Tema 9: EL ADN COMO RESPONSABLE DE LA HERENCIA

O BJETIVOS : Conocer cómo se descubrió que el ADN es el material genético responsable de la herencia, cómo es su composición física y química, y cómo se produce el mecanismo de la replicación. Conocer cómo es el funcionamiento de los genes, cómo se transfiere la información genética codificada en el ADN al ARNm y luego a las proteínas. Conocer cómo es el mecanismo de regulación de la expresión génica en procariotas y eucariotas.

T EMAS :

1. ADN: EL MATERIAL GENÉTICO1.1. El descubrimiento de Griffith1.2. El descubrimiento de Avery, MacLeod y McCarty1.3. El descubrimiento de Hershey y Chase

2. LA ESTRUCTURA DEL ADN2.1. La doble hélice2.2. Las reglas de Chargaff2.3. Los estudios de difracción de rayos X2.4. El modelo de Watson y Crick

3. LA REPLICACIÓN DEL ADN3.1. El modelo semiconservativo

1.1.1. El experimento de Meselson-Stahl3.2. El mecanismo de replicación3.3. La síntesis de cada hebra del ADN

4. El FUNCIONAMIENTO DEL ADN4.1. Transcripción

4.1.1. ARN4.1.2. ARN-polimerasa4.1.3. El proceso de transcripción en procariotas

4.1.3.1. Iniciación de la transcripción4.1.3.2. Elongación de la transcripción4.1.3.3. Terminación de la transcripción

4.1.4. Transcripción en eucariotas4.2. Traducción

4.2.1. El código genético4.2.2. Codón y anticodón4.2.3. Síntesis de proteínas

4.2.3.1. Iniciación de la traducción4.2.3.2. Elongación de la traducción4.2.3.3. Terminación de la traducción

5. LA EXPRESIÓN DE LOS GENES5.1. Mutaciones en los genes que codifican proteínas5.2. Mutaciones que afectan la regulación de la expresión génica

5.2.1. Mutaciones en el Operador e Inductor5.3. Control positivo del Operón lac5.4. Control génico en eucariotas

5.4.1. Niveles de control de la expresión en Eucariotas

1. DNA: EL MATERIAL GENÉTICO

Antes del descubrimiento de la estructura del ADN, a partir del trabajo pionero de Watson y Crick (1953), se conocía lo siguiente sobre los genes y el ADN:

El trabajo de Mendel (1866) donde demostró que existen “factores” (genes) hereditarios que están asociados con caracteres específicos.

El descubrimiento de los ácidos nucleicos por parte de Miescher (1869), el cual lo denominó nucleina, por encontrarlo en el núcleo de células obtenidas del “pus” del vendaje de heridas.

El descubrimiento que los genes son portados por los cromosomas, a partir del trabajo de Sutton y Boveri (1902), conocida como “Teoría cromosómica de la herencia”, y del trabajo de Morgan (1910) con genes ligados a cromosomas sexuales.

El descubrimiento que los cromosomas están constituidos por ADN y proteínas.

1.1. El descubrimiento de Griffith

En 1928, Frederick Griffitth, un médico británico, trabajó con la bacteria Streptococcus pneumoniae (también llamada neumococcus), la cual causa la neumonía en humanos, pero es normalmente letal en ratones. Griffitth usó dos razas o cepas de la bacteria, una cepa S, la cual produce colonias lisas en apariencia y es muy infecciosa (virulenta); y una cepa R, la cual produce colonias rugosas y es inofensiva (no-virulenta). Si bien por entonces no se conocía a qué se debía la diferencia entre las cepas, se supo después que es debido a la presencia de una cubierta de polisacáridos que envuelve a las bacterias S, la cual está ausente en las cepas R, y es quien le otorga las propiedades infecciosas y determina el aspecto liso de las colonias. La cepa R es un mutante de la cepa S, la cual se multiplica en el ratón, pero no es letal.

En su primer experimento, Griffitth inyectó a los ratones, por separado, con las cepas R y S, y luego observó si los ratones vivían o se morían. Los ratones inyectados con la cepa S se morían (Fig. 1a); mientras que los inyectados con la cepa R vivían (Figura 1b). En la sangre de los ratones muertos puedo aislar bacterias S vivas; mientras que en los ratones vivos no recuperó cepas R.

Figura 1. Experimento de Griffith con ratones. Descubrimiento de la Transformación.

El segundo experimento consistió en matar las bacterias S virulentas, por medio del calor, inyectarlas a los ratones y observar que sucedía con los mismos. Griffitth observó que los ratones vivían (Fig. 1c), y además que en la sangre extraída de los ratones no se encontraban bacterias de S. pneumoniae.

El tercer experimento consistió en mezclar cepas S virulentas, muertas por calor, con cepas R no virulentas vivas, e inyectó la mezcla a los ratones y observó que sucedía con los mismos. Sorprendentemente, los ratones se morían (Fig. 1d), y además en la sangre de los ratones muertos aisló bacterias S vivas.

A partir de los resultados de sus experimentos, Griffitth concluyó que algunas bacterias R no virulentas habían sido transformadas en bacterias S virulentas. Al agente que produjo la transformación de las cepas bacterianas, él lo denominó principio transformante. Sin embargo, Griffitth no logró determinar cuál era ese principio transformante. Él creía que se trataba de las proteínas. El descubrimiento de Griffitth es lo que hoy conocemos como Transformación Bacteriana.

1.2. El descubrimiento de Avery, MacLeod y McCarty

Luego del descubrimiento de Griffitth, el próximo paso fue determinar cuál era el componente químico que actuaba como principio transformante. Es decir, cuál era la sustancia responsable de cambiar el genotipo de las bacterias receptoras, con lo cual, sería un potencial candidato de ser el material hereditario.

En 1944, Oswald Avery, un biólogo americano, y sus colegas Colin M. MacLeod y Maclyn McCarty, continuaron con los experimentos de Griffitth. Ellos intentaron identificar cuál era el principio transformante, estudiando la transformación de las cepas bacterianas R en S, pero en un tubo de ensayo. Ellos lisaron las cepas S con un

detergente y usaron una centrífuga para separar los componentes celulares, el extracto celular, de los desechos celulares. Luego, incubaron el extracto celular con un cultivo de cepas R, y realizaron un “plaqueo” sobre una placa de Petri conteniendo medio de cultivo para bacterias. Si aparecían sobre la placa colonias con aspecto liso era una demostración que el extracto celular contenía el principio transformante.

Avery y sus colaboradores sabían que algunos de los componentes macromoleculares del extracto celular de las cepas virulentas S, polisacáridos, lípidos, proteínas, ARN o ADN, debía ser el principio transformante. Para determinar cuál de ellos era, realizaron una serie de tratamientos enzimáticos para degradar cada uno de ellos por separado, y luego probar si ocurría la transformación. Para ello, pusieron a incubar cepas bacterianas R, con los componentes celulares que no se habían degradado, y luego observaron si se desarrollaban colonias lisas (S). Primero degradaron los polisacáridos, luego pusieron el extracto restante de las cepas S con las bacterias R vivas, y observaron que se producía transformación. Hicieron lo mismo con los lípidos, proteínas, ARN y ADN. En el único caso donde no se observó transformación de bacterias R en S fue cuando se degradó el ADN con enzimas específicas denominadas Deoxyribonucleasas (DNasa) (Fig. 2).

Figura 2. Experimento de Avery y col. que demostró que el ADN fue el principio transformante.

Avery y colaboradores concluyeron que el principio transformante descubierto por Griffitth era el ADN. Sin embargo, esta prueba no fue suficiente para demostrar que el ADN era el material genético responsable de la herencia. Sus resultados fueron criticados por los científicos de la época, debido a que el ácido nucleico aislado por

Avery y col. estaba contaminado con proteínas, y por aquellos años un número importante de investigadores creían que las proteínas eran el material genético.

1.3. El descubrimiento de Hershey y Chase

En 1952, Alfred D. Hershey y Martha Chase, realizaron un experimento que terminaría por demostrar que el ADN es el material genético responsable de la herencia. Ellos trabajaron con un virus que infecta a bacterias (bacteriófago) denominado T2. Este fago no puede multiplicarse por sí mismo, sino que para poder replicarse necesita infectar a una bacteria y utilizar la maquinaria molecular de la bacteria para producir nuevas copias del virus.

Hershey y Chase sabían que el fago T2 estaba constituido por ADN y proteína y creían que el ADN era el material genético. Para probar esto, ellos pusieron a crecer células de Escherichia coli, en un medio de cultivo conteniendo tanto, el isótopo de fosforo (32P) o el isotopo de azufre (35S). Ellos usaron estos isótopos porque sabían que el ADN contiene fósforo pero no azufre, y las proteínas contienen azufre pero no fósforo. Ellos infectaron las bacterias con el fago T2 y las pusieron en un medio con 32P por un lado, y por otro en un medio con 35S. Entonces, obtuvieron por separado, progenies del fago T2 con el ADN marcado radioactivamente con 32P, y progenies de T2 con las proteínas marcadas con 35S (Fig. 3).

