Post on 12-Oct-2020
Recomendaciones técnicas y control de calidad para el rasteo de HPN por citometríade flujo
CURSO DE ACTUALIZACIÓN EN HEMOGLOBINURIA PAROXÍSTICA NOCTURNA
(HPN)
Con la colaboración de:
RECOMENDACIONES Y GUIAS PARA EL RASTREO DE HPN POR CMF
.- Parker et al, Blood 2005
.- Guia HPN da SEHH, 2010 y 2012
.- Borowitz et al, Cytometry B 2010
.- Sutherland et al, Cytometry B 2012
.- Marinov et al. Cytometry B 2013
.-Morado et al. Cytometry B 2017
.-Sutherland et al. Cytometry B 2018
La Citometria de Flujo es en la actualidad el método de referencia para el rastreo y diagnóstico de HPN.
Su objetivo es identifica y cuantificas células con perdida de expresión de GPI (GPI-def).
OBJETIVO
El diseño de los ensayos para el diagnóstico de HPN por citometria requiere responder 4 sencillas preguntas
1. ¿Como?
2. ¿Quien?
3. ¿Qué?
4. ¿Donde?
RASTREO DE HPN POR CITOMETRÍA
1. ¿Como?
2. ¿Quien?
3. ¿Qué?
4. ¿Donde?
FLAER SE HA CONVERTIDO EN EL MARCADOR UNIVERSAL PARA EL RASTREO DE HPN
% d
e mue
stra
s an
alizad
as
Evolución de los marcadores para el diagnóstico de HPN en España y Portugal (22 Labs/≈4,000 muestras)
Rastreo de HPN en leucocitos Confirmación en hematies
0
20
40
60
80
100
CD14 CD16 CD24 CD157 FLAER
2011 2012 2013 2014
0
20
40
60
80
100
CD55 CD59
2011 2012 2013 2014
% d
e mue
stra
s an
alizad
asMorado et al, Clinical Cytometry 2017
¿QUE ES FLAER?
Aerolisina:- Origen:
- Toxina de la bacteria patogénica Aeromonas hydrophila
- Mecanismo:- Se une a GPI formando poros en la membrana
de las células humanas GPI+Proaerolisina modificada:
- Origen: - Variante inactiva (T253/A300C) de la aerolisina
conjugada con un fluorocromo(e.g. FITC, AlexaFluor 488)
Mackenzie et al, J Biol Chem, 32: 22604-22609, 1999
VARIABLE RECOMMENDATIONType of sample Peripheral blood
Cell populations: 1st step Mature neutrophils and monocytes2nd step Red cells
GPI-associated proteins: 1st step CD16 or CD24 on neutrophils and CD14 on monocytes
Alternative: FLAER on neutrophils, monocytesCD16 or CD24 on neutrophils.
2nd step: CD59 on red cells
Additional markers: CD45 and CD64 for the study of leucocytesCD235a and CD61 for the study of rd cells
Ab combinations for WBC CD16(or CD24)-FITC, CD64-PE, CD45-PerCP/PC5, CD14-APCFLAER, CD64-PE, CD45-PerCP/PC5, CD16(or CD24)-APC
Red cell Ab combinations CD235a-FITC, CD59-PE, CD61-PerCP/PC5
Controls Internal controls (positive and negative cell populations
Indications DiagnosisMonitoring
RECOMENDACIONES DE LA SEHH
“Guia de HPN” of the SEHH, 2012
FLAER tiene una positividad muy fuerte tanto enlos neutrofilos GPI+ como en los monocitos GPI+
FLAER-FITC
CD33-PECy7CD45-PerCP
Borowitz et al, Cytometry B, 2010
CD14
-APC
Cy7
CD15
-APC
CD24
-PE
SSC
MonocitosNeutrofilos
Monocitos
Neutrofilos
0
20
40
60
80
100
Negative PNHtest
Positive PNHtest
Reproducibilidad de los resultados ente los participantes en el control de calidad externo para HPN organizado por la SIC (2010-)
% d
e re
sultad
os c
oinc
iden
tes * *
Casos analizados CON FLAER(n=1,210/1,241; 98%)*
Casos analizados SIN FLAER(n=107/118; 91%)
