INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONALtesis.ipn.mx/jspui/bitstream/123456789/14545/1/Tesis 2014...

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CENTRO DE DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS

EVALUACIÓN DE BACTERIAS RIZOSFÉRICAS DE Jatropha curcas L.

CONTRA Fusarium verticillioides Y Leptoglossus zonatus

TESIS

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE

MAESTRÍA EN CIENCIAS

EN

MANEJO AGROECOLÓGICO DE PLAGAS Y ENFERMEDADES

PRESENTA

HÉCTOR HERNÁNDEZ GUERRA

YAUTEPEC, MORELOS, JULIO DE 2014

El presente trabajo se realizó en el Laboratorio de Fitopatología y Laboratorio de Ecología

Química de Insectos del Departamento de Interacciones Planta-Insecto del Centro de

Desarrollo de Productos Bióticos del Instituto Politécnico Nacional bajo la dirección de la

Dra. Ana Niurka Hernández Lauzardo y del Dr. Víctor Rogelio Castrejón Gómez. Para la

realización de los estudios se contó con becas proporcionadas por el CONACyT (No.

480185) y del Programa Institucional de Formación de Investigadores de la Secretaria de

Investigación y Posgrado (SIP) del IPN. La investigación fue realizada con el

financiamiento otorgado a los proyectos de la SIP (No. 20121269, 20130490).

AGRADECIMIENTOS

A la Dra. Ana Niurka Hernández Lauzardo, Víctor Rogelio Castrejón Gómez por

permitirme ser parte de este proyecto de tesis, por sus enseñanzas, paciencia y apoyo en

todo momento.

Al Dr. Miguel Gerardo Velázquez del Valle por apoyarme y estar en disposición de

ayudarme, por sus enseñanzas y aportes al desarrollo de la tesis.

Al Dr. Rodolfo Figueroa Brito, Dr. Federico Castrejón y al Dr. Francisco Rodríguez

González por formar parte de mi comité tutorial, enseñanzas y aportes para el desarrollo

del trabajo de tesis.

A los Profesores de MAPE Dr. René Arzuffi, Dr. Roberto Montes, y la M. en C. Hilda

Elizabeth Moctezuma por sus enseñanzas impartidas dentro y fuera de las aulas.

A los administrativos del CeProBi, Lic. Elvia, Gabriel, Vanesa y todos aquellos que

siempre estuvieron con la disposición de ayudarme y que esto se prolongó durante toda

la Maestría.

DEDICATORIAS

A Dios por permitirme dar un paso más en mi formación académica y continuar este largo

camino de la vida.

A mi madre por darme todo su apoyo, cariño, amor y guiarme en este camino de la vida

con su paciencia y consejos.

A mi padre querido en paz descanse por enseñarme a trabajar de manera honrada y

esforzarme por todo aquello que vale en la vida.

A mis hermanos Jesús, Hugo y José Nicolás por su apoyo incondicional y a mi sobrina

Mariela.

A mis compañeros y amigos de la Maestría: Angel, Gustavo, José Miguel, Teresa, Valeria,

Erubiel, Humberto, Gilberto, Miguel y a los otros compañeros que hicieron también amena

esta estancia: Mari, Liliana, Cinthia, Monserrat, Itzel, Mitsu y demás personas especiales

que conocí dentro de la Maestría.

CONTENIDO

ÍNDICE DE CUADROS

I

ÍNDICE DE FIGURAS II

RESUMEN V

ABSTRACT VI

1. INTRODUCCIÓN 1

2. REVISIÓN DE LITERATURA 3

2.1 Clasificación taxonómica, características morfológicas y centro de

origen de Jatropha curcas L.

3

2.2 Localización, importancia y principales usos de Jatropha curcas 4

2.3 Problemas de sanidad del cultivo de Jatropha curcas 6

2.4 Principales enfermedades fúngicas en el cultivo de Jatropha curcas 7

2.5 Fusarium verticillioides 9

2.5.1 Características morfológicas 10

2.5.2 Distribución y biología 10

2.5.3 Daños 11

2.6 Plagas 12

2.6.1 Taxonomía y distribución de Leptoglossus zonatus Dallas 13

2.6.2 Importancia económica y ecológica 15

2.6.3 Ciclo biológico 15

2.6.4 Daños 16

2.7 Manejo de plagas y enfermedades en el cultivo de Jatropha curcas 16

2.7.1 Potencial de las bacterias rizosfericas como agentes de control

biológico

17

2.7.1.1 Bacillus subtilis 19

2.7.1.2 Bacillus mojavensis 19

2.7.1.3 Bacillus thuringiensis 20

2.7.1.4 Lysinibacillus sphaericus 21

2.8 Actividad antagonista de las bacterias rizosféricas 21

2.9 Actividad entomopatógena de las bacterias rizosféricas 24

3. OBJETIVOS 29

3.1 Objetivo general 29

3.2 Objetivos específicos 29

4. MATERIALES Y MÉTODOS 30

4.1 Material biológico 30

4.1.1 Cepas bacterianas 30

4.1.2 Cepa fúngica 30

4.1.3 Establecimiento de la cría de Leptoglossus zonatus 30

4.2 Establecimiento de las cinéticas de crecimiento de Bacillus

subtilis, Bacillus mojavensis, B. thuringiensis y Lysnibacillus

sphaericus.

