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ESPECTROSCOPIA DE FLUORESCENCIA, FOSFORESCENCIA Y QUIMIOLUMINISCENCIA MOLECULAR Q.F. ALEX SILVA ARAUJO
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ESPECTROSCOPIA DE FLUORESCENCIA, FOSFORESCENCIA Y
QUIMIOLUMINISCENCIA MOLECULAR
Q.F. ALEX SILVA ARAUJO
ESPECTROSCOPIA DE FLUORESCENCIA, FOSFORESCENCIA Y QUIMIOLUMINISCENCIA
MOLECULAR
GENERALIDADES Aquí se considerarán tres tipos de métodos ópticos relacionados entre sí:
fluorescencia, fosforescencia y quimioluminiscencia. En todos los mencionados, las moléculas de analito son excitadas dando una
especie cuyo espectro de emisión suministra información para el análisis cuali y cuantitativo.
FLUORESCENCIA Tiene lugar por absorción de fotones. Es la radiación UV/Vis que emiten los átomos, o con más frecuencia las
moléculas que se han excitado al absorber radiación. Esta emisión a la que se hace referencia cesa en 0,1µs después de que la
excitación ha terminado.
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FOSFORESCENCIA Tiene lugar por absorción de fotones. Es la radiación UV/ Vis que emiten los átomos, o con más frecuencia las
moléculas que se han excitado al absorber radiación. Esta emisión a la que se hace referencia puede durar varios segundos e incluso
minutos después de que la excitación ha terminado.
Comparación de los métodos de fluorescencia y fosforescencia Ambos son fenómenos considerados de manera general como fotoluminiscencia. La fluorescencia difiere de la fosforescencia en que las transiciones electrónicas
responsables de la fluorescencia no implica un cambio en el espín del electrón. Como consecuencia de lo anterior, la fluorescencia tiene una vida más corta
cesando la luminiscencia casi inmediatamente. Por el contrario, las emisiones de fosforescencia están acompañadas por un cambio en el espín del electrón, lo cual hace que la radiación tarde un tiempo fácilmente detectable después de haber acabado la irradiación.
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QUIMIOLUMINISCENCIA Fenómeno que se basa en el espectro de emisión, con frecuencia en la región
del visible, de una especie excitada que se ha formado en el curso de una reacción química.
En algunos casos, las partículas excitadas son los productos de una reacción entre el analito y un reactivo adecuado (normalmente un oxidante fuerte).
El resultado de lo descrito anteriormente resulta en un espectro característico de un producto de oxidación del analito más que del propio analito.
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INSTRUMENTOS PARA MEDIR FLUORESCENCIA Y FOSFORESCENCIALos diversos instrumentos y sus componentes para la medida de la fotoluminiscencia son similares a los que se encuentran en los fotómetros o espectrofotómetros UV/Vis.
Fuente de lámpara o de
laser
Cubeta de la
muestra
Selector de longitudes de
onda
Detector fotoeléctrico
Sistema de tratamiento y lectura
de señales
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INSTRUMENTOS PARA MEDIR FLUORESCENCIA Y FOSFORESCENCIAComponentes de los instrumentos
Fuentes Teniendo en cuenta que la magnitud de la señal de salida, y por tanto la
sensibilidad, es directamente proporcional a la potencia de la fuente Po, normalmente se utiliza una lámpara de arco de xenón o de mercurio.
La lámpara más corriente para los fluorímetros es la lámpara de arco de mercurio, esta fuente produce líneas muy intensas a 254, 366, 405, 436, 546, 577, 691 y 773 nm. Las líneas individuales se pueden aislar con los filtros de interferencia o absorción adecuados.
Para los espectrofluorímetros, en donde se requiere una fuente de radiación continua, normalmente se utiliza una lámpara de arco de xenón a elevada presión, el espectro de esta lámpara es continuo desde aproximadamente 300 a 1300nm.
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INSTRUMENTOS PARA MEDIR FLUORESCENCIA Y FOSFORESCENCIAComponentes de los instrumentos
Cubetas o compartimentos para la cubeta Para medidas de fluorescencia se utilizan tanto cubetas cilíndricas como
rectangulares fabricadas con vidrio o con sílice. Se debe tener en cuenta el diseño del compartimiento de la cubeta para
reducir la cantidad de radiación dispersada que llega hasta el detector.
Selectores de longitud de onda La mayoría de los espectrofluorímetros están equipados con
monocromadores de red.
Detectores de radiación La señal de fluorescencia típica es de baja intensidad, por tanto se
necesitan factores de amplificación altos para estas medidas. Los tubos fotomultiplicadores y los detectores de diodos se utilizan en
instrumentos de este tipo.
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Diseño de InstrumentosFluorímetros Proporcionan una vía relativamente simple y de bajo coste, utilizan tanto
filtros de interferencia como de absorción, para limitar las longitudes de onda de la radiación de excitación y fluorescencia.
Un fluorímetro típico utiliza una lámpara de mercurio y un par de tubos fotomultiplicadores como detectores.
Espectrofluorímetro
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Componentes de un fluorímetro o un espectrofluorímetro
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Esquema de un espectrofluorímetro
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Esquema de un fluorímetro Q.F. A. Silva A.
Aplicaciones y Métodos Fotoluminiscentes Los métodos fluorescentes y fosforescentes son inherentemente aplicables a
intervalos de concentración más bajos que las determinaciones espectrofotométricas y están entre las técnicas analíticas más sensibles.
El aumento de sensibilidad se alcanza por el hecho que el parámetro que relaciona la concentración en fluorimetría y en fosforimetría se puede medir independientemente de la potencia de la fuente.
Estos métodos son de una a tres veces más sensibles a los correspondientes espectrofotométricos.
Sin embargo en términos de precisión y exactitud los métodos espectrofotométricos son dos a cinco veces mayores que los correspondientes fotoluminiscentes.
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Aplicaciones y Métodos Fotoluminiscentes
Determinación fluorimétrica de especies inorgánicasSon de dos tipos: métodos inorgánicos fluorimétricos directos que implican la formación de un quelato fluorescente y la medición de su emisión y un segundo grupo que se basa en la disminución de la fluorescencia que resulta de la acción atenuadora de la sustancia que va a ser determinada.
Determinación fluorimétrica de especies orgánicasEl número de aplicaciones del análisis fluorimétrico a especies orgánicas y bioquímicas es muy amplio e incluye una variedad de compuestos orgánicos,enzimas, agentes medicinales, productos naturales, esteroides y vitaminas.La sensibilidad y selectividad del método lo hace una herramienta valiosa en el campo de análisis farmacéutico, clínico y de productos naturales
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Para mejorar nuestro conocimiento debemos aprender menos y contemplar más. René Descartes
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