Reporte Tipo Articulo Cientifico
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ANÁLISIS CUALITATIVO Y CUANTITATIVO DE LA COMPOSICIÓN DE
LA LECHE SEMIDESCREMADA DOS PINOS
Martínez, E.a y Villalobos, A.
b
Laboratorio de Bioquímica General
Escuela de Química, Universidad Nacional, Costa Rica
a. Escuela de Química, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad Nacional, Heredia, Costa Rica.
Teléfono: (+506)2277 3351 Fax: (+506) 2277 3579 Correo-e: [email protected] b. Escuela de Química, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad Nacional, Heredia, Costa Rica.
Teléfono: (+506)2277 3351 Fax: (+506) 2277 3579 Correo-e: [email protected]
RESUMEN
La leche es un alimento de consumo diario en la dieta humana y este representa un gran potencial benéfico para la
salud humana. Debido a las propiedades de la leche es necesario realizar investigaciones en las que se torna de suma
importancia conocer la composición química de este alimento. A nivel experimental se realizó la extracción de los distintos
compuestos de los que está compuesta la leche, por medio de la precipitación de la caseína de la leche en medio ácido,
posteriormente se realizó una extracción metanólica-etérea para la separación de los esteroles de los ácidos grasos, y por
último se realizó una extracción alcalina para realizar la separación de los componentes proteicos. Posteriormente se realizó
un análisis cualitativo y cuantitativo tanto de carbohidratos y azúcares. Los esteroles se analizaron por el método de
Liebermann-Bouchard y el análisis de ácidos grasos por el método de la Sulfo-fosfovainillina. Los resultados obtenidos
indican que se la leche analizada contiene 20 µg de grasa por mililitro, 480 µg de carbohidratos por mililitro, 32 µg proteína
por mililitro y no contiene una cantidad analizable de lípidos en su composición. Producto de las operaciones realizadas se
concluye que la leche eta compuesta de diversos compuestos desde distintas grasas, además de carbohidratos y proteínas
principalmente, y que se torna de suma importancia realizar estudios sobre la leche debido a la importancia de ella en el
consumo humano.
Palabras Clave: Leche, Acido Graso, Esterol, Liebermann-Bouchard, Vainillina.
ABSTRACT
Milk is a food for daily consumption in the human diet and this is a great potential to benefit human health. Due to the
properties of milk research is needed in which it becomes extremely important to know the chemical composition of this
food. For the experiment was extracted from the various components of milk which is made by means of precipitation of
milk casein in acid, then was extracted in methanol-ether to separate the sterols of fatty acids, and finally made an alkaline
extraction for the separation of protein components. Subsequently conducted both qualitative and quantitative analysis of
carbohydrates and sugars. The sterols were analyzed by the method of Liebermann-Bouchard and fatty acid analysis by the
method of Sulpho-phosphovainillin. The results indicate that the milk samples containing 20 µg of fat per milliliter, 480 µg
of carbohydrate per ml, 32 µg protein per milliliter and does not contain a parsable number of lipid composition. Product of
operations is concluded that milk it´s composed of several compounds from different fats, carbohydrates and protein as well
mainly, and that becomes very important studies on the milk because of the importance of her human consumption.
Key words: Milk, fatty acids, sterols, Liebermann-Bouchard, Vanillin.
INTRODUCCIÓN
La leche se compone principalmente de agua,
grasa, proteína, lactosa con pequeñas cantidades de
ácidos orgánicos y minerales [9]
.
La leche es una emulsión de glóbulos, donde
cada glóbulo está rodeado de grasa por una membrana
compuesta de fosfolípidos y proteínas por el que la
grasa se mantiene en una fase acuosa en forma de
emulsión sumamente fina. Las vitaminas liposolubles
A, D, E y K se encuentran dentro de la porción de
grasa de la leche [9].
La grasa de la leche se compone
principalmente de los triglicéridos (98%), que se
encuentran dentro de los glóbulos y otros lípidos (2%)
en la leche que incluyen diacilglicéridos,
monoacilglicéridos, fosfolípidos, colesterol,
glicolípidos y ácidos grasos libres. Los ácidos grasos
(AG) en la leche muestran una variación considerable
y más de 400 diferentes (AG) se han identificado en la
leche, que varían en longitud de la cadena y el
número, posición y geometría de los dobles enlaces.