32

4.2.1 Cinética en medio caldo nutritivo 33

4.2.2 Cinética en medio caldo nutritivo más extracto de levadura

suplementado con sales para Bacillus thuringiensis y

Lysinibacillus sphaericus

33

4.3 Observación de cristales de Bacillus thuringiensis y Lysinibacillus

sphaericus

33

4.4 Bioensayos de antagonismo in vitro 34

4.4.1 Cultivo dual de bacterias rizosféricas y Fusarium verticillioides.

Cultivo bacteriano en agar nutritivo

34

4.4.2 Cultivo dual de bacterias rizosféricas y Fusarium verticillioides.

Bacterias crecidas en caldo nutritivo

35

4.5 Evaluación del efecto de bacterias rizosféricas sobre la

morfología hifal de Fusarium verticillioides mediante microscopia

óptica

35

4.6 Evaluación del efecto de Bacillus thuringiensis y Lysinibacillus

sphaericus sobre la mortalidad de la ninfa 4 de Leptoglossus

zonatus

36

4.7 Evaluación del efecto biológico de Bacillus thuringiensis y

Lysinibacillus sphaericus sobre el peso de la ninfa 4 a ninfa 5 de

Leptoglossus zonatus

37

5. RESULTADOS 38

5.1 Cinéticas de crecimiento de Bacillus subtilis, Bacillus mojavensis,

Bacillus thuringiensis y Lysnibacillus sphaericus en medio caldo

nutritivo

38

5.2 Cinéticas de crecimiento y observación de cristales de Bacillus

thuringiensis y Lysnibacillus sphaericus en medio caldo nutritivo

más extracto de levadura suplementado con sales

40

5.3 Evaluación del efecto de bacterias rizosféricas en el crecimiento

micelial de Fusarium verticillioides en cultivo dual (bacteria

crecida en agar nutritivo)

42

5.4 Evaluación del efecto de bacterias rizosféricas en el crecimiento

micelial de Fusarium verticillioides en cultivo dual (bacteria

crecida caldo nutritivo)

45

5.5 Efecto de bacterias rizosféricas sobre la morfología hifal de

Fusarium verticillioides

49

5.6 Evaluación de Bacillus thuringiensis y Lysinibacillus sphaericus

sobre la mortalidad de Leptoglossus zonatus

55

5.7 Evaluación del efecto biológico de Bacillus thuringiensis y

Lysinibacillus sphaericus en el peso de la ninfa 4 a ninfa 5 de


55

6. DISCUSIÓN 56

7. CONCLUSIONES 61

8. LITERATURA CITADA 62

ÍNDICE DE CUADROS

Cuadro 1. Clasificación taxonómica de Jatropha curcas L. 3

Cuadro 2. Reportes de hongos fitopatógenos que afectan a Jatropha curcas L. 8

Cuadro 3. Clasificación taxonómica de Fusarium verticillioides (Sacc.) Nirenberg 9

Cuadro 4. Insectos plaga en el cultivo de Jatropha curcas L. 13

Cuadro 5. Clasificación taxonómica de Leptoglossus zonatus Dallas 14

Cuadro 6. Bacillus spp. utilizados en el biocontrol de fitopatógenos 24

Cuadro 7. Bacillus spp. utilizados en el biocontrol de plagas insectiles 25

Cuadro 8. Efecto antifúngico in vitro de bacterias rizosféricas crecidas en agar

nutritivo sobre el crecimiento micelial de Fusarium verticillioides

42

Cuadro 9. Efecto antifúngico in vitro de bacterias rizosféricas crecida en caldo

nutritivo (12 horas) sobre el crecimiento micelial de Fusarium

verticillioides

46

Cuadro10. Efecto antifúngico in vitro de bacterias rizosféricas crecidas en caldo

nutritivo (24 horas) sobre el crecimiento micelial de Fusarium

verticillioides

46

Cuadro 11. Efecto de Bacillus thuringiensis y Lysinibacillus sphaericus sobre la

mortalidad y peso (ninfa 4 a ninfa 5) de Leptoglossus zonatus

55

I

II

ÍNDICE DE FIGURAS

Fig. 1. Ninfas de Leptoglossus zonatus alimentándose de los granos de sorgo

en condiciones de campo.

31

Fig. 2. Cría de Leptoglossus zonatus en condiciones de laboratorio a una

temperatura de 28 ± 2 °C.

32

Fig. 3. Ninfa en vaso de plástico en laboratorio de Ecología Química de

Insectos del CEPROBI-IPN.

