Actualización en los métodos

diagnósticos de Sífilis

Dr Leonardo Chanqueo Jefe Unidad Infectología & Laboratorio Microbiología

03 de Mayo 2016

Temario

• Introducción y epidemiología

• Test directos

• Test serológicos

• Experiencia local

• Algoritmos de estudio de Sífilis

• Conclusiones

Primary and Secondary Syphilis — Rates of Reported

Cases by Age and Sex, United States, 2014

Microbiología

• Ha sido difícil la determinación taxonómica de las espiroquetas dado que son fastidiosas y no crecen en los cultivos.

• Utilizando 16S rRNA (Paster y cols) agruparon las secuencias de las en un sólo phylum que contiene 5 cluster:

– Treponema

– Spirochaeta

– Borrelia

– Brachyspira

– Leptospira

• Los 4 miembros del género Treponema son morfologicamente identicos y pese a los avances en biología molecular su diferenciación se realiza en base a distribución geográfica, epidemiología, manifestaciones clínicas y hospedero.

– Treponema pallidum subsp pallidum causa Sífilis

– T pallidum subsp pertenue causa Yaws

– T pallidum subsp endemicum causa Sífilis Endémica

– T carateum causa Pinta

Foto Susan Lindsley, CDC

Curr Opin Infect Dis 2015, 28:53 – 60

Curso Natural de una Sífilis no tratada

11th Manual of Clinical Microbiology. Jorgensen JH et al. 2015

Etapas Clínicas de la Sífilis

Normas de Manejo y Tratamiento de las Infecciones de Transmision Sexual (ITS) Ministerio de Salud, Chile, 2008.

Diagnóstico en pacientes con úlcera o lesion (“chancro”)

Peeling et al. / Bulletin of the World Health Organization / 2004 / Vol. 82 / No. 6

Gayet et al. Emerging Infectious Diseases • Vol. 21, No. 1, January 2015

Dark field photomicrograph of

a T. pallidum bacterium CDC

Diagnóstico serológico de Sífilis

• El diagnóstico de sífilis sigue siendo la detección de Ac. no treponémicos (TNT) (cardiolipinas) y Ac. Treponémicos (TT) – Test No Treponémicos (TNT)

• Monitorización o seguimiento de la enfermedad

– Test Treponémicos (TT)

• Confirmación la prsencia de una infección

• La S y E de ambos tests varía: – Según test – Etapa de la enfermedad

Curr Opin Infect Dis 2015, 28:53 – 60

Peeling et al. / Bulletin of the World Health Organization / 2004 / Vol. 82 / No. 6

Test no treponemicos

USR

(Unheated Serum Reagin)

RPR

(Rapid Plasma Reagin)

TRUST

(Toluidine Red Unheated Serum

TEST)

VDRL

(Venereal Disease Research Laboratory)

Test no treponémicos

• Todos son test de floculación cuya interpretación es subjetiva

• Miden los niveles de Ig G/M producidos por el hospedero en respuesta al material lipoideo (ppalmente cardiolipinas) liberado desde las células dañadas

• Cardiolipinas liberadas por la espiroquetas

• Baratas y laboriosas

Muhammad G et al. Clinical and Vaccine Inmunology February 2015 Volume 22 Number 2

Comparación entre el VDRL y RPR

VDRL RPR

Significado Venereal Disease Research

Laboratories

Rapid Plasma Reagin

Antígeno Preparación diaria

Contiene: Cardiolipina-

Colesterol y Lecitina

Contiene cardiolipina,

lecitina, colesterol, 10%

choline chloride, EDTA

Incorpora partículas de

carbón

Preparación No automatizada

Operador dependiente

No automatizada

Operador dependiente

Visualización Microscopica Macroscopica

Sensibilidad

Sifilis primaria

78%

86%

Diagnóstico en LCR Si No

Test no treponémicos

• Todo lo test reactivo debiese ser informado con cuantificación

• Los títulos

– se correlacionan con la actividad de la enfermedad y son utilizados

para seguimiento

– descienden habitualmente después de una terapia exitosa

– habitualmente van descendiendo progresivamente, sin embargo en

muchos pacientes permanecen reactivos (serología residual) en

títulos bajos

• Pacientes con títulos más altos tienen una gran caída en los

controles posteriores

• La evaluación de un paciente debe ser realizada idealmente

con el mismo test y en el mismo laboratorio

Morales-Munera CE, et al. FR - Sifilis: actualizacion en el manejo diagnostico y terapeutico. Actas Dermosifiliogr. 2014

Muhammad G et al. Clinical and Vaccine Inmunology February 2015 Volume 22 Number 2

