TransferenciaTransferencia de de polarizacion polarizacion (TP) (TP)

Hasta ahora hemos considerado vectores (magnetizaciones) proporcionales a la sensibilidad de los nucleos en estudio.

En experimentos de pulsos multiples vamos a hacer muchas cosas con un grupo de espines para obtener informacion. Si los nucleos son insensibles, sus efectos en otros nucleos (NOE, acople, etc.) va a ser dificil de ver.

En el caso del APT, miramos 13C y desacoplamos 1H durante el segundo periodo tD. Si consideramos que tenemos efectos NOE, la intensificacion de la seal de carbono sera a lo sumo 4 (H / C). Como hay muchas rutas de relajacion ademas del NOE, esto jamas se da

Que tal si pudiesemos usar el exeso de poblacion del nucleo sensible (1H) y pasarsela a los nucleos menos sensibles (13C, 15N), todo en forma controlda y predecible?

El metodo se llama transferencia de polarizacion, y involucra pasar el gran exceso de poblacion (polarizacion) de los 1H a los nucleos insensibles antes de perturbarlos.

Para entenderlo usamos el diagrama de energias de un sistema de dos espines ligeramente acoplados, y empezamos considerando un sistema homonuclear (1H)...

TP (TP (continuadocontinuado))

Para este diagrama usamos dos 1H que estan ligeramente acoplados y tienen una diferencia grande de s. Los llamo I y S para mantener no se que convencion, e indicamos con un el exceso de poblacion de un estado a otro:

Ahora irradiamos y saturamos una sola de las lineas de los nucleos selectivamente (con una BC). Despues de un tiempo, las poblaciones de esa transicion se igualan:

IS

IS IS

IS

I SS

S

I

I

2 3

1

4 1,2 3,41,3 2,4

I S

S

S

I

I

2 3

1

4

1,2

3,4

1,3 2,4

IS

IS IS

IS

TP - TPS and IPSTP - TPS and IPS

Como cambiamos las poblaciones del sistema de espines, la intesidad de las lineas del espectro lo reflejan. Lo que hicimos fue transferir polarizacion de un nucleo a otro. Lo llamamos transferencia de polarizacion selectiva, or TPS.

Hay una variacion util de la tecnica. Consideren la siguiente secuencia de pulsos:

El pulso gordito es un pulso selectivo de baja potencia. Invierte las poblaciones de una sola de las lineas en el sistema de espines.

S

S

I

I

2 3

1

4

1,2

3,4

1,3

2,4

180s

90

IS

IS IS

IS

TP - TPS and IPS (continuado)TP - TPS and IPS (continuado) Un jemplo practico de esta secuencia usando etilcinamato:

En este caso invertimos cada linea de los 1H olefinicos a y b, y vemos como varian las intensidades de las otras lineas. Hecho a 90 MHz (Anasazi Eft-90).

OEt

OH

H

a

b

b a

TP heteronuclearTP heteronuclear

En este caso, el experimento se llama inversion de polarizacion selectiva, o IPS. De nuevo, la intensdad de las seales se debe a lo que hicimos con las poblaciones del sistema de espines.

A pesar de que podemos usar TPS e IPS para identificar espines en regiones muy complicadas de un espectro 1H, la TP homonuclear no es tan util como la TP heteronuclear. Pensemos en estos experimentos en sistema heteronuclear:

Aca las diferencias de poblaciones entre los niveles reflejan que tenemos un radio de 1 a 4 entre 13C y 1H debido a las diferencias en los radios giromagneticos. Aca es que se empieza a ver porque esto puede ser util

Una cosa que esta mal en el diagrama son las intensidades relativas de las seales. Las dibujamos pensando en el radio de radios giromagneticos, no en la abundancia natural...

CH

CH

CH13C

13C

1H

1H

CH

1

4

3

2

1,2 3,4

1,3 2,4

I S

TP heteronuclearTP heteronuclear - TPS - TPS

Ahora aplicamos TPS e IPS a este sistema y vemos que pasa. Primero TPS

Despues de que saturamos, digamos, la transicion 1,2 vemos las siguientes poblaciones en el diagrama de energias:

Las seales de los dos espines cambian de acuerdo a la variacion de poblaciones, pero ahora una de las transiciones de 13C es tres veces mas grande que al principio. Ahora se pone interesante...