37

Fig. 4. Cinética de crecimiento Bacillus thuringiensis (a) y Lysinibacillus

sphaericus (b) en caldo nutritivo. Cultivo bacteriano a una temperatura

de 28 ± 2 °C en agitación a 150 rpm

38

Fig. 5. Cinética de crecimiento Bacillus thuringiensis (a) y Lysinibacillus

sphaericus (b) en caldo nutritivo. Cultivo bacteriano a una temperatura

de 28 ± 2 °C en agitación a 150 rpm.

39

Fig. 6. Cinética de Bacillus thuringiensis (a) y Lysinibacillus sphaericus (b) en

medio caldo nutritivo más extracto de levadura y suplementado con

sales. Cultivo bacteriano a una temperatura de 28 ± 2 °C en agitación a

150 rpm.

40

Fig. 7. Observación de cristales de Bacillus thuringiensis mediante tinción con

cristal violeta. (a) 12 h, (b) 16 h, (c) 20 h y Lysinibacillus sphaericus (d)

12 h, (e) 16 h, (f) 20 h. (100X).

41

Fig. 8. Cultivo dual de Bacillus subtilis y Fusarium verticillioides (a) Testigo, (b)

Tratamiento. Incubadas a una temperatura de 28 ± 2 °C.

43

Fig. 9. Cultivo dual de Bacillus mojavensis y Fusarium verticillioides (a)

Testigo, (b) Tratamiento. Incubadas a una temperatura de 28 ± 2 °C

durante siete días.

44

Fig. 10. Cultivo dual de Bacillus thuringiensis y Fusarium verticillioides (a)

Testigo, (b) tratamiento. Incubadas a una temperatura de 28 ± 2 °C


44

Fig. 11. Cultivo dual de Lysinibacillus sphaericus y Fusarium verticillioides (a)

Testigo, (b) Tratamiento. Incubadas a una temperatura de 28 ± 2 °C


45

Fig. 12. Bacillus subtilis (a) Testigo, (b) Tratamiento en fase exponencial (12 h), 47

III

(c) Tratamiento en fase estacionaria (24 h). Incubadas a una

temperatura de 28 ± 2 °C durante siete días.

Fig. 13. Bacillus mojavensis (a) Testigo, (b) Tratamiento en fase exponencial

(12 h), (c) Tratamiento en fase estacionaria (24 h). Incubadas a una


48

Fig. 14. Bacillus thuringiensis (a) Testigo, (b) Tratamiento en fase exponencial

(12 h), (c) Tratamiento en fase estacionaria (24 h). Incubadas a una

temperatura de 28 ± 2 °C durante siete días

48

Fig. 15. Lysinibacillus sphaericus. (a) Testigo, (b) Tratamiento en fase

exponencial (12 h), (c) Tratamiento en fase estacionaria (24 h).

Incubadas a una temperatura de 28 ± 2 °C durante siete días.

49

Fig. 16. Morfología hifal de Fusarium verticillioides a los siete días (40X). (a)

Testigo, (b) Tratamiento Bacillus subtilis en cultivo dual incubado a una

temperatura de 28 ± 2 °C. Corte en zona de inhibición

50

Fig. 17. Morfología hifal de Fusarium verticillioides a los 14 días (40X). (a)

Testigo, (b) Tratamiento Bacillus subtilis en cultivo dual a una


50


Testigo, (b) Tratamiento Bacillus mojavensis en cultivo dual a una

temperatura de 28 ± 2 °C. Corte en zona de inhibición.

51


Testigo a las 14 días (b) Tratamiento Bacillus mojavensis en cultivo

dual a una temperatura de 28 ± 2 °C. Corte en zona de inhibición.

51


Testigo, (b) Tratamiento Bacillus thuringiensis en cultivo dual a una


52


Testigo, (b) Tratamiento Bacillus thuringiensis en cultivo dual a una


52


Testigo (b) Tratamiento Lysinibacillus sphaericus en cultivo dual a una


53

IV


Testigo, (b) Tratamiento Lysinibacillus sphaericus en cultivo dual a una


53


Testigo, (b) Bacillus subtilis, (c) Bacillus mojavensis, (d) Bacillus

thuringiensis, (e) Lysinibacillus sphaericus. Incubación a una


54

V

RESUMEN

El centro de origen y domesticación de Jatropha curcas L. es México. Este arbusto se

distribuye en varios ecosistemas tropicales y tiene gran potencial para la producción

de biodiesel. Sin embargo, este cultivo puede ser afectado por la presencia de

diversos hongos fitopatógenos que causan diferentes enfermedades y disminuyen la

calidad de sus semillas. Además, algunas plagas insectiles causan daños en J.

curcas. El objetivo de este estudio fue evaluar la actividad antagonista y

entomopatógena de bacterias rizosféricas contra Fusarium verticillioides y

Leptoglossus zonatus. La actividad antagonista de Bacillus subtilis, Bacillus

mojavensis, Bacillus thuringiensis y Lysinibacillus sphaericus fue evaluada contra