FLAER MEJORA SIGNIFICATIVAMENTE LA REPRODUCIBILIDAD DE LOS RESULTADOS
ENTRE LABORATORIOS
Morado et al, Cytometry B, 2017
FLAER INCREMENTA EL NÚMERO DE CASOS DETECTADOS EN PATOLOGIAS CON BAJA
FRECUENCIA DE CÉLULAS GPI-DEF% d
e ca
os H
PN+
0
10
20
30
40
Hemolysis Cytopenia Thrombosis AA MDS
Casos analizados CON FLAERCasos analizados SIN FLAER
*
*
Morado et al, Cytometry B, 2017
Diagnóstico de HPN: utilidad de FLAER vs marcadores convencionales (anticuerpos)
VENTAJAS:
- Mayor sensibilidad y reproducibilidad.- Marcador común para varias líneas celulares de sangre periférica
LIMITACIONES:
- No es valido para la evaluación de hematies- El uso de FLAER está restringido a HPN y no tiene utilidad
para otras aplicaciones clínicas de la citometría de flujo - Requiere de la evaluación en paralelo de proteínas ancladas por GPI
RASTREO DE HPN POR CITOMETRÍA
1. ¿Como?
2. ¿Quien?
3. ¿Qué?
4. ¿Donde?
EL NÚMERO ABSOLUTO DE CÉLULAS GPI-DEFICIENTES ES MUY VARIABLE, Y EN LOS CASOS SIN HEMOLISIS REPRESENTA CON FRECUENCIA UNA MINORIA DEL TOTAL DE CADA LINEA CELULAR
RBC Neutrophils Monocytes
0%
20%
40%
60%
80%
100%
0%
20%
40%
60%
80%
100%
0%
20%
40%
60%
80%
100%
0 0
1,000
2,000
3,000
4,000
0
1,000
2,000
3,000
4,000
1,000
800
600
400
200
0
1,000
800
600
400
200
GPI-
cells
/uL
GPI+
cells/u
L
% o
f GP
I-ce
lls
AA MDS CYT HEM AA MDS CYT HEM
5,000
AA MDS CYT HEM
AA MDS CYT HEMAA MDS CYT HEM
AA MDS CYT HEM AA MDS CYT HEM
* *
#
#
#
#
#
*
* * ##
*p<0.05 vs. AA; #p<0.05 vs. all the other groups.
AA: Aplastyc Anemia
MDS: Myelodisplastyc
syndrome
CYT: Cytopenia (including
non-hemolytic anemia)
HEM: Hemolysis
Morado M et al, Cytometry B, 2017
0
20
40
60
80
100
% o
f ce
lls
Hernández-Campo PM et al. Transfusion 2008;48(7):1403-14.
El porcentaje de células GPI-deficientes es diferente entre compartimentos celulares y mas
elevado en celulas de linaje mieloide
VARIABLE RECOMMENDATIONType of sample Peripheral blood
Cell populations: 1st step Mature neutrophils and monocytes2nd step Red cells
GPI-associated proteins: 1st step CD16 or CD24 on neutrophils and CD14 on monocytes
Alternative: FLAER on neutrophils, monocytes, lymphs CD16 or CD24 on neutrophils.
2nd step: CD59 on red cells
Additional markers: CD45 and CD64 for the study of leucocytesCD235a and CD61 for the study of red cells
Ab combinations for WBC CD16(or CD24)-FITC, CD64-PE, CD45-PerCP/PC5, CD14-APCFLAER, CD64-PE, CD45-PerCP/PC5, CD16(or CD24)-APC
Red cell Ab combinations CD235a-FITC, CD59-PE, CD61-PerCP/PC5
Controls Internal controls (positive and negative cell populations
Indications DiagnosisMonitoring
Para alcanzar la máxima sensibilidad, la recomendación es realizar el rastreo en monocitos y neutrófilos, que son los
compartimentos con mayor numero de células GPI-deficientes
“Guia de HPN” of the SEHH, 2012
Recomendaciones de la ICCS/ESCCA para el rastreo de HPN
Sutherland et al, Cytometry B, 2018
Entre las proteínas no ancladas por GPI, las guiasinternacionales recomiendad en la actualidad
emplear CD15/CD64/CD45 como marcadores de identificación de monocitos y neutrofilos maduros
RASTREO DE HPN POR CITOMETRÍA
1. ¿Como?
