Tècniques ràpidespel diagnòstic de la

pneumònia

Andrea Vergara Gómez Dto. Microbiología

Hospital Clínic de Barcelona

20 octubre 2018

¿Por qué tanta urgencia?

Técnicas rápidas disponibles

Perspectivas de futuro

¿Por qué tanta urgencia?

4º

1º

6º

Neumonía Adquirida en la Comunidad (NAC)

Neumonía Intrahospitalaria (NIH)

Neumonía Asociada a la Ventilación Mecánica (VAP)

Neumonía Asociada a Cuidados Sanitarios

Neumonía Adquirida en la Comunidad (NAC)

Neumonía Intrahospitalaria (NIH)

Neumonía Asociada a la Ventilación Mecánica (VAP)

Neumonía Asociada a Cuidados Sanitarios

Neumonía intrahospitalaria: 20 casos/1000 ingresos

1/3 en UCI

>90% NAV

Pico entre los días 5-9 de ventilación

Hospital-acquired pneumonia and ventilator-associated pneumonia: recent advances in epidemiology and managementBarbier et al. Curr Opin Pulm Med. 2013 May;19(3):216-28.

Incidencia de la NAV

Of 87 337 patients staying in an ICU for more than twodays, 8% acquired pneumonia, which in 97.5% of the

cases was associated with intubation.

Source: ECDC, HAI-Net patient-based and unit-based data, 2014

2,6 / 1000 mil días de estancia en UCI

2 / 100 pacientes UCI

5 / 100 pacientes ventilados

6,3 / 1000 días de ventilación mecánica

Incidencia de la NAV

Estudio Nacional de Vigilancia de Infección Nosocomial en UCI (Registro ENVIN-UCI). Informe 2017

Distribución de las infecciones adquiridas en UCI

Estudio Nacional de Vigilancia de Infección Nosocomial en UCI (Registro ENVIN-UCI). Informe 2017

Impacto de la NAV

> duración ventilación mecánica

> estancia UCI

> estancia hospitalaria

> morbi-mortalidad asociada

> $

Dificultades para diagnosticar NAV

Signos clínicos inespecíficos

Radiografía difícil de interpretar

Confirmar con cultivo microbiológico:

Colonización/Infección

Distribución heterogénea en pulmón

Tratamiento empírico

5% NAVM sin diagnóstico etiológico (Informe ENVIN 2017)

Técnicas rápidas disponibles

1-2 días 1-varias semanas1 día 1-2 días

CULTIVO ID ANTIBIOGRAMA TIPAJE

1-2 días 1-varias semanas1 día 1-2 días

CULTIVO ID ANTIBIOGRAMA TIPAJE

CULTIVO

ID +/- INFORMACIÓN SOBRE RESISTENCIAS

1-varias semanas1-2 días 1-2 días

ID + ANTIBIOGRAMA TIPAJE

Métodos moleculares de diagnóstico de infecciones respiratorias. ¿Ha cambiado el esquema diagnóstico? Vila et al. Enferm Infecc Microbiol Clin. 2016;34(Supl 3):40-46

€280–300

€40

€100-120

Laboratory diagnosis of pneumonia in the molecular age.Torres A. Eur Respir J 2016; 48: 1764–1778

LAMPLoop-mediated isothermal amplification

Método de amplificación de ácidos nucleicos simple, rápido y económico

Temperatura constante mediante reacción de “desplazamiento de cadena”

Amplificación y detección en un único paso

Alta eficiencia: 109 copias a partir de <10 en aprox. 1 h

Alta sensibilidad y especificidad

Loop-mediated Isothermal Amplification of DNA (LAMP): A New Diagnostic Tool Lights the World of Diagnosis of Animal and Human Pathogens: A Review. Dhama et al. Pak J Biol Sci. 2014; 17:151-166

4 primers basados en 6 regiones del gen diana: F3c, F2c y F1c en el extremo 3’ B1, B2 y B3 en el extremo 5‘

2 primers opcionales que aceleran la reacción: LF, LB

ForwardInner

Primer

ForwardOuterPrimer

BackwardOuterPrimer

Backward Inner Primer

Enzima

“the hearth of the LAMP”

DNA polimerasa + capacidad de desplazamiento de cadena

Bst polymerase (Bacillus stearothermophilus)(66ºC)Bsm polymerase (Bacillus smithii) (60ºC)

LAMP vs. PCR

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP): A Rapid and Sensitive Tool for Quality Assessment of Meat Products. Kumar et al. Comp Rev Food Sci Food Saf. 2017;16:1359-78.

Métodos moleculares de diagnóstico de infecciones respiratorias. ¿Ha cambiado el esquema diagnóstico? Vila et al. Enferm Infecc Microbiol Clin. 2016;34(Supl 3):40-46

LAMP

Extract Boiling Direct

Sensitivity(%, CI95%)

88.0 (67.7-96.8) 80.0 (58.7-92.4) 80.0 (58.7-92.4)

Specificity(%, CI95%)

95.7 (76.0-99.8) 95.7 (76.0-99.8) 95.7 (76.0-99.8)

PPV(%, CI95%)

95.7 (76.0-99.8) 95.2 (74.1-99.8) 95.2 (74.1-99.8)

NPV(%, CI95%)

88.0 (67.7-96.8) 81.5 (61.3-93.0) 81.5 (61.3-93.0)

