TFM Neurociencias Rodriguez Rodriguez Patricia

PROYECTO FIN DE MASTERMASTER OFICIAL EN NEUROCIENCIASUNIVERSIDAD DE SALAMANCA

TRABAJO REALIZADO EN EL DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA Y BIOLOGA MOLECULAR DE LA UNIVERSIDAD DE SALAMANCA, BAJO LA DIRECCIN DE LOS DOCTORES JUAN PEDRO BOLAOS HERNNDEZ Y NGELES ALMEIDA PARRA.

FORMACIN DE ESPECIES REACTIVAS DE OXGENO POR INTERFERENCIA EN LA EXPRESIN DE LA GLUTAMATOCISTENA LIGASA

PATRICIA RODRGUEZ RODRGUEZ 2009

FORMACIN DE ESPECIES REACTIVAS DE OXGENO POR INTERFERENCIA EN LA EXPRESIN DE LA GLUTAMATO- CISTENA LIGASA

NDICE1. INTRODUCCIN.Pgina 2

- Mitocondria y estrs oxidativo. Pgina 2 - Glutatin (GSH): Funcin biolgica y sntesis.... Pgina 4

2. HIPTESIS Y OBJETIVO...

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3. MATERIAL Y METODOS- Especie ensayada, condiciones del animalario y control de la edad gestacional - Cultivo primario de neuronas.. - Tratamiento con MitoSOXTM. - Transferencia de Western.

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- Transfecciones. Pgina 9Pgina 10 Pgina 10

- Citometra de flujo... Pgina 11 - Anlisis estadstico de los resultados... Pgina 12

4. RESULTADOS Y DISCUSIN..- Disminucin de la expresin de la GCL mediante SiRNA.

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- Cultivo primario de neuronas corticales de rata. Pgina 12Pgina 13

- Citometra de flujo... Pgina 15 - Microscopa... Pgina 16

5. CONCLUSIONES

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6. REFERENCIAS

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1. INTRODUCCINLas enfermedades neurodegenerativas son un grupo de patologas

caracterizadas por la prdida progresiva de neuronas en reas concretas del cerebro. Entre ellas cabe destacar la Enfermedad de Alzheimer, Enfermedad de Parkinson, Esclerosis Lateral Amiotrfica y Enfermedad de Huntington.

Las enfermedades de Alzheimer y de Parkinson son las dos enfermedades neurodegenerativas mas prevalentes. La enfermedad de Alzheimer se caracteriza por una degeneracin cognitiva progresiva. Se observan placas seniles compuestas de pptido beta amiloide y ovillos neurofibrilares constituidos principalmente por protena tau hiperfosforilada. Existe una variante familiar que aparece a edades tempranas, aunque esto solo supone un 5-10% de los casos.(Brundin et al. 2008) (Linazasoro 2008)

La Enfermedad de Parkinson se caracteriza por la prdida de neuronas en la substantia nigra, y la aparicin de inclusiones intraneuronales denominadas cuerpos de Lewy, que son inclusiones citoplasmticas con alfa sinuclena y ubiquitina. A nivel clnico se caracteriza por una serie de defectos motores, como temblor, rigidez y bradicinesia, adems de otra serie de sntomas no motores. Al igual que ocurre con la enfermedad de Alzheimer existen formas familiares en las que estn implicadas al menos 10 loci genticos distintos: PARK1-PARK10 (Olzmann et al. 2004).

- MITOCONDRIA Y ESTRS OXIDATIVOCada vez existen mas evidencias que relacionan los defectos en la funcin mitocondrial y el estrs oxidativo con la patognesis de las enfermedades neurodegenerativas. Se sabe que la mitocondria contribuye al envejecimiento mediante la acumulacin de mutaciones en el DNA mitocondrial y la produccin de especies reactivas de oxgeno (ROS).

