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Tema VI. Conservación a nivel genético (continúa…)

Consecuencias genéticas en poblaciones pequeñas y especies amenazadas

Deriva génica Entrecruzamiento Fragmentación y flujo genético Tamaño poblacional efectivo (Ne)

Manejo genético de poblaciones en cautiverio y en jardines botánicos

Jerarquía y procesos en los diferentes niveles de los sistemas ecológicos

1

2

2

Origen de la variación

• La variación en cualquier sistema de caracteres, refleja una combinación de factores ecológicos, genéticos e históricos

3

INDIVIDUAL

POBLACIONAL

Ontogenética Clases de edades o sexos Cambios en el ambiente

Diferencias en el hábitat Diferencias sociales Transformaciones climáticas temporales Cambio de la densidad o estructura demográfica

Constitución genética

Constitución genética

La diversidad genética es uno de los atributos más importantes de las poblaciones.

Conocerla tiene aplicaciones importantes en la conservación de las especies.

La reducción de la diversidad genética causa un aumento en la homocigosidad y la expresión de alelos deletéreos recesivos

Consecuentemente, aumenta la depresión por endogamia y reduce la viabilidad de los individuos y de la población a adaptarse conduciendo a la extinción

Para entender las consecuencias genéticas en poblaciones pequeñas y especies amenazadas

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¿Qué es la diversidad genética?

¿Cuál es su origen?

¿Cómo la detectamos? ¿Cómo se mide?

Amos, W. & A. Balmford. 2001. When does conservation genetics matter? Heredity 87: 257-265. Frankham, R., J. D. Ballou, D. A. Briscoe. 2004. A primer of Conservation Genetics. Cambridge University Press. Frankham, R. 2005. Genetics and extinction. Biological Conservation 126: 131-140 Frankham, R. 2005. 2008. Genetic adaptation to captivity in species conservation programs. Molecular Ecology 17: 325-333 Freeland, J. R. 2005. Molecular Ecology. John Wiley and Sons, Ltd. Gillespie, J. H. 1998. Population Genetics: a concise guide. The Johns Hopkins University Press. González, D. 1998. Marcadores moleculares para los estudios comparativos de la variación en ecología y sistemática. Revista Mexicana de Micología 14: 1-21. Sunnucks, P. 2000. Efficient genetic markers for population biology. TREE 15: 199-203

Diversidad génetica

Qué es?

5

Cheetah (Acinonyx jubatus)

Ejemplo de la importancia de la variación genética en la sobrevivencia a largo y corto plazo

Diversidad genética

problemas fisiológicos

6

La incorporación de la genética en la conservación surgió por el efecto adverso de la endogamia en la reproducción y sobrevivencia de las especies en poblaciones pequeñas y fragmentadas

Padres no relacionados No. total animales considerados

3 4

21 22

7

Ejemplos del grado de variación genética en especies raras o en peligro

7

Qué es la conservación a nivel genético?

Es la disciplina que hacer uso de la teoría y técnicas de la genética para reducir el riesgo de extinción de especies amenazadas, y a largo plazo….. conservarlas como entidades dinámicas capaces de mantenerse a través de cambios ambientales.

Se enfoca en poblaciones pequeñas o que están disminuyendo en número.

Por ejemplo:

1. Los efectos de la endogamia en la reproducción y sobrevivencia

2. Las incertidumbres taxonómicas

3. La definición de las unidades de manejo dentro de las especies

Su objetivo es conocer aspectos genéticos de las especies que sean relevantes para su manejo

8

………

5. La pérdida de la diversidad genética y la habilidad de adaptarse en respuesta a cambios ambientales

6. La acumulación de mutaciones deletéreas

7. El efecto de la adaptación al cautiverio sobre el éxito de la reintroducción a habitats naturales

8. La identificación de las huellas genéticas de las especies para la ciencia forense (litigios)

Por qué es importante conservar la diversidad a nivel genético?

Necesaria para adaptarse a cambios ambientales inducidos por el hombre o por desastres naturales

9

Diversidad génetica

Se describe en términos de frecuencias alelicas, número de alelos y heterocigosidad

Qué es?

Cuál es su origen?

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Alteraciones en el ADN

POLIMORFISMO

Variación genética

A nivel de nucleótidos

indel

(a) CAC ACA TTT GGA AAA CAG GGT C -- TGT GGT ATA

(b) CAC ACA TTC GGA AAA CAG GTT CTT TGT GGA ATA

His Thr Phe Gly Lys Gln Val Leu Cys Stop Ile

His Thr Phe Gly Lys Gln Gly ? ? ?

