INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CARACTERIZACIÓN …
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Centro de Desarrollo de Productos Bióticos CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA DE LOS PROCESOS DE DESDIFERENCIACIÓN Y REDIFERENCIACIÓN DE EXPLANTES FOLIARES DE CEMPAXÚCHIL T E S I S Que para obtener el grado de Maestría en Ciencias en Desarrollo de Productos Bióticos PRESENTA: I.B.Q. LETICIA BETSAIDA RÍOS SALOMÉ DIRECTORES DE TESIS: DRA. ALMA ANGÉLICA DEL VILLAR MARTÍNEZ DR. ANDRÉS CRUZ HERNÁNDEZ YAUTEPEC, MORELOS; NOVIEMBRE 2009
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
Centro de Desarrollo de Productos Bióticos
CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA DE LOS
PROCESOS DE DESDIFERENCIACIÓN Y
REDIFERENCIACIÓN DE EXPLANTES FOLIARES DE
CEMPAXÚCHIL
T E S I S
Que para obtener el grado de Maestría en Ciencias en Desarrollo de Productos Bióticos
PRESENTA:
I.B.Q. LETICIA BETSAIDA RÍOS SALOMÉ
DIRECTORES DE TESIS:
DRA. ALMA ANGÉLICA DEL VILLAR MARTÍNEZ
DR. ANDRÉS CRUZ HERNÁNDEZ
YAUTEPEC, MORELOS; NOVIEMBRE 2009
Después de un tiempo uno aprende la sutil diferencia entre sostener una mano y encadenar el alma, que el amor no significa recostarse y una relación no significa seguridad... ..y uno empieza a aprender que los besos no son contratos y los regalos no son promesas; y uno empieza a aceptar sus derrotas con la cabeza alta y los ojos abiertos... …y uno aprende a construir todos sus caminos en el hoy, porque el terreno de mañana es demasiado inseguro para planes... y los futuros tienen una forma de caerse a la mitad …con el tiempo te das cuenta de que los amigos verdaderos son contados, que valen mucho más que cualquier cantidad de dinero y que el que no lucha por ellos, tarde o temprano se verá rodeado sólo de amistades falsas …con el tiempo aprendes que las palabras dichas en un momento de ira pueden seguir lastimando a quien heriste durante toda la vida ..con el tiempo te das cuenta de que cada experiencia vivida con cada persona es irrepetible …con el tiempo comprendes que apresurar las cosas o forzarlas a que pasen, ocasionará que al final, no sean como esperabas …con el tiempo te das cuenta, de que en realidad lo mejor no era el futuro, sino el momento que estabas viviendo justo en ese instante. …con el tiempo verás, que aunque seas feliz con los que están a tu lado, añorarás terriblemente a los que ayer estaban contigo y ahora se han marchado.
…con el tiempo aprenderás que intentar perdonar o pedir perdón, decir que amas, decir que extrañas, decir que necesitas, decir que quieres ser amigo, ante una tumba ya no tiene ningún sentido. Pero desafortunadamente... Sólo con el tiempo…
Jorge Luis Borges
DEDICATORIAS
A mi mamá…
Por enseñarme a arriesgarme y por demostrarme que hay que ser valiente a pesar de las
circunstancias. Gracias por brindarme siempre cariño, apoyo y por confiar en mi…Te
quiero … La adversidad alimenta el valor, nadie puede ser valiente
si en la vida no le han sucedido cosas maravillosas….
A mi papá….
Por que siempre has creído en mi, por tus palabras de aliento, por apoyarme en todas mis
decisiones…gracias…te quiero…lo sabes… Gracias, por que han sido parte importante de todos mis logros, por que con sus consejos y apoyo incondicional he logrado salir adelante cuando según yo, ya no hay mucho por hacer…
A Oswaldo y Andrea…
Como hermanos y amigos, los mejores, gracias por su apoyo, su paciencia, por soportarme
tanto y por estar siempre conmigo…los quiero muchísimo!!!!!
Aunque no siempre estemos juntos,
no olviden que yo estaré siempre allí…
A mi Cris…
Por que cambias mi día con el solo hecho de recordar tu sonrisa y por que desde que estas
aquí, eres un motivo más de alegría en nuestra casa… para ti que ocupas gran parte de mi
corazón desde mucho antes que llegaras…
Esperanza, fuerza, vulnerabilidad, inocencia, futuro, pureza,
amor, confianza.... eres dueño de todo eso, y más…
A mis amigos
Ene, Lau y Carlos
por su paciencia, por la gran amistad que hemos fortalecido a través del tiempo, por todas las cosas que hemos aprendido, por tener siempre una sonrisa para mi y por que a pesar de todo seguimos aquí, caminando juntos…
A Vero R y Vero P
por el gran apoyo que han sido durante todo este tiempo, por los consejos, por compartir momentos buenos y por estar cerca en los momentos difíciles, por contagiarme de su serenidad y por las palabras de aliento…
A Dul, Jan e Isra
por tantos ratos de carcajadas y por que no solo compartimos un espacio de trabajo, si no experiencias y buenos momentos que me llevo conmigo.
Gracias a todos por la compañía durante mi estancia, a pesar de estar tan lejos …
AGRADECIMIENTOS A la Dra. Alma Angélica Del Villar Martínez, gracias por la oportunidad
que me dio con este proyecto de seguir formando parte del Laboratorio de Biología Molecular, que me ha dejado tantas y muy agradables experiencias. Gracias por brindarme apoyo, orientación, por la confianza, las palabras de aliento y las sugerencias para terminar este trabajo.
Al Dr. Pablo Emilio Vanegas Espinoza, con toda sinceridad, muchas
gracias por el apoyo brindado, por el tiempo invertido, no solo en revisar trabajos, si no en escuchar y aconsejar…gracias por la asesoría, la confianza, por la amistad, por el interés que siempre demostró… y gracias también por los ratos de bromas y risas que hicieron mas agradable el trabajo en el laboratorio.
…estas son “gracias, gracias…”
Al Dr. Andrés Cruz Hernández, por las observaciones, recomendaciones,
sugerencias y por aceptar formar parte de este proyecto.
Al Dr. Antonio R. Jiménez Aparicio y al Dr. Adrián G. Quintero
Gutiérrez por su asesoría, apoyo y el interés demostrado durante todas las
juntas para la revisión del trabajo.
Al Dr. Javier Solorza Feria, por sus atinadas observaciones durante la
revisión de la tesis.
A la Dra. Mercedes Bonfill Baldrich, la Dra. Rosa María Cusidó y el
Dr. Javier Palazón por su apoyo, consejos y por su desinteresada asesoría
durante mi estancia en el Laboratorio de Fisiología Vegetal de la Universidad de Barcelona. También gracias a los alumnos del laboratorio que hicieron más agradable el trabajo y me ayudaron a conocer un poco más de lo bueno de
Barcelona: Susana Mangas, Miriam Onrubia y Oscar Expósito.
A mis compañeros del Ceprobi: Oscar, Rodo, Karina, Ana María,
Hipólita, Giovanni, Julián, María Luisa, Saúl, Meli, Raúl, Paul,
Norma, Roberto, Nadia, Caro … por el apoyo y la complicidad durante el
transcurso de la maestría.
A Elvia, Vane, Toñita, Gloria, Michel, Margarito, Marce, Lety,
Sarita, Rolando, Gerson… por que de una u otra forma, tuve su apoyo
durante este tiempo.
El presente trabajo se realizó bajo la dirección de la Dra. Alma Angélica Del Villar
Martínez y el Dr. Andrés Cruz Hernández en el Laboratorio de Biología Molecular y
el Laboratorio de Microscopía y Análisis de Imágenes del Departamento de
Biotecnología del Centro de Desarrollo de Productos Bióticos del Instituto
Politécnico Nacional; parte del trabajo experimental se desarrolló en el Laboratorio
de Biotecnología de Alimentos del Departamento de Biotecnología y Bioquímica
del Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del IPN Unidad Irapuato; en
la Central de Instrumentación de Microscopía de la Escuela Nacional de Ciencias
Biológicas del Instituto Politécnico Nacional y se realizó una estancia de
Investigación en el Laboratorio de Fisiología Vegetal de la Facultad de Farmacia
de la Universidad de Barcelona.
Para la realización de los estudios se contó el apoyo económico de la beca
CONACYT (212610), beca del Programa Institucional de Formación de
Investigadores (PIFI). La investigación fue realizada con el financiamiento
económico de los proyectos de la Secretaría de Investigación y Posgrado SIP
2009 0744 y SIP 2009 0787 y la Beca-Tesis Terminal del IPN Institucional para la
conclusión del trabajo.
[i]
CONTENIDO
PÁGINA
ÍNDICE DE TABLAS
iv
ÍNDICE DE FIGURAS
v
ABREVIATURAS vii
I. RESUMEN
1
II. ABSTRACT
3
III. INTRODUCCIÓN
4
IV. REVISIÓN DE LITERATURA
6
4.1 Cultivo de tejidos vegetales (CTV)
6
4.1.1 Medios de cultivo
6
4.1.2 Reguladores de crecimiento vegetal (RCV) 9 4.1.2.1 Auxinas 11 4.1.2.2 Citocininas
11
4.2 Proceso de desdiferenciación in vitro
12
4.3 Organogénesis in vitro
13
4.4 Embriogénesis somática
14
4.5 Aplicaciones del CTV
16
4.6 Microscopía en el CTV
17
4.7 Tratamiento digital de imágenes (TDI)
19
4.8 El cempaxúchil como modelo de estudio
20
4.8.1 Importancia y usos del cempaxúchil
20
4.8.2 Antecedentes de CTV en cempaxúchil
23
[ii]
V. JUSTIFICACIÓN
26
VI. OBJETIVOS
27
6.1 Objetivo general
27
6.2 Objetivos específicos
27
VII. MATERIALES Y MÉTODOS
28
7.1 Material vegetal
28
7.2 Métodos
28
7.2.1 Establecimiento del cultivo in vitro de cempaxúchil
28
7.2.2 Inducción del proceso de desdiferenciación de explante foliar de cempaxúchil
29
7.2.3 Tratamiento digital de imágenes del proceso de desdiferenciación
29
7.2.4 Inducción del proceso de rediferenciación en cempaxúchil
32
7.2.4.1 Organogénesis en explantes de hoja
33
7.2.4.2 Embriogénesis somática en explantes de hoja y callo
34
7.2.5 Análisis histológico
35
VIII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
37
8.1 Establecimiento del cultivo in vitro de cempaxúchil
37
8.2 Inducción del proceso de desdiferenciación de explante foliar de cempaxúchil
37
8.3 Morfometría del proceso de desdiferenciación en cempaxúchil utilizando tratamiento digital de imágenes
39
8.4 Inducción del proceso de rediferenciación en cempaxúchil
47
8.4.1 Organogénesis en explantes de hoja
47
8.4.1.1 Análisis cualitativo del proceso de organogénesis
52
8.4.2 Embriogénesis somática en explantes de hoja y callo 55
[iii]
8.4.2.1 Inducción de la embriogénesis somática con TDZ
55
8.4.2.2 Inducción del proceso de embriogénesis con ANA y BA
57
8.4.2.3 Inducción del proceso de embriogénesis con 2,4-D y BA
60
8.5 Análisis histológico del proceso de desdiferenciación
63
8.6 Análisis histológico del proceso de rediferenciación (organogénesis)
73
VIII. CONCLUSIONES
79
IX. PERSPECTIVAS
81
X. BIBLIOGRAFÍA
82
[iv]
ÍNDICE DE TABLAS
PÁGINA
Tabla 1. Efecto del AIA y BA sobre la producción de brotes a partir de explantes de hoja de cempaxúchil
49
[v]
ÍNDICE DE FIGURAS
PÁGINA
Figura 1. Totipotencia de las células vegetales
7
Figura 2. Respuestas generalmente observadas de los explantes en cultivo in vitro por efecto de las auxinas y citocininas
10
Figura 3. Imágenes de embriogénesis somática y de formación de callo tomadas con distintos tipos de microscopios
18
Figura 4. Inflorescencias de cempaxúchil (Tagetes erecta)
21
Figura 5. Procesamiento de imágenes y referencias utilizadas para la medición de los parámetros
31
Figura 6. Fotomicrografías de los explantes cultivados en medio MS con 2,4-D (2 mg/L) y BA (2 mg/L) durante el proceso de desdiferenciación
38
Figura 7. Valores de área y perímetro de los explantes de hoja durante el proceso de desdiferenciación en un periodo de 20 días
41
Figura 8. Valores para la dimensión fractal del perímetro de los explantes de hoja
43
Figura 9. Valores correspondientes al factor elíptico de los explantes de hoja
45
Figura 10. Etapas de desarrollo del explante durante el proceso de desdiferenciación
46
Figura 11. Brotes formados en medio MS con AIA y BA durante el proceso de organogénesis después de 10 días de siembra
51
Figura 12. Imágenes del proceso de organogénesis en explantes foliares de Tagetes erecta
53
Figura 13. Desarrollo del explante foliar durante el proceso de organogénesis
54
Figura 14. Explantes de hoja sembrados en medio MS adicionado con tres diferentes concentraciones de TDZ
56
[vi]
Figura 15. Explantes de hoja en medio MS adicionado con TDZ y ácido ascórbico
58
Figura 16. Formación de radículas en explantes de callo después de 21 días de siembra en medio MS con TDZ