Fusarium verticillioides por la técnica de cultivo dual en medio papa dextrosa agar. Las

variables estudiadas fueron el crecimiento micelial y la morfología hifal. Se realizaron

diferentes cinéticas de crecimiento con las cepas bacterianas y la observación de

cristales proteicos de B. thuringiensis y L. sphaericus. Se estableció la cría de L.

zonatus en condiciones de laboratorio. Se evaluó el efecto de B. thuringiensis y L.

sphaericus en la mortalidad y desarrollo de L. zonatus. Los resultados obtenidos

demostraron que todas las cepas de bacterias rizosféricas inhibieron el crecimiento

micelial y afectaron la morfología hifal de F. verticillioides. Las cepas de bacterias

rizosféricas mostraron actividad antagonista contra F. verticillioides con independencia

del medio de cultivo utilizado y de las fases de crecimiento probadas. En estas

condiciones de estudio, B. thuringiensis y L. sphaericus no afectaron la mortalidad ni

el desarrollo de L. zonatus. En general, las cepas de bacterias rizosféricas

evidenciaron actividad antagonista contra F. verticillioides y no mostraron actividad

entomopatógena contra L. zonatus.

V

VI

ABSTRACT

The center of origin and domestication of Jatropha curcas L. is Mexico. This shrub is

distributed in several tropical ecosystems and has great potential for biodiesel production.

Nonetheless, this crop can be affected by the presence of several phytopathogenic fungi

that cause different diseases and diminished the quality of their seeds. Additionally, some

insect pests cause damage in J. curcas. The aim of this study was to evaluate the

antagonistic and enthomopathogenic activity of rhizospheric bacteria against Fusarium

verticillioides and Leptoglossus zonatus. The antagonistic activity of Bacillus subtilis,

Bacillus mojavensis, Bacillus thuringiensis and Lysinibacillus sphaericus was evaluated

against Fusarium verticillioides by dual culture technique in potato dextrose agar medium.

The variables studied were the mycelial growth and hyphal morphology. Different bacterial

growth kinetics was done and observation of protein crystals of B. thuringiensis and L.

sphaericus. The breeding of L. zonatus was established in laboratory conditions. The

effect of B. thuringiensis and L. sphaericus on the mortality and development of L. zonatus

was evaluated. The obtained results demonstrated that all strains of rhizospheric bacteria

inhibited the mycelial growth and affected the hyphal morphology of F. verticillioides. The

strains of rhizospheric bacteria showed antagonistic activity against F. verticillioides

regardless of the cultured medium used and tested growth phases. In this study conditions

B. thuringiensis and L. sphaericus no affect the mortality neither development of L.

zonatus. In general, the strains of rhizospheric bacteria evidenced antagonistic activity

against F. verticillioides and no showed enthomopathogenic activity against L. zonatus.

1

1. INTRODUCCIÓN

Jatropha curcas L. es una planta originaria de México, que se caracteriza por producir

semillas con alto contenido de aceite y es una alternativa a nivel mundial para la

producción de biocombustible (Martínez-Herrera 2006). Posee gran adaptabilidad a

diversas condiciones climáticas y en particular a zonas con suelos pobres en nutrientes y

baja precipitación pluvial, es de ciclo corto y elevada producción de aceite de alta calidad

industrial (Fairless 2007). Además, de sus diversos usos como recuperador y reparador

de suelos, uso medicinal y alimenticio.

Las plantaciones comerciales alrededor del mundo se ubican en zonas tropicales o

subtropicales de Asia, África y América. En México, se ha establecido este cultivo en los

estados de Michoacán, Chiapas, Puebla, Yucatán, Veracruz, Guerrero, Oaxaca y Morelos

con el objetivo principal de obtener “biodiesel” (Martínez-Herrera 2007).

Las semillas de J. curcas son propensas al ataque de fitopatógenos que afectan el

contenido de aceite, que en condiciones normales va del 20 al 40 % (Augustus et al.

2002). La asociación de hongos con la semilla en la etapa de cosecha y bajo

almacenamiento ocasiona daños y degradación de los constituyentes de la semilla,

haciéndola no apta para la extracción de aceite, consumo o siembra. Hoy en día los

problemas relacionados con hongos han sido los más estudiados en este cultivo, algunos

de ellos son los siguientes: Colletotrichum sp., Fusarium moniliforme, Aspergillus sp.,

Rhizopus sp., Penicillium sp., Curvularia lunata, Fusarium equiseti y Fusarium

verticillioides.

Dentro de estos hongos destaca F. verticillioides que se ha encontrado causando pérdida

en la calidad de las semillas, disminuyendo su contenido de aceite, proteínas y lípidos.

Por otra parte, algunas de las plagas que afectan a frutos y semillas de Jatropha curcas

2

son Leptoglossus zonatus Dallas y Pachycoris klugii Burmeister, es importante señalar

que ambas chinches han sido encontradas en el estado de Morelos en cultivos de J.

curcas (Tepole-García et al. 2012). Sin embargo, L. zonatus es la que en sus estados de

ninfa y adulto causa más problemas en frutos y semillas, su daño mecánico provoca la

infección y colonización por hongos, además de reducir el rendimiento y su cantidad de

aceite.