Figura 3. Experimento de Hershey-Chase. (a) La producción de fago T2 con (1) ADN marcado con 32P o (2) proteína marcada con 35S. (b) La evidencia experimental que demostró que el ADN es el material genético en T2: (1) El 32P es encontrado dentro de la bacteria y aparece en la progenie de los fagos, mientras (2) el 35S no es encontrado dentro de la bacteria, sino en los “fantasmas” del fago que quedaron afuera.

Ellos infectaron E. coli con los dos tipos de fagos T2 marcados radioactivamente. En las bacterias infectadas con T2 marcado con 32P la mayor parte de la radioactividad fue encontrada dentro de la bacteria, luego de la infección, y muy poca en la proteína de la cápside de los fagos (“fantasmas”), los cuales quedan afuera de la bacteria. Los “fantasmas” fueron separados de las células bacterianas por agitación en un refrigerador y luego por medio de una centrífuga. De esta forma midieron la radioactividad en las dos fracciones. Por otra parte, ellos encontraron 32P en las progenies del fago luego de la lisis celular. Cuando ellos usaron los fagos marcados con 35S la radioactividad aparecía

en los “fantasmas” pero no adentro de la célula o en las progenies del fago. Esto indicaba que la proteína nunca ingresó dentro de la célula bacteriana.

Con estos resultados se llegó a la conclusión que el ADN es el material genético responsable de la herencia y que las proteínas del fago son componentes estructurales que forman parte de la cápside, la cual es descartada una vez que el fago inyecta su ADN a la bacteria.

2. LA ESTRUCTURA DEL ADN

El ADN y ARN son químicamente polímeros constituidos por varios monómeros. Los monómeros que constituyen el ADN y ARN se llaman nucleótidos. A su vez, cada nucleótido está constituido por tres partes: una azúcar pentosa (cinco carbonos), una base nitrogenada, y un grupo fosfato. El azúcar en el ADN se llama desoxyrribosa, y en el ARN es ribosa. Los dos azúcares se diferencia por el grupo químico que portan en el carbono 2´: un átomo de hidrogeno (H) en la desoxyrribosa y un grupo hidroxilo (OH) en la ribosa (Fig 4).

Figura 4. Estructura química de la ribosa y desoxyribosa

Hay 2 clases de bases nitrogenadas: las purinas, las cuales poseen estructura de doble anillo, y las pirimidinas que poseen un solo anillo. Las purinas son la adenina (A) y guanina (G), y hay tres pirimidinas: timina (T), citocina (C) y uracilo (U) (Fig. 5). Tanto el ADN como el ARN contienen adenina, guanina y citosina; mientras que la timina sólo es encontrada en el ADN y el uracilo en el ARN.

Figura 5. Estructura química de las bases nitrogenadas en el ADN y ARN

En el ADN y ARN, las bases nitrogenadas están unidas al carbono 1´ de la pentosa por medio de enlaces covalentes. Las purinas están unidas por medio del nitrógeno 9, y las pirimidinas por el nitrógeno 1. La combinación de un azúcar y una base nitrogenada se denomina nucleósido (Fig. 6a). La adición de un grupo fosfato al nucleósido constituye un nucleósido fosfato, mejor conocido como nucleótido (Fig. 6a). El grupo fosfato (PO4

-2) se une al carbono 5´ del azúcar, tanto en el ADN como en el ARN.Para formar un polinucleótido de ADN o ARN, los nucleótidos se unen entre sí,

por enlaces covalentes, entre el grupo fosfato de un nucleótido y el carbono 3´ del azúcar de otro nucleótido (Fig. 6b). Este enlace fosfato 5´- 3´ se llama enlace fosfodiéster. Los enlaces fosfodiéster son uniones fuerte, de tal manera que la repetición de los mismos en el ADN y ARN, formando un esqueleto azúcar-fosfato-azúcar-fosfato, le confiere estabilidad a la estructura. Los dos extremos de la cadena difieren entre sí, por la posición del átomo de carbono del azúcar en el cual está unido el grupo fosfato. En un extremo de la cadena está unido en posición 5´ y en el otro en 3´. Esta asimetría se denomina polaridad de la cadena.

Figura 6. Estructura química del ADN y ARN. (a) Estructura básica de los nucleósidos de ADN y ARN y nucleótidos (azúcar + base nitrogenada + grupo fosfato), las unidades fundamentales de la molécula de ADN y ARN. (b) Un segmento de una cadena de polinucleótido de una ADN de cadena simple. La desoxyribosa se une a la próxima azúcar por enlaces fosfodiéster entre el cabono 3´ de un azúcar y el carbono 5´ del siguiente azúcar.

2.1. La doble hélice

En 1953, James D. Watson y Francis Crick publicaron un artículo en la revista científica Nature, donde propusieron un modelo para la estructura física y química de la molécula de ADN. Ellos propusieron una estructura tridimensional compuesta por dos cadenas de nucleótidos, una al lado de la otra, que denominaron modelo de la doble hélice. Antes del descubrimiento de Watson y Crick, se sabía que el ADN estaba

compuesto por nucléotidos; sin embargo, no se sabía cómo los nucleótidos formaban la estructura del ADN.

Las dos cadenas de nucleótidos permanecen juntas por medio de uniones débiles entre las bases nitrogenadas de cada cadena, formando una estructura parecida a una escalera de caracol. El esqueleto de cada cadena está formado de unidades alternadas de azúcar desoxyribosa y grupos fosfatos, los cuales están ligados por enlaces fosfodiéster. Watson y Crick se basaron en estudios previos para poder generar su modelo. Uno de esos estudios fue el que condujo Erwin Chargaff sobre la composición de las bases en el ADN (conocido como las reglas de Chargaff), y el otro sobre difracción de rayos X realizado por Rosalind Franklin y Maurice Wilkins.

2.2. Las reglas de Chargaff

Chargaff hidrolizó el ADN de varios organismos, por medio de tratamiento químico, y luego cuantificó las purinas y pirimidinas liberadas. Sus estudios demostraron, que en todos los ADNs de doble cadena, el 50 % de las bases fueron purinas y el 50 % pirimidinas. A su vez, la cantidad de Adenina (A) era igual a la de timina (T), y la cantidad de guanina (G) era igual a la de citosina (C). Estas equivalencias se conocen como reglas de Chargaff. Al comparar el ADN de doble cadena de diferentes organismos, la proporción A/T es 1 y la de G/C es 1, pero la proporción (A + T)/(G + C) es variable entre los organismos (el % GC) pero es el mismo en los diferentes tejidos del mismo organismo.

2.3. Los estudios de difracción de rayos X

Rosalind Franklin y Maurice Wilkins estudiaron fibras de ADN aisladas, por medio de la técnica de difracción de rayos X. Un haz de rayos X paralelos es dirigido a la molécula de ADN. El haz es difractado (roto) por los átomos en un patrón que es característico del peso atómico y el ordenamiento espacial de las moléculas. Los rayos X difractados son registrados sobre una placa fotográfica. Analizando las fotografías, Franklin obtuvo información sobre la estructura atómica de las moléculas. Ella concluyó que el ADN es una larga y delgada estructura helicoidal que tiene dos partes similares, que están paralelas una de la otra, y corren a lo largo de la longitud de la molécula. Ella detectó dos regularidades distintivas a lo largo del eje de la molécula de 0,34 nm y 3,4 nm (Fig. 7).

Figura 7. Análisis del ADN por difracción de rayos X. El patrón de difracción de rayos X que usaron Watson y Crick para desarrollar su modelo de doble hélice. Las áreas oscuras que forman una X en el centro de la fotografía indican que se trata de una hélice de ADN. Las machas más oscuras arriba y debajo de la fotografía indican la distancia de 0,34 nm entre los pares de bases.

2.4. El modelo de Watson y Crick

Watson y Crick usaron los resultados de Franklin para construir su modelo tridimensional de la estructura del ADN (Fig. 8). Su modelo de doble hélice tiene las siguientes características:

La molécula de ADN consiste de dos cadenas de polinucleótidos enrolladas una con otra en una doble hélice.

Las dos cadenas son antiparalelas (muestran polaridad opuesta), es decir, las dos cadenas están orientadas en direcciones opuestas, una en dirección 5´a 3´, y la otra cadena en dirección 3´a 5´.