Sin embargo, hay sólo unos pocos de estos ácidos
grasos que están presentes en niveles de interés
(Cuadro 1). Los ácidos grasos se componen de
carbono (C), hidrógeno (H) y oxígeno (O) dispuestos
como un esqueleto de la cadena de carbono con un
grupo carboxilo (-COOH) en un extremo [7]
.
Cuadro 1. Distintos ácidos grasos presentes en la
leche ovina [9]
Los ácidos grasos de leche de vaca contiene un
promedio de 70% de ácidos grasos saturados, un 25%
de ácidos grasos monoinsaturados y un 5% de ácidos
grasos poli-insaturados. Los ácidos grasos más
abundantes son el C16:0 (ácido palmítico) y el C18:1
(ácido oleico) [6]
, como se observa en el Cuadro 1.
En la Figura 1 se muestra una conformación
detallada de la composición de la grasa en su forma de
glóbulos en la leche ovina.
Figura 1. Estructura general de la grasa de la leche ovina [2]
En comparación con la leche de otras especies
leche de vaca también contiene una gran proporción
de ácidos grasos de cadena corta, de los cuales C4:0 y
C6:0 son únicos a la leche de los rumiantes. La
composición de la grasa de leche es esencial para
muchas de las propiedades de los productos lácteos.
El equilibrio entre los ácidos grasos de cadena corta
insaturados y ácidos grasos de larga cadena puede
afectar a las propiedades de transformación, la calidad
del producto y las características organolépticas de la
leche [9].
Además de las grasas, otro gran constituyente
de la leche son las proteínas, Se considera que existen
dos tipos fundamentales de proteínas lácteas. Una
cantidad relativamente pequeña, se haya adsorbida en la
película que rodea a los glóbulos grasos, se le denomina
proteínas de la membrana del glóbulo de grasa
(MFGM por sus siglas en Inglés) como se observa en el
cuadro 2, no se conocen muy bien la naturaleza de estas
proteínas pero parece ser que algunas actividades
enzimáticas de la leche se hayan localizadas allí. La
eliminación de esta película suele dar lugar a la
aparición de “grasa libre” capaz de alterar las
características de solubilidad de la leche. La mayor parte
de las proteínas lácteas son retenidas en la leche
descremada tras la separación de los glóbulos grasos.
Las proteínas de la leche descremada se pueden separar
en varias fracciones: Caseína en un 80% y en un 20%
Albúmina y globulina, además de Proteasa-Peptona y
Nitrógeno no proteico en fracciones muy pequeñas [14].
En el cuadro 2 se observa la composición de la
leche en términos de las proteínas y grasas
constituyentes de un glóbulo de grasa de leche bovina:
Cuadro 2. Composición del glóbulo de grasa en la
leche ovina (mg/Kg de leche) [3]
Los carbohidratos de la leche están
representados en su mayoría por la lactosa (Figura 2),
el único carbohidrato libre presente en todas las
leches, que se encuentra en cantidades importantes. Se
sintetiza en la glándula mamaria y tiene un sabor que
es relativamente poco azucarado, poco soluble y posee
un efecto reductor [5]
. La lactosa es muy estable frente
al ataque enzimático; sin embargo, es la más sensible
a la acción microbiana. Dentro de la composición
química de la leche, la lactosa representa el 4.9%
aproximadamente, y es conocida como el azúcar de la
leche [3]
.
Figura 2. Estructura de lactosa es un disacárido formado por una
molécula de D-galactosa y otra molécula de D-glucosa, unidos por un
enlace glicosídico [13].
La caseína es una proteína conjugada de la
leche del tipo fosfoproteína que se separa de la leche
por acidificación y forma una masa blanca. Las
fosfoproteínas son un grupo de proteínas que están
químicamente unidas a una sustancia que contiene
ácido fosfórico. En la caseína la mayoría de los grupos
fosfato están unidos por los grupos hidroxilo de los
aminoácidos serina y treonina. La caseína en la leche
se encuentra en forma de sal cálcica(caseinato
cálcico). La caseína representa cerca del 77% al 82%
de las proteínas presentes en la leche y el 2,7% en
composición de la leche líquida [1]
.
