M a r i n a D e A n d r é s Z a m o r a G r a d o e n I n g e n i e r í a E l e c t r ó n i c a y A u t o m á t i c a I n d u s t r i a l

MARCADOR DE BRECHA MEDIANTE MICROFOTOGRAFÍA SOBRE CÉLULAS EPIDÉRMICAS

CULTIVADAS EN PETRI PARA DETERMINAR EL EFECTO DE

ELECTROTERAPIA

Trabajo Fin de Grado

Estructura

Proyecto de investigación biomédica

Proyecto de ingeniería

Análisis de los resultados

Conclusiones

Preguntas, dudas…

Motivación del proyecto

Colaboración entre la Universidad Politécnica y el Laboratorio del Servicio de Bioectromagnetismo del Hospital Universitario Ramón y Cajal de Madrid.

Automatización de una etapa de análisis y procesamiento de imágenes

de microscopía. Técnica experimental laboriosa, monótona y subjetiva. Solución eficaz y objetiva. Ahorro de tiempo al personal especializado y

perfeccionamiento de las técnicas utilizadas.

Investigación biomédica en Electroterapia

Objetivo del estudio de investigación. • Nivel biológico

¿Qué es la Electroterapia?

Aplicación de energía electromagnética al organismo.

0 Hz - 1.000 Hz (baja frecuencia)

450.000 - 600.000 Hz (alta frecuencia)

Transferencia Eléctrica Capacitiva Resistiva (TECR)

TEC: Transferencia Eléctrica Capacitiva

TER: Transferencia Eléctrica Resistiva

Protocolo de investigación empleado

1. Cultivo o siembra de células epiteliales.

• Queratinocitos humanos.

• Placas Petri. Una semana.

• Cultivos control y cultivos tratado.

2. Realización del surco en la monocapa.

• Micropipeta P1000 o P200.

• Longitud del surco: ~ 2 ó 3 cm.

Protocolo de investigación empleado

3. Dibujo de marcas guía en las placas Petri

Protocolo de investigación empleado

4. Realización de imágenes de microscopia a las cero horas

• Microscopio Nikon. Objetivos 10x.

• Cámara Nikon D90.

• Seis imágenes por placa Seis puntos.

Protocolo de investigación empleado

5. Electro-Estimulación de las placas Petri • Electrodos conectados en serie.

• 50 ó 100 µA/mm2 aplicados en pulsos de cinco minutos cada, aprox., 4 horas.

• Experimentos a cuatro, seis, doce o veinticuatro horas.

6. Obtención de imágenes de microscopía post-tratamiento / Siguiente estimulación

Problemática a resolver mediante procesamiento de imágenes

Estado de la técnica antes de automatizarla.

Medida de un área sobre microfotografías

Objetivos del proyecto de ingeniería

Diseño y búsqueda de algoritmos de procesamiento de imágenes para un determinado tipo de microfotografías.

Interfaz Gráfica de Usuario de uso lo más simple e intuitiva posible. Procesamiento por directorios o carpetas.

Rapidez, precisión y generación/extracción de valores numéricos.

Herramientas para el procesamiento de microfotografías

Image Processing Toolbox

CMEIAS (Center for Microbial Ecology

Image Analysis System)

Instituto Nacional de Salud Mental (NIMH)

MATrix LABoratory

Algoritmos de segmentación y procesamiento

Algoritmo empírico

Algoritmo de segmentación por textura

Algoritmos de segmentación y procesamiento

Algunos ejemplos…

…Los algoritmos también cometen errores

Interfaz de aplicación biomédica.

Posibilidad de intercambiar, de manera sencilla, el algoritmo seleccionado para el procesamiento.

Procesar automáticamente carpetas de microfotografías.

Uso fácil e intuitivo.

Interfaz de aplicación biomédica. Funcionamiento.

Interfaz de aplicación biomédica. Funcionamiento.