El esqueleto de azúcar-fosfato está en la parte de afuera de la doble hélice, con las bases nitrogenadas orientadas hacia el eje central. Las bases de ambas cadenas son estructuras planas orientadas perpendicularmente a lo largo del eje del ADN.

Las bases de cada cadena están unidas por enlaces de hidrógeno, los cuales son enlaces químicos relativamente débiles. Los apareamientos específicos observados son de Adenina (A) ligado con Timina (T), mediante dos enlaces de hidrógeno, y Guanina (G) con Citocina (C), mediante tres enlaces de hidrógeno. Los enlaces de hidrógeno permiten separar más fácilmente las dos cadenas mediante calentamiento. Los pares de bases específicas A-T y G-C son denominados pares de bases complementarias. La secuencia de nucleótidos específicas de una cadena dictamina cuál será la secuencia de nucleótidos en la otra cadena. Por Ejemplo, si en una cadena la secuencia es 5´-TATTCCGA- 3´, en la otra opuesta y antiparalela deberá ser 3´-ATAAGGCT- 5´.

Los pares de bases están separados en la hélice de ADN por 0,34 nm. Un giro completo (360°) de la hélice abarca 3,4 nm; por lo tanto, hay 10 pares de bases por giro. El diámetro externo de la hélice es de 2 nm.

Por la manera en que las bases se unen unas con otras, los dos esqueletos de azúcar-fosfato de la doble hélice no están igualmente espaciados uno del otro a lo largo de la doble hélice. Este espaciamiento desigual genera surcos de tamaño desigual entre los esqueletos, formándose un surco mayor y otro surco menor. Los bordes de los pares de bases están expuestos en los surcos, y ambos surcos son suficientemente grandes para permitir que proteínas hagan contacto con las bases.

Figura 8. Estructura molecular del ADN. (a) Modelo molecular tridimensional del ADN presentado por Watson y Crick. (b) Representación estilizada de la doble hélice de ADN. (c) Estructura química de un segmento de la doble cadena de ADN.

El descubrimiento de Watson y Crick de la estructura del ADN es considerado por muchos científicos como el hecho más importante del siglo XX. Por este descubrimiento, Watson, Crick y Wilkins recibieron en 1962 el Premio Nobel en Fisiología o Medicina.

3. LA REPLICACIÓN DEL ADN

3.1. El modelo semiconservativo

Cuando Watson y Crick propusieron su modelo de doble hélice para el ADN, entendieron que la replicación del ADN debería ser sencilla si su modelo fuera correcto. Esto significa que si la molécula de ADN fuera desenrollada y las dos cadenas separadas, cada cadena sería un molde para la síntesis de una nueva, complementaria a la cadena de ADN que debería permanecer ligada a la cadena parental. Este modelo de replicación del ADN es conocido como el modelo semiconservativo, debido a que cada una de las moléculas hijas retiene una de las cadenas parentales.

En aquel momento, otros dos modelos de replicación de ADN fueron propuestos: el modelo conservativo y el modelo dispersivo. En el modelo conservativo, las dos cadenas parentales de ADN permanecen juntas o se aparean después de la replicación, es decir se sintetiza una doble hélice nueva, por lo tanto, una de las dos moléculas de ADN doble cadena de la progenie es la parental y la otra es la recién sintetizada. En el modelo de replicación dispersivo, las moléculas hijas consisten de cadenas con segmentos de ADN parental y segmentos de ADN recién sintetizado.

3.1.1. El experimento de Meselson-Stahl

En 1958, Matthew Meselson y Frank Stahl demostraron que el modelo de replicación semiconservativo era el correcto. Ellos pusieron a crecer E. coli en un medio en el cual la única fuente de nitrógeno era el isótopo pesado 15N (15NH4Cl, cloruro de amonio). Este isótopo remplaza al isótopo normal 14N y posee una densidad mayor, lo que permite separarlos por centrifugación en un gradiente de densidad. Los isótopos son separados mediante centrifugación a alta velocidad, en una solución de cloruro de cesio (CsCl), donde se forma un gradiente de densidad, con el isotópo 14N más liviano en la parte superior del tubo, y el isótopo 15N más pesado en la parte inferior.

Después de varias divisiones celulares en 15N, el ADN de la célula fue marcado con el isótopo pesado. Luego, las células fueron removidas del medio con 15N, se pusieron a crecer en un medio con 14N, y después de una a dos divisiones celulares, las muestras fueron sacadas, se asiló el ADN de cada muestra, y finalmente fueron analizadas en un gradiente de densidad en CsCl. El ADN centrifugado con CsCl forma una banda en una posición idéntica con su densidad en el gradiente. Los ADNs de diferentes densidades formarán bandas en diferentes lugares. Las células que inicialmente crecieron en el isótopo pesado 15N, mostraron ADN de alta densidad. Después que estas células crecieron en el isótopo liviano 14N por una generación, los investigadores encontraron que el ADN fue intermedio en densidad. Después de dos generaciones, observaron ADN de densidad intermedia y también de baja densidad, tal cual lo había previsto Watson y Crick (Fig. 9).

Figura 9. El experimento de Meselson-Stahl demuestra que el ADN es copiado por replicación semiconservativa. ADN centrifugado en un gradiente de Cloruro de Cesio (CsCl) formará bandas de acuerdo a su densidad. (a) Cuando las células crecen en 15N son transferidas a un medio con 14N, la primera generación produce una banda de ADN intermedia y en la segunda generación produce dos bandas: una intermedia y una liviana. Este resultado concuerda con las predicciones de el modelo semiconservativo de replicación del ADN, (b) y (c) Los resultados para la replicación conservativa y dispersiva no fueron encontradas.

Si el modelo de replicación hubiese sido el conservativo, después de un ciclo de replicación debería haber 2 bandas de ADN: una de alta densidad, correspondiente a las moléculas de ADN parentales con 15N en ambas cadenas, y otra banda de baja densidad, conteniendo moléculas de ADN hijas con ambas cadenas marcadas con 14N. En sucesivas generaciones debería aumentar la cantidad de ADN de baja densidad en relación a la banda de alta densidad.

Si el modelo de replicación correcto fuera el dispersivo, todo el ADN presente en el medio con 14N, después de un ciclo de replicación, debería haber sido de densidad intermedia. Este modelo predice que después de un segundo ciclo de replicación en el mismo medio, segmentos de ADN del primer ciclo de replicación deberían dispersarse a través de la doble hélice del ADN de la progenie. Entonces, segmentos de ADN 15N-15N se dispersan entre nuevo ADN 14N-14N después de un ciclo de replicación deberían duplicarse después de dos ciclos de replicación. Como resultado de esto, las moléculas de ADN deberían encontrarse en una banda localizada en la mitad entre la banda de densidad intermedia y la banda de baja densidad.

Las observaciones realizadas por Meselson y Stahl demostraron que el modelo de replicación en E. coli fue el semiconservativo. Posteriormente, se comprobó que el mismo modelo de replicación ocurre en organismos Eucariotas.

1.2. El mecanismo de replicación

En 1955, Arthur Kornberg y sus colaboradores identificaron las enzimas necesarias para la replicación del ADN. Su descubrimiento sobre el mecanismo de la síntesis biológica del ADN lo llevó a recibir en 1959 el Premio Nobel en Fisiología o Medicina.

Kornberg identificó todos los ingredientes necesarios para sintetizar in-vitro ADN de E. coli. La primer síntesis de ADN in-vitro se realizó mezclando en una reacción: fragmentos de ADN, una mezcla de los 4 deoxiribonucleósidos 5´-trifosfato (dATP, dGTP, dTTP y dCTP, denominados colectivamente dNTP, por desoxyribonucleósido trifosfato), y un lisado de E. coli (células rotas y liberado su contenido). Para medir las cantidades pequeñas de ADN sintetizado, Kornberg utilizó dNTPs marcados radiactivamente. Kornberg analizó el lisado celular y aisló una enzima que fue capaz de sintetizar ADN. Esta enzima fue originalmente denominada la enzima de Kornberg, para ahora conocerse como ADN polimerasa I (ADN Pol I).

Para que la síntesis de ADN se produzca son imprescindibles cuatro componentes:

1. Los 4 dNTPs2. Un fragmento de ADN para actuar como molde3. ADN Pol I4. Iones magnesio (Mg2+), necesarios para una actividad óptima de la ADN

Polimerasa

Además de la ADN Pol I descubierta por Kornberg, también existen otras dos ADN polimerasas, la ADN Pol II, que no participa de la replicación del ADN, y la ADN Pol III que actúa junto con la ADN Pol I en la síntesis del ADN. Ambas ADN Pol I y III replican ADN en dirección 5´- 3´ y tienen actividad exonucleasa 3´- 5´, es decir puede eliminar los nucleótidos mal incorporados en el extremo 3´ de la cadena, y los reemplaza por los correctos. Este mecanismo evita que la frecuencia de errores cometidos en la síntesis sea alta, reduciéndola a una frecuencia de 10 -9. En términos generales, se cree que se comete un error con una frecuencia de 10-6.