Transición sinónima

Transversión No-sinónima

(con sentido)

Leu Trp Tyr

Transversión No-sinónima

(sin sentido)

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A nivel de segmentos de ADN

Variación genética

Inversión Translocación

Duplicación Deleción

Otras fuentes:

Variación genética A nivel de cromosomas

Cadenas homólogas

Cromosomas homólogos

Entrecruzamiento

Recombinación

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Variación genética A nivel de cromosomas

Trisomía

Monosomía

Aneuploidía

Poliploidía

Euploidía

Monoploidía

Uno o más cromosomas de un juego normal se pierden o están presentes en más de su número normal de copias.

Un juego entero de cromosomas se duplica una o varias veces

Pérdida de un juego

Enzimas de reparación

Reparación incorrecta

MUTACION

Endonucleasas Exonucleasas Polimerasas ligasas

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Cuál es la base de la variación genética en la población?

La frecuencia y fijación de las mutaciones

Mutación

Selección y deriva genética

Genoma o gen muestreado

*

*

Mutaciones en el linaje (fuente de variación dentro y entre especies)

Las mutaciones que observamos:

Dependen del organismo Algunas ADN polimerasas son más eficientes en corregir errores Hay diferencias en la reparación de genes Algunos organismos tienen tasas de mutación extremadamente altas.

Dependen de la posición en el genoma Regiones con nucleótidos repetidos más susceptible a errores durante la replicación (“slippage”)

Dependen del ambiente Presencia de mutágenos

*

*

14

En forma natural, la tasa de mutación es baja

Pero, otros factores como pocos individuos en poblaciones pequeñas promueve la fijación de mutaciones perjudiciales para la población

*

*

Cómo lo detectamos?

15

Cómo se descubren los procesos que están afectando a la población?

Explorando la constitución genética de los individuos de la población

GCGGCCCA TCAGGTAGTT GGTGGCCCGT

GCGGCCCA TCAGGTAGTT GGTGG---GT

GCGTTCCA TCAGCTGGTT GGTGGCCCCT

GCGTCCCA TCAGCTAGTT GGTGGCCCGT

GCGGCGCA TTAGCTAGTT GGTGA---GT

Propiedades de los marcadores moleculares

Polimórfico Codominante Frecuente Distribuido ampliamente en el genoma Reproducible De ensayo rápido y sencillo De fácil acceso

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Técnicas para detectar la variación genética

Actualmente es fácil conocer la variación genética usando datos moleculares de muchos loci para muchos individuos y para muchas poblaciones!

Clases de marcadores: ADN o proteínas Información de la secuencia de ADN: necesaria o no Origen del marcador:

Producto de extracto celular (ADN, ARN, enzima) Producto de amplificación de ADN Secuencia de ADN

Variación genética: por longitud o por nucleótidos Cobertura genómica, número de loci que detecta:

Un solo locus loci múltiples

Fenotipo del marcador: dominante o codominante

Características:

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28% monómeras 47% dímeras 4% trímeras 24% tetrámeras 1% octámeras

PROTEÍNAS

substrato

enzima Complejo enzina-substrato

enzima

producto

glicólisis

Glucosa-6-fosfato Fructuosa-6-fosfato

ATP ADP

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ELECTROFORESIS DE ISOENZIMAS

ZIMOGRAMA PARA UNA ENZIMA CON UN LOCUS Y DOS ALELOS

heterocigotos

aAA AB AB AB AB BBgenotipo

aa aaa aaaa

aab aaab

ab aabb

abb abbb

b bb bbb bbbb

subunidades polipeptídicas producidas por alelos A ó B

monomérica dimérica trimérica tetramérica (intensidad 1:4:6:4:1 si A y B producen concentración similar)

19

Extracción y purificación de ADN PCR PCR-RFLPs

RFLPs

5'

3'

T CG TAA

A GC T T A

Eco RI

5'

3' T CG T AA

A GC T TA

Hpa I

5'

3'

CC GG

G C CG

Hpa II

5'

3'

isosquizómero de Hpa II

CC GG

G C CG

Msp I

mm

RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphism)

ENZIMAS DE RESTRICCION

20

Loci RFLP en poblaciones segregantes. A) población de líneas diploides derivadas de F1 en Brassica napus. Cada línea es característicamente homocigota para uno u otro alelo en el locus RFLP. B) Locus RFLP estudiado en una población segregante F2. Además de los genotipos homocigotos para uno u otro alelo, se identifican también los heterocigotos. P = línea parental homocigota

Población de líneas diploides derivados de F1

Población de individuos F2

RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphisms)