La generacin de especies reactivas de oxgeno a partir del oxigeno molecular es un proceso fisiolgico que tiene lugar en las clulas de todos los organismos aerbicos. Entre las principales especies reactivas de oxigeno se encuentran el anin superxido (O2.-) y el perxido de hidrogeno (H2O2) que se presentan en las clulas en concentraciones basales del orden de nanomolar y micromolar, respectivamente

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(Dawson y Dawson 1996). En general, y en el sistema nervioso central (SNC) en particular, el anin superxido se forma in vivo como consecuencia de la reduccin incompleta del oxigeno en la cadena de transporte de electrones mitocondrial, aunque tambin puede generarse por la accin de enzimas como la xantina oxidasa. Su reaccin con la enzima superxido dismutasa (SOD) da lugar a la generacin de H2O2, una sustancia poco reactiva pero con capacidad oxidante. El H2O2 puede generarse adems por la accin de otras enzimas como la monoamina oxidasa (catabolismo de la dopamina). El O2- puede reaccionar en presencia de hierro dando lugar a la formacin de radicales hidroxilo (.OH) mediante la reaccin de Fenton. Asimismo, el H2O2 y el O2- pueden reaccionar entre s, en presencia de cationes metlicos, mediante la reaccin de Haber-Weiss, generando igualmente radicales hidroxilo, que son especies altamente reactivas y oxidantes (Halliwell 1992; Peuchen et al. 1997). (Ver Esquema 1)Cadena de transporte electrnico mitocondrial Xantina Oxidasa

O2.Reaccin de Haber- Weiss.

NO ONOO-

O2 + OH- +

.

OHO2

SOD

OH- + OH

.

Reaccin de Fenton Fe 3+ Fe 2+

H2O2Monoamino Oxidasa

Esquema 1: Generacin de especies reactivas de oxgeno.

Cuando se incrementa la produccin de sustancias oxidantes, o bien se produce una deficiencia en los mecanismos antioxidantes intracelulares, las especies reactivas de oxigeno resultan dainas para la clula. Esta situacin de desequilibrio en la homeostasis redox intracelular, es decir, entre oxidantes y antioxidantes, es lo que se conoce como estrs oxidativo. Los daos celulares producidos por estas sustancias son de naturaleza variada y afectan a la estructura del DNA, de los lpidos de membrana y de muchas protenas. En el sistema nervioso central, se ha descrito la implicacin de las especies reactivas de oxigeno en los efectos txicos y

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neurodegenerativos que tienen lugar en patologas como la isquemia cerebral o las enfermedades de Parkinson y Alzheimer (Halliwell 1992; Moro et al. 2005).

- GLUTATIN (GSH): FUNCIN BIOLGICA Y SNTESIS.El tripptido glutatin (-L glutamil-L-cisteinlglicina) se encuentra ampliamente distribuido en las clulas de animales, plantas y microorganismos. Es el compuesto tilico presente en mayor concentracin en todas las clulas (Meister 1988). Participa en distintas funciones como la detoxificacin de xenobiticos, el mantenimiento de los grupos sulfhidrilo de las protenas en su estado reducido, es cofactor de varias enzimas y constituye la forma de almacenamiento y transporte de la cistena en la clula, pero su funcin ms importante es la de antioxidante intracelular, desempeando un papel crucial en la defensa celular frente al estrs oxidativo y nitrosativo.

En su accin antioxidante, el glutatin puede combinarse de forma no enzimtica con distintos radicales libres como superxido, hidroxilo y xido ntrico, o actuar como donador de electrones en la reduccin de perxidos, en una reaccin catalizada por la glutatin peroxidasa. En ambos casos, el producto final es el glutatin oxidado o disulfuro de glutatin (GSSG) (Dringen 2000). El perxido de hidrgeno, el oxido ntrico y el peroxinitrito reaccionan con el GSH mayoritariamente (>90%) mediante este mecanismo (Radi et al. 1991). El GSSG as formado es el sustrato de la flavoenzima glutatin reductasa que transfiere electrones del NADPH al GSSG, regenerando de esta forma el GSH. El estado redox celular viene determinado por la relacin entre molculas oxidadas y reducidas en la clula. En condiciones normales, el GSH representa el 98% del glutatin total intracelular. Al ser el glutatin el antioxidante mayoritario, incluso la oxidacin de una pequea cantidad de GSH a GSSG, puede producir importantes cambios en el estado redox celular.

Otros compuestos como los xenobiticos, se unen al glutatin por accin de las glutatin- S- transferasas formando aductos de glutatin que se excretan al espacio extracelular (Meister 1988). En el sistema nervioso central, este mecanismo de detoxificacin est presente en astrocitos, pero no en neuronas (Johnson et al. 1993). El GSH y sus aductos se liberan al medio extracelular, donde son metabolizados a travs de reacciones enzimticas catalizadas por la -glutamltranspeptidasa y la dipeptidasa, regenerndose de este modo la glicina y la cistena. Este ltimo es el aminocido precursor limitante de la sntesis de GSH (Sagara et al. 1993). En

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situaciones de estrs oxidativo se produce adems la eliminacin al exterior celular de parte del GSSG formado (Meister 1988).

