FACULTAD DE MEDICINA HUMANA Y CIENCIAS DE LA

SALUDESCUELA PROFESIONAL DE

TECNOLOGÍA MEDICADOCENTE : Lic. TM. David Mattos

INTEGRANTES:Yakeline Arnado Cáceres

Fabiola loayza oviedo

CITOMETRIA DE FLUJO

INTRODUCCIÓN

La citometría de flujo se inició en la década de los 60 como un importante avance en el proceso de contar y medir el tamaño de partículas o células .

DEFINICIÓN

OPoderosa técnica analítica que mide propiedades de células suspenidas en una vaina de fluido.

Permite la medida simultánea de múltiples características físicas de una sola célula

ANÁLISIS CELULAR MULTIPARAMETRICO

COMPONENTESCOMPONENTES

FLuidosFLuidos

OpticoOptico

ElectrónicoElectrónico

Control de fluidos para establecer un flujo laminar que permita a la suspensión celular atravesar la cámara de flujo. 

Una fuente de excitación y un sistema colección para generar y recoger las señales luminosas.

Láser (Argón con luz monocromática de 488nm , filtros , lentes y detectores. 

Convierte la luz dispersa en señales eléctricas y las procesa para su análisis.

Citometría de Flujo

SISTEMA FLUÍDICO

COMPONENTES DEL EQUIPO SISTEMA ÓPTICO

SISTEMA ELECTRÓNICO

Células en suspensión pasan en “fila india”a través de un volumen

iluminado, donde dispersan la luz láser

y emiten fluorescencia que es colectada,

filtrada y convertida a valores digitales que

son guardados en una computadora.

Citometría de Flujo

FUNDAMENTO-El citómetro permite separar físicamente, poblaciones de células

Se basa en hacer pasar una suspensión de

partículas  (generalmente células) alineadas y de una en una por delante

de un haz de láser focalizado.

Detector FSCDetector FSCDetector FSCDetector FSC

Detector SSCDetector SSCDetector SSCDetector SSC

LaserLaserLaserLaser

Dispersión de luzDispersión de luz

 El impacto de cada célula con el rayo de luz produce señales que corresponden a diferentes parámetros de

la célula y que son recogidos por distintos

detectores.

PARÁMETROS CELULARES MEDIDOS O El tamaño celular relativo ( Forward Scatter o

FSC)

OLa complejidad interna o granularidad relativa (Side Scatter o SSC)

OIntensidades relativas de emisión de fluorescencia

( FL1, FL2, FL3 ,FL4…..etc..)

Citometría de Flujo

FORWARD SCATER – LUZ DIFRACTADA - SE RELACIONA CON LA SUPERFICIE Y AREA CELULARES -SE DETECTA EN EL EJE DE INCIDENCIA DEL LASER

-SE DETECTA EN UN ANGULO DE 90 GRADOS CON EL HAZ DEL LASER

Citometría de Flujo

COMO SE DETECTAN ESTAS

CARACTERISTICASEl citómetro de flujo detecta como las células interactúan con un rayo láser en términos de cómo la célula :O• desvía la luz incidente (parámetros FSC y SSC)O• emite fluorescencia (parámetros FL1. FL2. FL3)

LAS PROPIEDADES DE DISPERSION DE LA LUZ UNA CELULA NOS DA INFORMACION ACERCA DEL TAMAÑO CELULAR Y

GRANULARIDAD

COMO SE DETECTAN ESTAS

CARACTERISTICASO · Generalmente proporcional al

tamaño celularO - Dispersada lateralmente es

proporcional al la complejidad de la estructura celular.

O · Luz es desviada a altos ángulosO · Proporcional a la granularidad de

la célula y su complejidadO · Detectado a 90 grados del eje de

luz incidente.

FLUORESCENCIAO Un fluorocromo es una  molécula química que

absorbe la luz a una determinada longitud de onda (ENERGIA ) energía de excitación y emite a una longitud superior (MENOR ENERGIA) Interacciona con la luz de excitación procedente de el láser. Se utiliza unido a anticuerpos específicos (monoclonales ) para antígenos de la célula. La cantidad de fluorescencia con la cual una célula se tiñe es proporcional a la cantidad de sitios de unión.