Rubus nessensis (asexual) vs. R. idaeus (sexual)

21

enzima 1 enzima 2 enzima 3

gel

X 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 1

Y 0 0 1 1 1 0 0 1 0 1 0 0 1 1 1

Z 0 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

T A X A X Y Z X Y Z X Y Z

A)

m

B)

enzima 1 enzima 2 enzima 3

taxa

3' 5'

5' 3'

G A A T T C

C T TA A G

T T A A

A A T T

Mse I Eco RI

AFLPs

El ADN se digiere con dos enzimas de restricción diferentes

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T T A A

A A T T C N

G N

N T

N A A T

T A

iniciador + 1 base A 5 '

C 5 '

Primera amplificación selectiva

A B C

iniciador + 1 base

adaptador adaptador

G T T T A A

A A T T C A G T

C A A T

T A Segunda amplificación selectiva

A B C iniciador + 3 bases AAC 5 '

AAC 5 '

iniciador + 3 bases

AFLPs

MseI

MseI

MseI

MseI MseI

MseI

MseI

MseI

MseI

MseI

MseI

MseI

MseI

MseI

MseI

MseI

MseI

MseI

MseI

MseI

MseI

MseI

MseI

MseI

MseI

MseI

MseI

MseI

MseI

MseI

MseI

MseI

MseI

MseI

EcoRI

EcoRI

EcoRI

MseI

EcoRI

MseI

EcoRI

EcoRI

EcoRI

EcoRI

Solo un subjuego específico de productos de digestión se amplificarán, usando combinaciones selectivas de primers

Mse I (un corte cada 256 pb)

Eco RI (un corte cada 4096 pb)

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AFLPs (Amplified Fragment Length Polymorphisms)

* polimórficos

Black Robin

Individuos casi idénticos!

Bush Robin

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Son secuencia específicas de mono, di, tri, o tetra nucleótidos repetidos en tandem Por ejemplo:

AAAAAAAAAAA se refiere como (A)11 GTGTGTGTGTGT se refiere como (GT)6 CTGCTGCTGCTG se refiere como (CTG)4

ACTCACTCACTCACTC se refiere como (ACTC)4

SSR- microsatélites

También se conocen como, short tandem repeats (STR) o short sequence tandem repeats (SSTR)

SSR- microsatélites

Individuo 1 GTACTAGGCTCTCTCTCTGGATCC

Individuo 2 GTACTAGGCTCTCTCTCTCTGGATCC

Individuo 3 GTACTAGGCTCTCTCTCTCTCTGGATCC

CT5

CT6

CT7

Son altamente polimórficos. En una población pueden existir muchos alelos en un solo locus de microsatélite (hasta 20 en humanos)

(solo una cadena de cada cromosoma)

25

Dónde se encuentran?

La mayoría se localizan en cualquier parte del genoma en regiones no codificadoras

…CCTTGCATCCTTCTCTCTCTCTCTCTATCGGTACTAC…

…CCTTGCATCCTTCTCTCTCTCTCTCTATCGGTACTAC…

…CCTTGCATCCTTCTCTCTCTCTCTCTATCGGTACTAC…

…CCTTGCATCCTTCTCTCTCTCTCTCTCTATCGGTACTAC…

homocigoto

heterocigoto

Cromosomas homólogos

alelos

alelos

locus microsatélite

26

MICROSATELITES (Short Tandem Repeats) (Short Single Repeats)

ACC

TGCT

27

Secuencia de tres genotipos:

CACACACACACACA GTGTGTGTGTGTGT

CACACACACACACACACA GTGTGTGTGTGTGTGTGT

CACACACACACACACACA GTGTGTGTGTGTGTGTGT

CACACACACACACA GTGTGTGTGTGTGT

CA CA CA CA CA CA CA GT GT GT GT GT GT GT

CACACACACACACACACA GTGTGTGTGTGTGTGTGT

A1A1 A1A2 A2A2 (CA)7 (CA)9

28

• La secuenciación mejoró cuando: – Se incorporaron ddNTPs fluorescentes – Se introdujo la secuenciación de capilar

• Capilares vs geles – Capilares más rápidos – Más automatizado

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ALINEAMIENTO

¿ Cómo se mide el grado de diversidad genética dentro de las especies ?

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Descriptores básicos para cuantificar los patrones de variación genética dentro y entre las poblaciones

Identificar genotipos

Determinar la frecuencia alelica en cada locus (frecuencia génica)

Análizar estadísticamente los datos; determinar la asociación de alelos (dentro y entre loci)

Identificar alelos

Inferencias de la diversidad genética como la estructura de la población y los procesos evolutivos que la afectan (deriva genética, endogamia, flujo genético, cuello de botella etc.)

