UNIVERSIDAD NACIONALAUTÓNOMA DE MÉXICOFESC CAMPO 1

Profesores: Vargas Martínez María Gabriela Hernández Matamoros Pablo

Equipo: 3

REPORTE DE LABORATORIO:“Práctica convencional de Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución (HPLC). Determinación de clorhidrato de fenilefrina en medicamentos comerciales, mediante una curva de calibración”.

Grupo: 1552Químico Farmacéutico Biólogo

Fecha de entrega: 14 de septiembre del 2006

OBJETIVOS: Conocer los componentes básicos del cromatógrafo de

líquidos de alta resolución (HPLC), así como su manejo y cuidados necesarios.

Seleccionar las condiciones instrumentales óptimas para la cuantificación de Clorhidrato de Fenilefrina en medicamentos comerciales.

Aplicar los conocimientos teóricos adquiridos para efectuar adecuadamente la cuantificación de Clorhidrato de fenilefrina en medicamentos comerciales mediante la realización de una curva de calibración en HPLC.

De manera experimental, conocer las partes que componen al equipo para Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución, así como su funcionamiento mediante su uso en la cuantificación de clorhidrato de fenilefrina en un producto farmacéutico.

Interpretar de manera adecuada el cromatograma obtenido posterior a la lectura de los sistemas para la graficación de la curva de calibración y de ésta manera correlacionarla con la de nuestro analito problema.

ANÁLISIS III

LABORATORIO

Identificar y analizar los parámetros del cromatograma, como tiempo de retardo (tr), ancho de la columna (w) y altura, y de ésta manera obtener matemáticamente el número de platos teóricos y el AEPT, finalizando con su análisis en la interpretación de los resultados.

Concluir de manera concreta si el método de HPLC fue adecuado para la cuantificación de clorhidrato de fenilefrina en la muestra farmacéutica, y de ésta manera obtener el % presente en el problema y establecer si cae el resultado dentro de los límites de aceptación.

INTRODUCCIÓN:

La cromatografía de líquidos de alta eficacia es la técnica analítica de separación y cuantificación más ampliamente utilizado, con unas ventas anuales de equipo de HPLC que se aproximan a la cifra de mil millones de dólares. Las razones de la popularidad de ésta técnica son su sensibilidad, su fácil adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para la separación de especies no volátiles o termolábiles y, sobre todo, su gran aplicabilidad a sustancias que son de primordial interés en la industria, en muchos campos de la ciencia y para la sociedad en general. Algunos ejemplos de éstos materiales incluyen: aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, fármacos, terpenoides, plaguicidas, antibióticos, esteroides, especies organometálicas y una variedad de sustancias inorgánicas.

Con el objeto de alcanzar un caudal de eluyente razonablemente con rellenos de tamaño de partícula entre 2 y 10 µm, que, por otra parte, son comunes en la moderna cromatografía de líquidos, re requieren presiones de cientos de kg-fuerza por centímetro cuadrado. Como consecuencia de estas elevadas presiones el equipo de HPLC debe contar con sistemas de bombeo, que éstos a su vez deben cumplir con ciertos requisitos, como la generación de presiones por encima de 6.000 psi, un flujo libre de pulsaciones, un intervalo de caudales de 0.1 a 10ml/min, el control y la reproducibilidad del caudal mejor del 0.5 por 100 relativo y componentes resistentes a la corrosión (juntas de acero inoxidable o Teflón). Debe subrayarse que las altas presiones que genera las bombas de HPLC no constituyen un riesgo de explosión, debido a que los líquidos no son muy compresibles.

Las columnas para HPLC se construyen de ordinario con tubo de acero inoxidable de diámetro interno uniforme, aunque en algunas ocasiones se encuentran tubos de vidrio de paredes resistentes. La mayoría tiene una longitud entre 10 y 30 cm, en algunas ocasiones se pueden encontrar columnas configuradas con forma helicoidal aunque el resultado es una cierta pérdida de eficacia. El diámetro interno es a menudo de 4 a

10 mm y los tamaños de las partículas de los rellenos más comunes son 5 o 10 µm.