59
Figura 17. Raíces formadas en explantes de hoja y callo en medio con ANA y BA
61
Figura 18. Explantes de hoja y callo en medio MS con 2,4-D y BA para la inducción del proceso de embriogénesis
62
Figura 19. Micrografías de un corte transversal de hojas de cempaxúchil cultivadas in vitro
64
Figura 20. Micrografías de un corte transversal de hojas de cempaxúchil después de 4 días en medio para inducción de callo
65
Figura 21. Micrografías de células de explantes de hoja de cempaxúchil después de 4 días en medio para inducción de callo
66
Figura 22. Micrografías de un corte transversal de hojas de cempaxúchil después de 10 días en medio para inducción de callo
68
Figura 23. Micrografías de un corte transversal de explante de hoja de cempaxúchil después de 15 días en medio para inducción de callo
69
Figura 24. Micrografías del proceso de desdiferenciación
72
Figura 25. Micrografías de un corte transversal de explante de hoja de
cempaxúchil después de 4 días en medio para inducción de
organogénesis
74
Figura 26. Micrografías de un corte transversal de explante de hoja de
cempaxúchil después de 9 días en medio para inducción de
organogénesis
76
Figura 27. Micrografías del proceso de organogénesis
77
[vii]
ABREVIATURAS
2,4-D Ácido 2,4-diclorofenoxiacético a Almidón A Área ABA Ácido abscísico AIA Ácido indolacético AIB Ácido indolbutírico ANA Ácido naftalenacético BA Benciladenina B5 Medio Gamborg y col., 1968 CFB Capacidad de formación de brotes CIN Cinetina cl Cloroplastos CTV Cultivo de tejidos vegetales d Día Dfp Dimensión fractal de perímetro dms Diferencias mínimas significativas ec Espacios intercelulares FE Factor elíptico Fig. Figura g Gramos GA3 Acido giberélico h Hora kg/cm2 Kilogramo/centímetro cuadrado kV Kilovoltios L Litros lm Lámina media m Mitocondria MEB Microscopía electrónica de barrido MET Microscopía electrónica de transmisión mg Miligramos mg/L Miligramos/Litro min Minutos ml Mililitros mm Milímetros mm/d Milímetros/día mm2 Milímetros cuadrados mm2/d Milímetros cuadrados/día MS Medio Murashige y Skoog, 1962 n Núcleo nm Nanómetros OsO4 Tetraóxido de osmio P Perímetro pc Pared celular
[viii]
pH Potencial de Hidrógeno Picloram Ácido 4-amino -3,5,6-tricloropiridin-2-carboxílico pm Parénquima en empalizada ps Parénquima esponjoso p/v Peso/volumen re Retículo endoplásmico RCV Reguladores de crecimiento vegetal TDI Tratamiento digital de imágenes TDZ N-fenil-N´1,2,3-tidiazolil-5-urea uid A Gen que codifica para la β-glucuronidasa v Vacuola v/v Volumen/volumen ZEA Zeatina µA Velocidad específica de crecimiento del área (mm2/d) µP Velocidad específica de crecimiento del perímetro (mm/d) º C Grados centígrados % Porcentaje
[1]
I. RESUMEN
El cempaxúchil (Tagetes erecta) tiene una gran importancia a nivel industrial debido
a los pigmentos que acumula. En este trabajo se estudiaron los procesos de
desdiferenciación en medio MS, adicionado con bencialdenina (BA) y ácido 2, 4-
diclorofenoxiacético (2,4-D); y, de formación de brotes (organogénesis) en medio MS
adicionado con BA y ácido indol-3-acético (AIA), a partir de explantes de hoja. Se
capturaron imágenes de cada uno de los procesos diariamente durante 10 y 20 días
(organogénesis y desdiferenciación respectivamente), mediante las imágenes
capturadas se realizó un análisis cualitativo y se pudieron observar cambios en
cuanto a coloración, forma y tamaño en ambos procesos, con esto, se establecieron
etapas de desarrollo para realizar un análisis histológico; los días después de la
siembra elegidos fueron: para el proceso de desdiferenciación 0, 4, 7, 10 y 15; y,
para el proceso de organogénesis 0, 4, 7 y 9. Del proceso de desdiferenciación se
realizó el tratamiento digital de imágenes, evaluando parámetros como área,
perímetro, dimensión fractal y el factor elíptico. Con los datos de área y perímetro se
pudieron apreciar dos etapas, una de lento crecimiento que comprende del día 0 al 7
y en la segunda etapa del día 8 al 20 se presentó un crecimiento acelerado. La
dimensión fractal del perímetro indicó que el día en que los explantes presentaron
una mayor rugosidad del perímetro fue en el día 15 y los valores del factor elíptico
indican que los explantes presentaron un valor máximo en el día 7. Con el análisis
histológico del proceso de desdiferenciación se observaron células con
características del tipo meristemáticas, y células maduras con vacuolas que
desplazan los organelos hacia los márgenes. En el proceso de organogénesis las
[2]
micrografías muestran células que podrían estar en la fase de inducción y
rediferenciándose para formar los brotes, etapas características de la formación de
órganos.
[3]
II. ABSTRACT
Marigold (Tagetes erecta) is of great importance at industrial level, due to pigments
that accumulate. In this work, undifferentiation process in MS medium added with
benzyaldenine (BA) and 2, 4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D); and shoot
formation (organogenesis), in MS medium added with BA and indole-3-acetic acid
acid (IAA), from leaf explants, were studied. Images were captured of each
process daily for 10 and 20 days (organogenesis and undifferentiation,
respectively), using the captured images, a qualitative analysis was undertaken.
Changes in color, shape and size in both processes were observed, stages of
development were established for histological analysis, selected days after sowing
for the undifferentiation process were 0, 4, 7, 10 and 15 days and for
organogenesis 0, 4, 7 and 9 days. Undifferentiation process was followed by digital
image processing, evaluating parameters such as area, perimeter, fractal
dimension and elliptic factor. Using data of area and perimeter, two stages were
identified, slow growth stage until the 7th day and a second stage from the 8th to
the 20th day, showing a fast growth. Fractal dimension of perimeter indicated the
highest explants roughness on the 15th day, and the elliptic factor indicated that the
explants showed a highest value on the 7th day. Histological analysis of
differentiation process showed characteristic meristem like cells and mature cells
with vacuoles moving organelles toward the margins. Micrographs of the
organogenesis process showed cells that might be in the induction phase and
morphogenesis, characteristic stages of organ formation.
[4]
III. INTRODUCCIÓN
El cultivo de tejidos vegetales (CTV) in vitro comprende un grupo de técnicas
mediante las cuales un explante es cultivado de forma aséptica en un medio
nutritivo. La respuesta de los explantes dependerá del tipo y la concentración de
reguladores de crecimiento vegetal (RCV) empleados. Los RCV mas
frecuentemente utilizados en los cultivos in vitro, son aquellos que pertenecen a
los grupos de auxinas y citocininas, ya que regulan en gran medida los procesos
de crecimiento y división celular. Las respuestas generalmente observadas en los
explantes son la embriogénesis somática, la formación de órganos y la
desdiferenciación del tejido. La embriogénesis somática es la capacidad de formar
embriones a partir de células diferentes a las reproductoras; la organogénesis se
refiere a la formación de órganos en los explantes cultivados; y el proceso de
desdiferenciación lo constituye la formación de una masa de células
aparentemente desorganizada, conocida como callo.
El cempaxúchil (Tagetes erecta) es una especie herbácea de México empleada
tradicionalmente con fines ceremoniales durante las festividades del Día de
Muertos. Es cultivada debido a que sus inflorescencias constituyen una excelente
fuente de pigmentos, de los cuales el mayoritario es la luteína que representa
aproximadamente un 91% del total de los carotenoides, estos han sido empleados
como aditivos en la industria de alimentos para pigmentar mantequilla y quesos y
en la elaboración de alimentos para las dietas de aves de corral y peces.
[5]
Actualmente no se han realizado, estudios cualitativos ni cuantitativos de los
cambios que ocurren en las células durante la formación de órganos y callo. El
objetivo de este trabajo fue analizar los cambios que ocurren en explantes foliares
de cempaxúchil durante el proceso de desdiferenciación y rediferenciación in vitro,
utilizando técnicas como el CTV, para la inducción de los procesos; microscopía
electrónica de transmisión, la cual permitió realizar el análisis histológico
observando la ultraestructura de las células; y el tratamiento digital de imágenes
que es una técnica que presenta muchas ventajas, entre ellas que es una técnica
no destructiva que permite cuantificar cambios morfológicos. Se realizó un análisis
histológico de la formación de callo y del proceso de organogénesis, lo que
permitió conocer la organización de las células en cada proceso.
[6]
IV. REVISIÓN DE LITERATURA
4.1 Cultivo de tejidos vegetales (CTV)
El CTV in vitro comprende un grupo de técnicas mediante las cuales un explante
(parte aislada de un vegetal) es cultivado de forma aséptica en un medio de
composición química definida e incubado en condiciones controladas. El primer
paso para el establecimiento de los cultivos lo constituye la selección del explante
apropiado, la cual está determinada por el objetivo perseguido y la especie vegetal
utilizada (Roca y Mroginski, 1991). Las células vegetales, a diferencia de las
animales, son totipotentes; es decir, una sola célula es capaz de generar un
individuo completo e idéntico a la planta madre (Fig. 1). En algunos casos, las
células pueden conformar una masa aparentemente desorganizada, conocida
como callo, en otros casos, estarán presentes otras estructuras reconocibles como
brotes o raíces. Estas respuestas dependerán del medio de cultivo que se utilice y
la influencia de las fitohormonas adicionadas (Radice, 2004).
4.1.1 Medios de cultivo
Un medio de cultivo se define como una formulación de sales inorgánicas y
compuestos orgánicos que son suministrados en concentraciones óptimas para el
desarrollo y la manipulación de los tejidos hacia una respuesta en particular
(Krikorian, 1991; Mroginski y col., 2004). Los requerimientos nutricionales de los
[7]
Figura 1. Totipotencia de las células vegetales. Característica que les
permite formar brotes y raíces adventicios (A y B) y regenerar plantas
completas con las mismas características de la planta madre (C).
A) B)
C)
[8]
tejidos vegetales cultivados in vitro deben ser similares a los que recibe la planta
en condiciones normales. Sin embargo, los nutrientes del medio son adquiridos a
través de células no especializadas, a diferencia de las planta in vivo en donde la
raíz es la encargada de adquirir y distribuir los nutrientes (Pérez-Molphe y col.,
1999).
Actualmente existen diversos medios de cultivo, algunos específicos solo para un
tipo de tejido o para una determinada especie vegetal, otros medios pueden ser
utilizados con diversas especies y tejidos, entre los mas utilizados para la
regeneración de plantas se encuentran el MS (Murashige y Skoog, 1962) y el B5
(Gamborg y col., 1968). De manera general, todos los medios de cultivo están
compuestos por macro y micronutrientes, una fuente de carbono que
generalmente es la sacarosa, vitaminas como la piridoxina, el ácido nicotínico y
tiamina, entre otras y un agente gelificante que no debe reaccionar con el medio ni
ser digerible por el tejido vegetal, los mas utilizados son el agar y el fitagel. Un
factor importante en los medios de cultivo es el pH, que debe ser ajustado entre
5.5 y 6.0 (Krikorian, 1991; Mroginski y Roca, 1991; Villalobos y Thorpe, 1991;
Pérez-Molphe y col., 1999; Mronginski y col., 2004; Montes-Ayala, 2007);
generalmente el medio es adicionado con reguladores de crecimiento vegetal o
fitohormonas, los cuales son los encargados de inducir una respuesta en los
explantes.