La ADN Pol I también tiene actividad exonucleasa 5´- 3´ pudiendo remover, tanto de ADN como ARN, nucleótidos del extremo 5´ de la cadena. Esta actividad es importante en el proceso de replicación del ADN que describiremos a continuación.

1.2.1. Modelo molecular de la replicación del ADNi) Iniciación de la replicación:

La iniciación de la replicación es dirigida por una secuencia de ADN llamada el replicador (Fig. 10). El replicador usualmente incluye el origen de replicación, la región específica donde el ADN de doble hélice se separa en cadenas simples y dentro del cual la replicación comienza. El segmento de ADN donde se separan las cadenas se denomina burbuja de replicación. Los segmentos de cadenas simples separados sobre el cual la nueva cadena será copiada son llamados cadenas moldes (Fig. 10).

Cuando el ADN se desenrolla para exponer las dos cadenas simples, se forma una estructura en forma de Y llamada horquilla de replicación (Fig. 10). La horquilla de replicación se mueve en dirección del desenrrollamiento del ADN (Fig. 11). En E. coli el replicador es oriC, abarca 245 pb, y contiene un grupo de 3 copias de una secuencia de 13 pb rica en A-T y 4 copias de una secuencia de 9 pb. Una región rica en A-T es fácil de separar y es característica de todos los replicomas de los organismos. Para la iniciación de la replicación, se necesita que proteínas específicas se unan al replicador y estimulen la desnaturalización local en la región rica en A-T. Las helicasas de ADN son enzimas encargadas de comenzar a separar el ADN en ambas direcciones desde el origen de replicación. Las helicasas se mueven a lo largo de la cadena simple y separan cualquier ADN doble cadena (Fig. 10).

Luego, cada ADN helicasa reúnen a la enzima ADN primasa, formando un complejo llamado primosoma (Fig. 10). La ADN primasa es importante porque ninguna ADN polimerasa puede iniciar por sí sola la síntesis de una cadena de ADN. La ADN primasa es activada por su ADN helicasa asociada y sintetiza un corto segmento de ARN (“primer” o iniciador de ARN) de entre 5 y 10 nucléotidos, a partir del cual la ADN polimerasa puede ir adicionando nuevos nucleótidos. El “primer” de ARN es removido al final de la replicación y reemplazado por ADN. A partir de este momento la replicación se produce en forma bidireccional en ambas cadenas (Fig. 10).

Figura 10. Detalle del replisoma y proteínas accesorias en la horquilla de replicación. Topoisomerasas y helicasas desenrollan y abren la doble hélice preparando el ADN para la replicación. Una vez desenrrollada, proteínas de unión a cadena simple previenen que la dos cadenas se vuelvan a unir.

ii) Elongación de la replicación (semidiscontínua):

Luego que la helicasa separa el ADN para producir cadenas simples que servirán de molde para la replicación, proteínas de ligamiento a ADN de cadena simple (SSB proteins) se unen a éstas para estabilizarlas y prevenir que se vuelvan a unir (Fig. 10 y 12). Los “primers” de ARN son alargados por la ADN polimerasa III, la cual sintetiza ADN complementario a la cadena molde, mientras simultáneamente desplaza a las proteínas SSB ligadas a las cadenas. Como la ADN polimerasa solo puede sintetizar en dirección 5´- 3´ y las dos cadenas tienen polaridad opuesta, la síntesis se produce de manera opuesta en las dos cadenas. La cadena nueva sintetizada en dirección 5´- 3´ en la misma dirección del movimiento de la horquilla de replicación es llamada cadena adelantada o líder (leading strand), mientras que la cadena sintetizada en dirección opuesta al movimiento de la horquilla de replicación se llama cadena retrasada (lagging strand) (Fig. 11). La cadena líder necesita un simple “primer” de ARN para su

síntesis; mientras la cadena retrasada necesita varios “primers” de ARN para completar la síntesis.

Figura 11. Replicación del ADN en la horquilla de crecimiento. La horquilla de replicación se mueve en la síntesis de ADN a medida que la doble hélice se desenrolla. La síntesis en la cadena líder puede proceder sin interrupción en la dirección del movimiento de la horquilla de replicación, pero la síntesis sobre la cadena retrasada debe proceder en dirección opuesta, alejada de la horquilla de replicación.

A medida que la horquilla se mueve, la helicasa separa más ADN, y una ADN girasa (una forma de topoisomerasa) relaja las tensiones producidas a continuación de la horquilla de replicación (Fig. 10). La cadena líder es sintetizada continuamente a medida que la horquilla avanza. Sin embargo, la síntesis sobre la cadena retrasada se produce de manera discontinua, por tramos, a medida que la horquilla progresa. Por eso se dice que en conjunto la replicación ocurre de manera semidiscontinua. Los fragmentos discontinuos que se forman sobre la cadena retrasada se denominan fragmentos de Okazaki, en honor a su descubridor, Reiji y Tuneko Okazaki.

En la cadena retrasada se sintetizan nuevos “primers” de ARN cada 1.000 a 2.000 nucleótidos incorporados. Los extremos de los fragmentos de Okazaki son unidos por la actividad de la ADN polimerasa I y la ADN ligasa. La ADN polimerasa I es la encargada de remover el segmento del primer de ARN, por medio de su actividad exonucleasa 5´- 3´. Cuando la ADN polimerasa I ha reemplazado todos los “primers” de ARN por nucleótidos de ADN, una muesca (nick) es dejada entre los dos fragmentos. Los dos fragmentos son unidos por la ADN ligasa para producir una larga cadena de ADN (Fig. 12).

Figura 12. Modelo de los eventos que ocurren alrededor de una horquilla de replicación del cromosoma de Escherichia coli. (a) Iniciación. (b) Posterior desenrrollamiento y elongación de la nueva cadena de ADN. (c) Posterior desenrrollado y continuación de la síntesis de ADN. (d) Remoción de los “primers” por ADN Polimerasa I. (e) Unión de fragmentos de ADN adyacentes por acción de ADN ligasa. Verde = RNA; Rojo = Nuevo ADN.

3.2.1.1. Replicación en los extremos de los telómeros

La replicación de la molécula de ADN lineal en un cromosoma eucariótico se produce en ambas direcciones desde numerosos orígenes de replicación (Fig. 13).

Figura 13. La naturaleza bidireccional de la replicación del ADN. Las flechas en negro muestran la dirección de crecimiento de la molécula de ADN hija. (a) Comienza en el origen, la ADN polimerasa se mueve hacia fuera en ambas direcciones. Las flechas anaranjadas largas representa la cadena líder y las flechas anaranjadas cortas representan la cadena retrasada. (b) Cómo procede la replicación a nivel cromosómico. Tres orígenes de replicación son mostrados en este ejemplo.

Este proceso replica la mayor parte del ADN cromosomal, pero hay un problema con los dos extremos de la molécula de ADN lineal, llamada telómeros. La síntesis continua sobre la cadena líder puede proceder en la forma correcta hasta la punta del molde. Sin embargo, la síntesis de la cadena retrasada requiere iniciadores (“primers”) por delante del proceso, de tal forma que cuando el último iniciador es removido, un extremo de cadena simple permanece en una de las moléculas de ADN hija (Fig. 14). Si el cromosoma hijo con esta molécula de ADN se replica nuevamente, la cadena con la secuencia faltante en su extremo se convertiría en una molécula doble cadena más corta. En cada ronda de replicación posterior, los telómeros continuarán acortándose, hasta que eventualmente información codificante esencial se pierda.

Figura 14. El problema de replicación en los extremos del cromosoma. Una vez que el primer de la última sección de la cadena retrasada es removido, no hay manera de polimerizar aquel segmento, y debería resultar en un cromosoma acortado cuando el cromosoma conteniendo la cadena incompleta replica.

Las células han desarrollado un sistema especializado para evitar esta pérdida. Para ello, adicionan al extremo del ADN cromosómico unas copias múltiples de una secuencia simple no-codificante para prevenir el acortamiento. Por ejemplo, en el protozoario Tetrahymena, copias de la secuencia 5' -TTGGGG- 3' son adicionados a los extremos 3' de cada cromosoma. En humanos, copias de la secuencia 5' -TTAGGG- 3' son agregadas. Este alargamiento de la molécula de ADN crea ADN no-codificante que puede ser “sacrificado” en el proceso de replicación.