Se han utilizado 2 tipos de relleno: el peculiar y el de partícula porosa; el primero consiste en bolas de vidrio o de polímero, no porosas y esféricas con unos diámetros característicos de 30 a 40 µm, en la superficie de éstas bolsas se depositan una capa delgada y porosa de sílice, alúmina, de una resina sintética de poliestireno-divinilbenceno o de una resina de intercambio iónico. Los típicos rellenos de partículas porosas están formados por micropartículas porosas con diámetro entre 3 y 10 µm y con la menor dispersión posible con respecto a un tamaño determinado. Las partículas son de sílice, alúmina, de una resina sintética de poliestireno-polivinilbenceno o resinas de intercambio iónico, aunque las de sílice son más utilizadas.

En enlace siloxano (Si-O-Si) por medio del cual la fase estacionaria se une al soporte es estable en un intervalo moderado de pH (típicamente 2 a 8). La cobertura aproximada es de 4 µmol de grupos R por metro cuadrado de área superficial del soporte, con muy poca salida de fase estacionaria desde la columna durante la cromatografía. Se obtienen excelentes separaciones con una fase estacionaria ligada sobre partículas microporosas con diámetro de 3 a 5 µm. Es común obtener 50 000 a 100 000 platos teóricos por metro de longitud de columna. Cuando una fase polar está unida al soporte y se utiliza un solvente menos polar como fase móvil, se habla de cromatografía de fase normal, la fuerza eluotrópica del solvente aumenta por la adición de un solvente más polar. El esquema más importante y común en el que se utiliza una fase con enlace no polar y un solvente polar se denomina cromatografía de fase inversa, en este caso, la fuerza eluotrópica aumenta por la adición del solvente menos polar. Esta última permite realizar excelentes separaciones y elimina la formación de colas en los picos asociada con la absorción de compuestos polares por empaques polares.

MATERIALES Y REACTIVOS: 1 vaso de p.p. 250ml 6 matraces aforados de 10ml 1 matraz aforado de 50ml 1 matraz aforado de 25ml 6 pipetas volumétricas: 1ml, 2ml, 3ml, 4ml y 5ml 1 micropipeta de 100µl 1 agitador de vidrio 1 balanza analítica 1 balanza digital 1 cromatógrafo de líquidos de alta resolución 1 pizeta 1 espátula 1 perilla Fase móvil: Ácido acético-Trietanolamina-Agua (1.5:0.5:98)

Reactivo analítico de fenilefrina Agua destilada Agua desionizada Solución oftálmica con clorhidrato de fenilefrina

DIAGRAMA DE FLUJO DEL PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:

Una vez preparadas las soluciones, sigue la preparación de los sistemas:

Sistema 1 2 3 4 5 6Sol. Stock

1ml 2ml 3ml 4ml 5ml -

Sol. Prob.

- - - - - 0.1ml

Aforo 10ml 10ml 10ml 10ml 10ml 50ml

Nota: El sistema 6 (columna sombreada) es el que se describió con los diagramas anteriormente, no se vuelve a diluir.

Preparación de la fase móvil Ácido acético-Trietanolamina-Agua (1.5:0.5:98):

Preparación del problema con la solución oftálmica:SISTEMA #6

Preparación de la solución estándar de

Las condiciones de trabajo son: Tipo de columna: C-18 de 25cm Flujo de fase móvil: 1.5 ml/min

Se procede a la lectura de los sistemas, comenzando del más concentrado al más diluido, para posteriormente leer

150ml agua desion. + 3ml ác. Acético + 1ml trietanolamina

Aforar a 200ml .

Filtrar.

Ultrasonido.

Pesar 25mf fenilefrin

Diluir

Aforar a 25ml

Tomar 1ml

Aforar a 25ml

Tomar 0.1ml de la sol. Oft+álmica

Diluir.

Aforar a 50ml.

Ultrasonido (sonicar).

Equipo de HPLC. Sistema inyector.

RESULTADOS:

Tabla No. 1 Sistema

ppm Tr Área1.3 Área1.3+

1.5W Altur

aN AEPT

1 3.992 1.215

207,424 608,996 0.207 2.9 551.228

0.0272

2 7.984 1.339

429,711 429,711 0.255 5.5 441.164

0.0340

3 11.976

1.330

829,681 829,681 0.345 8.2 237.785

0.0630

4 15.968

1.347

1,124,356

1,124,356

0.344 11.4 245.323

0.0611

5 19.960

1.353

944,076 1,527,266

0.219 14.2 610.699

0.0245

Las gráficas se muestran a continuación.ANÁLISIS DE RESULTADOS:

El cálculo de las concentraciones expresadas en ppm de cada sistema son:

Cálculo de la concentración del stock:

Peso de reactivo analítico de fenilefrina: 25mg.

