Expoquimia 2011: Forum Biotech - JC Vidal

APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES

Uso de aptámeros en biosensores

8 -Marzo-2.011

Aptámeros

Juan C. Vidal


I. Aptámeros y Biosensores : II. Transducción de masa : III. Aptasensores ópticos : IV. Aptasensores electroquímicos :

ÍNDICE

● QCM ● AFM

● SPR ● Fluorescencia

● Aptabeacons ● Microarrays

SELEX, Transd.+Rec., vs Ab, Spielgelmers, Plegamientos

● Voltametría ● EIS

Índice

Uso de aptámeros en biosensores


BIOSENSOR

I. Aptámeros y Biosensores


Características ideales de un biosensor


• Alta sensibilidad (ppb / ng mL-1) • Alta selectividad

• Alta fiabilidad • Tiempo vida largo

• Bajo coste • Tiempo corto análisis

• Pretratamiento muestra innecesario • Manejo sencillo

• Tiempo real • Portátil

• Automatizable • Miniaturizable

• Pequeño requerimiento operativo • Capacidad de multi-análisis

APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES APLICACIÓN DE APTAMEROS EN BIOSENSORES

Biosensores analíticos

BIOSENSORES • Ópticos

• Electroquímicos

• T. Masa (QCM) • Catalíticos (enzimas) • De afinidad (aptámeros, anticuerpos, DNA, Receptores, tejidos, MIPs…)

Biosensor: Transductor + Elemento de bio-reconocimiento selectivo I. Aptámeros y Biosensores

Bioreactivo inmovilizado

Transductor


Selección de aptámeros: SELEX

Aptámeros

(DNA o RNA)

Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment

o SELEX convencional (1990)

o SELEX mejorado (ej. CE-SELEX)

o SELEX automatizado (1998)


(Librería combinatoria inicial 1013-1015 OLN;

In-vitro transcription; modific. quím.;

Selecc. negativa;Post-SELEX)


Aptámeros vs. Anticuerpos


Tamaño 6X: accesibilidad L, difusionabilidad,

cinética (superf. sólidas), nº L inmovilizados,

FP / EIS / SPR, Arrays

Aptámeros Anticuerpos

Afinidad μM - pM μM - pM

Especificidad Alta Alta

Síntesis In-vitro In-vivo (inmunización)

Dianas Moléc. tamaño grande-peq. Moléc. con inmunorespuesta

Réplicas Misma molécula (síntesis) Variaciones (pAb)

Modif. química Sencilla / Afinidad Limitada

Desnaturalización Reversible Irreversible

Tiempo de vida Largo Limitado

Nucleasas, pleomorfismo, simplicidad 5-25 kDa

vs

150 kDa


Spiegelmers / Aptámeros modificados

• “Mirror-image aptamers” (1996<)

• Síntesis de L-nucleósidos

(en lugar de D-enantiómeros)

• Mínima toxicidad e inmunogenicidad

Nucleósidos modificados (1994<) (no reconocidos por nucleasas). Post(Pre)-SELEX.


Noxxon Pharma AG


Plegamiento de los Aptámeros

Estabilización: puentes de H, hidrofobicidad, atracciones iónicas, interacciones dipolares (Van der Waals)

• Especificidad • Espaciadores • Disoluc. reguladoras • Iones • Regeneración

(Estructuras terciarias; Señal: Fluoróf. / MTC)


Transducción

II. III y IV. Transducción


Transducción de masa (I)

II. Transducción de masa

QCM

S ~ 0,5 nM (3 ng cm-2),

IgG, Regenerac. (2002)

• Efecto piezoeléctrico

• NO ETIQUETADO (t. real)

• f0 ~ 5 MHz, 10 MHz


Transducción de masa (II)

Flexible micro-cantilevers (2004)

Interferometría (“surface-stress” Apts >> Abs)

3-32 nm differential bending (Gold)

2x (referencia – ads. inespecífica)

Ej.: hepatitis HVC virus helicase (100 pg mL-1)

AFM II. Transducción de masa S ~ 1-100 nM Thbr

50 x 150 μm


Resonancia de Plasmón Superficial (SPR)