Conservación, manejo, uso eficaz de los recursos genéticos, evolución

• La población ha experimentado cuello de botella en el pasado?

• Hay flujo génico entre poblaciones?

• Hay endogamia en la población; qué impacto tiene?

• Las poblaciones aisladas geográficamente están relacionadas genéticamente?

• Cuáles son los progenitores de ciertos individuos? etc..

Por qué nos interesa medir la variación genética?

31

Genética de poblaciones ...

Estudiar las fuerzas evolutivas que resultan en cambios genéticos en las especies a través del tiempo

Conocer y caracterizar el grado de variación genética dentro de las especies

NO es posible conocer la estructura genética de las poblaciones!

t1 = x t2 = y

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Cómo se investiga?

Se ignora la complejidad de las poblaciones reales y se enfoca únicamente en la variación de uno o pocos loci en un tiempo específico y en una población que se asume en equilibrio

Pop 1 Pop 2 Pop 3 Pop 4

...

...

...

Tiempo t

t+1

t+2 . . .

, apareamiento al azar, no migración, mutación o selección

Modelo: población ideal en equilibrio

poblaciones en equilibrio Hardy-Weinberg

33

El modelo de la población ideal es irreal. Las

desviaciones significativas en las frecuencias

alélicas son una indicación de la violación de una

o más de las suposiciones de este modelo. Por lo

tanto, intuimos que están actuando procesos

naturales o inducidos que afectan la población.

Procesos evolutivos

Mutación Cambios al azar en el ADN

Recombinación Rearreglo de los alelos asociado con meiosis y/o mitosis

Flujo genético Movimiento de nuevos alelos en las poblaciones

Deriva génica Cambios en la frecuencia alélica debidos al azar

Selección Cambios en las frecuencias alélicas debido a diferencia en la reproducción y sobrevivencia

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Cómo se detecta el efecto de esos procesos?

– A través de marcadores cuya presencia común sea indicadora de

conexión ontogenética, genética o histórica

Cómo afectan los procesos evolutivos a las poblaciones?

Diversidad genética

Diversidad genética

Mutación Reproducción sexual

Flujo génico

Pérdida inmediata de alelos Cuello de

botella Deriva génica

Variación en el éxito reproductivo, radio desigual de sexos Tamaño pequeño de la población Ne

Endogamia Deriva génica

+

-

Ne

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Dos niveles de análisis

a. Una población

i. Programas de investigación muchas veces interesados en una población (conservación, prevención de enfermedades, etc.)

ii. Es importante caracterizar primero la población antes de hacer comparaciones entre varias poblaciones

b. Varias poblaciones

Diversidad alélica (A) Proporción de loci polimórficos (P) Frecuencia génica Heterocigosidad observada (H0) Heterocigosidad esperada (HE) Número efectivo de alelos [AE = 1/(1-HE)] Indice de fijación (FIS) Diversidad génica dentro de la población (HI) Diversidad media dentro de la población (Hs) Diversidad total (HT)

Parámetros genéticos estándar para un análisis de diversidad genética poblacional

36

Basada en el número de variantes • Polimorfismo o tasa de polimorfismo (Pj) • Proporción de loci polimórficos • Número de alelos y riqueza alélica

Basada en la frecuencia de los variantes • Promedio esperado de heterocigosidad (He; Nei’s genetic diversity, etc.)

Parámetros genéticos estándar para un análisis de diversidad genética entre poblaciones

Wright’s F statistics (Wright)

Diferenciación entre poblaciones para un locus (gST)

Diferenciación entre poblaciones para varios loci (GST)

Contribución de la población a la diversidad genética total

Análisis de varianza molecular (AMOVA)

37

glucose phosphate isomerase

Eider ducks

F

S …67

genotipos

FF

37 0.552

FS

24 0.358

SS

6 0.090

Total

67 1.00

observados 1) Frecuencias genotípicas (proporción ej. 37/67=0.552)

para.. Frecuencia alélica 2 alelos p y q diploides

p(A) = [2(AA) + (Aa)]/2n

Cada individuo porta 2 alelos por locus

Cada homocigoto porta 2 copias del mismo alelo

38

2) Frecuencia alélica 2 alelos p y q diploides

(2 x FF) + FS P = 2 x total (2 x 37) + 24 P = 2 x 67

= 0.73

q = 0.27

genotipos

FF

37

FS

24

SS

6

Total

67 observados

q = 1 - p

3) Diversidad alélica (A) = promedio del número de alelos por locus

(2 + 3 + 2 + 1 + 1 + 1 + 1 + 1 + 1 +1) 10

= 1.4 A =

Es la suma de todos los alelos detectados en todos los loci, divididos por el número total de loci