[9]
4.1.2 Reguladores de crecimiento vegetal (RCV)
Los RCV también llamados hormonas vegetales o fitohormonas, son compuestos
orgánicos sintetizados por la propia planta que controlan el crecimiento y
desarrollo de sus diferentes tejidos (Krikorian, 1991).
Los RCV se clasifican en cinco grupos básicos dependiendo de la respuesta que
provocan y de su origen: auxinas, citocininas, giberelinas, ácido abscísico y etileno.
Los utilizados mas frecuentemente en los cultivos in vitro son aquellos que
pertenecen a los grupos de auxinas y citocininas, ya que regulan en gran medida
los procesos de crecimiento celular, división celular y la formación de callo
(Gaspar y col., 1996, Coenen y Lomax, 1997; Pérez-Molphe y col., 1999).
Dependiendo del tipo de regulador de crecimiento empleado, la cantidad y la
combinación de éstos, será la respuesta del explante. De manera general se
puede observar que con el uso de altas concentraciones de auxinas con respecto
a la concentración de citocininas induce la formación de embriones (Fig. 2A); con
concentraciones similares para ambos tipos de reguladores, se promueve el
proceso de desdiferenciación del tejido (Fig. 2B) y con una concentración menor
de auxinas con respecto a las citocininas, se induce la organogénesis (Fig. 2C)
(Pérez-Molphe y col., 1999).
[10]
Figura 2. Respuestas generalmente observadas de los explantes en cultivo in vitro por
efecto de las auxinas y citocininas. A) Mayor concentración de auxinas con respecto a
citocininas, induce el proceso de embriogénesis somática; B) concentraciones iguales de
auxinas/citocininas, induce la desdiferenciación del tejido y C) menor concentración de
auxinas con respecto a la citocininas, induce la formación de brotes (Pérez-Molphe y col.,
1999).
[11]
4.1.2.1 Auxinas
Las auxinas son un grupo de compuestos derivados comúnmente del triptófano.
Intervienen en el desarrollo de tejido vascular, dominancia apical, desarrollo de
raíces adventicias, formación de embriones, además tienen la capacidad de
producir un agrandamiento y alargamiento celular, al mismo tiempo estimulan la
división celular en el cultivo de tejidos provocando la formación de callo (Del Pozo
y col., 2005). La auxina mas comúnmente usada es el ácido indolacético (AIA), el
cual es de origen natural. Se han utilizado otras sustancias que provocan un
efecto similar al AIA y que se han producido sintéticamente, (llamadas “auxinas
sintéticas”), tales como el ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), el ácido 1-
naftalenacético (ANA), el ácido indol-3- butírico (AIB) y el ácido 4-amino -3,5,6-
tricloropiridin-2-carboxílico (Picloram) (Krikorian, 1991; Pérez-Molphe y col., 1999).
4.1.2.2 Citocininas
Las citocininas generalmente son derivadas de la adenina y son sintetizadas en
tejidos jóvenes y raíces. Estimulan la división celular y rompen la latencia de las
yemas axilares haciéndolas brotar. Junto con las auxinas, las citocininas regulan la
división celular, por lo cual el balance entre éstas en un cultivo in vitro suele
determinar el patrón de desarrollo del tejido (Gaspar y col., 1996, Pérez-Molphe y
col., 1999). Entre las citocininas mas utilizadas se encuentran la zeatina (ZEA) que
es de origen natural, la 6-furfuril-aminopurina (CIN) y la benciladenina (BA) las
cuales son de origen sintético. En la actualidad el N-fenil-N´1,2,3-tidiazolil-5-urea
[12]
(TDZ), el cual es un herbicida sintético, se ha empleado como regulador de
crecimiento, empleando concentraciones bajas en los medios de cultivo (Krikorian,
1991; Pérez-Molphe y col., 1999).
4.2 Proceso de desdiferenciación in vitro
La totipotencia de las células para la generación de tejidos nuevos, disminuye con
el grado de diferenciación que presente el tipo de explante utilizado, pero puede
revertirse parcial o completamente según las condiciones de cultivo a las que se
someta (Sugiyama, 1999).
La formación de una masa de células desorganizadas y de rápida proliferación
llamada callo, ocurre debido a la desdiferenciación del tejido; en este proceso, las
células se vuelven competentes para responder ante cualquier estímulo
organogénico o embriogénico (Olmos y col., 2004). Las características del callo
dependerán de las condiciones de cultivo: tipo y cantidad de reguladores de
crecimiento, explante y condiciones de incubación. Los callos pueden ser
utilizados como una vía para la regeneración de plantas mediante la
organogénesis o la embriogénesis somática aunque es importante tener en cuenta
que no todos los callos tienen el potencial para diferenciarse (Pérez-Molphe y col.,
1999). Se han reportado diversos trabajos en los cuales se obtienen órganos o
embriones, partiendo primero de la desdiferenciación del tejido utilizando
explantes de hojas cotiledoneales, hojas maduras o tallos.
[13]
La regeneración de plantas directamente de los explantes o a partir de callos por
medio de la embriogénesis u organogénesis se ha utilizado como una alternativa
en los métodos de propagación (Litz y Jarret, 1991).
4.3 Organogénesis in vitro
El término organogénesis aplicado al cultivo in vitro de tejidos vegetales se refiere
a la formación de novo de órganos en los explantes cultivados (Litz y Jarret, 1991;
Pérez-Molphe y col., 1999), este fenómeno esta basado en la totipotencia de las
células. La organogénesis comprende la formación de yemas o raíces y puede ser
directa o indirecta, cuando tiene lugar en el explante original es directa; e indirecta
cuando primero se origina tejido calloso y luego se forman los órganos a partir de
éste (Pérez-Molphe y col., 1999). Estos órganos son inducidos a partir de una
célula o de un grupo de células que, según las condiciones de cultivo, tienen la
propiedad de mantenerse en división activa (Radice, 2004). Para que la
organogénesis ocurra a partir de un callo, deben ocurrir cambios que conduzcan a
la organización celular, estos cambios involucran la diferenciación e interacción
celular y la respuesta a señales específicas (Litz y Jarret, 1991).
El proceso de organogénesis comprende muchos aspectos, como la
desdiferenciación de tejidos y la organización de la división celular para formar
órganos específicos como primordios o meristemos. La organogénesis in vitro
[14]
depende de la adición exógena de RCV, en particular de auxinas y citocininas y en
la capacidad del tejido para responder a las señales hormonales (Sugiyama, 1999).
En general se han reconocido tres fases en el proceso de organogénesis. En la
primera fase las células adquieren la habilidad para responder a señales
hormonales (competencia); en la segunda fase, las células competentes en los
explantes cultivados son canalizadas y determinadas para la formación de
órganos específicos bajo la influencia del balance hormonal; la tercera fase la
comprende la morfogénesis que es el proceso mediante el cual se logran
desarrollar los órganos (Sugiyama, 1999).
4.4 Embriogénesis somática
Un embrión cigótico se origina a partir de la fusión de las células sexuales, sin
embargo, las células vegetales, tienen la capacidad de formar embriones mediante
un proceso similar a la embriogénesis cigótica sin involucrar la fusión de los
gametos. A estos embriones se les conoce como embriones adventicios,
embriones asexuales o embriones somáticos y el proceso por el cual se originan
se le llama embriogénesis somática (Raghavan, 1976; Tisserat y col., 1979, Litz y
Jarret, 1991).
Esta vía de regeneración consiste en la obtención de embriones que tienen su
origen en células somáticas de la planta donante, estas células se reprograman y
siguen un patrón de desarrollo idéntico al de los embriones de origen cigótico y no
[15]
presentan conexión vascular con la planta madre (Celestino y col., 2005), los
embriones son estructuras bipolares con un eje radical y uno apical, estas
estructuras son capaces de crecer y formar plantas completas normales.
Se necesita la presencia de una auxina para la iniciación de un callo embriogénico,
usualmente se emplea el 2,4-D, el cual aparentemente brinda el estímulo o inicia
la inducción de la embriogénesis somática en el callo. Sin embargo, la maduración
y germinación de los embriones, no ocurre en presencia de 2,4-D; en
consecuencia se reduce la concentración de las auxinas o se elimina
completamente del medio (Litz y Jarret, 1991).
Hay reportes de regeneración de plantas mediante la embriogénesis somática
entre los que se encuentra el girasol (Helianthus annuus), chicharo gandú
(Cajanus cajan), crisantemo (Chrysanthemum morifolium), albahaca (Ocimum
basilicum L.), orquidea (Phalaenopsis amabilis), entre otras (Saji y Sujatha, 1998;
Singh y col., 2003; Mandal y Datta, 2005; Gopi y Ponmurugan, 2006 y Chen y
Chang 2006).
En algunos trabajos adicionan al medio MS solo un regulador de crecimiento ya
sea auxina o citocinina para la inducción de la embriogénesis somática, como
Singh y col. (2003) y, Chen y Chang (2006) indujeron la formación de callo
embriogénico y la embriogénesis directa en leguminosas y orquídeas
respectivamente, utilizando únicamente TDZ. Gopi y Ponmurugan, (2006)
adicionaron solo 2,4-D induciendo la embriogénesis directa en albahaca. También
[16]
se ha reportado la combinación de auxinas y citocininas como lo reportado por Saji
y Sujatha (1998), quienes emplearon ANA y BA en girasol y obtuvieron callo
embriogénico; Mandal y Datta, (2005) utilizaron 2,4-D y BA en crisantemo e
indujeron la embriogénesis de forma directa.
Las estrategias empleadas para la germinación de los embriones son variadas, ya
que esto depende del material utilizado y del explante empleado, en algunos
trabajos esta reportada la eliminación de la auxina del medio (Saji y Sujatha, 1998),
el aumento en la concentración de citocininas (Singh y col., 2003) o el aumento en
la concentración de sacarosa en el medio (Mandal y Datta, 2005).
4.5 Aplicaciones del CTV
Las técnicas del CTV han sido utilizadas ampliamente para la propagación a gran
escala de especies ornamentales, obteniendo una gran cantidad de individuos a
partir de un genotipo seleccionado con características de interés y permite la
multiplicación de especies raras o en peligro de extinción asegurando la
estabilidad genética de las mismas, además de obtener plantas libres de
patógenos. El CTV es una herramienta muy útil en los programas de mejoramiento,
ya que tiene el potencial de producir plantas de calidad uniforme a escala
comercial, a partir de un genotipo selecto y con una tasa de multiplicación ilimitada.
[17]
El cultivo de callos puede ser utilizado como modelo para el estudio de
ultraestructura, metabolismo celular, respuestas a diferentes tipos del estrés; los
cultivos en suspensión también son iniciados a partir de células desdiferenciadas.
También el CTV se utiliza para la propagación asexual de plantas, lo cual es un
sistema clonal de propagación, la ventaja es que el cultivo no se ve afectado por
las condiciones ambientales externas, como la estación del año, sequías, heladas,
altas temperaturas, etc. El mejoramiento genético puede conferirle resistencia a
plagas e insectos o puede potenciar alguna característica importante que pueda
hacer más productiva a la planta y esto puede ser realizado a partir del CTV.
4.6 Microscopía en el CTV
La microscopía es una técnica utilizada para producir imágenes de objetos o
estructuras que no pueden ser percibidas a simple vista, para realizar esto
actualmente se cuenta con muchos instrumentos, como el microscopio óptico, el
microscopio electrónico de transmisión (MET) y el microscopio electrónico de
barrido (MEB) (Fig. 3). El MEB permite obtener una imagen aumentada del objeto
y funciona por refracción produciendo una imagen tridimensional de gran calidad,
la MET tiene mayor poder de resolución.
En el CTV la técnica de microscopía se ha empleado en diversos modelos de
estudio, para caracterizar o confirmar algún proceso.
[18]
Figura 3. Imágenes de embriogénesis somática y de formación de callo tomadas
con distintos tipos de microscopios. A) Imágenes del proceso de embriogénesis
somática en MEB (Mandal y Datta, 2005); B) Imágenes de la formación de callo a
través de MET (Orbán y col., 2007).
A)
B)
[19]
Martínez-Palacios y col. (2003) y, Chen y Chang (2006) realizaron el análisis
histológico del proceso de embriogénesis en agave (Agave victoriae-reginae), y
una especie de orquídea (Phalaenopsis amabilis) respectivamente. En estos
trabajos lograron confirmar la formación de los embriones somáticos e
identificaron la presencia de meristemos apicales y las zonas del explante que dan
origen a la formación de los embriones.