El alto número de residuos de prolina en la
caseína causa un especial plegamiento en la cadena de
proteína e inhibe la formación de una fuerte y
ordenada estructura secundaria. La caseína no
contiene puentes di sulfuro. De igual manera la falta
de estructura secundaria es importante para la
estabilidad de la caseína frente a la desnaturalización
por calor. La carencia de estructura terciaria facilita la
situación al exterior de los residuos hidrofóbicos lo
que facilita la unión entre unidades proteicas y la
convierte en prácticamente insoluble en agua. En
cambio es fácilmente dispersable en álcalis diluidas y
en soluciones salinas tales como oxalato sódico y
acetato sódico [1].
La propiedad característica de la caseína es su
baja solubilidad a pH 4,6. El pH de la leche es 6,6
aproximadamente, estando a ese pH la caseína
cargada negativamente y solubilizada como sal
cálcica. Si se añade ácido a la leche, la carga negativa
de la superficie de la micela se neutraliza (los grupos
fosfato se protonan) y la proteína neutra precipita [11]
,
como se observa en la ecuación 1:
Ec, 1.
La caseína precipitada puede tornarse
nuevamente soluble por la adición de calcio o una
base, por el cambio del pH más allá del punto
isoeléctrico. De hecho la caseína se purifica por su
precipitación con ácido y disolución con bases por
varias veces. A pesar que la caseína no se coagula
comúnmente en el hervido, podrá haber coagulación,
si la leche estuviera ligeramente ácida o si se emplean
temperaturas elevadas. Así la leche fresca ligeramente
ácida tiene tendencia a coagular [14]
.
El método químico de Liebermann-Burchard
para la determinación de colesterol en una muestra
lipídica se basa en el desarrollo de una coloración
verde en presencia de anhídrido acético y ácido
sulfúrico concentrado con temperatura, después de 30
min de reacción [12]
. La intensidad de la coloración es
medida por absorción en el espectrofotómetro a 620
nm. La intensidad tiene una relación lineal con la
concentración de colesterol entre 100 y 600μg, se
debe realizar una solución control de colesterol de
diferentes concentraciones para realizar una
comparación [10]
. El mecanismo de la reacción que
ocurre entre el colesterol y el reactivo de Liebermann-
Bourchard se muestra en la Figura 3.
Figura 3. Mecanismo de reacción del colesterol con anhídrido acético en
medio ácido (Reacción Liebermann-Bourchard). El compuesto formado
absorbe de 600-620nm [4] n
La especificidad de la reacción de la sulfo-
fosfovanillina con los lípidos fue determinada para
estos metabolitos por su potencial para el análisis de
lípidos, esta reacción es comparable con la reacción
de ninhidrina para los aminoácidos. La sulfo-
fosfovainillina muestra su versatilidad en que se
aplica tanto a los extractos de lípidos como de las
soluciones de lipoproteínas. La reacción de este
compuesto cromofórico con los lípidos brinda una
coloración rojiza clara que absorbe a 530-540 nm [10]
.
El mecanismo de reacción de la sulfo-
fosfovainillina es complejo y se ha propuesto el que se
muestra en la Figura 4.
Figura 4. Mecanismo de reacción de los lípidos con el reactivo de la
sulfo-fosfovainillina. El compuesto formado absorbe de 530-540nm [10].
Día a día la investigación encuentra nuevos
componentes tanto del núcleo como de la membrana
del glóbulo de grasa de la leche ovina, relacionados
con la salud humana. Por lo tanto, el potencial
benéfico de la grasa de la leche continúa siendo
atractivo para su exploración y de ahí la importancia
de llevar a cabo estos análisis [2]
.
SECCIÓN EXPERIMENTAL
El análisis de lípidos en leche se realizó en tres
etapas, la primera parte correspondió a la extracción
de las fases acuosa, metanólica, etérea y alcalina.