39

alozimas

4) Heterocigosidad observada (Ho): 24/67 = 0.36

Entre poblaciones: 5) Hererocigosidad promedio (H) Ej:

(0.36 + 0.2 + 0.1 + 0.0 + 0.1 + 0.0 + 0.08) H = 7 = 0.12

genotipos

FF

37

FS

24

SS

6

Total

67 observados

Frecuencias genotípicas esperadas , apareamiento al azar, no migración,

mutación o selección poblaciones en equilibrio Hardy-Weinberg

p2 + 2pq + q2

+ A1 A2 p q

A1

A2

p

q

p2 pq

pq q2

A1 A1 A1 A2

A2 A1 A2 A2

A1 A1 2A1 A2 A2 A2

= (p + q)2 = 1

Si la frecuencia de los alelos A1 y A2 es 0.9 y 0.1 Las frecuencia genotípicas esperadas en equilibrio Hardy-Weinberg son:

0.92 + 2 x 0.9 x 0.1 + 0.12 = 1.0

Para saber si la población esta en equilibrio…

40

Las frecuencias observadas se comparan con las esperadas bajo EHW

genotipos

FF

37 p2 0.732

0.5329 0.552

35.7

FS

24 2pq 2x0.73x0.27 0.3942 0.356

26.4

SS

6 q2 0.272

0.0729 0.090

4.9

Total

67 1.00 1.00 1.00

67

Observados

Frecuencias esperadas

observadas

Genotipos esperados (Frecuencias esperadas X 67)

Esta en equilibrio!

tamaño (pb) Intensidad (unidades ABI)

SSRs de maiz

2 alelos 2 alelos 3 alelos

Locus 1 Locus 2 Locus 3

41

...GATAGCTTGAGAGAGAGAGAGACTATTG...

...CTATCGAACTCTCTCTCTCTCTGATAAC...

primer

A1

...GATAGCTTGAGAGAGAGAGACTATTG...

...CTATCGAACTCTCTCTCTCTGATAAC...

A2

...GATAGCTTGAGAGAGAGAGACTATTG...

...CTATCGAACTCTCTCTCTCTGATAAC...

A3

Cuando hay más de dos alelos (microsatélites Tarr et al, 1998):

Heterocigosidad esperada

He=1- pi2

Tres alelos en un locus

He=1-[(p1)2+(p2)2+(p3)2] He=1-[(0.364)2+(0.352)2+(0.284)2]

He=0.663

pi es la frecuencia del alelo ith

Cuando hay más de dos alelos (microsatélites Tarr et al, 1998):

42

El grado de desviación al EHW indica que hay factores externos que afectan a la población

La desviación se determina con indicadores de bondad de ajuste (goodness-of-fit, X2, G-test), para comparar los resultados observados contra los esperados, lo que indicará si las diferencias se deben al azar o no

Las desviaciones a las frecuencias genotípicas esperadas bajo el HWE, nos permiten detectar procesos evolutivos que afectan a la población (ej. endogamia, fragmentación de las poblaciones, migración, selección, etc.)

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1. Descripción de la variación dentro y entre poblaciones

2. Cálculo de relaciones genéticas entre individuos o poblaciones

3. Expresión de las relaciones

Ind5

Ind3

Ind6

Ind4Ind2Ind1

Análisis básico de la diversidad genética

01 02 03 04 05 06

01 0

02 0.56 0

03 0.33 0.33 0

04 0.47 0.26 0.50 0

05 0.32 0.43 0.37 0.28 0

06 0.33 0.56 0.56 0.37 0.46 0

Individuos

M

at

ri

z

de

d

at

os

1 0 1 1 0 1

1 0 0 0 1 1

0 1 1 0 1 0

1 0 0 0 1 1

0 0 1 1 0 0

1 1 1 0 0 0

1 0 1 0 1 1

AMOVA (Excoffier et al, 1992) Análisis jerárquico de varianza. Separa y prueba niveles de diversidad genética

•Diversidad entre grupos de poblaciones •Diversidad entre las poblaciones dentro de grupos •Diversidad entre los individuos dentro de una población

44

Los niveles jerárquicos de la diversidad génica en un AMOVA pueden incluir:

1. Continentes

2. Regiones geográficas dentro de un continente

3. Areas dentro de una región

4. Poblaciones dentro de un área de una región

5. Individuos dentro de una población en un área de una región

algunos programas para análisis

45

Ejercicio 1…