Para el manejo del hongo Fusarium verticillioides y el insecto Leptoglossus zonatus que

afectan la calidad de las semillas, el empleo de agentes bacterianos es una alternativa

natural como control biológico. Estos agentes bacterianos pertenecen a la familia

Bacillaceae y son conocidos como agentes de control biológico o ACBs, los cuales han

sido ampliamente desarrollados como una alternativa a los plaguicidas químicos en el

control de plagas y enfermedades (Jacobsen et al. 2004).

Dentro del grupo de bacilos que muestran una actividad antagonista en contra de hongos

fitopatógenos se han encontrado algunas rizobacterias como Bacillus subtilis, Bacillus

mojavensis, Lysinibacillus sphaericus y actualmente a Bacillus thuringiensis que ha

mostrado actividad antagonista contra algunos hongos como Rhizoctonia solani

(Montealegre et al. 2003). Por otro lado a excepción las dos primeras, también han

demostrado una actividad entomopatógena por su capacidad de producir toxinas en

contra de varios insectos (Carreras 2011, Berry 2012).

3

2. REVISIÓN DE LITERATURA

2.1 Clasificación taxonómica, características morfológicas y centro de origen de

Jatropha curcas L.

Jatropha curcas pertenece a la familia Euphorbiaceae, en 1753 fue propuesto su nombre

por Linnaeus y proviene del griego “iatrós” que significa médico, y “trophé” que significa

alimento (Heller 1996). La clasificación identificación taxonómica de esta planta se

observa en el Cuadro 1. El género Jatropha incluye 188 especies (Govaerts et al. 2012)

es un planta caducifolia que ha despertado el interés en todo el trópico como cultivo para

obtener biocombustible (Openshaw 2000). Sin embargo el conocimiento sobre su

taxonomía, la distribución y la etnobotánica es aún incompleto. Su distribución está

relacionada con las variables ambientales tales como elevación, tipo de clima, suelo y

metros sobre el nivel del mar (Fresnedo-Ramírez y Orozco-Ramírez 2013).

Cuadro 1. Clasificación taxonómica de Jatropha curcas L.

Reino Plantae

División Magnoliophyta

Clase Magnoliopsida

Orden Euphorbiales

Familia Euphorbiaceae

Género Jatropha

Especie Jatropha curcas L.

Heller 1996

Esta planta puede alcanzar de 3 a 5 m de altura (Carels 2009), el diámetro del tronco es

de 15 cm o más en arbustos adultos, la corteza externa es pálida papelosa que se

4

desprende con facilidad y muy delgada con pequeñas lenticelas, la corteza interna lisa

verrugosa de color verde oscuro, látex blanquecino con sabor amargo, ramas robustas,

ascendentes y glabras (Hannan-Jones y Csrhues 2008).

Las hojas adultas miden de 15 a 20 cm de largo y de 14 a 18 cm de ancho, son alternas

con una duración de 7 a 8 meses. Presenta flores monoicas y en ocasiones

hermafroditas. Las flores se encuentran en racimos, cinco sépalos, de hasta 18 mm de

largo. El fruto es una cápsula ovoide, de 4 a 5 cm de largo y 3 a 4 cm de ancho, en estado

inmaduro presenta un color verde y cuando madura se torna de un color amarillo y

después café (Hannan-Jones y Csrhues 2008)

El fruto presenta tres semillas son ovoides de 20 a 24 mm de longitud y 10-12 mm de

ancho y con una línea blanquecina apical, indicando la posición de la carúncula,

endospermo grueso, el embrión con dos cotiledones foliáceos, de 10-13 mm de longitud,

de color blanco crema (Heller 1996).

Investigaciones recientes demuestran que J. curcas es nativa de México y Centroamérica,

aunque su distribución corresponde principalmente a las regiones tropicales de

Sudamérica, África y Asia. Se concluyó que en base a análisis bioquímicos y moleculares

su centro de origen y domesticación se encuentra en el Golfo de (Dias et al. 2012). Dentro

de los nombres comunes que recibe esta planta se encuentran los siguientes: piñón,

piloncillo, jatrofa, nuez negra y skil- te por los mayas en la Península de Yucatán (Jones

1987).

2.2 Localización, importancia y principales usos de Jatropha curcas

Las plantaciones comerciales con mayor superficie sembrada se encuentran en Asía,

donde sobresalen los países de China e India con una superficie sembrada de 2.6

5

millones de hectáreas. En África los países que sobresalen son Magadascar, Zambia,

Mozambique y Tanzania con 120 000 ha. En Latinoamérica la superficie es menor con 21

800 ha, encontrándose a Brasil con el mayor número de hectáreas sembradas con un

total de 15 000 y el resto se encuentran distribuidas en Nicaragua, Colombia Guatemala y

México (Fairless 2007, Gexsi 2008). En el 2011, en México la superficie sembrada de J.

curcas con fines comerciales fue de 2,536 ha de las cuales 2, 450 ha se encuentran

distribuidas en los estados de Yucatán y Quintana Roo (SAGARPA 2011).