La concentracin intracelular de GSH es un factor determinante de la vulnerabilidad neuronal al anin peroxinitrito (ONOO-) (Radi et al. 1991; Bolanos et al. 1995) (Bolanos et al. 1996) (Almeida et al. 1998; Clementi et al. 1998). De hecho, la concentracin intracelular de GSH disminuye dramticamente cuando las neuronas se exponen a ONOO- endgeno o exgeno (Bolanos et al. 1995) (Bolanos et al. 1996; Almeida et al. 1998; Almeida et al. 2001). Es ms, el ONOO- nicamente provoca el dao mitocondrial y la subsiguiente muerte celular en los astrocitos cuando en stos se disminuyen drsticamente las concentraciones intracelulares de glutatin (Barker et al. 1996). En este sentido, es importante resaltar que los astrocitos disponen de una alta concentracin intracelular de antioxidantes, como el glutatin (Raps et al. 1989) (Sagara et al. 1993; Bolanos et al. 1995) y vitamina E (Makar et al. 1994), que no poseen las neuronas, diferencia que puede explicar, al menos en parte, la resistencia de los astrocitos frente a la citotoxicidad del ONOO-.

Por otro lado, la activacin del ciclo de las pentosas fosfato por H2O2 (BenYoseph et al. 1996) o peroxinitrito (Garcia-Nogales et al. 2003) incrementa la disponibilidad de NADPH, necesario para la regeneracin de GSH a partir de GSSG.

El glutatin se sintetiza de novo en el citosol celular en dos reacciones ATPdependientes consecutivas, catalizadas por la glutamato-cistena ligasa (GCL, EC 6.3.2.2) y la glutatin sintetasa (GSHS, EC 6.3.2.3) (Ver esquema 2). La primera es limitante y se inhibe por retroalimentacin por producto final (GSH) (Dringen 2000). En sta, el L-glutamato y L-cistena forman L--glutamil-L-cistena (-GC). En la segunda reaccin, la -GC se une a la L-glicina generando GSH.

La GCL es una protena heterodimrica, compuesta por una subunidad cataltica (GCLCat, PM ~ 73000 Da) y una subunidad moduladora (GCLMod, PM ~30000 Da). sta modula la afinidad de la cataltica por los sustratos y los inhibidores, reduciendo as la Km de la GCLCat por el glutamato, e incrementando la Ki para el GSH. Ambas subunidades han sido clonadas y secuenciadas (Yan yMeister 1990; Huang et al. 1993), de forma que estn codificadas por diferentes genes con diferentes localizaciones cromosomales. La expresin de ambas subunidades est poco

coordinada, posiblemente por estar situadas en cromosomas diferentes, de forma que el control de la transcripcin de ambas subunidades es independiente y diferente

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segn los tejidos (Dahl yMulcahy 2001). Ambas subunidades estn unidas mediante un puente disulfuro (Seelig et al. 1984; Chang yChang 1994) (Misra yGriffith 1998) aunque a juzgar por la resistencia frente a tioles, es evidente la presencia de fuerzas no covalentes como decisivas en la estabilidad del dmero (Chang yChang 1994).

L- Glu

GCL- GC

GSHSGSHATP ADP + Pi

L- Cys

ATP

ADP + Pi

L- Gly

Esquema 2: Sntesis de glutatin (GSH)

2. HIPTESIS Y OBJETIVODado que la GCL es la enzima limitante en la biosntesis de novo del GSH, su regulacin es de especial importancia en la defensa celular frente al estrs oxidativo y/o nitrosativo. Por lo tanto, conocer las vas de sealizacin en las que est involucrado el glutation podra ayudar a dilucidar los mecanismos moleculares implicados en la muerte neuronal que se asocia a las enfermedades

neurodegenerativas.

Actualmente, la nica herramienta conocida para estudiar la funcin del glutatin es el compuesto denominado L-butionina-sulfoximina (L-BSO), un anlogo del L-glutamato que inhibe competitivamente la GCLcat. Sin embargo, L-BSO presenta el inconveniente de su inespecificidad, ya que tambin inhibe la glutation sintetasa, e imposibilidad de su uso in vivo, dado que no atraviesa la barrera hematoenceflica. Por este motivo, en el presente trabajo nos planteamos disear e implementar una herramienta molecular, a ser posible ms especfica, que nos permitiera interferir en la biosntesis de glutation en cultivos primarios de neuronas. Con los resultados previsibles pretendemos establecer una herramienta til para el estudio de los mecanismos moleculares implicados en la neurodegeneracin asociada a ciertas enfermedades neurodegenerativas, tales como la Enfermedad de Parkinson.