Intensidad de fluorescencia y sitios de unión

Intensidad de fluorescencia FITC

Número de eventos

FITC

FITC

FITC

FITCFITC

FITC

FITC

FITC

FITC FITC

Citometría de Flujo

Cómo se obtiene la luz fluorescente.

O · Unión de sitios específicos con anticuerpos marcados con fluorocromos

O · El fluorocromo absorbe energía del láser

O · El fluorocromo libera energía absorbida por :

· Vibración y disipación del calor. · Emisión de fotones a una mayor

longitud de onda llamada  fluorescencia (1,2,3).

Fluorocromos utilizados

Citometría de Flujo

FL1

FL2

FL3FL4

ANALISIS DE DATOS

Los datos colectados se pueden observar:

Histograma

Eventos medidos

FLUORESCENCIA

Citometría de Flujo

HISTOGRAMA

APLICACIONESO Hematología : tipificacion y conteo de células

, reticulocitos y análisis de medula ósea .O Farmacología :estudios de cinética celularO Inmunología :subpoblaciones de

linfocitos ,tipaje tisularO Oncología :Diagnostico y

pronostico ,monitores de tratamientosO Microbiología :diagnostico bacteriano y virico

,estudios de sensibilidad a los antibióticosO Genética : Cariotipo y diagnostico de

portador y diagnostico prenatal.

INMUNOTIFICACIÓNO          Es el proceso para determinar

marcadores expresados en la superficie celular. Esta detección se hace empleando anticuerpos monoclonales antígeno-específicos marcados con un fluorocromo dirigidos al marcardor que queremos evaluar. 

DETERMINACION DE APOPTOSIS MEDIANTE CITOMETRIA DE FLUJO

La apoptosis es la muerte celular programada. Hay varias enzimas implicadas en este proceso celular. Dichas enzimas pueden ser determinadas por citometría de flujo al ser unidas a anticuerpos marcados con fluorocromos (por ejemplo la dipeptidilpeptidasa, calpaina, aminopeptidasa y catepsina D , las dos últimas implicadas en el proceso de apoptosis inducido por citoquinas y expresadas en la superficie celular)

MicrobiologíaMicrobiología

• Determinación del contenido de ADN - ARN.• Determinación del efecto de antibióticos.• Determinación de viabilidad.

Dot Plot mostrando FSC vs Dot Plot mostrando FSC vs SSC de E. coli. SSC de E. coli. Dot Plot mostrando FSC vs Dot Plot mostrando FSC vs SSC de E. coli. SSC de E. coli.

Dot plot de FL1 vs FL3. Las Dot plot de FL1 vs FL3. Las regiones muestran las bacterias regiones muestran las bacterias vivas, dañadas y muertas.vivas, dañadas y muertas.

CFSE

XX

Fluorescencia / célulaFluorescencia / célula

X / 2X / 2 X / 4X / 4

Después del Después del cultivocultivo

BasalBasal

M1

OBJETIVOSO • Identificar y enumerar

subpoblaciones celulares únicas y definidas.

O • Seleccionar y separar físicamente subpoblaciones de células deseadas (por deflección electrostática ; esta tecnología de separación se llama "electronic cell sorting")

O • Medir capacidad funcional de subpoblaciones celulares definidas

VENTAJASO · Análisis de un número estadísticamente significativo

de células ( 1000 a más de 100.000 células).O · Múltiples marcajes de una sola célula.O · Análisis de alto numero de partículas en corto

tiempo (5.000 eventos /seg. ).O · Alta sensibilidad y objetividad.O · Medidas separadas de cada célula (no sólo el

promedio).O · Medidas cuantitativas : discriminación de las células

según la cantidad de marcador.O · Múltiples parámetros : define subpoblaciones

complejas.O · Miles de células por segundo .

DESVENTAJASO · Poca información morfológica de la célulaO · No proporciona información de la localización

celular en un tejidoO · Puede analizar solamente una cantidad limitada de

material (10 millones de células / hora)O · Necesita suspensión de células individuales .O · Costos de la tecnologíaO · Método destructivo.O · Incapacidad de visualizar las células que se

analizan.