En la Fig. 15 se muestra un diagrama simplificado del mecanismo en Tetrahymena. La telomerasa actua en el estado mostrado en la Fig. 15c, donde un extremo cromosómico ha sido producido con un “hueco” (gap) en el extremo 5' del nuevo ADN (Fig. 15a). La telomerasa es una enzima que produce, tanto proteína y ARN. El componente de ARN de la enzima incluye una secuencia de bases que es complementaria a la unidad repetida del telómero del organismo en el cual esta se encuentra. Por lo tanto, la telomerasa se une específicamente a la repetición del telómero sobre-expuesta en el extremo del cromosoma (Fig. 15b). Luego, la telomerasa cataliza la síntesis de 3 nucleótido de ADN nuevo (TTG), usando el ARN de la telomerasa como molde (Fig. 15c). Luego, la telomerasa se mueve hacia el extremo del molde de ARN, que ahora se apareó con la secuencia TTG recientemente sintetizada sobre el ADN (Fig. 15d). La telomerasa sintetiza el resto de la repetición del telómero TTGGG (Fig. 15e). El proceso se repite y se adicionan más repeticiones teloméricas. De esta manera, el cromosoma es alargado por el agregado de un número de repeticiones teloméricas. Luego, los huecos son llenados por la síntesis del iniciador y la síntesis del ADN catalizada por la ADN polimerasa en la forma conveniente, y el nuevo ADN cromosomal es alargado (Fig. 15f). La síntesis de ADN a partir de un molde de ARN es llamada transcripción inversa, por lo tanto la telomerasa es un ejemplo de una enzima transcriptasa inversa.

Figura 15. Síntesis del ADN telomérico por la telomerasa. El ejemplo es de los telómeros de Tetrahymena. (a) El punto de inicio es el extremo del cromosoma con el gap 5' dejado después de la remoción del primer. (b) Unión de la telomerasa a la repetición telomérica sobre-expuesta en el extremo del cromosoma. (c) Síntesis de un segmento de ADN de tres nucleótido en el extremo del cromosoma, usando el molde de ARN de la telomerasa. (d) La telomerasa se mueve de tal manera que el molde de ARN pueda unirse al TTG recién sintetizado en una manera diferente. (e) La telomerasa cataliza la síntesis de una nueva repetición telomérica, usando el molde de ARN. (f) Después que la telomerasa ha dejado, nuevo ADN es sintetizado sobre el molde, comenzando con un primer de ARN. (g) Después que el primer es removido, el resultado es un cromosoma más largo que al comienzo, con un nuevo gap 5´.

2. El FUNCIONAMIENTO DEL ADN

La estructura, función, desarrollo y reproducción de un organismo depende de las propiedades de las proteínas presentes en cada célula y tejido. Una proteína consiste de una o más cadenas de aminoácidos. Cada cadena es un polipéptido, y la secuencia de aminoácidos en una cadena polipeptídica es codificada por un gen. Dos pasos ocurren durante la síntesis protéica, transcripción y traducción.

La Transcripción es la síntesis de una copia de ARN de cadena simple a partir de un segmento de ADN. La Traducción (síntesis proteica) es la conversión de la información de la secuencia de bases del ARN mensajero en una secuencia de aminoácido de un polipéptido. A diferencia de la replicación del ADN que sólo ocurre durante una parte del ciclo celular (por lo menos en eucariotas), la transcripción y traducción generalmente ocurren a lo largo de todo el ciclo, aunque es mucho más reducido durante la fase M.

2.1. Transcripción

La transcripción es la síntesis de una copia de ARN a partir de un segmento de ADN. La copia de ARNm se produce por medio de la enzima ARN polimersa sobre una de las dos cadenas de ADN. No todos los genes codifican proteínas, sino que hay genes que codifican para cada uno de los 4 tipos de moléculas de ARN que existen en una célula.

2.1.1. ARN

Existen 4 tipos diferentes de moléculas de ARN: 1) ARNm (ARN mensajero): codifica la secuencia de aminoácidos de un polipéptido. Los ARNm son los transcriptos de los genes que codifican proteínas (genes estructurales). 2) ARNr (ARN ribosómicos): junto a proteínas ribosomales constituyen los ribosomas. 3) ARNt (ARN transferencia): llevan los aminoácidos a los ribosomas durante la traducción. 4) ARNsn (ARN nucleares pequeños): junto a proteínas forman complejos que son utilizados en el procesamiento de los ARNm de eucariotas.

2.1.2. ARN polimerasa

La ARN polimerasa es la enzima encargada de la síntesis de los diferentes tipos de ARN, a partir de los genes específicos que se encuentran en el ADN. En muchos procariotas una simple ARN polimerasa sintetiza los ARNm, ARNr y ARNt. En los eucariotas, los tres ARN nucleares son codificados por diferentes genes y la transcripción de los mismos es producida por 3 clases de ARN polimerasas: 1) ARN polimerasa I: transcribe los genes para los ARNs ribosomales 28S, 18S y 5.8S. 2) ARN polimerasa II: transcribe los genes de los ARNm y algunos genes ARNsn. 3) ARN polimerasa III: transcribe genes para el ARNr 5S, ARNt y otros ARNsn.

En procariotas la ARN polimerasa es una enzima compuesta por un complejo de varias subunidades protéicas, cuatro de ellas constituyen el núcleo de la enzima, formada por 2 subunidades alpha (), una beta () y una beta prima (´), más una subunidad llamada factor sigma (). La enzima completa con la subunidad sigma se denomina Holoenzima ARN polimerasa (Fig. 16).

Figura 16. El núcleo de la enzima ARN polimerasa consiste de 4 subunidades: dos polipéptidos alpha (), uno beta () y otro beta prima (´). La adición de una subunidad sigma () permite la iniciación de la transcripción en el sitio del promotor.

2.1.3. El proceso de transcripción

En procariotas y eucariotas el proceso de transcripción ocurre en tres etapas: Iniciación, Elongación y Terminación. Asociados a cada gen se encuentran secuencias de ADN llamadas Elementos regulatorios del gen, los cuales están involucrados en la regulación de la transcripción. Un gen procariota puede ser dividido en tres secuencias con respecto a su transcripción: 1) Promotor: es una secuencia ubicada “río arriba” (hacia el extremo 5´) de la región codificante y con la cual la ARN polimerasa interactúa para iniciar la transcripción. 2) Secuencia codificante del ARN: es la secuencia de ADN transcripta por la ARN polimerasa en un ARNm. 3) Terminador: es la secuencia ubicada al final de la secuencia ARN-codificante, y es el lugar específico de terminación de la transcripción (Fig. 17).

Figura 17. Promotor, secuencia codificante del ARN, y regiones de terminación de un gen. El promotor está “río arriba” (5´) de la secuencia codificante y el terminador “río abajo” (3´). La secuencia codificante comienza en el nucleótido +1.

4.3.1.1. Iniciación de la transcripción

Para iniciarse la transcripción, primero la doble hélice de ADN debe desenrollarse en una corta región próxima al gen que será transcripto. En procariotas, la ARN polimerasa es la responsable del desenrrollamiento, y en eucariota el mismo es producido por otras proteínas que se unen al ADN en el punto de inicio de la transcripción (Fig. 18). El ARN es sintetizado en dirección 5´ 3´. La cadena de ADN que es leída para sintetizar la cadena de ARN es llamada cadena molde. La cadena de ADN 5´ 3´ complementaria a la cadena molde es llamada cadena no-molde.

Figura 18. Resumen de la transcripción. (a) Transcripción de dos genes en direcciones opuestas. El gen 1 es transcripto a partir de la cadena de abajo. La ARN polimerasa migra a la izquierda, leyendo la cadena molde en una dirección 3´ 5´ y sintetizando la cadena de ARN en dirección 5´ 3´. El gen 2 es transcripto en la dirección opuesta, a la derecha, debido a que la cadena de arriba es el molde. A medida que la transcripción avanza, el extremo 5´del ARN es desplazado del molde a medida que la burbuja de transcripción se cierra detrás de la polimerasa.

La región del ADN que señala la iniciación de la trascripción en los procariotas se denomina Promotor, el cual se halla ubicado cercano al inicio de la región transcripta, hacia el extremo 5´ (río arriba). En los promotores de los genes de Escherichia coli existen dos secuencias de ADN que son críticas para especificar el inicio de la transcripción. Estas secuencias son encontradas a -35 y -10 pares de bases (pb) río arriba del par de base +1 en el cual comienza la transcripción. La secuencia consenso (la secuencia encontrada más frecuentemente en cada posición) para la región -35 (el box -35) es 5´-TTGACA- 3´. La secuencia consenso para la región -10 (el box -10) es 5´-TATAAT- 3´ (Fig. 19).