Posteriormente se realizó el análisis cualitativo y por
último el análisis cuantitativo como se detalla a
continuación:
Parte 1: Extracción y separación de componentes
Extracción Acuosa
En dos tubos de 16×100 mm se colocaron 2,5
mL de leche, se agregó a cada tubo 5 mL de ácido
tricloroacético 9,0% m/v; se mezcló suavemente y se
dejó en reposo, se repitió la agitación cada minuto por
3 minutos. Luego de este tiempo se dio la aparición de
grumos, se tapó el tubo con tapón de hule y se
centrifugó a máxima velocidad en centrífuga clínica
por 5 minutos. Se separaron los sobrenadantes y se
transfirieron a una probeta de 25 mL. Se aforó a 25 mL
el volumen de líquido contenido en la probeta con agua
destilada. Se mezcló y se transfirió a un recipiente rotulado
como “extracto acuoso”.
Extracción Etérea – Metanólica
Se transfirieron los sedimentos del paso anterior
a un solo tubo de ensayo. Se agregó a los sedimentos
en el tubo, 2 mL de metanol 99% m/m, se agitó
enérgicamente durante 3 minutos y se dejó reposar
por 2 minutos. Se agregó otros 2 mL de metanol y se
repitió el proceso de mezclado. Se agregó 2 mL de éter
de petróleo (40:60), y se colocó el tapón de hule, se agitó
enérgicamente por 3 minutos y se dejó en reposo por 2
minutos. Se repitió este proceso agregando otros 2 ml
de éter de petróleo (40:60). Aparecieron tres fases
nítidamente separadas y se centrifugó por 5 minutos en
centrífuga clínica a máxima velocidad. Se trasladó la
fase líquida superior a una probeta de 25 mL rotulada
“extracto etéreo”. Se trasladó la fase líquida inferior a
una probeta de 25 mL rotulada “extracto metanólico".
Se aforó a 25 mL, con éter de petróleo el “extracto
etéreo” y se guardó dicho extracto en un recipiente
apropiado. Se aforó a 25 mL, con metanol el “extracto
metanólico” y se guardo dicho extracto en un recipiente
apropiado.
Extracción Alcalina
Al sedimento que se centrifugó de la extracción
etérea–metanólica en cada tubo, se le agregó 6 mL de
NaOH 1.0 M, se suspendió por agitación y se coloco en
baño maría por 10 minutos, y posteriormente se enfrió en
baño de agua. Se separó el sobrenadante y se transfirió
a una probeta de 25 mL. Se agregó al sedimento
centrifugado 6 mL de NaOH 0,1 M, se suspendió por
agitación y se colocó en baño maría por 10 minutos, se
enfrió en baño de agua. Se tapó el tubo con tapón de
hule y se centrifugó a máxima velocidad en centrífuga
clínica por 5 minutos. Se separó el sobrenadante y se
transfirió a la probeta de 25 mL con el sobrenadante
de la primera extracción con NaOH 1,0 M. Se
completó el volumen a 25,0 mL con NaOH 0,33 M, se
mezcló y se transfirió a un recipiente rotulado como
“extracto alcalino”. Se guardaron todos los extractos en
refrigeración.
Parte 2: Análisis Cualitativo
Se realizaron las siguientes pruebas cualitativas a los
cuatro extractos:
- Extracto acuoso: Molisch, Lugol, Nelson-
Somogyi, Antrona, Bial-Orcinol, Selliwanoff y
Biuret.
- Extracto metanólico: Molisch, Lugol, Nelson-
Somogyi, Antrona, Bial-Orcinol, Selliwanoff,
Biuret, Liebermann y Vainillina.
- Extracto etéreo: Liebermann y Vainillina
- Extracto Alcalino: Molisch, Lugol, Nelson-
Somogyi, Antrona, Bial-Orcinol, Selliwanoff y
Biuret.
Para las pruebas de Molisch, Lugol, Nelson-Somogyi,
Antrona, Bial-Orcinol, Selliwanoff y Biuret, se utilizó
los procedimientos ya antes conocidos de prácticas
pasadas, en el caso de las pruebas de Vainillina y
Liebermann se siguió el siguiente procedimiento:
- Prueba de Liebermann
A 50,0 µL de la incógnita se agregó 2,0 mL de
reactivo de Liebermann. Se colocó el tubo en un
sitio oscuro y se esperó 15 minutos. Hasta la
aparición de un color de azul al verde.