Mandal y Datta (2005), confirmaron el proceso de embriogénesis somática directa
en crisantemo mediante microscopia electrónica de barrido (MEB), observando el
desarrollo asincrónico de los embriones en la superficie del explante (Fig. 3).
En el 2007, Orbán y col., realizan el análisis histológico mediante MET en
diferentes etapas de formación de callo de Rubia tinctorium, observan la
degradación de los organelos conforme la aparición del callo se hace mas
evidente y la formación de múltiples vacuolas en el contorno de núcleo (Fig. 3).
Ferreira y col. (2009), realizaron el análisis histológico del proceso de
organogénesis en álamo (Populus euphratica), observando la formación de los
brotes después de 40 días de cultivo.
4.7 Tratamiento digital de imágenes (TDI)
El procesamiento de imágenes se refiere al conjunto de técnicas y métodos
encaminados a facilitar la extracción de la información cuantitativa contenida en
[20]
una imagen, con el fin de facilitar su posterior interpretación mediante un análisis
de las imágenes procesadas, esto se realiza con un sistema informático capaz de
extraer de forma rápida toda la información relevante contenida en una imagen
determinada como el número o tamaño de las células. El tratamiento digital de
imágenes esta siendo utilizada como una herramienta útil para la investigación en
diversos campos de estudio como la medicina, meteorología, ecología, física y
biotecnología entre otras, debido a que es una técnica no destructiva y que puede
dar información sobre la textura y morfología de los objetos. El procesamiento de
imágenes involucra varios pasos, como la adquisición de la imagen digital, el
procesamiento de la imagen y la medición. En la imagen capturada, se le llama
objeto a los elementos que son distinguibles e independientes entre sí y que
destacan del fondo que los rodea, durante el procesamiento de la imagen, se
extraen los objetos, los cuales contienen la información de interés. Para obtener
las características dimensionales de los objetos, se utilizan un conjunto de
herramientas morfométricas que permiten obtener datos de área, perímetro,
volumen o parámetros de forma (Ibaraki y Kenji, 2001; Pertusa-Grau, 2004)
4.8 El cempaxúchil como modelo de estudio
4.8.1 Importancia y usos del cempaxúchil
El cempaxúchil (Tagetes erecta), es una especie herbácea de origen mexicano
(Tosco, 1970). Pertenece a la familia Asteraceae, cuya característica principal es
la presencia de flores agrupadas en inflorescencias llamadas capítulos (Fig. 4). En
[21]
Figura 4. Inflorescencias de cempaxúchil (Tagetes erecta). Las flores se
agrupan en capítulos, son utilizadas con fines ceremoniales, en la medicina
tradicional mexicana y en la industria de alimentos por el tipo de pigmentos
que acumula.
[22]
México se emplea principalmente con fines ceremoniales durante las festividades
del Día de Muertos (Gommers y Geerligs, 1973) y también son conocidas sus
cualidades en la medicina tradicional por su uso como antiparasitario,
antiespasmódico y en el tratamiento de enfermedades del estómago, bazo e
hígado (Guzmán-Maldonado y Paredes-López, 1998; Delgado-Vargas y col.,
2000).
Actualmente el cempaxúchil es un recurso importante a nivel industrial, ya que los
carotenoides acumulados en sus inflorescencias son utilizados en la elaboración
de alimentos para aves de corral, con el fin de pigmentar la piel de los pollos y la
yema de los huevos; peces y/o crustáceos para mejorar la calidad y aceptación de
esos productos para el consumo humano (Delgado-Vargas y Paredes-López,
1997a; 1997b; Delgado-Vargas y col., 2000; Del Villar-Martínez y col., 2007).
El mercado actual a nivel mundial no solo demanda productos que además de
tener capacidad nutricional, provoquen algún efecto benéfico en la salud humana
(anticancerígeno y antioxidante), lo cual asegura la permanencia del cempaxúchil
a nivel mundial por mucho tiempo debido al tipo de pigmentos que sintetiza (Del
Villar-Martínez y col., 2007). Además de la función de los carotenoides como
colorantes, destacan por su importancia a nivel fisiológico la propiedad de algunos
de ellos de ser precursores de la vitamina A y antioxidantes (Van den Berg y col.,
2000; Ye y col., 2000; Toledo de Oliveira y col., 2004); como el β-caroteno que
protege del daño provocado por los radicales libres, que son los responsables de
[23]
varias enfermedades degenerativas como arteroesclerosis, artritis y
carcinogénesis (Hof y col., 2000; Roodembury y col., 2000; West, 2000).
4.8.2 Antecedentes de CTV en cempaxúchil
Existen varios trabajos en los que se reporta la desdiferenciación y
rediferenciación de explantes de cempaxúchil mediante la formación de callo,
organogénesis y embriogénesis somática, para lo cual se han utilizado distintas
fuentes de explantes como hojas maduras, hojas cotiledoneales e hipocotilo
(Kothari y Chandra, 1984; Belarmino y col., 1992; Bespalhok y Hattori, 1998;
Mohamed y col., 1999; Misra y Datta, 2001; Vanegas y col., 2002 y García-
Chavarría, 2007).
Según la respuesta que se desea obtener, se han empleado diferentes
reguladores de crecimiento. Para la formación de callo Bespalhok y Hattori (1998),
utilizaron 2,4-D y CIN; García-Chavarría (2007) indujo el proceso de
desdiferenciación con 2,4-D y BA. En estos trabajos se ha reportado la formación
de callo friable y con coloraciones que varían entre amarillo, verde y café.
Para inducir el proceso de organogénesis Kothari y Chandra (1984) y Belarmino y
col. (1992) utilizaron distintas concentraciones de ANA y BA; Mohamed y col.
(1999) y Vanegas y col. (2002) emplearon AIA y BA; Misra y Datta (2001)
indujeron este proceso con BA y AG3. En algunos de estos trabajos se reporta
primero la desdiferenciación del tejido y posteriormente la formación de los brotes
[24]
a partir del callo formado (organogénesis indirecta), en el trabajo de Misra y Datta
(2001) inhibieron la formación de callo adicionando al medio AG3, para obtener
órganos directamente del explante (organogénesis directa).
Además de la adición de los reguladores de crecimiento en el medio, está
reportada la utilización del ácido ascórbico como pretratamiento para evitar la
oxidación de los explantes (Belarmino y col., 1992).
Existe un solo trabajo en el que se indujo el proceso de embriogénesis somática
en cempaxúchil. Bespalhok y Hattori (1998) sembraron callos de cempaxúchil en
medio adicionado con TDZ para el desarrollo de callo embriogénico. Para la
conservación de las características embriogénicas, los callos se mantuvieron en
medio MS con 2,4-D.
Algunos de los trabajos reportados han sido encaminados para obtener protocolos
efectivos para la regeneración de plantas. En el 2002, Vanegas y col., indujeron la
formación de brotes y reportaron el 100% de supervivencia de estos en
condiciones de invernadero, obteniendo valores superiores a los reportados por
Kothari y Chandra (1984) y por Belarmino y col. (1992).
Misra y Datta (2001), realizaron una comparación entre plantas formadas a partir
de la inducción de la organogénesis directa y plantas germinadas a partir de
semillas, encontrando que las características evaluadas fueron significativamente
mejores en aquellas provenientes del cultivo in vitro.
[25]
Bespalhok y Hattori (1998), reportaron la identificación de las 4 etapas de
desarrollo de los embriones somáticos en callos inducidos hacia este proceso, sin
embargo, no lograron la regeneración de plantas completas a partir de estos
embriones.
Se han realizado trabajos utilizando las técnicas de microscopía y biobalistica; en
1999, Bespalhok y Hattori, realizaron un análisis histológico del proceso de
desarrollo de callos embriogénicos de cempaxúchil utilizando entre otras técnicas
la MEB, donde identificaron células no embriogénicas y embriogénicas y la forma
de éstas; Ramos-Viveros (2007), identifica mediante MET las estructuras que
acumulan los pigmentos en callos de cempaxúchil. Orbe-Rogel (2009), reporta las
condiciones apropiadas para realizar eventos de transformación genética como la
distancia y presión, para evaluar la expresión transitoria del gen uid A en callos de
cempaxúchil, utilizando el método de biobalística.
[26]
V. JUSTIFICACIÓN
El cempaxúchil es importante a nivel industrial debido a los pigmentos que acumula
en sus inflorescencias. Mediante el cultivo de tejidos vegetales se han buscado las
condiciones adecuadas para la formación de callos y brotes en distintas variedades
de esta planta, con los trabajos realizados se han determinado concentraciones y
combinaciones adecuadas de RCV para ambos procesos. En callos se han
reconocido las estructuras que acumulan los pigmentos y se tienen las condiciones
apropiadas para realizar eventos de transformación genética; sin embargo, los
procesos de desdiferenciación y rediferenciación aun no han sido caracterizados. El
análisis de estos procesos de forma cualitativa y cuantitativa permitirá conocer los
cambios a nivel morfológico y celular, con lo que se obtendrá un patrón de
comportamiento de los explantes dependiendo del proceso que se les induzca y,
conociendo estas características, se podrán establecer eventos de transformación
genética mas eficientes para obtener algún metabolito de interés, o la regeneración
de plantas trasformadas genéticamente.
[27]
VI. OBJETIVOS 6.1 Objetivo General
Analizar los cambios que ocurren en la organización celular de explantes foliares
de cempaxúchil durante el proceso de desdiferenciación y rediferenciación in vitro.
6.2 Objetivos específicos
Observar los cambios morfológicos que ocurren en explantes foliares de
cempaxúchil durante el proceso de desdiferenciación.
Cuantificar mediante el tratamiento digital de imágenes, los cambios que
ocurren durante la transición del explante foliar a callo.
Evaluar el efecto de diferentes reguladores de crecimiento sobre el proceso
de rediferenciación de explante foliar.
Analizar cualitativamente los cambios que ocurren en explantes de hoja
durante el proceso de organogénesis.
Analizar mediante microscopía electrónica de transmisión, las etapas de
desarrollo del proceso de desdiferenciación y formación de brotes.
[28]
VII. MATERIALES Y MÉTODOS
7.1 Material vegetal
Se utilizaron semillas de cempaxúchil (Tagetes erecta) del material experimental
Porte Bajo, donado por el Dr. Miguel Ángel Serrato de la Universidad Autónoma
Chapingo.
7.2 Métodos
7.2.1 Establecimiento del cultivo in vitro de cempaxúchil
Para establecer el cultivo in vitro de plántulas de cempaxúchil, se desinfestaron
las semillas mediante el método reportado por Vanegas-Espinoza (2003). Se
realizaron lavados con etanol al 100 y 70% (v/v) durante 1 y 5 minutos
respectivamente, posteriormente las semillas se lavaron con cloro al 2 y al 1% (v/v)
por 15 minutos, entre cada lavado con etanol y cloro se enjuagaron las semillas
con agua destilada estéril. Una vez terminado el proceso de desinfestación, se
eliminó el exceso de agua secándolas con papel filtro estéril. Las semillas se
sembraron en medio MS (Murashige y Skoog, 1962), el cual se preparó con 30 g/L
de sacarosa y 3 g/L de fitagel sin adicionar reguladores de crecimiento, se ajustó
el pH a 5.8 y el medio se esterilizó en autoclave a una presión de 1.2 kg/cm2 por
15 minutos, las semillas se incubaron bajo condiciones de luz con un fotoperiodo
de 16 h de luz por 8 h oscuridad, durante un periodo de un mes para la
[29]
germinación y elongación de las plántulas, las que posteriormente se utilizaron
como fuente de explantes.
7.2.2 Inducción del proceso de desdiferenciación de explante foliar de
cempaxúchil
Para inducir la formación de callo, se preparó medio MS semi-sólido adicionado
con 2 mg/L de 2,4-D y 2 mg/L de BA (García-Chavarría, 2007). El medio se vació
en cajas Petri, y se sembraron los explantes de hojas de aproximadamente 5 mm2,
a los cuales se le realizaron heridas para favorecer el proceso de
desdiferenciación. Los explantes se mantuvieron en obscuridad durante todo el
experimento para evitar la oxidación.
7.2.3 Tratamiento digital de imágenes del proceso de desdiferenciación
Para realizar el tratamiento digital de imágenes del proceso de desdiferenciación,
fue necesario capturar imágenes desde el momento en que los explantes se
colocaron en el medio, hasta la formación del callo en el tejido.