Interfaz de aplicación biomédica. Funcionamiento.

Interfaz de aplicación biomédica. Funcionamiento.

Interfaz de aplicación biomédica. Funcionamiento.

Interfaz de aplicación biomédica. Funcionamiento.

Interfaz de aplicación biomédica. Funcionamiento.

Interfaz de aplicación biomédica. Funcionamiento.

Interfaz de aplicación biomédica. Funcionamiento.

Interfaz de aplicación biomédica. Excel.

Herramientas y técnica para el análisis estadístico de datos

ANOVA Simple

Distribución t de Student

Análisis de resultados. Experimentos estimulados a 50 µA/mm2

Porcentaje de superficie de brecha a un tiempo T.

Time = 4 horas

• Variable dependiente: Th

• Numero de observaciones: 164

• Número de niveles: 2 (C = Control = 0, T = Tratado = 1)

CT Casos Media

0 78 58,52

1 66 58,78

Análisis de resultados. Experimentos estimulados a 50 µA/mm2

Porcentaje de superficie de brecha a un tiempo T.

Time = 6 horas

• Variable dependiente: Th

• Numero de observaciones: 69

• Número de niveles: 2 (C = Control = 0, T = Tratado = 1)

CT Casos Media

0 36 42,99

1 33 46,66

Análisis de resultados. Experimentos estimulados a 50 µA/mm2

Porcentaje de cicatrización a un tiempo T.

Time = 6 horas

• Variable dependiente: (0h-Th)/0h*100

• Numero de observaciones: 69

• Número de niveles: 2 (C = Control = 0, T = Tratado = 1)

CT Casos Media

0 36 26,61

1 33 25,07

Análisis de resultados. Experimentos estimulados a 100 µA/mm2

Porcentaje de superficie de brecha a un tiempo T.

Time = 6 horas

• Variable dependiente: Th

• Numero de observaciones: 209

• Número de niveles: 2 (C = Control = 0, T = Tratado = 1)

CT Casos Media

0 106 51,68

1 103 54,47

Análisis de resultados. Experimentos estimulados a 100 µA/mm2

Porcentaje de cicatrización a un tiempo T.

Time = 6 horas

• Variable dependiente: (0h-Th)/0h*100

• Numero de observaciones: 209

• Número de niveles: 2 (C = Control = 0, T = Tratado = 1)

CT Casos Media

0 106 27,64

1 103 24,52

Conclusiones proyecto de investigación

Tiempo (h)

I/sup Variable dependiente Razón F Valor - P

6

50 µA/mm2

Porcentaje de brecha 0,94 0,3348

Porcentaje de cicatrización

0,13 0,7166

100 µA/mm2

Porcentaje de brecha 2,24 0,1362

Porcentaje de cicatrización

2,37 0,1252

En general, no existen evidencias de diferencias significativas al comparar los experimentos control con los tratado.

Una inhibición de la emigración de las células epidérmicas puede afectar favorablemente al proceso general de cicatrización de heridas cutáneas, al evitar problemas originados por el cierre prematuro de la epidermis con respecto a la dermis. Cierre en falso.

Posible tendencia a que existan diferencias significativas en los experimentos estimulados a 100 µA/mm2. A partir de esta intensidad por unidad de superficie, la temperatura aumenta y las células sufren hipertermia.

Conclusiones proyecto de ingeniería

Logro de la automatización de la etapa.

Aplicación informática que facilita el análisis y el procesamiento de imágenes de microscopía.

Implementación de un método medida preciso y objetivo.

Herramienta intuitiva y de fácil uso.

Importante ahorro de tiempo, pudiendo procesar y analizar una cantidad determinada de microfotografías en pocos minutos.

Aporte al gran mundo que engloba lo relacionado con la investigación y el desarrollo.

Publicitación del Congreso de INDIBA

FIN

Rueda de preguntas, dudas…

…¡¡GRACIAS!!