Figura 19. Secuencia del promotor. (a) El promotor se ubica “río arriba” (hacia el extremo 5´) del punto de iniciación de la secuencia codificante. (b) Los promotores tienen regiones de secuencias similares, como es indicado por el sombreado amarillo en 7 diferentes secuencias de promotores en E. coli. Espacios (puntos) son insertados en las secuencias para optimizar el alineamiento de las secuencias comunes. Los números se refieren al número de bases antes (-) o después (+) del punto de iniciación de la síntesis de ARN. (c) La secuencia consenso para muchos promotores de E. coli está escrita en la parte inferior.

Para que la transcripción comience, la holoenzima de la ARN polimerasa se une al promotor en dos pasos. Primero, se une débilmente al box –35 con el ADN doble cadena, formando un estado denominado complejo de promotor cerrado (Fig. 20b). Luego, la holoenzima se une más fuertemente al box –10, produciendo el desenrrollamiento del ADN (Fig. 20c).

Figura 20. Iniciación de la transcripción. (a) La holoenzima de la ARN polimerasa explora el ADN de doble cadena antes de unirse al promotor. (b) La holoenzima se une primero débilmente al box -35 y luego al box -10, formando un complejo abierto, y se produce el desenrrollamiento del ADN. (c) El facto sigma () de la ARN polimerasa es liberado y comienza la transcripción.

4.3.1.2. Elongación de la transcripción

Luego de iniciada la transcripción el factor sigma () se disocia de la ARN polimerasa y el núcleo de la enzima continúa con la transcripción. A medida que la ARN polimerasa se mueve a lo largo del ADN, ésta va desenrollando el ADN por delante y vuelve a enrollar el mismo por detrás donde la transcripción ya se produjo. De esta manera se mantiene una región de ADN de simple cadena llamada burbuja de transcripción, dentro de la cual la cadena molde está expuesta (Fig. 21). En la burbuja, la polimerasa monitorea la unión de los ribonucleósidos trifosfatos libres a las bases expuestas sobre el ADN molde y si hay complementariedad de bases se produce el apareamiento y de esta forma avanza la cadena.

Figura 21. Elongación de la transcripción. Síntesis de una cadena de ARN complementaria a la región de cadena simple del ADN molde en dirección 5´ 3´.

4.3.1.3. Terminación de la transcripción

La transcripción de un gen individual es terminada luego del segmento codificante de la proteína mediante el reconocimiento de secuencias nucleotídicas especiales que actúan como una señal para la terminación de la cadena. Existen dos mecanismos para la terminación: 1) Directo o independiente del factor proteico rho (), y 2) Indirecto o dependiente de rho ().

En el mecanismo directo la secuencia terminadora contiene alrededor de 40 pares de bases, finalizando en una región rica en GC que es seguida por seis o más bases A. Debido a que G y C en el molde se transcribirán como C y G en el transcripto, el ARN en esta región es rica en GC. Estas bases C y G son capaces de formar enlaces de hidrogeno complementarios con cada una de sus bases complementarias, resultando en la formación de un bucle en horquilla. El “lazo en horquilla” y los residuos U sirven de

señales para la liberación de la ARN polimerasa y la terminación de la transcripción (Fig. 22).

Figura 22. Secuencia y estructura de un terminador independiente de Rho. Las mutaciones en el “cuello” (sección amarilla) impiden parcial o completamente la terminación.

En el mecanismo indirecto o dependiente de Rho se necesita un factor protéico denominado rho () para que la ARN polimerasa reconozca las señales de terminación. Los terminadores dependientes de rho () carecen del cordón AT y generalmente no forman estructuras de lazo. Rho es un hexámero con dos dominios, un dominio se une al ARN y el otro al ATP. Para la terminación, rho primero se une al ATP para ser activado. El rho activado se une a su secuencia de reconocimiento cerca del extremo 3’ del ARN transcripto (sitio rut). Rho hidroliza el ATP y se mueve a lo largo del ARN hacia la ARN polimerasa. Cuando la ARN polimerasa alcanza el terminador, ésta para, y rho alcanza y rompe los enlaces de hidrogeno (Fig. 23).

Figura 23. Modelo de terminación de la transcripción dependiente del factor protéico Rho. (a) Región de ADN de un gen con una secuencia de 40 a 60 pb que es rica en Citosina (C) y pobre en Guanina (G) e incluye una parte “río arriba” llamado el sitio rut (utilización de Rho). (b) El factor protéico Rho se une al ARN sintetizado en el sitio rut. (c) Rho unido al sitio rut produce un plegamiento del ARN y la posterior terminación de la transcripción.

4.3.2. Transcripción en eucariotas

La transcripción en eucariotas es más complicada que en procariotas, porque los eucariotas poseen 3 clases de ARN polimerasas y además por la manera en la cual los transcriptos son procesados para convertirse en funcionales.

En eucariotas, tres ARN polimerasas diferentes transcriben los genes para los 4 tipos de ARNs (Ítem 4.1.2). La ARN polimerasa de eucariotas tienen una estructura de subunidades protéicas mucho más compleja que los procariotas. Algunas de esas subunidades son similares a las de E. coli. La ARN polimerasa II transcribe los genes que codifican proteínas. El producto de la transcripción es un precursor del ARNm (pre-ARNm). El pre-ARNm debe ser procesado y/o modificado para obtener un ARNm maduro. Primero, se incorpora en el extremo 5’ una caperuza de un residuo 7-methylguanosine. Segundo, una cola de residuos de adenina es agregada al extremo 3’. Esta cola poly (A) contiene entre 150 a 200 bases. La caperuza y la cola poly-A protegen al ARNm de la degradación por exonucleasas cuando éste sale al citoplasma.

Además, la caperuza en 5´ también es importante para la unión del ARNm al ribosoma como un paso inicial en la traducción. Por otra parte, en el procesamiento del transcripto primario se produce la eliminación de los Intrones (secuencias no-codificantes de un gen), mediante un mecanismo de corte y empalme (“splicing”), y la unión de los Exones (secuencias codificantes de un gen). Una vez producida la maduración del transcripto, éste sale del núcleo al citoplasma para dirigirse a los ribosomas donde se produce la traducción (síntesis protéica) (Fig. 24).

Figura 24. Proceso de transcripción y traducción en Eucariotas. Primero, en el núcleo se origina un transcripto de ARN primario (pre-ARN), el cual sufre procesamiento (maduración) donde se le agrega en el extremo 5´ una caperuza de un residuo 7-methylguanosine y en el extremo 3´ una cola de poly-A; mientras que mediante un proceso de corte y empalme (“splicing”) son eliminados los intrones (secuencias no-codificantes) y los exones (secuencias codificante) que quedan son unidos entre sí. El transcripto maduro sale del núcleo al citoplasma donde se dirige a los ribosomas para que se produzca la traducción (síntesis protéica).

2.2. Traducción

Es la conversión de la información que portan los ARNm, a través de su secuencia de bases, en secuencias de aminoácidos (polipéptido). La información nucleotídica que especifica la secuencia de aminoácidos de un polipéptido es llamada Código Genético.

2.2.1. El código genético

Es un código formado por el conjunto de tres letras (triplete), es decir tres nucleótidos (un codón en el ARNm) que codifican un aminoácido particular. Con cuatro nucléotidos diferentes (A, C, G, U) existen 64 posibles combinaciones para sintetizar los 20 aminoácidos. Algunos aminoácidos son sintetizados por más de un codón o triplete (Fig. 25).

Figura 25. El código genético. De los 64 codones, 61 especifican uno de los 20 aminoácidos. Los otros 3 codones no codifican aminoácidos sino codones de terminación. El codón AUG es el codón de iniciación de la síntesis protéica y codifica para metionina que posee un grupo formilo (formyl-metionina).

Las principales características del código genético son las siguientes:

1) Es un triplete de letras. Cada codón de un ARNm que especifica un aminoácido consiste de tres letras.

2) El código está libre de comas, es decir es continuo. El ARNm es leído de a tres nucléotidos por vez, en forma continua, sin saltearse ningún nucleótido.

3) El código es no-superpuesto. El ARNm es leído en grupos sucesivos de tres nucléotidos.

4) El código es casi universal. Casi todos los organismos comparten el mismo lenguaje genético.

5) El código es degenerado. Significa que más de un codón codifica para cada aminoácido (dos excepciones: sólo AUG metionina y UGG triptófano).

6) El código tiene codones de inicio y finalización. Solamente 61 de los 64 codones especifican aminoácidos. Estos se llaman codones con sentido.