Se sembraron 90 explantes de hoja en el medio de inducción de callo, los cuales
se observaron en un equipo compuesto por el microscopio estereoscópico (marca
NIKON modelo SMZ 1500) acoplado a una cámara digital (modelo 3CCD marca
MTI) conectada a una computadora (PC genérica, 2.66 MHz, 4 GB RAM).
[30]
Se capturaron las imágenes de los 90 explantes diariamente durante 20 días, bajo
las mismas condiciones de captura (posición con respecto a un eje, luz, brillo,
intensidad, apertura de objetivo y tiempo de exposición) utilizando aumentos de 3,
2 y 1X. Posteriormente, las imágenes obtenidas de todos los explantes sembrados
se procesaron utilizando el programa ImageJ 1.42, cada una de las imágenes se
transformó a escala de grises (8 bits) y después se binarizaron (2 bits); con este
procedimiento el fondo de la imagen es presentado en blanco y el objeto
capturado en la fotografía es aislado en color negro (Fig. 5); esto permitió
posteriormente evaluar los cambios morfológicos de los explantes foliares,
realizando distintas mediciones con los parámetros morfométricos, los parámetros
evaluados en este trabajo fueron:
Area: indica el espacio que ocupa un objeto. Perímetro: se refiere a la longitud del
contorno del objeto. Factor elíptico: si la relación entre el eje longitudinal mayor
(Lmax) y el eje menor transversal (Lmín), es superior a 1, el objeto es elíptico y si
la relación tiende a la unidad, el objeto tiene una forma circular. Dimensión fractal
del perímetro (Dfp): los fractales se caracterizan por que presentan la misma
apariencia independientemente del grado de ampliación con que se observen
(Mandelbrot, 1982). Es una herramienta que permite cuantificar, entre otros
aspectos que tan irregular es una línea o una superficie; es decir, en términos
prácticos es una medida de la irregularidad; en este caso, del perímetro del objeto
analizado
[31]
Figura 5. Procesamiento de imágenes y referencias utilizadas para la medición de
los parámetros. A) Imagen capturada; B) imagen en escala de grises; C) imagen
binarizada; D), E) y F) imágenes utilizadas como referencias, 3, 2 y 1X
respectivamente. Separación entre líneas:1 mm.
A B C
D E F
[32]
Estos descriptores se calcularon utilizando el programa Sigma ScanPro (V 5.0,
SPSS, USA). Debido a que el programa proporciona los datos en pixeles, se
necesitó medir el objeto capturado en las imágenes según el aumento en el que
fueron tomadas, para obtener las mediciones de los parámetros en mm ó mm2. La
calibración consistió en capturar la imagen de un objeto con medidas ya conocidas,
en este caso se utilizó papel milimétrico (una división = 1 mm) (Fig. 5), la imagen
se guardó y posteriormente se define la distancia con el valor en mm. La imagen
es guardada nuevamente y de esta manera está calibrada y sirve para realizar las
mediciones de objetos capturados con el mismo aumento. Con los datos obtenidos
de las mediciones de todas las imágenes, se realizó un análisis del proceso de
desdiferenciación y se establecieron etapas para realizar en análisis histológico.
7.2.4 Inducción del proceso de rediferenciación en cempaxúchil
Para inducir el proceso de rediferenciación se utilizaron dos vías de regeneración,
la organogénesis y la embriogénesis somática, realizando diferentes experimentos,
basándose en trabajos reportados para Tagetes erecta y para especies
pertenecientes a la misma familia como el girasol y crisantemo (Bespalhok y
Hattori, 1998; Saji y sujhta, 1998; Mandal y Datta, 2005).
[33]
7.2.4.1 Organogénesis en explantes de hoja
Para la formación de brotes se utilizó medio MS adicionando con ácido
indolacético (AIA) y benciladenina (BA) a diferentes concentraciones (1.5, 3.0 y 5.0
mg/L, y 0.5, 1.0, 1.5 y 3.0 mg/L respectivamente), a partir de lo reportado por
Vanegas y col. (2002), quienes utilizaron 3.0 mg/L de AIA y BA. Los explantes
utilizados fueron hojas de cempaxúchil cultivadas in vitro, las cuales se
mantuvieron bajo condiciones de luz. Para evaluar el efecto de los reguladores de
crecimiento se cuantificó el porcentaje de explantes con brotes, el número de
brotes por explante y para una mejor determinación de la eficacia de los
tratamientos, se evaluó la Capacidad de Formación de Brotes (CFB) según lo
reportado por Martínez-Pulido y col. (1992), que es la relación que existe entre el
número de brotes por explante y el porcentaje de explantes con brote:
CFB = (Número promedio de brotes por explante) X (% de explantes con brote)
100
Como unidad experimental se utilizó una caja Petri con 10 explantes y se
realizaron 5 repeticiones de cada combinación de RCV. Todos los datos fueron
analizados mediante un análisis de varianza (ANOVA), las medias de los
tratamientos fueron analizadas utilizando la prueba de Fisher de diferencias
mínimas significativas (dms) con α=0.05 (Vanegas y col., 2002), utilizando el
paquete estadístico SAS System (versión 9.0). Una vez seleccionada la
concentración de reguladores de crecimiento que favoreciera el proceso de
[34]
organogénesis se capturaron imágenes diariamente en el microscopio
estereoscópico con el equipo mencionado anteriormente, las imágenes tomadas
permitieron seleccionar los días en los que los explantes sufrieron cambios
morfológicos mas evidentes, para realizar un análisis histológico mediante MET y
caracterizar este proceso.
7.2.4.2 Embriogénesis somática en explantes de hoja y callo
Para inducir el proceso de embriogénesis somática, se utilizaron explantes de hoja
y callo, los materiales se sembraron en medio MS adicionado con diferentes
concentraciones de reguladores de crecimiento. El primer experimento consistió
en adicionar distintas concentraciones de TDZ las cuales fueron de 0.005, 0.010 y
0.020 mg/L, partiendo del trabajo reportado por Bespalhok y Hattori (1998), que es
el único reporte de embriogénesis en cempaxúchil. Otro experimento se basó en
los reportes de Saji y Sujatha (1998), quienes utilizaron ANA y BA para inducir
embriogénesis somática en girasol, para este trabajo se probaron tres
concentraciones de ANA y BA, las cuales fueron de 0.05, 0.1, 0.2 mg/L y 0.1, 0.5 y
1.0 mg/L respectivamente. Se realizó un tercer experimento siguiendo lo reportado
por Mandal y Datta (2005), quienes utilizaron 2,4-D y BA en crisantemo; para
inducir la embriogénesis en cempaxúchil utilizando estos reguladores, se
emplearon tres concentraciones de cada regulador, las cuales fueron de 2.0, 4.0,
6.0 mg/L de 2,4-D y 1.0, 2.0 y 5.0 mg/L BA. De cada tratamiento se utilizaron
explantes de hoja y callo y se realizaron cinco repeticiones, cada repetición
consistió en una caja Petri con 10 explantes.
[35]
7.2.5 Análisis histológico
Una vez seleccionadas las etapas para los procesos de desdiferenciación y
rediferenciación, se realizó la preparación de las muestras para realizar un análisis
histológico, utilizando microscopia electrónica de transmisión. Se adicionó a las
muestras tetraóxido de osmio (OsO4) al 1% (p/v), para fijar los lípidos presentes en
el tejido. Una vez realizada la fijación, las muestras se deshidrataron con
diluciones seriadas de etanol desde el 10 hasta el 100%, con cada solución las
muestras se incubaron por 10 minutos, el alcohol se retiró y se realizaron tres
lavados con soluciones 2:1, 1:1 y 1:2 de etanol absoluto y óxido de propileno (v/v)
para eliminar los residuos de etanol. Como paso siguiente a la deshidratación, se
realizó la preinclusión en una resina, para lo cual se prepararon soluciones 2:1, 1:1
y 1:2 de óxido de propileno y resina EPON 812 (v/v), se incubó el tejido por 1 h en
cada una de las soluciones, posteriormente se agregó resina pura y se incubó
durante 1 h a temperatura ambiente. Los fragmentos se colocaron en los moldes
de inclusión y se llenaron con resina EPON 812, para favorecer la polimerización
de la resina, se incubaron a 60° C por 24 h. Una vez incluido el tejido en la resina,
se realizaron los cortes con el ultramicrotomo, el espesor de los cortes fue de 65
nm con una cuchilla de diamante, los cortes se colocaron sobre rejillas metálicas
de cobre, las cuales se trataron con diferentes soluciones de acetato de uranilo al
4% (p/v); una diluida en etanol y otra en agua, las rejillas se dejaron en cada una
de estas soluciones durante 15 minutos y se realizaron lavados con agua entre
cada cambio de solución de acetato de uranilo, después se secaron en papel
absorbente. Las rejillas con los cortes, se colocaron en citrato de plomo al 1%
[36]
durante 20 minutos, después de esto, las muestras se observaron en el
microscopio electrónico de transmisión de la marca JEOL 1010, a un voltaje de
aceleración de 60 kV para observar las estructuras celulares. Las imágenes se
capturaron con el programa AMT Image Capture a diferentes magnitudes de
distancia en nm.
[37]
VIII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
8.1 Establecimiento del cultivo in vitro de cempaxúchil
Para iniciar con el cultivo in vitro se desinfestaron 100 semillas de cempaxúchil, de
las cuales se obtuvo el 100% de desinfestación al igual que lo reportado por
Vanegas-Espinoza (2003).
8.2 Inducción del proceso de desdiferenciación de explante foliar de cempaxúchil
Se logró inducir la formación de tejido calloso a partir de explantes de hoja, en
medio MS adicionado con 2.0 mg/L de BA y 2.0 mg/L de 2,4-D; de manera similar
a lo obtenido por García-Chavaría, (2007). La figura 6 muestra imágenes que
ejemplifican el proceso de desdiferenciación en un mismo explante durante 20
días de cultivo; las imágenes fueron capturadas diariamente. Durante los primeros
tres días no se observaron cambios evidentes en el tamaño y forma del tejido; sin
embargo, de manera general se pudo observar la disminución en la intensidad del
color verde característico de la hoja, este cambio en la coloración (sin haberse
cuantificado) se apreció principalmente en el centro del explante y se hizo mas
evidente en el día seis, llegando a tener callos con una coloración verde pálido
uniforme. Orbán y col. (2007), realizaron la inducción de callo a partir de explantes
de hoja de Rubia tinctorum, reportaron la evidente degradación de la clorofila,
[38]
Figura 6. Fotomicrografías de los explantes de hoja de cempaxúchil cultivados en medio MS con 2,4-D (2 mg/L) y BA (2 mg/L) durante el proceso de desdiferenciación. La barra indica 2 mm.
0
3X
0
3X
0
0 1 2 4 5 6
3X
2X
1X
3 4 5 4 5 6
6 7 8 4 5 6
9 10 11 4 5 6
12 13 14 4 5 6
15 16 17 4 5 6
18 19 20 4 5 6
3X
2X
1X
[39]
durante la desdiferenciación del tejido con un decremento acelerado de la clorofila
a y b durante los primeros tres días; para el día 13 el contenido de clorofila en las
hojas disminuyó poco más de cuatro veces con respecto al día cero. Estos
cambios probablemente se deban, a que las células nuevas no tienen
desarrollado los sistemas fotosintéticos y el proceso de síntesis de la clorofila se
encuentra en las etapas iniciales, por lo que la concentración del pigmento es baja
(Cayón, 2001).
En cuanto al tamaño del explante, a partir del día seis se presentó un incremento
en este parámetro. El aumento de tamaño se comenzó a evidenciar
marcadamente a partir del día siete, observándose aproximadamente al doble del
tamaño con respecto al inicial y en el día 12, alcanzó al menos tres veces el
tamaño inicial (Fig. 6). Este comportamiento podría ser producto de la expansión
del tejido por efecto de la acumulación de agua y por un incremento en el número
de células (duplicación celular) por efecto de los reguladores de crecimiento
(Cosgrove, 1997).
8.3 Morfometría del proceso de desdiferenciación en cempaxúchil utilizando
tratamiento digital de imágenes
Para realizar la morfometría, se utilizaron las imágenes capturadas durante el
proceso de desdiferenciación, después de ser procesadas, binarizadas y
calibradas utilizando un papel milimétrico como referente de medición, se
[40]
determinaron los siguientes parámetros: área (A) y perímetro (P), factor elíptico
(FE; factor adimensional) y dimensión fractal del perímetro (Dfp).