En México J. curcas se puede localizar a lo largo de la vertiente del Golfo, desde

Tamaulipas y el Norte de San Luís Potosí pasando por los estados de Hidalgo, Puebla,

Morelos y Veracruz, hasta el Norte de Chiapas. En la vertiente del Pacífico se encuentra

en la Sierra Madre del Sur, Oaxaca y en la Sierra del Soconusco en Chiapas. También se

encuentra en los estados de Tabasco, Yucatán, Michoacán y Guerrero (Reyes-Quintanar

2003). A partir del 2006 se han desarrollado proyectos gubernamentales para establecer

plantaciones comerciales en varios estados de la República Mexicana (Martínez-Herrera

2007).

Actualmente, diversas especies de plantas que pueden ser procesadas para proporcionar

un sustituto al combustible diesel han captado el interés de los científicos siendo una de

ellas J. curcas (Heller 1996). Esta planta es una fuente potencial para la obtención de

biodiesel que demuestra ser una alternativa a la quema de combustibles fósiles (Gubitz et

al. 1999, Fairless 2007, Achten et al. 2008). Se trata de una especie tropical, que tiene un

alcance geográfico más amplio que la palma de aceite ya que se adapta bien a los suelos

pobres en nutrientes y con baja precipitación (King et al. 2009).

6

Dentro de algunos de sus usos se encuentran los siguientes: mejora el control de la

erosión y la infiltración del agua, aportación de materia orgánica al suelo, se utiliza para la

alimentación del ganado, puede ser utilizada en programas de reforestación, base leñosa

para la propagación del cultivo de la vainilla, como barrera de demarcación, leña y uso en

medicina a partir de extractos de diversas partes de la planta, propiedades insecticidas y

moluscocida a partir de extractos de la semilla (Heller 1996).

En México el programa Pro-árbol de la CONAFOR incluyó a J. curcas como un arbusto

forestal no maderable, apoyando con recursos financieros para el establecimiento de

predios con este cultivo (Martínez-Herrera et al. 2010).

2.3 Problemas de sanidad del cultivo de Jatropha curcas

El cultivo de J. curcas en grandes extensiones bajo un sistema de monocultivo presenta

varios problemas relacionados a plagas y enfermedades que pueden dañar cualquier

parte de la planta como raíz, tallo, hoja, inflorescencia fruto y semillas, que no solo afectan

ó disminuyen el rendimiento de semilla, sino también su calidad en condiciones de

almacenamiento, siendo diversos los agentes causales.

Los agentes causales reportados son hongos, bacterias virus, ácaros y diversas plagas

insectiles. Algunos de los problemas que causan son disminución en la germinación de la

semilla, pudrición de raíces en plántulas y en planta adulta la pudrición en tallo provoca la

muerte de ésta, manchas necróticas, royas, cenicillas en hojas y pudrición de

inflorescencias. Ácaros y larvas de insectos se alimentan de hojas. El aborto de frutos es

provocado por insectos. En condiciones de almacenamiento hongos fitopatógenos afectan

la calidad de aceite de la semilla o bien afectan la viabilidad de ésta cuando es utilizada

para la producción de plántula. Hasta el 2012 se han reportado más de 35 especies de

7

hongos, 4 virus, 4 bacterias, 6 nematodos y alrededor de 60 especies de insectos que

afectan el cultivo de Jatropha curcas (Anitha y Varapasrad 2012).

2.4 Principales enfermedades fúngicas en el cultivo de Jatropha curcas

En los últimos años se ha informado sobre la susceptibilidad de J. curcas a diferentes

enfermedades, alrededor del mundo se ha determinado que J. curcas es atacada por

diversos hongos fitopatógenos estudiados hasta ahora en Asia, África y América. La

calidad de la semilla de J. curcas debe mantenerse durante la producción, cosecha y

almacenamiento, ya sea como semillas para la producción de plántulas o para producción

de biodiesel. La semillas se ven afectadas por poblaciones fúngicas que disminuyen la

cantidad de lípidos, contenido de ácidos grasos libres y la viabilidad de las mismas

(Dharmaputra et al. 2009).

Algunos Ommicetes tales como Phythophora sp. Pythium sp. (Valdés et al 2011) y el

hongo Fusarium moniliforme causan pudrición de la raíz (Kaushik et al. 2001). Los

géneros causantes de pudrición de manchas foliares son Helminthosporium,

Pestalotiopsis, Cercospora (Garcete et al. 2009). Mientras que las enfermedades en raíz

y tallo son causadas por Lasiodiplodia teobramae (Pereira et al. 2009).

Recientemente, en México se ha reportado al hongo Alternaria alternata que afectan al

cultivo de J. curcas provocando manchas necróticas de color café en plantaciones

localizadas en parcelas experimentales en Sinaloa, México (Espinoza-Verduzco et al.

