu total 2,87 ± 0,73 % ≤ 11%5. Kadar abu tidak larut

asam0,43 ± 0,42 % ≤ 3 %

6. Kadar abu larut air 2,38 ± 0,59 % -7. Susut pengeringan 4,47 ± 0,25 % -

*) Pustaka:Ministry of Health and Family Welfare Departement of Ayush Goverment of India, 2001.

Skrining fitokimia ekstrak etanol daun pacar kuku

Skrining Pereaksi Hasil Keterangan*)

Saponin Kocok kuat Timbul busa PositifKuinon NaOH 1N Warna merah Positif

Terpenoid Eter, asam asetat, H2SO4 Hijau PositifFlavonoid NaOH + H2SO4 Kuning kemerahan PositifAlkaloid Dragendorff Tidak ada endapan

jinggaNegatif

Tanin FeCl3 Hijau Positif

*) Pustaka : Farnsworth (1966).

Nilai Rf Hasil Pengujian Ekstrak Etanol Daun Pacar Kuku dengan Pembanding Kuersetin

UV 254 nm UV 366 nmEkstrak

(A)Kuersetin

(B)Ekstrak

(A)Kuersetin

(B)

Rf

0,11 0,110,27 0,270,56 0,560,70 0,70 0,70 0,700,78 0,780,83 0,830,89 0,89

Penambahan penampak noda dengan AlCl3 diperoleh noda bercak berwarna kuning kecoklatan yang menandakan adanya kandungan flavonoid.

Toluen : Etyl asetat(3 : 7)

Daya Inhibisi Allopurinol terhadap Aktivitas Enzim Xantin Oksidase

Konsentrasi ekstrak(µg/mL)

% inhibisi % inhibisi ± SD IC50

(µg/mL)n1 2 n3

0,2 34,88 24,93 25,21 28,34 ± 5,66 n1= 0,68

0,4 29,67 41,67 27,12 32,82 ± 7,76 n2= 0,50

0,8 61,87 69,39 61,43 64,23 ± 4,47 n3= 0,68

1,6 73,39 71,19 63,05 69,20 ± 5,44

3,2 77,69 66,93 72,55 72,39 ± 5,38

Rata-rata ± SD 0,62 ± 0,10

Dari pengujian diperoleh nilai IC50 allopurinol sebesar 0,62 ± 0,10 µg/mL atau 4,57± 0,74 µM. Nilai IC50 diperoleh dari persamaan garis polinomial orde 4 dimana nilai Y sebagai persen inhibisi sebesar 50% sehingga diperoleh nilai X sebagai konsentrasi inhibitor.

Grafik Daya Inhibisi Allopurinol terhadap Aktivitas Enzim Xantin Oksidase

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.50

10

20

30

40

50

60

70

80

90

f(x) = 55.3505766369092 x⁴ − 306.595256696454 x³ + 478.714635416711 x² − 198.440678571453 x + 48.1100514285746R² = 1f(x) = 14.028304811509 x⁴ − 64.9304501488156 x³ + 47.3371701388993 x² + 71.7768273809464 x + 9.17934603174684

R² = 1

f(x) = 61.3720783730212 x⁴ − 350.30296875003 x³ + 582.082038194496 x² − 284.574891071458 x + 71.2127151111153R² = 1

N1

Konsentrasi allopurinol (ppm)% in

hibi

si

Allopurinol yang digunakan dalam pengujian menggunakan tablet komersial sehingga perlu dilakukan uji daya hambat matriks pembawa tablet terhadap aktivitas xantin okidase.

Dari pengujian diperoleh hasil rata-rata daya inhibisi matriks terhadap aktivitas enzim xantin oksidase sebesar 1,98 ± 0,63 %. Hasil yang diperoleh ini sangat kecil sehingga matriks pembawa dalam tablet allopurinol dianggap tidak mempunyai daya hambat terhadap aktivitas enzim xantin oksidase.