2. ¿Quien?
3. ¿Qué?
4. ¿Donde?
EnzymesAcetylcholinesterase CD73CD157Alkaline phosphatase ADP-ribosyl transferase
Adhesion moleculesCD48 CD58CD66b
Complement regulatory proteinsCD55CD59
ReceptorsCD16
CD14CD87CD90
Red cellsSubpopulations of T & B lymphocytes
Monocytes & neutrophilsNeutrophils
Subpopulations of T lymphocytes, neutrophils
Lymphocytes & monocytes All haematopoietic lineages
Neutrophils
All haematopoietic lineages All haematopoietic lineages
Neutrophils, NK-cells, monocyte-associated dendritic cells
MonocytesMonocytes & neutrophils
Stem cells & subpopulations of T-cells
CELL DISTRIBUTIONPROTEIN
Existen múltiples proteínas ancladas por GPI
PATTERNS OF EXPRESSION
OF GPI-A-AP ON PNH+ VS.
NORMAL CELLS NORMAL
UNIMODAL
MIXED(CD58, CD109)Bimodal & Unimodal
Monocytes
BIMODAL
Neutrophils
Hernández-Campo PM et al. Transfusion 2008;48(7):1403-14.
Solo aquellas con expresión bimodal en pacientes con HPN son útiles para el rastreo de esta enfermedad
0
4
8
12
16
20
24
CD55 CD59 CD16 CD66b CD24 CD157 CD87
* *
*
*
*
*
*
Es importante seleccionar para el rastreo de HPN marcadores reactivos con alta expresión en la
población de células normales
Hernández-Campo PM et al. Transfusion 2008;48(7):1403-14.
Ant
igen
Bin
ding
Cap
acity
(x10
3A
BC
uni
ts)
El clón SY11B5 anti-CD157 presentan una expresión bimodal en pacientes con HPN y elevada
intensidad en neutrófilos y monocitos
NEUTROPHILSGPI-AP- vs Normal
GPI-AP- vs NormalMONOCYTES
Imagen proporcionadapor la Universidad deSalamanca
Las guias actuales proponen realizar el rastreo de HPN en monocitos y neutrofilos combinando FLAER y CD157, con otras proteínas ancladas por GPI
Sutherland et al, Cytometry B, 2018
Recomendaciones de la ICCS/ESCCA para el rastreo de HPN
Rastreo de HPN por citometría empleando los paneles recomendados por ICSS/ESCCA
GPIdeficient
Identificationof monocytes
Identificationof neutrophils
GPIdeficient
GPIdeficient
GPIdeficient
Alexa488 PE PECy5 PE-Cy7
CD235a
FLAER
FLAER
CD59
CD24
CD14
CD15
CD64
CD45
CD45
El resultado del rastreo de HPN por citometría en los leucocitos debe completarse con el estudio de la
expression de CD59 en hematies
Sutherland et al, Cytometry B, 2012 & 2018
GPI proteins
Identificationof RBC
Identificationof WBC
Identificationof monocytes
Identificationof neutrophils
Alexa488 PE PECy5 PE-Cy7
CD235aKC16*FLAER
FLAER
CD59MEM43**
CD24ALB9CD14
RMO52
CD1580H5CD6422
CD45J33CD45J33
No todas las combinaciones de anticuerpos frente a CD235a y CD59 son aptas para el estudio de HPN, y
es conveniente revisar los clones y fluorocromospreviamente testados en las guias de referencia
* Beckman-Coulter; ** Invitrogen
Sutherland et al, Cytometry B, 2012 & 2018
RASTREO DE HPN POR CITOMETRÍA
1. ¿Como?
2. ¿Quien?
3. ¿Qué?
4. ¿Donde?