Para el Sistema 1:

Análogo con los demás sistemas, sólo varía el volumen de alícuota (1ml, 2ml, 3ml, 4ml y 5ml).

Las ecuaciones de las curvas anteriores son:

Tabla No. 2. Ecuación de la curva Área1.3 vs ppm.Curva de calibración de fenilefrina Área1.3 vs ppm

A= 56,664.9 = b r2 = 0.8218B= 54,307.3396 = m Ecuación:

Área=54,307.3396(ppm)+56,664.9r = 0.9065

Tabla No. 3. Ecuación de la curva Área1.3+1.5 vs ppm.Curva de calibración de fenilefrina Área1.3+1.5 vs ppm

A= 144,646.5 = b r2 = 0.8491B= 63,406.4378 = m Ecuación:

Área=63,406.4378(ppm)+144,646.5r = 0.9214

Tabla No. 4. Ecuación de la curva Altura vs ppm.Curva de calibración de fenilefrina Altura vs ppm

A= -0.11 = b r2 = 0.9986B= 0.7139 = m Ecuación:

Áltura= 0.7139(ppm)-0.11r = 0.9993

Podemos observar entre la linealidad de las curvas contempladas con el área, no corresponden con un comportamiento de tipo lineal, aunque los datos de área de 1.3 + 1.5 obtuvieron un coeficiente de determinación ligeramente más grande, debido quizá a que se está contemplando el área bajo toda la curva o pico, sin embargo, en el de área 1.3, sólo se contempla una fracción de área y por lo tanto es más erróneo el análisis.

Sin embargo se decidió trabajar con los datos de altura, ya que podemos observar que el coeficiente de determinación es mayor de 0.98 y por lo tanto tiene un mejor comportamiento lineal, además de que en los cromatogramas se observó claramente como iba ascendiendo la altura con forme la concentración iba aumentando, mientras que en el área, en los sistemas 1 y 5 se observó un doble pico y en los sistemas 2, 3 y 4 sólo se observó 1 solo pico.

En análisis que efectuamos en relación con lo anterior, podemos decir que de cierta manera influyó la fase móvil, ya que para la lectura de los sistemas 1 y 5 que precisamente es el más concentrado y el más diluido, se utilizó un frasco y para los demás sistemas se utilizó otro, aunque teóricamente contienen los mismos componentes en la misma proporción. Podemos decir que probablemente en la fase móvil del primer frasco de lectura tenía menos trietanolamina, ya que al haber menos trietanolamina, quedan grupos –Si-OH sin reaccionar con ésta e interactúan con la fenilefrina, observándose un dato de tiempo de retardo extra, que

precisamente corresponde a aquella pequeña fracción de fenilefrina que se tardó en la columna por interaccionar con ella.

Para haber evitado el error, podríamos hacer 2 cosas, una de ellas es utilizar una columna donde se le halla hecho una segunda reacción para eliminar la interferencia que observamos a causa de los grupos R-Si-OH residuales, o podríamos haber incrementado el pH de la solución de fenilefrina para volverla menos iónica y por lo tanto no interacciona con los grupos R-Si-OH.

Decimos que la fenilefrina interaccionó con dichos grupos ya que como la fenilefrina, por tener nitrógeno, se puede protonar a pH ácido, volverse más iónica y por lo tanto más polar e interaccionar con los grupos polares –OH del grupo R-Si-OH. Sin embargo al aumentar el pH, provocamos que el nitrógeno esté desprotonado y por lo tanto sea menos iónico y menos polar y de ésta manera ya no interacciona con los hidrófilo del R-Si-OH.

Pero como el error estuvo en la fase móvil, quizá la explicación anterior fue lo que pasó. La trietanolamina que también tiene nitrógeno, reacciona con los grupos residuales de R-Si-OH y la vuelve menos polar, y al pasar la fenilefrina no interacciona con ella.