Se seleccionaron estos parámetros morfométricos, ya que con ellos es posible
cuantificar los cambios en el crecimiento de los callos (A y P), en su forma (FE) y
en su apariencia como objetos regulares o no (Df).
a) Área y perímetro.- En un principio y hasta el día siete, el crecimiento fue
lento, incrementándose en ganancia de área a razón de 0.41 mm2/d y el aumento
del perímetro fue de 0.30 mm/d. A partir del día ocho, los explantes crecieron con
mayor rapidez, a una velocidad para área de 2.01 mm2/d y para el perímetro 1.00
mm/d (Fig. 7). Es decir, se obtuvieron dos velocidades de crecimiento distintas. La
cinética hasta el día siete puede ser resultado de la adaptación del tejido
(explante) a las nuevas condiciones de cultivo, además de los procesos de
reparación y de desdiferenciación celulares como respuesta a la combinación de
los reguladores de crecimiento utilizados (Del Pozo y col., 2005). La segunda
etapa, correspondiente a un crecimiento acelerado, posiblemente se deba, a una
rápida proliferación celular como producto del proceso de desdiferenciación,
sumado a la incorporación de agua en las células desdiferenciadas ya que se
sabe que el callo está constituido por una alta proporción de células muy
vacuoladas (Cosgrove, 1997; Cosgrove, 2000). Con respecto al perímetro, se
observó un efecto similar al área; hasta el día siete, el incremento fue marginal
(2.6 mm) mientras que del día 8 al 30 el incremento fue aproximadamente cinco
veces mayor (15 mm) (Fig. 7).
[41]
Figura 7. Valores de área y perímetro de los explantes sembrados durante el
proceso de desdiferenciación en un periodo de 20 días. Los valores representan el
promedio de 90 imágenes procesadas por día. µP= velocidad específica de
crecimiento del perímetro; µA= velocidad específica de crecimiento del área.
µP= 0.30 mm/d
µP= 1.00 mm/d
µA= 0.41 mm2/d
µA= 2.01 mm2/d
[42]
Es interesante destacar que desde el día 0 al día 15, el perímetro creció de
manera paralela al área; sin embargo, a partir del día 16 la velocidad con
que se incrementaron los valores para este parámetro es menor con relación a la
del área (Fig. 7). Es decir, conforme aumenta la desdiferenciación del tejido, éste
tiende a incorporar mayor cantidad de agua, haciéndose más turgente y por ende,
el borde del tejido (perímetro), se hace más liso, pudiendo contener una mayor
área. En este sentido, la expansión de la pared celular tiene un aspecto temporal,
primero incluye un lento crecimiento de las células meristemáticas, este fenómeno
pudiera estar ocurriendo en los días 0 al 7, donde se aprecia un lento incremento
en los valores de área y perímetro en comparación con los siguientes días.
Posteriormente, las células continúan con una rápida expansión y vacuolización, lo
que coincide con los valores obtenidos a partir del día ocho para área y perímetro
donde comienza un crecimiento mas acelerado (Cosgrove, 2000).
b) Dimensión fractal del perímetro.- En la figura 8 se muestran los datos obtenidos
para la dimensión fractal del perímetro de los explantes de hoja. Se puede
observar que los valores se incrementan desde el día 0 hasta el día 15 de 1.108 a
1.183, lo que indica que durante este periodo de tiempo el borde de los explantes
va adoptando una mayor irregularidad. Sin embargo, para el día 20 se logra
apreciar una clara disminución en este valor (1.13), el proceso de
desdiferenciación ya es evidente a simple vista con la formación de callo en los
bordes, la disminución en el valor de la Dfp puede deberse a la vacuolización de
las células.
[43]
1.04
1.05
1.06
1.07
1.08
1.09
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Tiempo (dias)
Dim
en
sió
n f
ra
cta
l d
el p
erím
etr
o (
Dfp
)
Figura 8. Valores para la dimensión fractal del perímetro de los explantes de hoja.
Los resultados corresponden a los días 0, 4, 7, 10, 15 y 20. Los valores
representan las mediciones realizadas a partir de 90 imágenes binarizadas del
proceso de desdiferenciación. Las imágenes corresponden al seguimiento del
mismo explante
[44]
Esto ocasiona un agrandamiento celular, así como el incremento en la turgencia
de las células (Cosgrove, 1997) y por lo tanto el alisamiento del borde. En 1999,
Yokota y col. realizaron un análisis de la dimensión fractal del perímetro de callos
de zanahoria concluyendo que los valores para la Df aumentan conforme
transcurren los días y que los callos adoptan una forma mas irregular después de
300 h de exposición al medio, en este trabajo se encontró que la mayor
irregularidad en el perímetro ocurrió a los siete días (168 h) coincidiendo con los
cambios observados en el área y perímetro. Es evidente que el proceso de
desdiferenciación, por efecto de los reguladores de crecimiento, promueve la
vacuolización celular y la incorporación de agua, lo que hace que los tejidos sean
más turgentes y disminuya en valor de Dfp
c) Factor elíptico.- Este factor describe que tan elíptico es un objeto, mientras los
valores se encuentren mas alejados de la unidad, el objeto tiende a ser mas
elíptico, por el contrario, si se acercan a uno indica que el objeto está adquiriendo
una forma mas redondeada. En la figura 9 se muestran los valores para este
descriptor, se puede observar los explantes inician con un FE de 1.414 y conforme
pasan los días, el factor elíptico va aumentando, llegando a un máximo de 1.517
en el día siete, a partir del día ocho los valores van disminuyendo hasta alcanzar
1.355 en el día 20, lo que indica que los explantes van adquiriendo una forma
redondeada conforme la aparición del callo es más evidente.
Los cambios morfológicos que ocurren durante el proceso de desdiferenciación, se
pueden definir como el desarrollo de los explantes (Fig. 10), ya que durante este
[45]
1.25
1.3
1.35
1.4
1.45
1.5
1.55
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Tiempo (Dias)
Facto
r eli
pti
co
(F
E)
Figura 9. Valores correspondientes al factor elíptico de los explantes de hoja. Las
mediciones se realizaron a partir de las imágenes binarizadas del proceso de
desdiferenciación.
[46]
Figura 10. Etapas de desarrollo del explante durante el proceso de
desdiferenciación. Días después de la siembra: A) 0, B) 4, C) 7, D) 10 y E) 15.
D E
A)
B C
2 mm
[47]
proceso se pueden apreciar cambios que se dan de forma gradual y progresivo en
cuanto al tamaño, estructura y función, se sabe que estos cambios se pueden
llevar a cabo mediante la expansión y división celular en donde la expansión de
las células es lo que siempre produce un incremento físico, cuantificado como
aumento de área y disminución de la Dfp.
Durante el crecimiento de las células, éstas se expanden y la rigidez de la pared
celular es la que condiciona su crecimiento y mediante la presión de turgencia la
pared se extiende, perdiendo parte de su rigidez, permitiendo un incremento en el
volumen celular por la entrada de agua (Segura, 2000). En el proceso de
desdiferenciación in vitro, éstos son inducidos mediante la adición de los
reguladores de crecimiento, como resultado de la relación ente auxinas
(alargamiento celular) y citocininas (división celular).
8.4 Inducción del proceso de rediferenciación en cempaxúchil
8.4.1 Organogénesis en explantes de hoja
Para inducir la formación de brotes a partir de explantes de hoja se utilizaron
distintas concentraciones de AIA (1.5, 3.0 y 5.0 mg/L) y BA (0.5, 1.0, 1.5 y 3.0
mg/L) en medio MS, partiendo del trabajo reportado por Vanegas y col. (2002) en
el que lograron inducir la formación de brotes a partir de explantes de hoja,
adicionado con 3.0 mg/L de AIA y 3.0 mg/L de BA.
[48]
En un primer experimento se pudo observar que a concentraciones de 5.0 mg/L de
AIA, no se promovió la formación de brotes, por lo que se estableció otro
experimento con concentraciones de 1.5 y 3.0 mg/L para AIA y 0.5, 1.0, 1.5 y 3.0
mg/L para BA, los parámetros que se evaluaron fueron el porcentaje de explantes
con brote, el número de brotes por explante y la CFB. Es importante mencionar
que las plántulas utilizadas como fuentes de explante, tenían dos meses de haber
sido germinadas debido a que se realizaron ensayos preliminares para el proceso
de organogénesis con plántulas de mayor edad y los explantes solo formaron
raíces, por lo que se decidió utilizar plántulas jóvenes para posteriores
experimentos.
Los resultados obtenidos del análisis estadístico indican que la combinación en la
que se obtuvo un mayor porcentaje de explantes con brotes fue con 3.0 mg/L de
AIA y 0.5 mg/L de BA (58%) (Tabla 1), para el número de brotes por explante y la
CFB la mejor combinación fue la de 3.0 mg/L de AIA y 1.5 mg/L de BA con valores
6.9 y 2.07 respectivamente, lo que indica que en estas concentraciones de RCV,
los explantes forman la mayor cantidad y tienen una mayor eficacia para la
formación de los brotes. Vanegas y col. (2002) reportaron que la combinación de
3.0 mg/L de AIA y 3.0 mg/L de BA es en la que obtienen mejores resultados para
la formación de explantes con brote con un 69.4%, para el número de brotes por
explante y la CFB, la mejor combinación fue la de 1.0 mg/L de AIA y 3.0 mg/L de
BA, con valores de 2.8 y 1.39 respectivamente. En este trabajo se obtuvieron
valores más altos para el número de brotes por explante y para la CFB.
[49]
Tabla 1. Efecto del AIA y el BA sobre la producción de brotes a partir de explantes
de hoja de cempaxúchil
Valores seguidos por la misma letra en cada columna no difieren estadísticamente
a p=0.05 de acuerdo a la prueba de Fisher de diferencias mínimas significativas.
Concentración (mg/L)
Explantes con
Brotes (%)
Número de brotes por explante
Capacidad de Formación de Brotes (CFB)
AIA BA
1.5
0.5 22.0 bc 2.86 bc 0.67
1.0 34.0 b 6.24 ab 1.79
1.5 38.0 b 2.74 bc 1.04
3.0 10.0 c 3.60 abc 0.52
3.0
0.5 58.0 a 3.10 abc 1.83
1.0 30.6 b 2.15 c 0.82
1.5 26.0 bc 6.91 a 2.07
3.0 10.0 c 1.00 c 0.10
[50]
Se pudo observar claramente la formación de los brotes a los diez días para todas
las combinaciones, sin embargo, en las concentraciones de 3.0-0.5 mg/L de AIA y
BA y 1.5-1.0 mg/L para AIA y BA, los brotes estaban muy desarrollados y se
lograba apreciar la formación de tallos, a diferencia de los brotes formados en las
combinaciones de 3.0-1.5 mg/L de AIA y BA y 1.5-3.0mg/L de AIA y BA, en donde
los brotes eran pequeños y aun no estaban muy desarrollados (Fig. 11). Vanegas
y col. (2002) reportaron que el periodo adecuado de permanencia de los explantes
en el medio fue de 13 días, obteniendo un 37.5% mas de explantes con brotes, en
comparación con los explantes expuestos al medio solo nueve días. En este
trabajo, los explantes se dejaron 13 días en el medio y nuevamente se realizó la
cuantificación, observando que no hubo formación de más brotes; solo el
desarrollo y crecimiento de los que se habían formado previamente. Debido a esto,
para los siguientes experimentos, los explantes se expusieron solo diez días al
medio.
Para realizar el seguimiento del proceso de organogénesis, fue necesario elegir la
combinación de reguladores en la que se obtuvo el mayor porcentaje de explantes
con formación de brotes, por lo que se eligió la concentración de 3.0 y 0.5 mg/L de
AIA y BA debido a que en esta combinación, antes de los diez días que duró el
experimento, se logró apreciar la formación de brotes en más de la mitad de los
explantes sembrados.
[51]
Figura 11. Brotes formados en medio MS con AIA y BA durante el proceso de
organogénesis después de 10 días de siembra. A) 3.0 mg/L de AIA y 0.5 mg/L de
BA; B) 3.0 mg/L de AIA y 1.5 mg/L de BA
A
B
[52]
Una vez determinada la combinación de reguladores de crecimiento en la que la
mayor cantidad de explantes formaban brotes en el menor tiempo, se realizó el
seguimiento del proceso de organogénesis.