2012). Otro más es Phakopsora arthuriana causante de una roya en las hojas que fue

encontrada en Puebla, México en 2011 y 2012 (Nolasco-Guzmán et al. 2013).

Diversos hongos causan pérdidas y disminución de la viabilidad de semillas de J. curcas

en condiciones de almacenamiento, la concentración de ácidos grasos y la concentración

8

proteica y por ende una disminución en la producción de biodiesel (Worang et al. 2008).

Dentro de los géneros involucrados se encuentran a Fusarium, Curvularia, Aspergillus,

Penicilium (Worang et al. 2008, Dharmaputra et al. 2009). Se hace referencia a los

hongos reportados en el cultivo de J. curcas en sus diversas partes vegetativas en el

Cuadro 2.

Cuadro 2. Reportes de hongos fitopatógenos que afectan a Jatropha curcas L.

Agente causal Parte vegetativa

que afecta

Daño o síntoma Referencia

Fusarium moniliforme Raíz Pudrición Kaushik et al. 2001

Lasiodiplodia

theobromae

Pudrición de raíz

y cuello

Latha et al. 2009,

Pereira et al. 2009

Cercospora sp. Hoja Mancha

necrótica

Garcete et al. 2009

Phakopsora jatrophicola

Alternaría sp.

Phakopsora arthuriana

Collectotrichum

gloeporoides

Roya

Roya

Necrosis

Nolasco-Guzmán et

al. 2013

Kwon et al. 2012

Alternaria alternata Inflorescencia Manchas

necróticas

Espinoza-Verduzco

et al. 2012

Cladosporium sp.,

Fusarium verticillioides.

Curvularia lunata y

Fusarium equiseti

Semillas

Disminuyen

germinación

Worang et al. 2008

Pabón-Baquero

2013

9

2.5 Fusarium verticillioides

El género Fusarium es el anamorfo de varios hongos de Ascomicetes que pertenecen al

orden Hypocreales y a la famila Nectriaceae (Cuadro 3). El estado sexual o teleomorfo

pertenece a los géneros Nectria y Giberella. Es el agente causal de pudrición de raíz,

hoja, fruto y semillas en diversos cultivos. Fusarium verticillioides es uno de los principales

hongos que generan problemas en granos almacenados de cereales (De León 2004)

también se ha encontrado afectando bulbos de ajo (Ochoa-Fuentes et al. 2012), además

de causar daños a la salud humana (Desjardins 2006). Recientemente, F. verticillioides

se ha encontrado afectando semillas almacenadas de J. curcas (Dharmaputra et al.

2009).

Cuadro 3. Clasificación taxonómica de Fusarium verticillioides (Sacc.) Nirenberg

Reino Fungi

Phylum Ascomycota

Clase Deutoromycete

Orden Hypocreales

Familia Hypocreaceae

Género Fusarium

Especie Fusarium verticillioides

Díaz de Castro et al. 2007

10

2.5.1 Características morfológicas

Se caracteriza por poseer conidióforos abundantes y microconidios fusiformes a ovoides,

formando largas cadenas. Los microconidios se producen en monofialides. Los

macroconidios son rectos a ligeramente curvados, de paredes delgadas y poseen la

célula basal con forma de pie, se producen en bajo número. Fusarium verticillioides es

miembro de la sección Liseola, en la que sus integrantes no forman clamidosporas, sino

hinchamientos de hifas que ocasionalmente son confundidas con pseudoclamidosporas.

Inicialmente, aislamientos de este hongo en medio PDA tienen un crecimiento micelial de

color blanco, posteriormente naranja y finalmente morado (Leslie y Summerell 2006). Se

considera que los aislamientos de F. verticillioides que producen pigmentos en medio de

cultivo PDA, son más virulentos (Kimura et al. 1981, Visconti et al. 1983). No obstante, su

efecto como factor de virulencia aún no está bien definido (Medentsev et al. 2005).

2.5.2 Distribución y biología

F. verticillioides presenta una distribución mundial se encuentra en zonas de clima

templado, extendiéndose a zonas de clima tropical y subtropical. Raramente se presenta

en zonas de temperaturas frías, aunque ha sido encontrado en Rusia (Bacon y Nelson

1994). Es un hongo que se encuentra en el suelo, causando pudriciones de raíz en

plántula, marchitamientos vasculares, manchas necróticas y tizones en hojas. Causa

pérdida en la calidad de semillas disminución de la viabilidad en condiciones de campo y

almacenamiento (Bai y Shaner 2004, Dharmaputra et al. 2009).