2014 European Guideline on the Management of Syphilis

Parametro VDRL USR RPR TRUST

Metodo Floculacion Floculacion

Floculacion

Floculacion

Muestras Suero / LCR Suero Suero, Plasma Suero, Plasma

Vol (ul) 50-100 50-100 50-100 50-100

Tiempo de

ejecucion

15 min 15 min 15 min 15 min

FDA Si Si Si Si

Sensibilidad (%)

Primaria 67-78 80 60-86 70-85

Secundaria 96-100 100 100 100

Terciaria 85-95 95 98 98

Especificidad 96-99 98-99 93-99 98-99

Diagnostico de Sifilis

con Test No Treponemico

11th Manual of Clinical Microbiology. Jorgensen JH et al. 2015

Efecto de prozona

• Corresponde a un “Falso Negativo” de la técnica

• Son muestras informadas como “no reactivo”, a menos que la muestra sea diluida

• Ocurre en muestras con altos títulos de Ac

• Principalmente en sífilis secundaria (alrededor de 1-2%), llegando a un 10% en pacientes VIH (+)

Arch Dermatol Vol. 116 Jan 1980

Acta Med Colomb Vol. 39 No 1 2014

South Med J 2004;97(4)

Relación Antígeno/Anticuerpo

Falsos positivos de los test no

treponémicos

• FP agudas (< 6

meses)

– Enfermedades febriles

– Inmunizaciones

– Embarazo

• FP crónicos

– Infección por VHC

– Infección por VIH/SIDA

– Enfermedades autoinmunes

– Drogadicción EV

– Cánceres

– 3ra edad

– Malaria

– Enfermedad de Chagas

– Tuberculosis

– Lepra Felman Y et al. Syphilis Serology Today. Arch Dermatol Vol 116 Jan 1980

Muhammad G et al. Clinical and Vaccine Inmunology February 2015 Volume 22 Number 2

2014 European Guideline on the Management of Syphilis

Falsos positivos : 3 - 40%

Títulos bajos < 1/8

Fig 1. Algoritmo Tradicional para el

diagnostico

TP-PA or TPPA: T. pallidum particle agglutination test

EIA: enzyme immunoassay

CIA: chemiluminescence immunoassay

Test no treponémicos

• Desventajas – Poca Especificidad

– Laborioso

– Subjetivo

– Manual / manipulacion

– Deteccion de etapas mas tardias

– Efecto de prozona

• Ventajas – Alta Sensibilidad

– Bajo costo

– Requiere poco equipamiento

– Util en la monitorizacion de los pacientes

Interpretación de resultados de un TNT reactivo

• Va a depender de la población testeada

• El VPP de un TNT incrementa con la combinación de un TT

• Un TNT realizado en una población de bajo riesgo debe ser confirmado con un TT, dado que puede ser un falso positivo

• Un TNT debe ser también interpretado de acuerdo a la etapa de sífilis sospechada

Test Treponémicos

TTHA /TPPA/ MHA -TP

FTA-ABS

Western Blot / LIA

ELISA / CIA / EIA /IC

Test Treponémicos

• Fueron desarrollados utilizando la cepa de

Nichols de T.pallidum y usando células o

Ag derivados de T.pallidum

• Detectan IgG o IgM según el kit

• Son detectados previo a la detección de

TNT y permanecen de por vida, aún con

terapia exitosa

Muhammad G et al. Clinical and Vaccine Inmunology February 2015 Volume 22 Number 2

Felman Y et al. Syphilis Serology Today. Arch Dermatol Vol 116 Jan 1980

Test de aglutinación indirecta:

TPHA y TPPA

• Los antígenos son extraidos de: – TPHA (Treponema pallidum

hemagglutination assay) • antígenos T. pallidum sobre GR

– TPPA (Treponema pallidum particle agglutination assay)

• antígenos T. Pallidum con partículas de gelatina

• La S y E no son optimas en etapas primarias

• TPPA sería mejor que TPHA, posiblemente debido a la estructura homogénea de las partículas de gel

TPHA Test Principle

Clinical Infectious Diseases 2010;51(6):700–708

MHA-TP (Micro-hemaglutinación indirecta para

Treponema pallidum)

3 4

Pocillo 3 Reactivo control

(GR no sensibilizados)

Pocillo 4 Reactivo Antígeno

(GR sensibilizados)

11th Manual of Clinical Microbiology. Jorgensen JH et al. 2015

• Es una inmunofluorescencia indirecta (IFI)

• Utiliza como Ag un liofilizado de T. pallidum (Nichol´s

strain)

• Previamente el suero del paciente ha sido absorvido

con un sorbente

• Sorbente es un extracto de un T. phagedenis no

patogenico (con el objeto de eliminar la reacción

cruzada con otros treponemas)