- Prueba de Vainillina:
A 100,0 µL de la solución problema en un tubo de
13×100 mm, se le agregó 100,0 µL de ácido
sulfúrico concentrado. Se mezcló, se tapó el tubo
con una bola de vidrio y se puso en baño María
por 10 minutos. Se sacó el tubo del baño, se dejó
enfriar a temperatura ambiente. Se le añadió 4,0
mL de ácido fosfórico concentrado y se mezcló;
luego se le agregó 1,0 mL del reactivo de
vainillina. Se mezcló muy bien y se puso en baño
de agua a 35-40ºC por 15 minutos.
Parte 3: Análisis Cuantitativo
Se determinó cuantitativamente los azúcares
totales por fenol-sulfúrico, leída a 480 nm, el almidón
por Lugol, leída a 570 nm y las proteínas por Biuret,
leída a 550 nm, en aquellos extractos en que se
obtuvieron resultados cualitativos positivos para cada
caso. En el caso de estas pruebas se realizaron los
procedimientos conocidos con anterioridad de prácticas
pasadas, y en el caso de la determinación de lípidos
insaturados y esteroles se realizaron los procedimientos
cuantitativos de Lípidos Insaturados por Sulfo-
Fosfovainillina y de esteroles por el método de
Liebermann-Bouchard de la siguiente forma:
- Análisis de Lípidos Insaturados por Sulfo-
fosfo-vainillina
Se construyó una curva patrón conteniendo 3, 6, 9,
12 y 15 mg/mL de ácido oleico. Se agregó 10 µL
de etanol (blanco), patrón y muestra a un tubo de
ensayo de 16x100 mm. Se agregó 100 µL de ácido
sulfúrico concentrado a cada tubo y se mezcló bien
en un agitador vórtex. Se agregó 5 mL de reactivo
de Fosfovainillina y se mezcló en un agitador
vórtex, se espero la aparición de un color rosado y se
leyó a 540 nm en un lapso no mayor a 30 minutos.
- Análisis de Esteroles por Liebermann-
Bouchard
Se construyó una curva patrón conteniendo 2, 4, 6,
8 y 10 mg/mL de colesterol. Se colocó 6 mL de
reactivo de Liebermann-Bouchard en un tubo de
ensayo de 16x100 mm. Se agregó 100 µL de ácido
acético glacial, estándar y muestra, y se mezcló
bien con un agitador vórtex. Se leyó a 650 nm en
un lapso no mayor a 10 minutos.
RESULTADOS Y ANÁLISIS
Cuadro 3. Resultados de las diferentes pruebas
cualitativas para los diferentes extractos obtenidos de
la leche.
Prueba/Fase Acuosa Etérea Metanólica Alcalina
Molisch Positivo *NA Negativo Negativo
Lugol Negativo *NA Negativo Negativo
Nelson Negativo *NA Negativo Negativo
Antrona Negativo *NA Negativo Negativo
Bial Positivo *NA Negativo Negativo
Seliwanoff Positivo *NA Negativo Negativo
Biuret Negativo *NA Negativo Positivo
Liebermann *NA Positivo Negativo *NA
Vainillina *NA Positivo Negativo *NA
*NA: No Aplica
Figura 5. Curva de calibración por Fenol Sulfúrico, utilizando patrones
de glucosa de diferente concentración, para la determinación de azúcares
totales en la leche, leída a 480 nm en un Spectronic 20 D+.
Figura 6. Curva de calibración por Lugol, utilizando patrones de
almidón de diferente concentración, para la determinación de almidones
en la leche, leída a 570 nm en un Spectronic 20 D+.
Figura 7. Curva de calibración por Biuret, utilizando patrones de
albúmina de suero bovino de diferente concentración, para la
determinación de proteínas en la leche, leída a 550 nm en un Spectronic
20 D+.
Figura 8. Curva de calibración por Sulfo-fosfo-vainillina, utilizando
patrones de ácido oleico de diferente concentración, para la
determinación de lípidos insaturados en la leche, leída a 540 nm en un
Spectronic 20 D+.