7) Existen movimientos de un lado a otro en el anticodón. Al existir 61 codones con sentido, es decir que especifican aminoácidos en el ARNm, un total de 61 ARNt pueden tener el anticodón apropiado. Sin embargo, existen menos de 61 ARNt distintos debido a las propiedades de apareamientos de las bases del anticodón. Específicamente la base en el extremo 5´ del anticodón, complementario a la base en el extremo 3´ del codón, o la tercera letra, no está limitada tridimensionalmente como las otras dos bases. Esta característica le permite un apareamiento de bases menos exacto, de tal manera que la base en el extremo 5´ del anticodón puede aparearse con más de un tipo de base en el extremos 3´ del codón, es decir puede “tambalearse” (Fig. 26, Tabla 1).

Figura 26. Ejemplo del tambaleo en el apareamiento de bases. Dos codones de leucina diferentes (CUC, CUU) pueden ser leídos por la misma molécula de ARNt leucina, contrario a las reglas de apareamiento regular de bases.

Tabla 1. Tambaleo en el código genético

2.2.2. Codón y anticodón

El codón es la secuencia de tres bases (triplete) en la cual se divide el ARNm para la síntesis protéica. El anticodón es la secuencia de tres bases, complementaria a las bases del codón, el cual es portado por los ARNt encargados de llevar los aminoácidos específicos a los ribosomas, para que se vayan uniendo en una cadena peptídica.

2.2.3. Síntesis de proteínas

Se produce en los ribosomas donde el mensaje genético codificado en el ARNm es traducido. El ARNm es traducido en dirección 5’ 3’ y el polipéptido se forma en dirección N-terminal a C-terminal. Los aminoácidos son llevados al ribosoma ligados a una molécula de ARNt. La correcta secuencia de aminoácidos se logra como resultado de: 1) el ligamiento de cada aminoácido a su ARNt específico y 2) el ligamiento entre el codón del ARNm y el anticodón complementario en el ARNt.

La síntesis de proteínas es una reacción química que comprende los siguientes pasos:

Cada aminoácido se une al ARNt por enlaces de alta energía derivado del ATP. El proceso es catalizado por la enzima Sintetaza (carga del ARNt).

aa1 + ARNt1 + ATP sintetaza1 aa1ARNt1 + AMP + PPi

La energía del ARNt cargado es convertida en un enlace peptídico para ligar un aminoácido con otro sobre el ribosoma.

aa1ARNt1 + aa2ARNt2 peptidyl transferase aa1aa2ARNt2 + ARNt1

La síntesis de proteína se divide en tres etapas: Iniciación, Elongación y

Terminación.

2.2.3.1. Iniciación de la traducción

Posee tres pasos. Además del ARNm, los ribosomas, y los ARNt específicos se necesitan varios factores llamados Factores de Iniciación IF1, IF2 y IF3 (Fig. 27).1) Se liga el ARNm a la subunidad 30S del ribosoma. Este es estimulado por el factor

IF3 (las subunidades del ribosoma sólo se unen cuando se inicia el proceso de síntesis).

2) El factor IF2 se liga a GTP y al iniciador fMet-ARNt y estimula el ligamiento de fMet-ARNt al complejo de iniciación, dejando a fMet-ARNt dentro del sitio P.

3) Una proteína ribosomal separa el GTP ligado a IF2, ayudando a ensamblar las dos subunidades ribosomales. En esta etapa se liberan los factores IF1 y IF2.

Figura 27. Iniciación de la síntesis de proteína en procariotas. Una subunidad ribosomal 30S forma un complejo con factores de iniciación y GTP, unidos al ARNm y fMet-tRNA para formar un complejo de iniciación 30S. Luego, la subunidad ribosomal 50S se une, formando un complejo de iniciación 70S. Durante este evento, los factores de iniciación son liberados y el GTP es hidrolizado.

2.2.3.2. Elongación de la traducción

El factor EF-Tu dirige la entrada de amino-acyl-ARNt dentro del sitio A. Primero, EF-Tu se liga a GTP formando un complejo EF-Tu-GTP. Este complejo activado se liga al ARNt. Luego, la hidrólisis del GTP a GDP ayuda a conducir el ligamiento del aminoacyl-ARNt al sitio A, donde EF-Tu es liberado, dejando al nuevo ARNt en el sitio A. El factor EF-Ts se encarga de la liberación de EF-Tu-GDP del ribosoma y la regeneración de EF-Tu-GTP. En el paso de translocación, la cadena polipeptídica ubicada sobre el peptidyl-ARNt es transferida al aminoacyl-ARNt sobre el sitio A en una reacción catalizada por la enzima peptidyltransferasa. Los ribosomas son translocados por movimientos sobre un codón alejado del ARNm. Este paso es realizado por el factor de elongación EF-G (Fig. 28).

Figura 28. Proceso de elongación de la traducción en procariotas.

2.2.3.3. Terminación de la traducción

Los tres codones de terminación UAG, UAA y UGA no son reconocidos por un ARNt, pero sí por factores proteicos denominados Factores Liberadores RF1 y RF2. RF1 reconoce los tripletes UAA y UAG, y RF2 reconoce a UAA y UGA. Existe un tercer factor RF3 que ayuda a catalizar la terminación. Cuando el peptidyl-ARNt está en el sitio P, el factor liberador, en respuesta a codones de terminación, se liga al sitio A. Entonces el polipéptido es liberado del sitio P, y los ribosomas se disocian en sus dos subunidades (Fig. 29).

Figura 29. Terminación de la traducción. Los ribosomas reconocen un codón de terminación (UAG) con la ayuda de factores de liberación. Un factor de liberación lee el codón stop, iniciando una serie de eventos de terminación específicos que conducen a la liberación del polipéptido completo.

3. LA EXPRESIÓN DE LOS GENES

Las células o los organismos poseen diferentes sistemas de regulación de la expresión de sus genes de acuerdo a las necesidades específicas. En organismos superiores, los tipos celulares específicos se han diferenciado a tal punto que ellos están altamente especializados. Una célula del ojo humano sintetiza las proteínas importantes para el color del ojo, pero no produce las enzimas desintoxificantes que se sintetizan en el hígado. Cada tipo celular tiene orden de expresar sólo algunas de sus proteínas. Las bacterias también necesitan regular la expresión de sus proteínas. Un ejemplo son las

enzimas que metabolizan los azúcares. La lactosa, glucosa, maltosa, rhamosa, galactosa y xylosa son algunas de las fuentes de energía utilizadas por las bacterias.

Circuito básico de control:

Toda célula necesita mecanismos para reprimir o apagar la transcripción de todos aquellos genes que codifican enzimas que no son necesarias; como así también activar la transcripción de aquellos genes cuando se necesitan las enzimas. Para ello, se requieren dos condiciones:

1. Las células deben ser capaces de “encender o apagar” la transcripción de cada gen específico o grupo de genes.

2. Las células deben ser capaces de reconocer condiciones del medio en la cual ellas deberían activar o reprimir la transcripción de los genes.

El primer sistema descubierto por François Jacob y Jacques Monod en la década del 50 fue el control de las enzimas de la lactosa. El metabolismo de la lactosa requiere de dos enzimas: una permeasa, para transportar la lactosa dentro de la célula, y una -galactosidasa para desdoblar la lactosa en glucosa y galactosa. La permeasa y -galactosidasa son codificadas por dos genes contiguos, Z e Y, respectivamente. Un tercer gene denominado A, codifica la enzima Transcetylasa, la cual no es requerida para el metabolismo de la lactosa. Los tres genes son transcriptos en una sola molécula de ARNm multigénica (policistrónico) (Fig. 30).

El gen I, adyacente a Z, Y y A, codifica una proteína represora, la cual bloquea la expresión de Z, Y y A. El represor se liga a la región del ADN cercana al comienzo del gen Z y cerca del punto de inicio de la transcripción del ARNm. Este sitio se denomina operador. Esto impide el inicio de la transcripción a través de la ARN polimerasa. Normalmente la ARN polimerasa se liga a la región de ADN denominada Promotor. El segmento POZYA constituye un Operón, es decir una unidad genética de expresión coordinada (Fig. 30).

Figura 30. Regulación del operon lac. El gen I produce la proteína represora en forma continua. El represor se une a la región O (operador) impidiendo que la ARN polimerasa unida a P (la región promotora) transcriba los genes adyacentes. Cuando la lactosa está presente, esta se une al represor y cambia su forma de tal manera que el represor no se pueda unir al operador. La ARN polimerasa es entonces capaz de transcribir los genes estructurales Z, Y, y A, y las tres enzimas son producidas.

El represor lac posee dos sitios de reconocimiento: uno que reconoce la secuencia específica del operador en el operón lac (Fig. 31), y el otro que puede reconocer la lactosa o análogos de la lactosa. Cuando el represor se une a derivados de la lactosa, éste sufre un cambio conformacional de tal forma que el represor pierde afinidad por el operador. Esto satisface el segundo requerimiento para el sistema de control.

Figura 31. Estado funcional del el operon lac en Escherichia coli silvestre (wild-type) creciendo en ausencia de lactosa.