PROGRAMA DE CONTROL DE CALIDAD EN HPN DE LA SIC: OBJETIVOS PRINCIPALES
-Identificar fuentes communes de variabilidad asociadas con el análisis y la interpretación de los ficheros de rastreo de HPN por CMF.
-Facilitar y promover la educación de los métodos validados para el rastreo de HPN por CMF.
-Aumentar la calidad, reproducibilidad, y el conocimiento de las aplicaciones clinicas del rastreo de HPN entre los laboratorios de citometría clínica
- Incrementar la eficiencia y rentabilidad del rastreo de HPN
-Mejorar el diagnóstico por CMF de HPN en cada laboratorio (de rutina) diagnóstica.
PARTICIPANTES
1er paso:
Rastreo de HPN
2o paso:
Análisishematíes
CENTRO COORDINADOR
Ficheros FCS HPN vs. Normal
(4 envios/añp)
INFORME DERESULTADOS
SIC PNH SEND AROUND SCHEME
CONCLUSIONES
ESQUEMA DEL CONTROL DE CALIDAD DE HPN DE LA SIC
CONTROL DE CALIDA SIC 2010-2018:MUESTRAS PARA RASTREO DE HPN
Participantescoincidentes con la
referencia
- Muestras infiltradas (n=45):
HPN clásica (n=28)HPN subclínica (n=14)Neutrofilos deficientes en GPI(n=1)Monocitos deficientes en GPI (n=1)Mo. GPI-def en SMD (n=1)
100%95%88%80%63%
- Muestras no infiltradas (n=75):
50 casos19 casos6 casos
100%80%-90%
<70%
CONTROL DE CALIDAD HPN 2010-2018
Tipo de muestra
- Sangre periférica (n=2.739)
- Médula osea (n=123)
Total de resultados coincidentes (Casos x centros)
2.650/2.735 (97%)
105/124 (85%)
Diagnóstico
- Muestras normales (n=1.709) - Muestras HPN (n=1.150)
Total de resultados coincidentes (Casos x centros)
1.634/1.709 (96%)1.121/1.150 (98%)
GPI-deficient comparments
- Un compartimentos (n=30)
- Dos o más (n=1.120)
Total de resultados coincidentes (Casos x centros)
25/30 (83%)
1.096/1.120 (98%)
Los laboratorios participantes en el control de calidadexterno de HPN de la SIC detectaban con mayor
frecuencia casos de HPN en su rutina clínicaMuestras HPN detectadas en centros PARTICIPANDO EN EQA (n=164/1.536; 11%)Muestras HPN detectadas en centros que NO PARTICIPAN EN EQA (n=7/182; 4%)
Morado et al, Clinical Cytometry 2017
0
2
4
6
8
10
12% d
e ca
sos
HPN
+
CONCLUSIONES (1)- El rastreo de HPN debería basarse preferentementeen el estudio de los neutrofilos y monocitos maduros deSP, mientras que el estudio de los hematies deberealizarse solamente en casos HPN+ en el rastreo.
- La combinación de FLAER con CD157 para neutrofilosy monocitos simultaneamente, junto con otrosmarcadores convencionales como CD24 ó CD16 paraneutrófilos y CD14 para monocitos es el métodorecomendado en la actualidad para el rastreo de HPNen leucocitos. Para hematies, CD59 es el marcadorrecommendado.
- Actualmente, CD64 es el marcador mas habitual parala identificación de monocitos, mientras que se empleapara neutrofilos CD10 o CD15. Para hematies, CD235ase recomienda como marcador de identificación.
CONCLUSIONES (y 2)
-El rastreo de HPN en SP es altamentereproducible cuando al menos dos líneas celularesestán afectadas, pero podría ser mas complicadocuando se analizan ficheros de médula ósea y/ocuando solo una línea celular está afectada.
-Las estrategias de rastreo con FLAER mejoran laidentificación de células GPI-deficientes,demostrando una mayor reproducibilidad ysensibilidad en la detección de células HPN en casosque presentan con ausencia de hemolisis.
-La experiencia individual adquirida en losprogramas de Control de Calidad Externo aumenta lareproducibilidad de los resultados.