Konsentrasi ekstrak(µg/mL)

% inhibisi % inhibisi ± SDN1 N2 N3

0,2 0,59 1,58 3,36 1,84 ± 1,40

0,4 2,49 1,62 4,47 2,86 ± 1,46

0,8 0,87 2,77 1,30 1,64 ± 0,99

1,6 1,78 2,53 0,47 1,59 ± 1,04

3,2 1,06 0,03 2,33 1,14 ± 1,15Rata-rata ± SD 1,98 ± 0,63

Daya Inhibisi matriks terhadap xantin oksidase

Daya Inhibisi Ekstrak Etanol Daun Pacar Kuku terhadap Aktivitas Enzim

Xantin OksidaseKonsentrasi ekstrak

(µg/mL)% inhibisi % inhibisi ±

SDIC50

(µg/mL)n1 n2 n3

1,5 21,74 18,65 15,64 18,68 ± 3,04 n1= 19,43

3,125 28,72 22,89 18,87 23,49 ± 4,95 n2= 24,22

6,25 28,80 27,52 25,40 27,24 ± 1,71 n3= 29,62

12,5 37,11 29,64 28,85 31,87 ± 4,55

25 86,17 80,78 76,85 81,27 ± 4,67

50 92,15 92,35 93,00 92,50 ± 0,44

100 91,47 92,64 89.50 91,20 ± 1,58

200 91,41 92,89 89,93 91,41 ± 1,48

400 88,42 96,77 89,52 91,57 ± 4,53

Rata-rata ± SD 24,42 ± 5,10

IC50 merupakan nilai konsentrasi minimal ekstrak yang dapat menginhibisi enzim sampai 50%. Dari hasil pengujian daya hambat ekstrak etanol daun pacar kuku terhadap aktivitas enzim xantin oksidase diperoleh hasil IC50 ekstrak etanol daun pacar kuku sebesar 24,42 ± 5,10 µg/mL.

Aktivitas inhibisi enzim xantin oksidase oleh suatu senyawa yang didasarkan pada nilai IC50, senyawa dikatakan aktif bila memiliki IC50 kurang dari 100 µg/mL (Thuong et al, 2006).

Grafik Daya Inhibisi Ekstrak Etanol Daun Pacar Kuku terhadap Aktivitas

Enzim Xantin Oksidase

0 50 100 150 200 250 300 350 400 4500

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110f(x) = 14.3210060734096 x^0.369082826233317R² = 0.85044809985456f(x) = 16.6555898043576 x^0.345068390451797R² = 0.854352755119433f(x) = 20.8438625120067 x^0.295876929239896R² = 0.823670399737739

Rep. 1Power (Rep. 1)Rep. 2Power (Rep. 2)Rep. 3Power (Rep. 3)

Konsentrasi ekstrak (ppm)

% in

hibi

si

Berdasarkan uji statistik antara allopurinol sebagai pembanding dengan ekstrak etanol daun pacar kuku diperoleh perbedaan yang bermakna antara IC50 allopurinol dengan IC50 ekstrak etanol daun pacar kuku. Dari hasil tersebut diketahui kemampuan ekstrak etanol daun pacar kuku dalam menghambat aktivitas xantin oksidase 39 kali lebih kecil dibandingkan dengan allopurinol.

Kemampuan ekstrak etanol daun pacar kuku dalam menghambat aktivitas enzim xantin oksidase disebabkan oleh adanya kandungan metabolit sekunder yaitu flavonoid. Flavonoid mampu menghambat kerja dari enzim xantin oksidase.

Struktur Kimia Quersetin, Luteolin, Mirisetin, Apigenin, Xantin dan Allopurinol

Golongan kuersetin, mirsetin, apigenin dan luteolin dari ekstrak tumbuhan berfungsi sebagai inhibitor xantin oksidase. Hal ini disebabkan adanya ikatan rangkap antara C2 hidroksil dan C3 hidroksil sehingga cincin B koplanar terhadap A, sehingga memudahkan terjadinya interaksi dengan xantin oksidase.