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3. MATERIAL Y MTODOS- ESPECIE ENSAYADA, CONDICIONES DEL ANIMALARIO Y CONTROL DE LA EDAD GESTACIONAL

Para la realizacin de todos los cultivos se emplearon ratas albinas de raza Wistar, criadas y suministradas por el Servicio de Experimentacin Animal de la Universidad de Salamanca. Los animales se criaron en jaulas manteniendo un ritmo de luz-oscuridad de 12 horas, con fase de oscuridad entre las 20:00 y las 8:00 horas del da siguiente. La humedad oscil entre el 45 % y el 65 % y la temperatura entre los 20 C y los 25 C. Los animales se alimentaron ad libitum con una dieta slida estndar (17 % de protenas, 3 % de lpidos, 58,7 % de glcidos, 4,3 % de celulosa, 5 % de minerales y 12 % de humedad) y tuvieron en todo momento acceso libre al agua de bebida.

La edad gestacional de la rata se control limitndose a una noche el tiempo de cohabitacin de las ratas vrgenes con los machos. A las 9:00 horas de la maana siguiente se separaron aquellas que presentaban espermatozoides en el frotis vaginal, acompaados de clulas epiteliales de la vagina caractersticas del da frtil del estro. Bajo estas condiciones, el periodo de gestacin de la rata se asume que es de 21,7 das.

Todos los tratamientos con animales cumplen con la normativa vigente de la comisin europea del 18.06.2007 (2007/526/CE) y la legislacin espaola (RD 1201/2005) sobre las lneas directrices relativas al alojamiento y cuidado de los animales utilizados para experimentacin y otros fines cientficos, y los protocolos fueron aprobados por el Comit tico para la Experimentacin Animal y Humana del Instituto de Neurociencias de Castilla y Len (INCyL).

- CULTIVO PRIMARIO DE NEURONAS

Para la realizacin del cultivo primario de neuronas se emplearon fetos de rata de 16 das de gestacin (Almeida et al. 1998). Las ratas gestantes fueron anestesiadas con ter etlico y sacrificadas mediante dislocacin cervical.

Posteriormente se extrajeron los fetos mediante una histerectoma. Los fetos se

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trasladaron en una placa petri a una cabina de flujo laminar (TC48, Gelaire Flow Laboratories, McLean, Virginia, EEUU) para garantizar las condiciones de esterilidad del cultivo. Con la ayuda de tijeras, pinzas y papel impregnado en etanol al 70 %, se retir el crneo y se extrajeron ambos hemisferios cerebrales.

El tejido as obtenido se deposit sobre una placa Petri de poliestireno que contena la solucin de disgregacin (NaCl 116 mM, KCl 5,4 mM, NaH2PO4 1,01 mM, MgSO4 1,5mM, NaHCO3 26 mM, glucosa 4 mM, rojo fenol 10 mg/mL, albmina 0,3 % p/v y DNAsa tipo I 20 g/mL a pH 7,2) y, empleando un bistur, se disgreg parcialmente y se dej decantar en un tubo de 50 mL (BD, Falcon, Bedford, Massachussets, EEUU) durante 4 minutos. El sedimento obtenido se resuspendi en la solucin de tripsinizacin (solucin de disgregacin suplementada con tripsina al 0,025 %, p/v) y se incub a 37 C durante 15 minutos, en un bao agitando suavemente cada 2-3 minutos para facilitar la tripsinizacin. Transcurrido este tiempo, la digestin se detuvo aadiendo suero fetal de ternera (FCS; Roche Diagnostics, Heidelberg, Alemania) a una concentracin final del 10 % v/v y el tejido se centrifug a 500 x g durante 5 minutos (Beckman Instruments, Palo Alto, California, EEUU).