Si consideramos los valores absolutos de las seales, tenemos el doble de seal que en el espectro original...

13C

13C

1H

1H

1

4

3

2

1,2

3,4

1,3

2,4

I SCH

CH

CH

CH

1,2

3,4

1,3

2,4

I S

TP heterocuclearTP heterocuclear - IPS - IPS

Ahora hacemos el mismo analisis para IPS. Si invertimos selectivamente las poblaciones de 1,2, nos da lo siguiente:

Ahora, ESTO SI esta bueno, si consideramos que empezamos con una seal de 13C que era asi:

Manipulando las poblaciones de los protones, obtenemos una intensificacion de 4 en la seal de 13C (considerando seales positivas y negativas).

1,3 2,4

I

13C

13C

1H

1H

1

4

3

2

CH

CH

CH

CH

180s

1H:

13C:

90

tD

{1H}

Modulacion J y TPModulacion J y TP

El aumento en la seal de 13C esta bien, pero todavia hay que lidiar con un espectro 13C que esta acoplado a 1H y que tiene picos para arriba y para abajo. No podemos desacoplar en la adquicision, porque el aumento se debe a los niveles de 1H, que desaparecen si desacoplamos

Lo que hacemos es combinarlo con modulacion J. Consideren la siguiente secuencia de pulsos:

Hacemos que tD sea 1 / 2J. Esto significa que despues del pulso / 2 en 13C y el tD, la magnetizacion de 13C va a haber reenfocado los acoples con 1H. Con vectores

Modulacion J y TP (continuado)Modulacion J y TP (continuado)

Solo consideramos magnetizacion de 13C, porque lo unico que hicimos con 1H es invertir las poblaciones selectivamente el puslo gordito). Despues del puslo / 2 en 13C, tenemos componentes de la magnetizacion de +5 y -3 en :

{1H} {1H}

SIN REENFOQUE CON REENFOQUE ANTES DE DESACOPLAR ANTES DE DESACOPLAR

x

y

x

y

tD = 1 / 2JJ / 2

TP selectiva con pusos durosTP selectiva con pusos duros

Barbaro. Otro problema de la TPS y la IPS es que tenemos que usar pulsos suaves, que en los equipos mas viejos no se pueden hacer. Seria bueno si pudiesemos usar pulsos duros para hacer lo mismo. Dos secuencias de 1H hacen esto.

La primera es selectiva para lineas de 1H que esten en resonancia con los dos pulsos / 2. Notar que los dos pulsos se aplican en el mismo eje:

La otra invierte las poblaciones de un solo proton si el pulso esta en resonancia con el corrimiento quimico del doblete (i.e., en el centro del doblete):

En los dos casos, tD = 1 / 2JCH. Analizamos solo para el primer caso, y el otro se los dejo a ustedes...

9090

tD

90y90x

tD

tD = 1 / 2JCH

tD = 1 / 2JCH

TPS con pulsos duros (continuado)TPS con pulsos duros (continuado)

Despues del pulso / 2, los dos vectores y estan en en eje +x:

Si esperamos 1 / 2JCH segundos, el vector que se mueve mas rapido () se aleja del otro () por radianes. Si en este momento aplicamos el otro pulso / 2, invertimos las poblaciones (los estados y cambian de lugar):

Esta secuencia se puede usar con excitacion de 13C para ver intensificacion de nucleos de 13C enlazados a este proton.

z

x

y

z

x

y

JCH / 2

tD = 1 / 2J

z

x

y

z

x

y

90

TP no-selectivaTP no-selectiva

Otro problema de la TPS y la IPS es que es selectiva, y tenemos que ir de a un 1H por vez. Seria bueno poder hacer todo a la vez, de forma que transfiiriesemos polarizacion de todos los protones a todos los nucleos insensibles (13C o 15N) que esten enlazados.