III. Aptasensores ópticos

SPR ~ 10 pg/mm2

QCM ~ 1 ng/mm2

Afinidad (y cinética) aptámero-diana en tiempo real, sin etiquetado (2001)

Sistemas de flujo (Biacore)

Kd (afinidad)


Aptasensores de fluorescencia (FP)


Fibra óptica-avidina+bi-RNA-Apt, L-adenosina (μM) (1998)

• Anisotropía fluorescente: F. luz Polarizada • Tamaños Ab-Apt => cambio difusión rotacional, onda evanescente • Etiquetado fluorescente del aptámero • Gran sensibilidad (LOD 0,7 amol ThBr, 3 órdenes magnitud; 10 min.) • También cinética y Ka´s (en disolución, no immovilizados)


Aptamer microarrays


• Spotting” • Multianalito (1998, FP) • Somalogic (LOD 10 fM) • FP (fibras ópticas) • Bi-Apt + av-agarosa

Lisozima + HIV + Ricina (glass-slides) (LODs 320 ng mL-1) (Ellington, 2004)


Aptamer molecular beacons - FP

Aptabeacon: F*-Apt-F*(Q*) (hairpin) (1996)

• Versatilidad frente Ab’s • Composición disoluciones • En disolución (no inmovilizac. Apt) • No regeneración

F*-Q*

F*-F*

FRET Mayor sensibilidad

(ej. thrombin pM) (TBA, 2002)

Cocaine (dye displac.) III. Aptasensores ópticos


Aptasensores electroquímicos

IV. Aptasensores electroquímicos

•DPV, CRA, SWV, LSV, … •EIS

ELAA (<1 nM) (2005)

TBA (CNTs)

(*): enz., MB, NPs

•S~20-200 mM (LOD ≤ 1 nM)

Desplazamiento


Aptasensores: sandwich / competitividad


Sandwich: => necesidad de 2º Apt*/Ab* y epitopo

• Conjugaciones previas

• No influye el cambio conformacional (3D)

• Ensayo directo o indirecto (o sobre MBs)

Competitividad o desplazamiento: => Necesidad de Ag*

LODs ~ 0,5 pM

ELONAs (~ ELISAs)


Espectroscopía de Impedancia e-

EIS (2005)


• No etiquetado (difus. externa) • Sensibilidad (Ab’s) • Modulac. carga Apt.(-) • IgG (Ferric.), hairpin, (2-100 nM, LOD 0,1 nM) • Medida rápida (10-90 min.)


Electrochemical aptabeacons


•Etiqueta electroquímica (mediador) •Regeneración (immovilizac.) •“Reagentless” (as SPR, QCM) •No “contaminación óptica” •Cuádruple / helix-junction •Grandes cambios conformac. (Prot.)

Ejemplos:

TBA, 15 mesh, MB, DPV, nM-μM, G-quad. (2002)

Cocaína, MB, 3-stem, DPV, LOD 10 μM (2006)

Señal ON / Señal OFF


Aptasensor electroquímico de OTA (ejemplo)


Determination of OTA in wheat flour

DPV

LODs: 0,10 ng mL-1 OTA UE < 3-5 ppb´s

http://www.conecultachiapas.gob.mx/noticias/imagenes/1262006_0716_cacao.jpg


Aptasensores: ejemplos


• Factor Xa (p-Thbr=>Thbr) • 2 Apt* (FM - híbrido) • LOD 50 pM

Aplicaciones Aptasensores: Drogas, proteínas, peq. molec., Thrombina, fact. coagulac., Vit. B12, Aminoácds., Citoquinas, fact. crecim., IgG, toxinas, HIV, Bi/Av, Dip-stick assays (ej. embarazo, micotoxinas)

Cocaína (500 μM)

(3-way-juntion)

Platelet PDGF

NPs (CNTs, QDs)


Gracias por su atención !!

Prof. Juan R. Castillo (GEAS – Chairman) Prof. Juan C. Vidal (GEAS) Lcda. Alba Ezquerra (GEAS) Dra. Laura Bonel (Capher IDI SL) Lcda. Susana Hernández (Capher IDI SL)

Aptasensores (inmunosensores) electroquímicos:

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