Figura 9. Curva de calibración por Liebermann-Bouchard, utilizando
patrones de colesterol de diferente concentración, para la determinación
de esteroles en la leche, leída a 650 nm en un Spectronic 20 D+.
y = 0.0012xR² = 0.9971
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
0.14
0 20 40 60 80 100 120
y = 0.001x + 0.0481R² = 0.7634
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0 50 100 150 200
y = 0.0377xR² = 0.9976
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0 5 10 15
Absorban
cia
concentracion
y = 0.0028xR² = 0.9984
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
0.030
0.035
0.040
0.045
0.00 5.00 10.00 15.00 20.00
Ab
sorb
anci
y = 0.0009xR² = 0.8243
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0 100 200 300 400 500 600
Es importante recalcar que para la obtención
Fig.9 los patrones de colesterol utilizados fueron de
100, 200, 300, 400 y 500 µg/mL, debido a que la
disolución madre de colesterol que nos brindaron era
de 1 mg/mL, por lo que los patrones sugeridos en el
procedimiento de 2, 4, 6, 8 y 10 mg/mL no se podían
preparar a partir de esta disolución madre.
Como se muestra en el cuadro 3, la fase o
extracto acuoso mostró un resultado positivo para
Molisch, Antrona y Bial, por lo que sugiere que se
encuentran presentes azúcares, por este motivo este
extracto acuoso solamente se cuantificó mediante el
método de Fenol sulfúrico. El azúcar más importante
que se encuentra en la leche es la lactosa, un
carbohidrato soluble en agua, lo que concuerda que el
mismo se haya encontrado en la fase acuosa, ya que
cuando se agregó el ácido tricloroacético a la leche, se
formaron 2 fases: la fase sólida, que contenía las
grasas y proteínas y la fase acuosa que contenía los
carbohidratos. La presencia de carbohidratos en esta
fase es debido a que los mismos son solubles en el
ácido tricloroacético ya que forman puentes de
hidrógeno entre los grupos hidroxilo de los
carbohidratos con el grupo carboxílico del ácido.
En el cuadro 3 también observamos que para el
extracto etéreo Liebermann y Vainillina resultaron
positivos, lo que resulta en la presencia de lípidos
insaturados y esteroles como el colesterol. Lo cual es
concordante con lo esperado debido a que las grasas
se separaron de la fase acuosa por precipitación con
ácido tricloroacético y luego se realizaron
extracciones con éter de petróleo y etanol, dejando así
las grasas (no hidrosolubles) en la fase etérea y los
demás compuestos hidrosolubles en la fase
metanólica. La fase metanólica debía contener
proteínas solubles y otros compuestos hidrosolubles,
pero según el cuadro 3, al resultar negativo para todas
las pruebas, supone una cantidad muy pequeña de los
mismos, tal vez por la clase de leche que utilizamos.
Para el extracto alcalino según el cuadro 3,
solamente dio positivo para la prueba de Biuret,
prueba que detecta proteínas. En este caso se trata de
la caseína, proteína encontrada en mayor proporción
en la leche. La caseína se separó de la leche junto con
las grasas, mediante la adición del ácido
tricloroacético; la caseína no es soluble ni en éter de
petróleo ni en metanol, razón por la cual seguía sólida
en la extracción etérea-metanólica. La caseína al
tratarse con hidróxido de sodio se convierte en
caseinato de sodio y se solubiliza, razón por la cual
esta proteína la encontramos en este extracto.
A continuación mostramos para los distintos
extractos las absorbancias y concentraciones, junto
con la respectiva curva de calibración con que fueron
cuantificados los componentes de la leche.
Cuadro 4. Resumen de las absorbancias y
concentraciones de los distintos extractos, utilizando
para su cuantificación la prueba específica que aquí se
menciona.
Prueba
cuantitativa
Acuoso Etéreo Alcalino
Liebermann A NA 0,006 NA
C (µg/mL)
NA 5,4 x10-6
NA
Fenol
sulfúrico
A 0,312 NA NA
C
((µg/mL)
0,0936 NA NA
Vainillina A NA 0,000 NA
C (µg/mL)
NA 0,000 NA
Biuret A NA NA 0,152
C (µg/mL)
NA NA 5,73
*A: absorbancia, C: concentración
*NA: no aplica
El extracto metanólico no se sometió a cuantificación
debido a que el mismo presentó solamente resultados
negativos en todas las pruebas cualitativas
anteriormente mencionadas.