Una forma de hacerlo es combinando la ultima secuencia de pulsos con un eco de espin con un tD = 1 / 4JCH

El pulso y los dos tDs reenfocan corrimientos quimicos, osea que las poblaciones de todos los 1H en la molecula son invertidas a la vez. El puslo en el nuclo X invierte las marcas y de los 1H:

Ahora el puslo / 2 invierte los vectores y de nuevo al eje z, y tenemos inversion de las poblaciones de 1H.

90

tDtD = 1 / 4JCH

90

tD

x

y

x

y

x

y

1801H18013C tD

1801H & 18013C

TP no-selectiva - INEPTTP no-selectiva - INEPT

Si expandimos esta secuencia un poquito mas obtenemos el INEPT (Insensitive Nuclei Enhancement by Polarization Transfer). Es un una secuencia de pulsos importante que aparece como un bloque en muchas secuencias de pulso mutinucleares.

Es usada para intensificar la seal (polarizacion) de nucleos como 13C, 15N, 29Si, etc. La secuencia es:

Aca X es 13C o 15N. El analizis es el mismo que vimos para protones, mas el pulso / 2 de lectura en el nucleo X para crear (y poder detectar) magnetizacion transversal.

180

180x90x

tD tD

90y

90

1H:

X:

BloqueINEPT

INEPT reenfocadoINEPT reenfocado

Con el INEPT comun aun tenemos el problema de seales +5 hacia arriba y -3 hacia abajo. Seria bueno reenfocar las dos lineas en una, y sabemos que no podemos desacoplar.

Simplemente combinamos el INEPT con un bloque de reenfoque al final (un eco), y detectamos en el eje -y:

Dependiendo del tipo de carbono usamos diferentes s:

CH - = 1 / 4J CH2 - = 1 / 8J

Para que todos los tipos de carbono tengan un aumento similar, usamos 1 / 7J.

180

180x90x

tD

90y

90

1H:

13C:

tD

180x

180

{1H}

[ -y ]

INEPT reenfocado (continuado)INEPT reenfocado (continuado)

Despues del pulso / 2 en 13C, tenemos la magnetizacion de 13C aumentada (+5 & -3) en el plano .

Variaciones de esta secuencia aparecen en todos lados. Con ella podemos transferir polarizacion de y hacia nucleos insensibles (13C, 15N, 29Si, etc., etc.). Tambien la podemos usar para editar los espectros, y para marcar a un nucleo con informacion sobre otros nucleos (s, Js).

Se usa como bloque en casi todas las secuencias de RMN de proteinas que involucran 1H, 15N, y 13C.

x

y

x

y

x

y

18013C 1801H

x

y

INEPT reenfocado (continuado)INEPT reenfocado (continuado)

Un ejemplo con INEPT de 1H a 29Si. Aceite de bomba de difusion Dow 709. Hecho en un Eft-60 (Anasazi):

Espectro de 29Si 1D normal:

Espectro INEPT reenfocado de 29Si:

El acople 2J1H-29Si es ~7 Hz, y el radio 1H / 29Si es 5.

Si

O

Si

O

Si

H3C CH3CH3H3C

Mas transferencia de polarizacion - DEPTMas transferencia de polarizacion - DEPT

DEPT (Distortionles Enhancement by Polarization Transfer) es otra secuencia que toma ventaja del exceso de poblacion de 1H para ver seales de 13C. Es mas, se usa para editar seales y obtener distintas respuestas de carbonos CH, CH2, y CH3 dependiendo de los parametros de la secuencia:

Dezafortunadamente, se basa en la creacion y manipulacion de magnetizacion de cuantos multiples (el pulso / 2 en 13C) que no podemos analizar con vectores.

De cualquier manera, se pueden analizar los resultados para distintos valores de .

90x

180x90x

tD

y

1H:

13C:

tD

180x

{1H}tD

Resultados del DEPT para distintos angulos Resultados del DEPT para distintos angulos Usando como ejemplo datos de la pulegona:

Con = / 2 (90), editamos los carbonos CH:

Con = 3 / 4 (135), distinguimos carbonos CH, CH2, y CH3.

O

MeH

DEPT (continuado) Si graficamos las respuestas de distintos tipos de carbonos en funcion del angulo del pulso de 1H, obtenemos:

Maana empezamos con 2D...

CH2

CH3

CH/2 3/2/4