Dr. DANTE FLORES
H P L C
HIGH –PRESSURE LIQUID-SOLID CHROMATOGRAPHY
CROMATOGRAFIA DE LIQUIDOS DE ALTA RESOLUCION
CROMATOGRAFIA DE LIQUIDOS DE ALTA EFICACIA
VENTAJASVENTAJAS
El proceso cromatográfico es rápido pudiéndose resolver mezclas muy complejas en minutos.
Permite la separación de sustancias termolábiles.
Se puede lograr resolución de sustancias con peso molecular de 54 a 450.000
Diagrama de los componentes Diagrama de los componentes del HPLCdel HPLC
InstrumentaciónInstrumentación
Reservorio de solventes Desgasificador Bomba
Inyector automático Termostato de columna Detectores
Instrumentación Instrumentación
BOMBASBOMBASLos instrumentos de HPLC deben tener un sistema que suministre la presión adecuada, para que se alcance un caudal suficiente a su salida.
•Bombas reciprocas
•Bombas de jeringas o desplazamiento
•Bombas neumáticas o de presión constante
Requisitos para un sistema de bombeo•Generación de presión por encima de 6000 psi
•Flujo libre de pulsaciones
•Intervalo de caudal de 0.1 ml a 10 ml
•Componentes resistentes a la corrosión
Funciones de la bomba Funciones de la bomba
LA BOMBA TIENE TRES FUNCIONES BASICAS
Proveer al sistema un flujo exacto y constanteProveer una fase móvil de composición exactaProveer la fuerza necesaria para impulsar la
fase móvil a través de la columna
Gradiente:
Isocrático
Gradiente de caudal:
Es la variación del caudal durante el proceso cromatográfico.
Muestras de características hidrosolubles
VITAMINAS
INYECTORES
Actualmente se disponen de inyectores automáticos.
Los manuales son:
* Sistema de bucle
* Resistencia hidrodinámico
Volumen de muestra de 5 a 500 ul.
7000 psi
Jeringas Hamilton
COLUMNAS PARA HPLCCOLUMNAS PARA HPLC
Se construyen de acero inoxidable.Presentan una longitud de 10 y 30 cm. El
mas frecuente es de 25 cm.El diámetro es 4 a 10 mm.El tamaño de la partícula de la fase
estacionaria es de 3.5 y 10um
Precolumna
Aumenta la vida de la columna analíticaSatura la fase móvil con la fase
estacionaria.La composición de la fase estacionaria
debe ser semejante a la columna analíticaEl tamaño de partícula es mayor
Precolumna
Clasificación de la columna Clasificación de la columna según su rellenosegún su relleno
En función de su consistenciaSegún la porosidad de las partículas En función de la forma de la partículaEn función del diámetro medio de la
partícula.
Partículas del soporte fijo tomadas con un microscopio electrónico
Columnas Columnas
La parte interna de las columnas presentan surcos concéntricos revestidos con una capa de glicerina para dar uniformidad a la fase estacionaria empacada.
Cromatografía de fase Cromatografía de fase normalnormal
Retardo por interacción de la superficie polar de la fase estacionaria con partes polares de las moléculas.
SIO2, Al2 O3, AMINO,-CN, -NO2
Cromatografia de fase normalCromatografia de fase normal
Heptano, hexano, ciclohexano, cloroformo diclorometano, dioxano, metanol
Separación de sustancias no iónicas apolares hasta semipolares (hidrocarburos --- Ac. Carbónicos)
Cromatografía fase inversaCromatografía fase inversa
Retardo por interacción de la cadena apolar hidrocarbonada de la fase estacionaria con partes apolares de las moléculas de la prueba
Cromatografía fase inversaCromatografía fase inversa
n – octadecilo (RP-18) n-octilo , etilo fenilo polímeros hidrófobos.
Metanol o Acetonitrilo/agua o tampón Separación de sustancias no iónicas
apolares hasta semipolares. Mayor resolución de separación.
Condiciones que debe reunir Condiciones que debe reunir el detectorel detector
Respuesta universal con todos los solutosSensibilidad alta (10-12 – 10-11g/mlRuido de fondo muy bajoCelda del detecto de menor volumenNo debe destruir la muestraDebe ser capaz de funcionar durante mucho
tiempo.
Clasificación de los detectoresClasificación de los detectores
AbsorbanciaFluorescenciaElectroquímicoÍndice de refracciónConductividadEspectrometría de masas
Detector de absorbanciaDetector de absorbancia
Definida por la ley de Lambert-BeerUtiliza lámparas de vapor de mercurioCelda de flujo para 10 ulSon de doble hazDeberá tener regiones electromagnéticas de
la luz ultravioleta y visible.
Detectores de diodos en serie Detectores de diodos en serie photodiode arrayphotodiode array
Detectan dos tipos de compuestos que absorben a distintas longitudes de onda
Los datos espectrales se registran en la memoria del computador en fracciones de segundo.
Proporciona gráficos tridimensionalesSistema de diodos
diodos
Campos de aplicacionCampos de aplicacion
Acidos biliares, colorantes biliaresAlcaloidesAnestésicos locales AnticarcinógenosAnticuagulantesAntimicrobianosAzucareshormonas
LípidosNucleósidos /nucleotidosSustancias cardioactivasVitaminas Extractos de orinaMetabolitos de drogasVenenosPlaguicidas
CREATININA
Benzodiacepinas en suero
Clorodiacepóxido
Benzodiacepinas en suero
Nitracepan
Oxacepan
Diacepan