• Después de la remoción de los Ac no ligados, se

incuba con un conjugado fluorescente de Ac anti

globulina humana

• Test (+) visualización de espiroquetas fluorescentes al

microscopia

• Es un poco mas sensible que el TPHA y TPPA

• Examen operador dependiente

• Ocasionalmente hay FP (fluorescencia no especifica)

Fluorescent Treponemal Antibody

Absorption (FTA-ABS) test

Western Blotting (WB) & Line

immunoassay (LIA)

• Utilizan antigenos de T.pallidum sobre un gel de poliacrilamida (WB) o en una tira de nylon (LIA)

• Disponibles IgG e IgM

• IgG LIA: TpN47, TpN17, TpN15 y TmpA

• S y E > 98%

BJID 2008; 12(April)

ELISA / CIA / EIA

• Utilizan antígenos recombinantes

• CIA (quimioluminiscencia) & EIA (multiplex bead enzyme immunoassay) son los que tienen un mayor rendimiento

• El desempeño de estos ensayos para screening difiere segun plataforma

• La reproducibilidad sería mejor con la CIA

Clinical Infectious Diseases 2010;51(6):700–708

Fig 2. Algoritmo Reverso para el

diagnostico

TP-PA or TPPA: T. pallidum particle agglutination test

EIA: enzyme immunoassay

CIA: chemiluminescence immunoassay

CID 2010:51 (15 September) • Sen a et al.

• El uso de un algoritmo reverso en el estudio de sífilis podría sobre diagnosticar y además sobre tratar pacientes en algunos circunstancias

• Las recomendaciones de un algoritmo reverso podrían no ser apropiadas en países con patrones diferentes de seroreactividad, sistemas de salud y epidemiología de la enfermedad

• Es necesario realizar mayores análisis y costos asociados a esta forma alternativa de realizar tamizaje dado el incremento en el uso de TT en EEUU

Resultado

ELISA TP Reactivo

VDRL No reactivo

El uso de Las Pruebas Rapidas para Sifilis. Copyright © Organizacion Mundial de

la Salud en nombre del Programa Especial de Investigaciones y Ensenanzas sobre

Enfermedades Tropicales (TDR) 2007

*** En una poblacion de 10.000 habitantes

Fig 3. Algoritmo Reverso para el

diagnostico segun recomendaciones

del ECDC (European Centre for Disease

Prevention and Control)

TP-PA or TPPA: T. pallidum particle agglutination test

EIA: enzyme immunoassay

CIA: chemiluminescence immunoassay

2014 European Guideline on the Management of Syphilis

2014 European guideline on the management of syphilis

© 2014 European Academy of Dermatology and Venereology

(TT): T. pallidum Haemagglutination test

(TPHA), Micro-Haemagglutination Assay for T. pallidum

(MHA-TP), T. pallidum Passive Particle Agglutination test

(TPPA), Fluorescent Treponemal Antibody absorption test

(FTA-abs test), Treponemal Enzyme Immunoassay (EIA),

Chemiluminescence Immunoassay (CIA)

UK Standards for Microbiology Investigations

Syphilis Serology 2015

Historia

paciente

Test y resultado Interpretación Seguimiento

EIA/CIA/MFI RPR TP-PA

Desconocida No reactivo N/A N/A No evidencia serológica

de sífilis

Ninguno, a menos

exista indicación

clínica

Desconocida

Reactivo Reactivo N/A Sífilis no tratada o

recientemente tratada

Ver guías de

tratamiento

Desconocida

Reactivo No reactivo No reactivo

Probable Falso positivo Ninguno, a menos

exista indicación

clínica

Desconocida

Reactivo

No reactivo

Reactivo

Posible sífilis (ej: precoz

o latente) o previamente

tratada

Requiere

evaluación e

historia clínica

Historia conocida

de sífilis

Reactivo

No reactivo

Reactivo o N/A

Sífilis antigua, tratada

exitosamente

No

CIA, chemiluminescence immunoassay; EIA, enzyme immunoassay; MFI, multiplex flow immunoassay

N/A, not applicable

RPR, rapid plasma reagin

TP-PA, Treponema pallidum particle agglutination.

http://www.cdc.gov/std/treetment/2010/

Interpretación y seguimiento siguiendo flujograma reverso

de screening de sífilis

Consideraciones para seguir un

algoritmo

• Volumen de muestras recibidas

• Carga del laboratorio y recursos humanos

• Prevalencia e incidencia de sifilis en la población

• Costos

• Desempeño del test a usar

• Necesidades del clínico

• Recomendaciones locales www.aphl.org

Can J Infect Dis Med Microbiol Vol 26 Suppl A January/February 2015

Muchas Gracias