El auxilio de la represión para sistemas como el lac se los llama Inducción; en el cual derivados de la lactosa inactivan al represor y conducen a la expresión de los genes lac (Inductores) (Fig. 32). Existen otros sistemas bacterianos operados por moléculas proteicas activadoras, las cuales se unen al ADN como un prerrequisito para la transcripción.

Figura 32. Estado funcional del operon lac en E. coli silvestre (wild-type) creciendo en presencia de lactosa como única fuente de carbono.

3.1. Mutaciones en los genes que codifican proteínas

Los mutantes de los genes estructurales se denominan lacZ-, lacY- y lacA- y se obtienen con mutágenos químicos. Una mutación con pérdida de sentido en los genes lac cambia un par de bases en el ADN, lo cual causa un cambio en un codón del ARNm, resultando en la substitución de un aminoácido por otro en el polipéptido. Esta mutación solo afecta la función del producto génico.

Las mutaciones sin sentido en el gen lacZ no solo afectan la función de la -galactosidasa sino también afectan las funciones de la permeasa y transcetilasa (Fig. 33).

Las mutaciones sin sentido en lacY producen permeasas y transcetilasas no funcionales, pero no afecta a la -galactosidasa.

Las mutaciones sin sentido en lacA afectan a la transcetilasa pero no a la -galactosidasa y permeasa.

Figura 33. Traducción de un ARNm policistrónico codificado por los genes lac (a) E. coli wild-type y (b) una raza mutante con una mutación sin sentido en el gene de la -galactosidasa (lacZ).

3.2. Mutaciones que afectan la regulación de la expresión génica

Jacob y Monod obtuvieron mutantes que sintetizaban constitutivamente todos los genes del operón lac, independientemente de la presencia o no del inductor (lactosa). Ellos hipotetizaron que las mutaciones se produjeron en los elementos regulatorios y que afectaron el mecanismo normal que controla la expresión de los genes estructurales. Jacob y Monod identificaron dos clases de mutaciones constitutivas: una cercana al gen lacZ llamada el operador (lacO) (Fig. 34) y otra ubicada “río arriba” y denominada gen represor de lac (lacI) (Fig. 35).

3.2.1. Mutaciones en el Operador e Inductor

Son llamadas mutaciones operador-constitutivo o lacOc. El uso de razas diploides parciales (razas F´ donde unos pocos genes cromosomales están sobre un elemento genético extra-cromosomal denominado factor F) les permitió a Jacob y Monod establecer el rol del operador en la regulación de la expresión génica.

Un diploide parcial fue F´ lac O + lac Z- lac Y +

lacOc lacZ+ lacY-

Se utilizó en presencia y ausencia de un inductor denominado IPTG (Isopropyl--D-thiogalactoside) (Fig. 34a).

El fenómeno mediante el cual un gen o una secuencia de ADN controla a genes ubicados sobre el mismo segmento de ADN contiguo se denomina dominancia en cis. La mutación lacOc es cis-dominante porque sólo afecta a los genes adyacentes y no puede ser resuelta por una región lacO+.

Figura 34. Efecto de dominancia en Cis de la mutación lacOc en una raza de E. coli diploide parcial. (a) En ausencia del inductor, el operon lacO+ está apgado, mientras el operon lacOc produce -galactosidasa funcional a partir del gen lacZ+ y permeasa no-funcional del gen lacY- con una mutación con pérdida de sentido. (b) En presencia del inductor, la -galactosidasa funcional y la permeasa defectiva son producidas del operon lacOc, mientras el operon lacO+ produce -galactosidasa no-funcional a partir del gen lacZ- (mutación sin sentido) y permeasa funcional a partir del gen lacY+. Entre los dos operones en las células, -galactosidasa y permeasa funcional son producidas.

Figura 35. Efecto de una mutación lacI-. (a) Efecto sobre la expresión del operon lac en una célula haploide, donde el mutante, una molécula represora Lac inactiva no puede unirse a el operador lacO+, de tal forma que los genes estructurales son transcriptos constitutivamente. Efecto en una raza diploide parcial lacI+ lacO+ lacZ- lacY+ / lacI-

lacO+ lacZ+ lacY-. (b) en ausencia del inductor o (c) en presencia del inductor.3.3. Control positivo del Operon lac

En el operón lac, la proteína represora ejerce un efecto negativo sobre la expresión de los genes lac, bloqueando la acción de la ARN polimerasa en ausencia del inductor. Existe un sistema de control positivo que regula la expresión del operón lac. Este sistema permite que el operón lac se exprese a altos niveles si la lactosa es la única fuente de carbono y nada de glucosa se encuentra presente.

Una proteína llamada proteína activadora de catabolitos (CAP) se une con AMP cíclico (cAMP) para formar un complejo CAP-cAMP. Este complejo es la molécula reguladora positiva. El complejo CAP-cAMP se une al sitio CAP, el cual se ubica “río arriba” del sitio de unión de la ARN polimerasa al promotor. La unión provoca que el ADN se doble, facilitando las interacciones proteína-proteína entre el dominio activado de CAP y sitios específicos sobre la ARN polimerasa, produciendo la activación de la transcripción (Fig. 36).

Figura 36. Rol del AMP cíclico (cAMP) en el funcionamiento de operones sensitivos a glucosa tales como el operon lac de E. coli.

Cuando la glucosa está presente con la lactosa, la glucosa es usada preferencialmente, produciéndose una represión catabólica (efecto glucosa). En la represión catabólica, el operón lac es expresado en muy bajos niveles, aunque la lactosa

esté en el medio. Esto ocurre porque la glucosa provoca una disminución de los niveles de cAMP, por lo tanto, es insuficiente la cantidad de complejo CAP-cAMP para facilitar que la ARN polimerasa se una al promotor lac y la transcripción se produzca, aunque los represores sean liberados del operador por la presencia de alolactosa. La ARN polimerasa no puede unirse al promotor sin la ayuda del complejo CAP-cAMP. La represión catabólica actúa sobre la adenilato ciclasa, la enzima que produce cAMP (Fig. 37).

Figura 37. Control negativo y positivo del operon lac por el represor lac y la proteína activadora de catabolito, respectivamente. (a) en ausencia de lactosa que sirve como un inductor, el represor Lac se une al operador; más allá de los niveles de cAMP y la presencia de CAP, la producción de ARNm está reprimida. (b) Con lactosa presente unida al represor, el represor es incapaz de unirse al operador; sin embargo, pequeñas cantidades de ARNm son producidas debido a que la presencia de glucosa baja los niveles de cAMP, y entonces el complejo cAMP-CAP no se forma y une al promotor. (c) con el represor inactivado por la lactosa y con altos niveles de cAMP presente (en ausencia de glucosa), cAMP se une a CAP. El complejo cAMP-CAP es entonces capaz de unirse al promotor; siendo activado el operon lac, y grandes cantidades de ARNm son producidas.

5.4. Regulación de la expresión génica en Eucariotas

Si bien tiene similitudes con la regulación de la expresión génica en Procariotas, presenta algunas diferencias debidas a la mayor complejidad de los genomas eucariotas. Las principales similitudes incluyen: 1) secuencias promotoras que varían para especificar el rango de iniciación de la transcripción, 2) secuencias regulatorias que determinan la respuesta de los genes a moléculas efectoras, y 3) proteínas regulatorias, tanto activadores como represores, con dominios específicos de unión al ADN que interactúan con secuencias regulatorias para controlar la transcripción. Las principales diferencias debida a la mayor complejidad de las células eucariotas incluyen: 1) un rol de la estructura de la cromatina en la regulación de expresión génica; 2) la necesidad de agregar una caperuza en 5’ y una cola poly(A) en 3’ al pre-ARNm y luego la eliminación de los intrones para producir el ARNm maduro; 3) la posibilidad de producir diferentes ARNm a partir del corte y empalme alternativo de los pre-ARNm; 4) la regulación del transporte del ARNm del núcleo al citoplasma. Por último, en los procariotas es común que los genes estén regulados por operones mientras que en eucariotas son muy raros.

5.4.1. Niveles de control de la expresión en Eucariotas

Los niveles de control de la expresión en eucariotas se deben a la compartimentalización de las células y la necesidad en eucariotas multicelulares de generar un gran número y tipos celulares diferentes. La presencia de un núcleo en células eucariotas separa los procesos de transcripción y traducción. Como consecuencia de ello hay mayores niveles de regulación de la expresión de genes que codifican proteínas. La Fig. 38 muestra un diagrama de estos niveles: transcripción del ARNm, procesamiento del ARNm, transporte del ARNm, traducción y degradación del ARNm, y procesamiento y degradación de las proteínas.

Figura 38. Niveles de control de la expresión génica en eucariotas