8.4.1.1 Análisis cualitativo del proceso de organogénesis
Para realizar el análisis cualitativo del proceso de organogénesis se sembraron 90
explantes de hoja en medio MS con 3.0 mg/L de AIA y 0.5 mg/L de BA y se
capturaron imágenes desde el primer día de siembra hasta la formación completa
de los brotes (Fig. 12).Se pudo observar que a partir del primer día en que los
explantes se sembraron en el medio, éstos comenzaron a curvarse exponiendo el
envés, para el día tres la coloración verde fue disminuyendo, comenzando en el
centro del explante, en el día cinco se logró apreciar el crecimiento del explante de
casi el doble con respecto al tamaño inicial y la curvatura que adquirió en el primer
día se hace mas evidente; para el día seis se comenzó a observar la formación de
callo en el área del envés y la aparición de pequeñas protuberancias que para el
día siete se desarrollaron en brotes. En los días siguientes, estos brotes siguieron
creciendo junto con la aparición de callo en toda el área del explante (Fig. 12). Las
imágenes capturadas se analizaron a simple vista y se seleccionaron los días en
los que los cambios morfológicos fueron mas evidentes para realizar el análisis
histológico del proceso de organogénesis mediante MET. Los días seleccionados
fueron 0, 4, 7 y 9 después de la siembra (Fig. 13), los cuales coinciden con los
días seleccionados previamente para analizar el proceso de desdiferenciación.
[53]
Figura 12. Imágenes del proceso de organogénesis en explantes foliares
de Tagetes erecta. Explantes cultivados en medio MS adicionado con 3. 0
mg/L de AIA y 0.5 mg/L de BA, en un periodo de 10 días. La barra indica 2
mm.
2X
3X
0 1 2
3 4
2X
5
6 7 8
9
1X
10
[54]
Figura 13. Desarrollo del explante foliar durante el proceso de organogénesis.
Días después de la siembra: A) 0, B) 4, C)7 y D) 9.
C D
A B
2 mm
[55]
8.4.2 Embriogénesis somática en explantes de hoja y callo
Se realizaron tres distintos ensayos para inducir el proceso de embriogénesis a
partir de explantes de hoja y de callo de cempaxúchil, siguiendo lo reportado por
Bespalhok y Hattori (1998), Saji y Sujatha (1998), Mandal y Datta (2005), quienes
indujeron este proceso en cempaxúchil, girasol y crisantemo respectivamente.
8.4.2.1 Inducción de la embriogénesis somática con TDZ
Se sembraron explantes de hoja y de callo en medio MS adicionado con TDZ,
partiendo de lo reportado por Bespalhok y Hattori (1998) quienes utilizan 0.010
mg/L, para este ensayo se probaron también las concentraciones de 0.005, y
0.020 mg/L. Se pudo observar a los ocho días, en el microscopio estereoscópico,
la formación de pequeñas burbujas (estructuras globulares) en las heridas y en los
bordes de los explantes, este fenómeno se presentó en las tres concentraciones
utilizadas (Fig. 14). A los 12 días se apreció que las burbujas que antes eran color
verde, posteriormente presentaron una coloración café y no se observó la
formación de nuevas estructuras, o el desarrollo de aquellas formadas
previamente; a los 14 días los explantes presentaron una gran parte del tejido con
zonas de color café. Al observar con el microscopio estereoscópico, se pudo
apreciar que las estructuras se necrosaron (Fig. 14). Por la forma de las
estructuras desarrolladas, se pensó que se podrían estar obteniendo respuestas
favorables en cuanto al proceso de embriogénesis, por lo que el experimento se
[56]
Figura 14. Explantes de hoja sembrados en medio MS adicionado con tres
diferentes concentraciones de TDZ (0.005, 0.010 y 0.020 mg/L). Las
flechas indican algunas de las estructuras globulares formadas.
TDZ (mg/L)
0.005 0.010 0.020
8 días 15 días 21 días
[57]
repitió utilizando hojas cotiledoneales, las cuales se emplearon debido a que, por
ser tejido más joven no contienen compuestos fenólicos que son los que pudieron
estar promoviendo la oxidación; sin embargo, los resultados fueron los mismos
que con el experimento anterior, se formaron estructuras esféricas en el contorno
y en las heridas de los explantes, a los 15 días estas estructuras comenzaron a
oxidarse sin lograr desarrollarse. Se realizó un tercer ensayo utilizando solo la
concentración de 0.020 mg/L de TDZ y 35 mg/L de ácido ascórbico, utilizando
explantes de hojas. Se desarrollaron las estructuras esféricas, las cuales se
mantuvieron durante más de un mes sin presentar oxidación, sin embargo, éstas
no desarrollaron alguna otra estructura característica del proceso de
embriogénesis (Fig. 15).
En los explantes de callo no se apreció el desarrollo de las estructuras observadas
en los explantes de hoja; sin embargo, a los 21 días comenzaron a aparecer
raíces en algunos callos sembrados en 0.010 mg/L, las raíces se formaron en la
parte del callo que estuvo en contacto directo con el medio (Fig. 16).
8.4.2.2 Inducción del proceso de embriogénesis con ANA y BA
Se sembraron explantes de hoja y de callo en medio MS adicionado con distintas
concentraciones de ANA y BA partiendo de lo reportado por Saji y Sujhata (1998),
quienes utilizan 0.10 mg/L de ANA y 0.50 mg/L de BA, para este ensayo se
probaron dos concentraciones mas: 0.05 y 0.20 mg/L para ANA y 0.10 y 1.00 mg/L
para BA.
[58]
Figura 15. Explantes de hoja en medio MS adicionado con TDZ (0.020 mg/L) y
ácido ascórbico (35 mg/L). Días después de la siembra: A) 9; B) 17 y C) 31.
A
B
C
[59]
Figura 16. Formación de radículas en explantes de callo después de 21 días
de siembra en medio MS con TDZ (0.01 mg/L).
[60]
En los explantes de hoja, se logró apreciar la formación de raíces para todas las
combinaciones, sin la formación de estructuras características del proceso de
embriogénesis (Fig. 17A y C). En los explantes de callo no se presentó formación
de brotes o embriones, sin embargo, en las combinaciones de 0.05 mg/L de ANA-
1.00 mg/L de BA y 0.10 mg/L de ANA-1.00 mg/L de BA, se formaron raíces en los
bordes del explante, y hubo una mayor formación de éstas en la que se empleó
una mayor concentración de ANA (Fig. 17B y D). Los callos desarrollados con las
distintas concentraciones de ANA y BA fueron callos muy compactos y de color
amarillo.
8.4.2.3 Inducción del proceso de embriogénesis con 2,4-D y BA
Se sembraron explantes de hoja y de callo en medio MS adicionado con distintas
concentraciones de 2,4-D y BA partiendo de lo reportado por Mandal y Datta,
(2005), quienes utilizaron 5.0 mg/L de 2,4-D y 3.0 mg/L de BA, para este ensayo
se probaron dos concentraciones mas: 4.0 y 6.0 mg/L de 2,4-D y 2.0 y 5.0 mg/L de
BA. En los explantes de hojas sembrados en las distintas concentraciones de 2,4-
D (4.0, 5.0 y 6.0 mg/L) y BA (2.0, 3.0 y 5.0) no hubo crecimiento de alguna
estructura características del proceso de embriogénesis, ni la aparición de raíces,
brotes o embriones, solo algunos explantes presentaron la formación de callo (Fig.
18A). En los explantes de callo tampoco hubo formación de estructuras
embriogénicas o brotes, sin embargo, el crecimiento de los callos fue favorable,
apreciándose callos friables y de color amarillo (Fig. 18B).
[61]
Figura 17. Raíces formadas en explantes de hoja y callo en medio con ANA y BA.
Explantes de hoja (A) y callo (B) en 0.05 mg/L de ANA y 1.00 mg/L BA. Explantes de
hoja (C) y callo (D) en 0.10 mg/L de ANA y 1.00 mg/L BA, B) 0.10 -1.00 mg/L de ANA y
BA.
A) B
C) D
A
C
[62]
Figura 18. Explantes de hoja y callo en medio MS con 2,4-D (6.0 mg/L) y BA (2.0
mg/L) para la inducción del proceso de embriogénesis. A) Explantes de hoja; B)
explantes de callo.
B
A
[63]
8.5 Análisis histológico del proceso de desdiferenciación
Una vez seleccionados los días en que los explantes sufrían cambios notables en
cuanto a forma y tamaño, se realizó el análisis histológico.
En el día cero (Fig. 19A) se observó tejido característico del mesófilo, donde se
logró diferenciar la presencia de cloroplastos con gránulos de almidón; los
cloroplastos se encontraban ubicados en las células del parénquima en
empalizada (Fig. 19B), estas células tienen una morfología alargada y se
encuentran acomodadas en capas (Bidwell, 1999). En esta etapa se logró
diferenciar también el parénquima esponjoso (Fig. 19C), que se caracteriza por
tener grandes espacios aéreos entre grupos de células, que le permite el
intercambio gaseoso (Bidwell, 1999) y una pared celular muy gruesa (Fig.19D) que
define el tamaño y la forma de las células (Segura, 2000). En el día cuatro (Fig.
20A) se observó la presencia de células de mayor tamaño, comparadas con el día
cero, en esta etapa se pueden diferenciar células con formas cuadradas,
irregulares o redondeadas, en donde se logró apreciar organelos como el núcleo,
cloroplastos, mitocondrias, retículo endoplásmico y la presencia de gránulos de
almidón que de acuerdo a Zeeman y col. (2004) se caracterizan por estar
formados por un núcleo central cristalino rodeado por un "manto pastoso” (20B y C;
21A y B). La vacuolización de las células fue evidente; se observaron abundantes
vacuolas las cuales se encuentran distribuidas en toda la célula, algunas con un
tamaño superior a los 2 µm (Fig. 21C), este organelo se caracteriza por tener
[64]
Figura 19. Micrografías de un corte transversal de hojas de cempaxúchil
cultivadas in vitro. A) Apariencia del explante en el día 0; B) parénquima en
empalizada (pm); C) parénquima esponjoso (ps) y D) micrografía con mayor
acercamiento del parénquima esponjoso; cl: cloroplastos; a: gránulos de almidón;
pc: pared celular; ps: parénquima esponjoso; pm: parénquima en empalizada;
ec: espacios intercelulares.
B)
D)
cl
a
pm
pc
ps
A)
ps
ps
ec
C)
2 mm
100 nm
[65]
Figura 20. Micrografías de un corte transversal de hojas de cempaxúchil
después de 4 días en medio para inducción de callo. 1) Apariencia del explante;
2) célula completa y 3) acercamiento de una célula, donde se aprecian más
claramente los organelos. a: gránulos de almidón cl: cloroplasto; m: mitocondria;
n: núcleo; re: retículo endoplásmico; v: vacuola.
B)
C)
A)
n
cl
m
A)
C)
2 mm
re
v
m
a
a
a
[66]
Figura 21. Micrografías de células de explantes de hoja de cempaxúchil
después de 4 días en medio para inducción de callo. A y B) Células
completas con distintas formas en donde se distinguen claramente los
organelos y se aprecia la formación de varias vacuolas; C) distribución de las
vacuolas y D) acercamiento a la pared celular, en la fotografía se observa
una pared celular gruesa y la lámina media. cl: cloroplasto; lm: lámina media;
m: mitocondria; n: núcleo; pc: pared celular; re: retículo endoplásmico y v:
vacuola.
B) A)
C)
v
a
v
v
v
n
a
n
cl a
v
v
v
lm
lm
pc
v
re
m
pc
lm
m
D)
[67]
distintas formas tamaños y variar la composición de su contenido dependiendo de
las necesidades de la célula, en las células maduras puede ocupar del 80 al 90 %
del volumen total (Salisbury y Ross, 1992; Bidwell, 1999; Marty, 1999). Después
de cuatro días en el medio para inducción de callo, las células conservaron
paredes bien definidas y se logró diferenciar la lámina media y los espacios entre
las células se hicieron más visibles (Fig. 21D). Para el día diez (Fig. 22A), se pudo
diferenciar células de mayor tamaño formadas por una sola vacuola o el conjunto
de varias que ocupaban gran parte del espacio (Fig. 22B y C), en un tejido
diferenciado, las células inmaduras contienen gran cantidad de vacuolas
pequeñas, que aumentan de tamaño y se fusionan para formar una sola vacuola a
medida que la célula va creciendo y madurando (Marty, 1999), esto sugiere que
las células encontradas en esta etapa se comportan de manera similar a aquellas
que forman un tejido diferenciado: en células inmaduras muchas vacuolas y en
células maduras, una sola vacuola de gran tamaño. Se observó que las células
tuvieron formas mas ovaladas o irregulares; en estas últimas, los organelos como
los cloroplastos y el núcleo se pudieron distinguir claramente y las vacuolas no
eran de gran tamaño a diferencia de aquellas células con formas redondeadas en
donde se apreciaba la pared celular mas delgada y se observaron los espacios
entre las células (Fig. 22D y E). Para el día 15 se pudieron apreciar grandes
vacuolas que ocupaban la mayor parte de la célula, en algunas de estas se logró
distinguir el núcleo, mitocondria y retículo endoplásmico, los cuales fueron
desplazados hacia los márgenes probablemente por efecto de la vacuolización
(Fig. 23).