Pada senyawa apigenin yang berinteraksi dengan molybdopterin (Mo-pt kofaktor) adalah pada C4 karbonil, C5 hidroksil dan C7 hidroksil, sedangkan pada mirisetin dan kuersetin berada di pusat enzim dengan gugus polar C3 hidroksil, C5 hidroksil dan C7 hidroksil pada cincin A serta C3’ hidroksil dan C4’ hidroksil pada cincin B berikatan dengan salah satu sisi aktif enzim yaitu molybdopterin (Mo-pt kofaktor).

Untuk senyawa luteolin interaksi dengan molybdoterin (Mo-pt kofaktor) terjadi pada gugus C5

hidroksil dan C7 hidroksil pada cincin A serta C3’ hidroksil dan C4’ hidroksil pada cincin B. Antara xantin, allopurinol dan senyawa flavonoid mempunyai kesamaan dalam hal interaksi dengan sisi aktif enzim xantin oksidase yaitu pada molybdopterin (Mo-pt kofaktor).

Selain itu adanya ikatan rangkap pada flavonoid memungkinkan terjadinya reaksi adisi (oksidase oleh enzim xantin oksidase).

Adapun kemampuan daya hambat flavonoid terhadap aktivitas enzim xantin oksidase terjadi melalui interaksi dengan gugus samping enzim dan mekanisme inhibisi kompetitif.

KesimpulanBerdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa :• Ekstrak etanol daun pacar kuku (Lawsonia inermis Linn.)

mempunyai daya hambat terhadap aktivitas enzim xantin oksidase. Kesimpulan ini diambil berdasarkan kemampuan ekstrak etanol daun pacar kuku yang mampu menghambat aktivitas enzim pada semua rentang konsentrasi. Dengan peningkatan konsentrasi terjadi peningkatan daya hambat ekstrak terhadap aktivitas enzim xantin oksidase.

• Dari hasil pengujian diketahui nilai IC50 ekstrak etanol daun pacar kuku terhadap enzim xantin oksidase sebesar 24,424 ± 5,10 µg/ mL.

Xantin merupakan alkaloid golongan purin yang mempunyai sifat basa sangat lemah dengan pKb sekitar 13 sampai 14. Kehadiran oksigen dalam struktur menyebabkan perubahan posisi ikatan karena tautomerisasi yang dapat terjadi.

Pergeseran tautomerik hidrogen dari nitrogen ke Keto oksigen (enolization) dapat menyebabkan xantin bersifat asam lemah (pKa sekitar 9). Xantin bersama dengan berbagai oxopurines lain dan turunannya membentuk garam dengan basa kuat (Remington and Beringer, 2006).

Tambahan

Metode sampling• Terkontrol yang meliputi:1. Bulan sampling : maret – april2. Metode : random pada lokasi yang sama3. Pengambilan dilakukan saat tanaman

berbunga.

KLTDipilih satu fase gerak yang sesuai karena

berdasarkan penelitian sebelumnya dengan tanaman dan lokasi pengambilan sampel yang sama dengan berbagai eluen dari non polar hingga yang bersifat polar diperoleh hasil eluen toluen : etyl asetat (3:7) mempunyai pemisahan yang bagus.

Eluen lain yg bisa digunakan :Etanol : etil asetat (5:5)Kloroform : etil asetat (9:1)

Metode perkolasi• Pemilihan cara dingin dilakukan agar semua

metabolit sekunder aktif terekstraksi semua baik yang tahan panas maupun yang tidak tahan terhadap pemanasan dan tidak mengalami kerusakan.

• Metode perkolasi dipilih karena rendemen ekstrak yang diperoleh lebih besar dari metode ekstraksi dingin lainnya.

Screening fitokimia & KLT• Screening fitokimia : menentukan golongan

kandungan senyawa metabolit sekunder.

• KLT : menentukan golongan kandungan senyawa metabolit sekunder tanaman dengan pola kromatogram yang spesifik terhadap tanaman tertentu dengan eluen/ pembawa tertentu.