El sedimento resultante se resuspendi en 12 mL de la solucin de disgregacin y, para conseguir su disociacin, se hizo pasar 9 veces a travs de una pipeta Pasteur previamente siliconada y con la punta redondeada. Tras dejar reposar la solucin celular durante 4 minutos, se recogi cuidadosamente el sobrenadante conteniendo las clulas disociadas en un tubo de 50 mL. Este proceso se realiz otra vez resuspendiendo el sedimento en 9 mL de la solucin de disgregacin para incrementar la eficiencia. Los sobrenadantes obtenidos se combinaron y las clulas disociadas se centrifugaron de nuevo a 500 x g durante 5 minutos. El sedimento celular se resuspendi primero en 1 mL de DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium; Sigma-Aldrich Chemical Co., Barcelona, Espaa) y, a continuacin, en 20 mL de DMEM, y una pequea alcuota de esta suspensin celular (10 L) se diluy cuatro veces y se mezcl con un volumen igual de azul de tripano (Sigma-Aldrich) al 0,4 % para el recuento celular, empleando para ello una cmara cuentaglbulos de Neubauer (Zeiss, Oberkochen, Alemania) y un microscopio de contraste de fases, modelo CK30 (Olympus, Japn).

Una vez determinado el nmero de clulas, la suspensin se diluy en el medio de cultivo (DMEM suplementado con FCS al 10 %) y se sembraron a una densidad de de 250.000 clulas/cm2 en placas de cultivo (Nunc; Roskilde, Dinamarca) previamente

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recubiertas con poli-D-lisina (10 g/mL; Sigma-Aldrich). Las placas se colocaron en un incubador termostatizado a 37 C (Thermo Forma 310, Thermo-Fisher Scientific, Ohio, EEUU) con una atmsfera saturada de vapor de agua, compuesta por un 95 % de aire y un 5 % de CO2.

A los dos das de cultivo, el medio se cambi por DMEM suplementado con suero de caballo (Sigma-Aldrich) al 5 % v/v, glucosa 20 mM (Sigma-Aldrich). Al cuarto da de cultivo se aadi arabinsido de citosina 10 M (Sigma-Aldrich) para impedir la proliferacin de clulas no neuronales. Las clulas se utilizaron a los 6-7 das de cultivo. Bajo estas condiciones, los cultivos de neuronas mostraron una pureza aproximada del 97-99 %, determinada mediante inmunorreaccin con el marcador neuronal Map-2 (Almeida et al. 2005).

Todos los medios de cultivo se suplementaron con penicilina (100 U/mL), estreptomicina (100 g/mL) y anfotericina B (0,25 g/mL) suministrados por SigmaAldrich.

- TRANSFECCIONESLas transfecciones celulares se realizaron con el reactivo catinico

Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Madrid), siguiendo las instrucciones detalladas por el fabricante. Para reducir la expresin de GCL decidimos emplear la tecnologa del RNA de interferencia. Basndonos en criterios de diseo racional de siRNA (Reynolds et al. 2004), seleccionamos la secuencia mostrada en la Tabla 1, que est dirigida contra la subunidad cataltica de la GCL. Como control empleamos un siRNA dirigido contra la luciferasa, por emplearse de forma rutinaria en nuestro laboratorio (Tabla 1). La concentracin final de siRNA empleada fue de 100 nM. Los dplex siRNAs se adquirieron comercialmente (Dharmacon, Lafayette, Colorado, EEUU).

SiRNA GCL SiRNA Luciferasa

5-GAAGGAGGCTACTTCTATA-3 5-CTGACGCGGAATACTTCGA-3

Tabla 1: Secuencias del SiRNA empleado para disminuir la expresin de la GCL y como control (SiRNA Luciferasa).

Por otro lado, estas mismas secuencias se utilizaron tambin en forma de RNA en horquilla de pequeo tamao o small hairpin RNA (shRNA) mediante el empleo del

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vector de expresin pSuper-neo/GFP (Oligoengine, Seattle, Washington, EEUU). La eleccin de este sistema nos permiti identificar las clulas eficientemente transfectadas por seleccin del marcador (GFP) mediante citometra de flujo. Como es sabido, la estructura en horquilla del shRNA se reconoce por la enzima Dicer, que la digiere en los RNA pequeos de interferencia (siRNA) funcionales. As, tanto por el mtodo del siRNA como del shRNA, la separacin de las hebras del siRNA permite la unin de una de ellas a la secuencia complementaria del RNA mensajero. Como consecuencia se produce la degradacin del mRNA por el complejo RISC, que conduce a una disminucin de la abundancia de la protena.