LAMP may be useful as a rapid screening tool to detect HSV-1 in BALF

Aceptado en EIMC

Microorganismidentified by

culture

Total nº of samplestested

Concordance Minorerrors

Majorerrors

Comments

S. aureus 19 15 2A,B 2C,D ALAMP: SAUR+SMAL detectedBLAMP: SAUR+PAER detected(GNB in GRAM)C,DCulture: Few cfu SAUR

P. aeruginosa 11 9 - 2E,F ECulture:< 1000cfu PAER, LAMP: SAUR positiveFCulture:<1000cfu PAER, all LAMP negative

S. maltophilia 6 6 - - -

K. pneumoniae 4 2 - 2G GCulture:<1000cfu KPNE (twocases)

E. coli 3 3 - -A. baumannii 2 1 - 1H HCulture:100000ufc ABAU

Negative 7 6 1I - ILAMP:KPNE detected (GNB in GRAM)

Mixed flora 6 3 3J,K,L - JLAMP:PAER detectedKLAMP:SAUR detectedLLAMP:KPNE detected

TOTAL 58 45 6 7Artículo en preparación

LAMP method may be useful to detect the most frequent bacteria causing VAP from BAL samples

Microorganismidentified by culture

Total nº of samplestested

Concordance Minorerrors

Majorerrors

Comments

K. pneumoniae 13 10 3A,B - ALAMP: KPNE + ECOL (two cases)BLAMP: KPNE+PAER

S. aureus 10 7 2C,D 1E CLAMP: SAUR+KPNE DLAMP: SAUR+ECOL ECulture: <1000cfu SAUR

P. aeruginosa 11 9 2F - FLAMP: PAER + ECOL (two cases)

E. coli 8 3 5G,H,I,J - GLAMP: ECOL + PAER HLAMP: ECOL + PAER + SAUR +SMAL ILAMP: ECOL + KPNE JLAMP: ECOL + PAER + SMAL (twocases)

S. maltophilia 2 2 - - -

Polymicrobial 10 3 4 3 See table in supplementary material.

Other 10 7 3K,L,M - KLAMP: ECOL + KPNELLAMP: PAERMLAMP: PAER + SAUR + SMAL

Mixed flora 10 10 - - -

Negative 9 9 - - -

TOTAL 83 60 19 4

Artículo en preparación

LAMP method may be useful to detect the most frequent bacteria causing VAP from AT/BAS samples

The presence/absence of carbapenem-hydrolyzing enzymes was correctly determined

for all isolates in <30 min.

82 Acinetobacter spp: 15 sensibles (OXA-51)19 OXA-40 24 OXA-5820 OXA-233 NDM 1IMP-2

Evaluation of a Loop-Mediated Isothermal Amplification-Based Methodology To Detect Carbapenemase Carriage in Acinetobacter Clinical Isolates. Vergara et al. Antimicrob Agents Chemother. 2014;58:7538–40.

Strain Concentration (cfu/mL)

Eazyplex SuperBugcomplete A (min:seg)

OXA-23 producing A.baumannii 103 14:00102 16:15

OXA-40 producing A.baumannii103 12:50102 13:15

OXA-58 producing A.baumannii103 16:10102 18:30

OXA-23 producing A.baumannii R308 103 11:45102 -

OXA-40 producing A.baumannii R329 103 16:15102 -

OXA-58 producing A.baumannii R80103 20:00102 -

NDM producing A.pitii 103 20:00102 -

NDM producing A.dijkshoorniae 103 18:30102 -

Datos no publicados

Detección directa de carbapenemasas en BAL

Strain Concentration (cfu/mL) Xpert Carba-R (Ct) Eazyplex SuperBug CRE

(min:seg)

NDM producing K. pneumoniae 103 27.2 18:45102 29.3 -

OXA-48 producing K. pneumoniae 103 28.3 18:00102 30.4 -

VIM producing K. pneumoniae 103 28.3 27:00102 31.1 -

NDM + CTXM1 producing E. coli103 27.2 NDM 7:45, CTXM1 6:00

102 30.6 NDM 10:30, CTXM1 8:15

OXA-48 producing E. coli 103 28.3 20:00102 31.3 -

VIM producing E. coli 103 29.1 12:20102 33.5 19:50

KPC + CTXM15 producing E. asburiae

103 30.4 KPC 18:45, CTXM1 14:00

102 33.1 KPC 25:30, CTXM1 26:00

NDM+OXA-48+CTXM1 producing K. pneumoniae

103 NDM 31.4 OXA 31.2 CTXM1 12:00102 NDM 33.4 OXA 33.4 -

NDM+CTXM1 producing K. pneumoniae

103 30.5 NDM 17:00 CTXM1 10:15102 35.4 CTXM1 16:30

KPC producing K. pneumoniae 103 31.1 -102 35.3 -

Detección directa de carbapenemasas en BAL

Datos no publicados

Perspectivas de futuro

Bacterias

Virus

Resistencias

Hongos

Bacterias

Virus

Resistencias

Hongos

Rapid Whole-Genome Sequencing for Detection and Characterization of Microorganisms Directly from Clinical Samples.Hasman et al. J Clin Microb. 2014;52:139-146.

WGS + Metagenómica

Early insights into the potential of the Oxford Nanopore MinION for the detection of antimicrobial resistance genes. Judge et al. J Antimicrob Chemother 2015;70.2775-78

Rapid Pathogen Identification in Bacterial Pneumonia Using Real-Time Metagenomics. Pendleton, K.M. et al. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine 2017;196:1610-12

Rapid Diagnosis of Lower Respiratory Infection using Nanopore-based Clinical Metagenomics. Charalampous et al. bioRxiv 2018

This study demonstrates that nanopore metagenomics can rapidly and accurately characterise bacterial lower respiratory infections when combined with efficient human DNA depletion.

• Se requiere un diagnóstico rápido en los casos de

neumonía.

• El cultivo es necesario, ya que nos permite aislar al

microorganismo causante.

• Las técnicas moleculares son de gran ayuda, aunque

no están exentas de limitaciones.

• La metagenómica (Nanopore) puede suponer un gran

avance en el diagnóstico de la neumonía.