[68]
ei
v
v
v
v
v
Cl
Figura 22. Micrografías de un corte transversal de hojas de cempaxúchil después de 10 días en medio para inducción de callo. A) Apariencia del explante; B) célula con una vacuola que ocupan casi la totalidad del espacio; C) células con numerosas vacuolas fusionándose; D) organelos visibles en célula con forma irregular y E) espacios intercelulares formados entre células muy vacuoladas. cl: cloroplasto; ec: espacios intercelulares; n: núcleo; pc: pared celular; v: vacuola.
A
A)
3)
v n
cl
ei
ei
ei
Cl
a
V
V V
a
ei
v
v pc
v
pc B) C)
D) E)
2 mm
10 µm
2 µm
[69]
Figura 23. Micrografías de un corte transversal de explante de hoja de
cempaxúchil después de 15 días en medio para inducción de callo. A) Apariencia
del explante (barra= 2 mm); B y C) vacuolización y formas irregulares de las
células; D y E) reacomodo de los organelos hacia los márgenes de la células. a:
gránulos de almidón; cl: cloroplasto; ec: espacios intercelulares; lm: lámina
media; m: mitocondria; pc: pared celular; v: vacuola.
3) 3)
v
v
ec
c
l
v v
pc
v
v
v
n
ec
pc
n
v
re
v
cl
a
a
ec
A)
B) C)
D) E)
v
m
m
m
m
cl a
a
pc
lm
E)
2 mm
cc
a
a
[70]
Los resultados obtenidos en este trabajo indicaron que durante el proceso de
desdiferenciación, se fueron formando gran cantidad de vacuolas que conforme
pasa el tiempo, se fusionaron hasta formar sólo una de gran tamaño, lo que podría
ser resultado de la maduración de las células que conforman el callo. Cuando la
célula presentó una sola vacuola que ocupaba la mayor parte del espacio, era una
célula madura de callo; en cambio, las células isodiamétricas, formadas por
múltiples vacuolas pequeñas, y paredes delgadas, son características de células
jóvenes o de tipo meristemático (Litz y Jarret, 1991). Las células inmaduras están
formadas por paredes primarias que son las que permiten; al disminuir su rigidez,
la extensión de la célula por la presión de turgencia generada dentro de ella
(Cosgrove, 2000). Este fenómeno puede estar inducido por la adición de las
auxinas en el medio, ya que éstas promueven al agrandamiento y alargamiento
celular (Del Pozo y col., 2005). El aumento del tamaño de la vacuola incrementa la
presión dentro de la célula, reacomodando los organelos y desplazándolos hacia
el margen de las células conforme esta va madurando. Debido a que al callo lo
conforman células desorganizadas en activa división, es posible encontrar células
maduras, jóvenes y de tamaños distintos conformando la masa amorfa (callo). Es
importante que el explante utilizado para inducir el proceso sea tejido joven, ya
que esta reportado que la edad fisiológica del explante es importante para tener
una mejor respuesta, por que en este tipo de tejidos se encuentran células en
división, que pueden responder más rápidamente a los estímulos (Dodds y
Roberts, 1982).
[71]
Algunos de los resultados de este trabajo coincidieron con lo reportado por Orbán
y col. (2007), quienes indujeron la formación de callo en Rubia tinctorium y
reportaron que entre los siete y nueve días, los organelos dejan de ser visibles y
se formó una vacuola de gran tamaño. También reportan que el contenido de
almidón se va haciendo indetectable conforme aumenta el grado de
desdiferenciación, en este trabajo a partir de los diez días la cantidad de almidón
va disminuyendo y en el día 15 ya no se logró apreciar.
En la figura 24 se presenta un resumen del proceso de desdiferenciación, el cual
se indujo en medio MS con 2 mg/L de BA y 2 mg/L de 2,4-D, se muestran los
datos obtenidos del tratamiento de imágenes: perímetro (P), área (A), dimensión
fractal del perímetro (Dfp), el factor elíptico (FE); y, las micrografías capturadas de
los días 0, 4, 10 y 15 después de la siembra. Con los datos de área y perímetro,
es posible apreciar el aumento de tamaño que sufren los explantes conforme el
grado de desdiferenciación se hace más evidente. Para el día 15, el área aumentó
casi cinco veces y el perímetro aumentó poco más del doble con respecto al
tamaño inicial del explante. Esta característica indica que el tejido va aumentando
de tamaño y el borde va haciéndose más rugoso. Con los valores de la dimensión
fractal del perímetro, se pudo observar que los explantes presentaron en el día
cero valores de 1.05 y para el día 15 de 1.08, lo que indica que el tejido va
adoptando una mayor irregularidad para el día 15, lo que coincide con el aumento
en el perímetro. Los valores del factor elíptico disminuyeron conforme aumenta el
grado de desdiferenciación del tejido, debido a que los explantes van adquiriendo
una forma redondeada.
[72]
Figura 24. Micrografías del proceso de desdiferenciación. Días después de la siembra: A) 0, B) 4; C) 10 y D) 15. Apariencia del explante (1); micrografías de las células durante la formación de callo (2 y 3). P: perímetro; A: área; Df: dimensión fractal del perímetro y FE: factor elíptico.
P (mm)= 12.2 Df=1.05 A (mm
2)= 5.3 FE=1.414
P (mm)= 16.0 Df=1.06 A (mm
2)= 8.5 FE=1.475
P (mm)= 20.9 Df=1.08 A (mm
2)= 14.2 FE=1.472
P (mm)= 25.6 Df=1.08 A (mm
2)= 25.5 FE=1.38
A)
B)
C)
D)
1) 2) 3)
2 mm
2 mm
2 mm
2 mm
[73]
Con el análisis histológico mediante MET se pudieron observar cambios en las
células conforme la aparición del callo es mas evidente, se observaron formas
redondeadas, paredes delgadas, espacios intercelulares grandes y el
reordenamiento de los organelos por efecto de la formación de grandes vacuolas
que ocupan la mayor parte del espacio.
8.6 Análisis histológico del proceso de rediferenciación (organogénesis)
Después de seleccionar las etapas en donde los explantes sufrieron cambios
morfológicos notables durante el proceso de formación de brotes, se realizó el
análisis por microscopía electrónica de transmisión.
En el día cero se apreció el parénquima en empalizada con la presencia de
cloroplastos con gránulos de almidón y el parénquima esponjoso, (Fig. 19).
En el día cuatro, se observaron células con formas redondas e irregulares, muy
vacuoladas con paredes delgadas. En algunas se observaron organelos como
núcleo, mitocondrias, cloroplastos, vacuolas y gránulos de almidón que de
acuerdo con algunos autores (Litz y Jarret, 1991; Bidwell, 1999), es necesario para
que las células puedan rediferenciarse y formar órganos ya que funciona como
reserva de energía (Fig. 25). Las células observadas en el día cuatro
podrían encontrase en activa división y probablemente están por iniciar el proceso
[74]
Figura 25. Micrografías de un corte transversal de explante de hoja de cempaxúchil
después de 4 días en medio para inducción de organogénesis. A) Apariencia del
explante; B, C, D y E) células con distintas formas, organelos visibles y paredes
delgadas. a: gránulos de almidón; cl: cloroplasto; ei: espacio intercelular; m:
mitocondria; n: núcleo; pc: pared celular; v: vacuola
v
pc
cl
a
a
2µm
n v
cl v
a
n
n
ei
v
m
2µm
A)
B) C)
D) E)
2 mm
v
v
v
v
a
a
cl
ei
v
v
v
v
v
pc
ei
2 µm
[75]
de desdiferenciación, inducido por la adición de los RCV al medio. Es en esta
etapa donde las células se hacen competentes para formar los llamados
“meristemoides” que posteriormente podrán desarrollarse y formar los brotes
adventicios; este proceso se le conoce como “inducción” (Sugiyama, 1999). En el
día nueve, se pudieron apreciar células grandes con formas irregulares,
vacuoladas, con paredes gruesas y espacios intercelulares grandes (Fig. 26).
Estas células podrían encontrarse en la fase de morfogénesis, que es donde las
células sufren múltiples divisiones para rediferenciarse y formar un órgano
determinado.
La figura 27 muestra en resumen el proceso de rediferenciación (organogénesis)
inducido en medio MS adicionado con 3.0 mg/L de AIA y 0.5 mg/L de BA. En los
primeros días de aprecio la formación de callo en los bordes de los explantes,
característica determinante del proceso de organogénesis indirecta. A nivel celular,
se observaron vacuolas grandes, la formación de gránulos de almidón y, conforme
pasaron los días, las células tomaron formas irregulares con paredes gruesas
probablemente especializándose para la posterior formación de órganos.
[76]
Figura 26. Micrografías de un corte transversal de explante de hoja de
cempaxúchil después de 9 días en medio para inducción de organogénesis. A)
Apariencia del explante; B, C, D y E) células con formas irregulares,
probablemente listas para la formación del órgano determinado. ei: espacio
intercelular; n: núcleo; pc: pared celular; v: vacuola
10 µm 2 µm
A)
B) C)
D) E)
v
v
v
v
V
v
pc
n
n
pc
ei
ei
2 mm
[77]
Figura 27. Micrografías del proceso de organogénesis. Días después de la
siembra: A) 0, B) 4; C) 9. Apariencia del explante (1); micrografías de las
células durante la formación de brotes (2 y 3).
A)
1) 2) 3)
B)
C)
2 mm
2 mm
2 mm
[78]
Mediante la captura de imágenes, en este trabajo, fue posible hacer un
seguimiento de los procesos, de desdiferenciación (hasta la formación de callo), y
de rediferenciación (organogénesis) hasta la formación de brotes, en explantes
foliares de cempaxúchil. Se registraron cuantitativamente los cambios ocurridos en
la formación de callo mediante el tratamiento digital de imágenes (TDI), esta
herramienta se utilizó con la finalidad de emplear parámetros objetivos en
procesos que normalmente han sido evaluados de manera subjetiva. Mediante la
captura de imágenes y el TDI se establecieron etapas de desarrollo que fueron
observadas por MET para conocer la organización celular y relacionarla con los
cambios morfológicos de los explantes. Los resultados obtenidos permiten sentar
las bases para identificar las etapas en que las células se encuentren competentes
para seguir alguno de los procesos estudiados (desdiferenciación y
rediferenciación), lo que permitirá, en un futuro facilitar ensayos de transformación
genética, regeneración de plantas y/o embriogénesis somática.
[79]
VIII. CONCLUSIONES
Durante el proceso de desdiferenciación, se observó a simple vista una
disminución en la coloración verde de los explantes y un aumento de
tamaño conforme la aparición de callo fue más evidente.
El crecimiento del callo es confirmado con los datos de área y perímetro
obtenidos mediante el tratamiento digital de imágenes, donde se pudieron
observar dos etapas, una de lento crecimiento y una segunda etapa donde
se presentó un crecimiento acelerado.
Se lograron establecer las concentraciones adecuadas de AIA y BA y el
tiempo de exposición de los explantes foliares al medio para promover la
formación de brotes, mediante el proceso de organogénesis indirecta.
Se realizaron ensayos para la obtención de embriones somáticos, lo que
permitió conocer los RCV que podrían promover la formación de las
estructuras características del proceso.
Mediante el tratamiento de imágenes del proceso de desdiferenciación y la
captura de imágenes del proceso de organogénesis, fue posible establecer
las etapas de desarrollo para realizar el análisis histológico mediante MET.
[80]
Se observó a simple vista durante la formación de órganos, la disminución
en la coloración del explante, un aumento de tamaño y la aparición de callo
en los bordes antes de la formación de los órganos.
Con el análisis histológico se observaron las distintas formas celulares
durante el proceso de desdiferenciación y la formación de órganos.
[81]
IX. PERSPECTIVAS
El conocimiento de los procesos de desdiferenciación y rediferenciación a nivel
celular contribuirá a trabajos encaminados a transformar genéticamente el
cempaxúchil, con la finalidad de potenciar sus pigmentos y/o algún otro metabolito
de interés, incrementando su eficiencia ya sea transformando explantes inducidos
a callo u órganos.
[82]
VII. BIBLIOGRAFÍA
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