Para la cuantificación del extracto acuoso se
realizó una dilución de 0,4 mL de extracto en 100 mL
de agua destilada. En la cuantificación por Vainillina
y Liebermann del extracto etéreo, no se realizó
dilución alguna; y para la cuantificación por Biuret del
extracto alcalino no se realizó dilución alguna
tampoco. En el extracto etéreo la cuantificación con
la vainillina resultó en una concentración de ácidos
grasos de 0 µg/mL, puede ser porque la leche
semidescremada utilizada posee muy pocos de estos
lípidos insaturados. A parte que el procedimiento
sugiere el calentamiento adicional en baño maría, lo
cual no se debe realizar porque el calentamiento que
provoca el ácido sulfúrico es suficiente, y un extra
calentamiento puede provocar datos erróneos.
Además que la curva de calibración realizada utilizó
el ácido oleico como patrón, estaba viejo por lo que la
instauración del acido graso se oxida a un epóxido que
posteriormente se abre por medio de la hidrólisis del
epóxido, por lo cual al no haber doble enlace la
reacción con la fosfovainillina no se da o se da muy
baja. La concentración de esteroles en la leche, según
la cuantificación por Liebermann del extracto etéreo
nos da de 5,4 x10-6
µg/mL, lo cual es una cantidad
bastante pequeña, esto debido a que el procedimiento
según el manual sugería el calentamiento de las
disoluciones antes de hacer su lectura en el
espectrofotómetro, lo cual al realizarlo el color verde
desarrollado inicialmente se perdió y por ende su
absorbancia no es la correcta ni su concentración
tampoco.
Según las especificaciones detalladas en la
leche utilizada se informa que; contiene 5 gramos de
grasa, 12 gramos de carbohidratos y 8 gramos de
proteína, esto referido a 250 mL, por lo que para 1 mL
sería: 20 µg de grasa por mililitro de leche, 480 µg de
carbohidratos por mililitro de leche y 32 µg proteína
por mililitro de leche. Por lo que los resultados, según
el cuadro 4, de concentración obtenidos para grasas
(Liebermann), proteínas (Biuret) y carbohidratos
(Fenol sulfúrico) no coinciden con las teóricas
especificadas en la información nutricional de la
leche, esto debido a las razones anteriormente
mencionadas en el caso de Liebermann y Vainillina; y
para el caso de Biuret se obtuvo un resultado menor
que el teórico debido a que las proteínas se encuentran
en el extracto acuoso, el cual es el último extracto que
se obtiene, por ende luego de todo el tratamiento que
se le realizó a la leche, parte de la proteína pudo
quedar en los diferentes extractos, eso sí, quedando la
mayoría en el extracto alcalino. En el caso de la
cuantificación por Fenol sulfúrico, se obtuvieron datos
erróneos, por errores de los analistas que realizaron
esta curva de calibración.
CONCLUSIONES
En la prueba cuantitativa de Fosfo-sulfo-vainillina no
debe de ser calentada en baño maría luego de la
adición de los diferentes reactivos, ya que puede
resultar en datos erróneos.
En cuanto al patrón de Ácido Oleico para la
realización de la curva de calibración en la
cuantificación de lípidos en leche es necesario realizar
la preparación de la disolución patrón de este acido
antes de hacer el análisis y no utilizar uno que sea
viejo para evitar la oxidación de la instauración.
Es necesario realizar un blanco de 100 µL en etanol en
el primer patrón en la reacción con sulfo-
fosfovainillina y no con agua como indica el método
debido a que mejora la introducción de los patrones en
la curva de calibración y realizar los aforos de los
patrones con este mismo solvente.
En la prueba de Liebermann, la disolución resultante
no debe de calentarse antes de realizar la lectura
espectrofotométrica, ya que la intensidad del color
desarrollado previamente al calentamiento disminuye
significativamente y los resultados podrían resultar
erróneos.
Para la cuantificación exacta de los componentes de la
leche, se debería de utilizar un procedimiento en el
cual tome en cuenta la repartición de los diferentes
componentes a analizar en los distintos extractos de la
leche.
Para una mejor visualización, en modo de laboratorio,
de la repartición de los componentes de la leche en los
distintos extractos y una mejor cuantificación es
recomendable utilizar leche que no sea
semidescremada o descremada, sino leche entera.
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