ELECTROFORESIS

INTRODUCCIÓN

Se denomina electroforesis al transporte de partículas en un campo eléctrico. Cualquier ión o molécula cargada eléctricamente migrará cuando se someta a la acción de un campo eléctrico. A un pH determinado, muchas moléculas biológicas poseen carga eléctrica, cuya magnitud depende del pH y composición del medio en que se encuentren. Con técnicas electroforéticas, es posible separar los diferentes componentes de una mezcla de aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos y otras biomoléculas cargadas. En el laboratorio clínico, la aplicación más importante de la electroforesis es la separación de proteínas presentes en el suero, orina y otros fluidos biológicos como el líquido cefalorraquídeo y el líquido sinovial.

HISTORIA

Fue desarrollada por el químico sueco Arne Tiselius; el cual la aplicó al estudio de las proteínas séricas. En 1948 fue galardonado con el premio Nobel por estos trabajos.

¿QUÉ ES LA ELECTROFORESIS?

CLASIFICACIÓN

LA VELOCIDAD DE MIGRACIÓN EN UN SISTEMA ELECTROFORÉTICO ES:

PARÁMETROS QUE INFLUYEN EN LA MOVILIDAD ELECTROFORÉTICA

1) Parámetros externos Campo eléctrico Temperatura

2) Parámetros relacionados con el solvente y con el sistema electroforético

Viscosidad Fuerza iónica La naturaleza de los iones componentes El pH

3) Parámetros relacionados con el soluto La carga La forma y tamaño de los iones

Aquella en la cual las partículas se mueven de forma libre en el medio en el que se encuentran dispersas.

Las sustancias a separar se introducen en un tubo en forma de U, disueltas en un tampón de pH y fuerza iónica adecuados. Se colocan los electrodos en sendos brazos del dispositivo, entre los que se crea un campo eléctrico, provocando que las moléculas de la muestra (por ejemplo: proteínas) cargadas emigren hacia los electrodos de polaridad opuesta.

Electroforesis de frente móvil

ELECTROFORESIS EN GEL

Se lleva a acabo en una matriz polimérica con estructura de gel poroso, cuyos poros contienen una mezcla tampón en la que se lleva a cabo la separación. Se observó que un medio de este tipo puede ejercer una acción de tamiz molecular, retardando la migración de las especies a analizar en diferentes grados, dependiendo del tamaño del por del polímero y del tamaño de los iones a analizar.

La electroforesis capilar se basa en los mismos principios de las técnicas electroforeticas convencionales, pero utiliza condiciones y tecnología distinta que nos permiten obtener una serie de ventajas al respecto

La ventaja de esta técnica es que el capilar de silica fundida que generalmente se cubre con una capa de polimina para darle mayor rigidez y resistencia, tiene una ventaja a través de ella que permite el pasaje de la luz UV de tal manera que la visualización es on-line.

Con esta técnica descripta es posible separar cationes, aniones, proteínas, macromoléculas y sustancias no cargadas en forma simultánea.

Electroforesis capilar

¿DÓNDE SE UTILIZA?

El efecto de tamiz es útil en las separaciones de macromóleculas, tales como proteínas, fragmentos de ADN y oligonucleótidos, que tienen en esencia la misma carga pero distinto tamaño.

La electroforesis bidimensional se basa en separar las proteínas en una mezcla según sus dos propiedades moleculares, una en cada dimensión. El procedimiento más usado se basa en la separación en una primera dimensión mediante isoelectroenfoque y la segunda dimensión según peso molecular mediante electroforesis en poliacrilamida.

Electroforesis bidimensional

ELECTROFORESIS EN CUBETA HORIZONTAL

En papel para aminoácidos u otras moléculas pequeñas.

Soporte de acetato de celulosa para proteínas. Del almidón o agarosa (gel) para proteínas y aminoácidos.

El tampón cubre el gel para evitar que se seque debido al calentamiento sufrido al pasar la corriente.

Soporte impregnado de disolución tampón por capilaridad, disuelve la muestra.

DE FRENTE MÓVIL O LIBRE Las sustancias a separar se introducen en un

tubo en forma de U, disueltas en un tampón de pH y fuerza iónica adecuados. Se colocan dos electrodos en sendos brazos del dispositivo, entre los que se crea un campo eléctrico, provocando que las moléculas de proteína cargadas emigren hacia los electrodos de polaridad opuesta. Las diferentes proteínas se desplazan a velocidades diferentes de acuerdo con sus cargas y coeficientes de fricción respectivos, formándose nubes (o frentes) que se desplazan en la disolución tampón.

ELECTROFORESIS EN CUBETA VERTICAL

Gel de poliacrilamida (no se desliza facilmente) para ácidos nucleicos y proteínas.

Electrolisis continua (un solo tipo de gel).

Electrolisis discontinua ( cuando se utiliza dos geles de distinta constitución).

ELECTROFORESIS EN PAPEL

La electroforesis en papel se emplea principalmente en la separación de sustancias de bajo peso molecular como aminoácidos y péptidos. La difusión que se produce puede disminuirse aumentando la diferencia de potencial entre los electrodos con lo que se reduce el tiempo de desarrollo. Este tipo de electroforesis se denomina de “alto voltaje” también hay electroforesis de “ bajo voltaje que se utiliza en el análisis de mezclas de proteínas que no fueron separadas completamente por cromatografía.

Si el papel es fino, se puede desgarrar con facilidad.

Si el papel es grueso, las bandas se distorsionan.

Se produce interacción entre las proteínas y los grupos hidroxilos de la celulosa del papel, por lo tanto la migración se frena.

Calidad del papel: 90% de celulosa produce absorción de agua y modifica la conductividad eléctrica.

No tiene efecto electro osmótico ánodo-cátodo

Desventajas

DE ZONA

En esta técnica, la muestra está obligada a desplazarse sobre un soporte sólido de papel, celulosa o gel. La pequeña cantidad necesaria de muestra permite que las moléculas migren en discretas zonas o bandas. La electroforesis zonal de biomoléculas cargadas, generalmente se lleva a cabo en una disolución estabilizada con un medio que sirve de soporte.

Papel Filtro Papel Filtro

Método sencillo y rápido

Se usa para la separación de

proteínas oligonucleótidos carbohidratos lípidos

Medios de soporte usados en electroforesis de zona

- +

muestra

muestra

+

fuente de alimentación

fuente de alimentación

cable

cable

-

tampón

tampón

cubeta

cubeta

gel

gel

electrodo electrodo

cátodo ánodo

electrodo cátodo

ánodo

(E. horizontal)

(E. vertical)

EQUIPO ELECTROFORÉTICO

INSTRUMENTACIÓN

GelesGeles

Almidón

Poliacrilamida

Agarosa

Técnica barata, fácil y rápida

Soporte más usado en electroforesis. De alta resoluciónSus componentes son tóxicos

Buena resoluciónSeparación de moléculas grandes con r > 5-10nm (virus, ácidos nucleicos, lipoproteínas

La principal aplicación en la caracterización y análisis cuantitativo de moléculas biológicas, principalmente proteínas, péptidos y aminoácidos. También encuentra aplicación para la separación de otras sustancias bioquímicas (insulina, histonas, fibrinógeno, lipoproteínas, enzimas…). Aplicaciones de los geles de poliacrilamida en electroforesis es la separación de moléculas circulares y lineales de DNA.

APLICACIONES