- TRATAMIENTO CON MITOSOXMitoSOXTM Red es un reactivo derivado de hidroxietidina (HE) que permite detectar de manera selectiva la produccin de anin superxido en clulas vivas mediante citometra de flujo y microscopia confocal. La oxidacin del anin superxido produce la liberacin de un producto fluorescente que se excita a una longitud de onda de 480 nm, con un mximo de emisin de 567 nm. MitoSOXTM Red se dirige especficamente hacia la mitocondria, donde se une al DNA mitocondrial y muestra fluorescencia en funcin del grado de oxidacin. Para el tratamiento con MitoSOXTM Red se lavaron las clulas una vez con el medio Hanks (glucosa 5.5 mM, Ca2+, Mg2+, pH=7.4) a 37 C. Posteriormente se realiz una incubacin con MitoSOXTM Red durante 30 minutos en un incubador termostatizado a 37C. Luego se realizaron lavados nuevamente con Hanks y se tripsiniz con EDTA al 10%. Las muestras as obtenidas se pusieron en tubos de citmetro, centrifugando durante 5 minutos a 500g. El sobrenadante obtenido en la centrifugacin se desech y se realizo un nuevo lavado con 500 L de Hanks, volviendo a centrifugar 5 minutos a 500g. Finalmente, el pellet obtenido se resuspendi en un volumen final de 500 L de Hanks fro y se analiz por citometra de flujo.

- TRANSFERENCIA DE WESTERNPara obtener los extractos proteicos totales, las clulas se lavaron con PBS y se lisaron en tampn de lisis, compuesto por RIPA (SDS al 1 %, EDTA 0,5 M, Triton Tx-100 al 1 % v/v, NaCl 150 mM, Na2HPO4 10 mM a pH 7,0) al que se le aaden inhibidores de proteasas y fosfatasas (aprotinina 50 g/mL, leupeptina 50 g/mL,

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inhibidor de tripsina (soybean) 50 g/mL, TLCK 100 M, NaF 50 mM, ortovanadato sdico 1 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 100 M, N-p-tosil-L-fenilamina

clorometil cetona (TPCK) 100 M, fenantrolina 1 mM y pepstatina A 50 g/mL). Los extractos se hirvieron durante 5 minutos, se centrifugaron a 13.000 x g durante 10 minutos y se recogi el sobrenadante. La concentracin de protenas se determin mediante el sistema BCA (Pierce, Rockwell, Illinois, EEUU).

Las protenas (50 g aprox.) de los extractos obtenidos se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (solucin de acrilamida/bisacrilamida 29/1; BioRad Labortories S.A., Alcobendas, Madrid) al 8 %, con un marcador de peso molecular de protenas (BenchmarkTM, Invitrogen, Carlsbad, California, EEUU), utilizando un sistema de electroforesis vertical (MiniProtean-3, BioRad Laboratories, California, EEUU). Posteriormente, las protenas se transfirieron electroforticamente a membranas de nitrocelulosa (Hybond, Amersham Biosciences) que, tras la transferencia, se bloquearon con leche al 5 % p/v en TTBS (Tris 20 mM, NaCl 500 mM, Tween 20 al 0,1 % v/v a pH 7,5), durante 1 hora. Las membranas se incubaron en la solucin de anticuerpos (TTBS suplementado con BSA al 2 % p/v) que contena el anticuerpo para la GCL (1/500, Abcam, Cambridge, UK) a 4 C durante toda la noche. Tras lavar 3 veces con TTBS, las membranas se incubaron en TTBS con BSA al 2 % en presencia del anticuerpo secundario adecuado; conjugado con la peroxidasa de rbano a 25 C durante 45 minutos.

Finalmente,

las

membranas

se

incubaron

con

el

reactivo

de

quimioluminiscencia SuperSignalTM West Dura (Pierce) y se expusieron a una pelcula Kodak XAR-5 (Sigma-Aldrich).

- CITOMETRA DE FLUJOEl anlisis se realiz utilizando un citmetro de flujo FACScalibur (BD, Bioscences) y los programas CellQuestTM PRO y Paint-A-GateTM

PRO (BD

Bioscences). Se seleccionaron nicamente las clulas que presentaran fluorescencia verde, posteriormente cuantificando la fluorescencia roja debida al MitoSOXTM Red para determinar el incremento de estrs oxidativo en las clulas transfectadas con el RNA para la GCL frente a los controles, transfectados con RNA para la Luciferasa.

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- ANLISIS ESTADSTICO DE LOS RESULTADOSTodos los valores se expresaron como medias S.E.M. (error estndar de la media). La significatividad se determin mediante anlisis de la varianza, seguido del test de la menor diferencia significativa de rango mltiple (para comparaciones mltiples) o el test de la t de Student (para comparaciones entre dos nicos grupos de valores). En todos los casos, un valor de p

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