D acuerdo con la siguiente tabla:

Tabla No. 5. Datos estadísticos de tr, N y AEPT.Dato Desviación

estándarPromedio Coeficiente de

variacióntr 0.05148 1.3168 0.039N 153.4347 417.2398 0.3677

AEPT 0.01670 0.04196 0.398

Donde: Tr = tiempo de retardo N = número de platos teóricos AEPT = altura equivalente del plato teórico W = ancho de la base del pico

Donde, de manera sencilla, el tiempo de retardo es aquel tiempo que está presente el analito en la columna, o bien el tiempo que interacciona el analito con la columna. El plato teórico son pequeños equilibrios que se dan dentro de la columna, la cual hace más eficiente cuando el número de platos teóricos es mayor, el fundamente es similar al de destilación fraccionada. La AEPT es con relación a la longitud de la columna. Al tener coeficientes de variación menores al 2.0%, podemos decir que nuestro datos están dentro de los límites de confianza.

Como el área bajo la curva del pico y la altura son proporcionales a la concentración, tomaremos la altura para cuantificar por lo antes mencionado.

Ahora proseguiremos a la cuantificación:

Con los datos de la curva de calibración Altura vs ppm de la Tabla No. 4:

8.65cm x = 12.27 ppm; donde el 8.65 es la altura del pico de nuestro analito problema (fenilefrina9.

Si el marbete decía: Por cada 100ml hay 500mg de fenilefrina.

Por lo tanto: 6.135mg ------ 1 litro X ------ 0.1 litro (100ml) X= 613.5mg

Ahora: 500 mg ----- 100% 613.5mg ----- X X = 122.7%

Por lo visto, no entra dentro de los límites de aceptación 96-105%, sino que se excede dentro de éste intervalo. Lo podríamos considerar como no aceptable debido a que hasta sobrepasa el intervalo, sin embargo el exceso de masa que obtuvimos podría ser a que se utilizó el frasco de fase móvil de la primera lectura, o a que se tomó en cuenta la altura del pico más alto sin tomar en cuenta el doble pico, debido a todos estos factores que influyeron, no podemos decir que el resultado es o no aceptable, ya que los resultados no son confiables porque no se obtuvieron con la misma fase móvil. Sin embargo podríamos decir que podría estar dentro de los parámetros ya que al disminuir el error, podría traer como consecuencia la disminución del % y por lo tanto entraría dentro del intervalo de confianza.

CONCLUSIONES:Concluimos, que se cumplió con la expectativa de la práctica, que fue manejar el equipo de HPLC y en base a los resultados obtenidos, analíticamente cuantificar el contenido de fenilefrina en una muestra farmacéutica, además se conoció las partes de cromatógrafo de líquidos de alta resolución y su funcionamiento, así como aprender como se leen muestras utilizando los pasos adecuados y de ésta manera supimos analizar de manera general un cromatograma, identificando aquellas propiedades que son proporcionales a la concentración para poder cuantificar, como el área bajo la curva del pico y la altura del pico; matemáticamente calculamos datos teóricos como número de platos teóricos y la altura equivalente del plato teórico (AEPT). En base a las datos anteriores, se cuantificó fenilefrina de manera correcta aunque el resultado fue un poco exagerado en el % del contenido de éste en la muestra farmacéutica. Por lo tanto, concluimos que todos los objetivos citados al inicio de éste reporte de laboratorio se cumplieron satisfactoriamente.

OBSERVACIONES:El proceso de sonicación, se realizó para eliminar el oxígeno presente en la disolución, es decir, las posibles burbujas que pudieran estar presente y que por lo tanto alteraría el Tr del analito y de la presión de la bomba. En los datos experimentales se sumó ambas áreas, el de 1.3 y 1.5 ya que podríamos pensar que, como se muestra en la figura, se podría tener un error debido a que el área sombreada se estaría sumando 2 veces, sin embargo, lo que hace el equipo es que en el momento de presentarse un pico (“hombro”), a un costado de otro pico, traza una línea a la mitad de ambos picos y cada valor de área representa a una mitad y por lo tanto si se pueden sumar.

Se llevó a cabo una cromatografía de fase inversa, ya que nuestra columna es no polar por

presentar cadenas de 18 C y una fase móvil polar por presentar agua en una proporción de 98 con respecto a los demás.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS: Harris, D. 1992. Análisis Químico Cuantitativo. Editorial

Iberoamericana. México, D.F. Willard, H. 1991. Métodos instrumentales de análisis. Editorial

Iberoamericana. México, D.F. Skoog, D. A. 2001. Principio de Análisis Instrumental. 5ª Edición.

Editorial Mc Graw-Hill. Madrid, España.