F. verticillioides puede permanecer en el suelo dentro de fragmentos de tallos enterrados

a 30 cm de la superficie, con humedad de 5 a 35%, y temperatura de 5 a l0°C durante

doce meses. En condiciones de laboratorio la temperatura óptima para el crecimiento de

11

es de 22.5 a 27. 5 °C con un máximo de 32 a 35 °C y una temperatura mínima de -5 °C a

2.5 °C. (Bacon y Nelson 1994). Llega a infectar raíces de la planta a partir de su presencia

en residuos de plantas y suelo. Los microconidios funcionan como propágulos

produciendo infecciones secundarias en diversos cultivos (Sanabria et al. 2002). Tiene la

capacidad de desarrollar la enfermedad en plantas procedentes de semillas. Llega a

causar un declinamiento o muerte de las plantas antes de que alcancen su estado

reproductivo.

2.5.3 Daños

La calidad de las semillas de J. curcas depende del grado de madurez del fruto,

contenido de humedad, condiciones de almacenamiento, duración del almacenamiento,

buena viabilidad y vigor de las semillas, sin embargo está sujeta al deterioro que causan

los microorganismos que colonizan granos y semillas, dentro de ellos encontramos a los

hongos ya que son los más tolerantes a la baja disponibilidad de agua en condiciones de

almacenamiento.

Durante el almacenamiento de granos o semillas, éstas pueden ser infectadas por hongos

que causan una disminución de la viabilidad, decoloración, pérdida de peso, cambios

químicos y nutricionales, calentamiento, apelmazamiento y contaminación por

micotóxinas. Chelkowski en 1991 informó, que en muchos de los casos, los hongos que

infectan granos provienen de la semilla, esta juega un papel importante en la transmisión

de numerosas especies de hongos patógenos para plántulas e infección del suelo. F.

verticillioides afecta la semilla de J. curcas en condición de almacenamiento disminuyendo

la cantidad de lípidos, contenido de ácidos grasos libres y la viabilidad de las semillas

(Dharmaputra et al. 2009).

12

2.6 Plagas

Al establecer plantaciones de J. curcas bajo condiciones de monocultivo, es posible que

muchos organismos, representen un problema debido a que son plagas potenciales si se

presentan las condiciones ambientales adecuadas (Heller 1996). En los últimos años, a

nivel mundial, se han reportado organismos que representan un problema fitosanitario en

el cultivo de J. curcas. Diversos estudios registran que cultivos de J. curcas de forma

comercial reportan plagas insectiles que afectan a la raíz, hojas, tallos, inflorescencias y

frutos (Cuadro 4). Hasta 2012 se han reportado alrededor de 60 especies de insectos

(Anitha y Varaprasad 2012).

Dentro de los insectos que afectan la raíz se encuentran algunos gusanos de alambre,

gallinas ciegas, las hojas se ven dañadas por grillos, gusanos y ácaros. El tallo es

barrenado por un escarabajo de la familia Cerambicidae. Los frutos se ven afectados por

dos insectos que pueden afectar su desarrollo o provocar aborto de éstos, P. klugii y L.

zonatus, ambos especímenes reportados en México en el estado de Morelos (Tepole-

García et al. 2012). La inflorescencia también se ve afectada por el polinizador

Hypselonotus intermedius cuando se encuentra en altas densidades (Grimm 1999).

13

Cuadro 4. Insectos plaga en el cultivo de Jatropha curcas L.

Insecto Daño Referencia

Pempelia

morosalis

Se alimenta de flores y

frutos

Shanker y Dhyani 2006

Scutellera nobilis

Caída de flores, aborto de

frutos, malformaciones en

semilla


Oxycetonia versicolor Se alimenta de flores


Pachycoris klugii

Provoca aborto y

malformaciones de frutos

Grimm 1999


Afecta frutos inmaduros y

provoca aborto

Grimm 1999

Tepole-Garcia et al. 2012

Lagocherius undatus,

Maconellicoccus

hirsutus

Barrenador del tallo

Caída de Hojas

Garcete et al. 2009

Kumar y Singh 2013

Polyphagotarsonemus

latus

Stomphastis thraustica

Deformación de flor y hoja

Minador de tallo y hoja

Almeida et al. 2010

Terren et al. 2012

2.6.1 Taxonomía y distribución de Leptoglossus zonatus Dallas

L. zonatus pertenece a la familia Coreidae (Cuadro 5) y es conocida como “chinche pata

de hoja”, caracterizada por la dilatación de la tibia posterior. Después del tercer segmento

14

antenal muestran una foliación similar, especialmente las ninfas. En algunas especies el

fémur en uno o ambos sexos se encuentran adornados con espinas (Schaefer y Panizzi

2000).

Cuadro 5. Clasificación taxonómica de Leptoglossus zonatus Dallas

Reino Animal

División Arthropoda

Clase Insecta

Orden Heteroptera

Suborden Hemiptera

Familia Coreidae

Subfamilia Coreinae

Género Leptoglossus

Especie Leptoglossus zonatus Dallas

Brailovsky y Barrera 1998

Esta especie se encuentra distribuida desde el sureste de Estados Unidos, pasando por

México y América Central, hasta Brasil. El color de los adultos es de tonalidades cafés

presentando usualmente bandas anchas en forma de zigzag a través del coreo, dos

grandes manchas blanco-amarillentas en el pronoto. Las dilataciones en las tibias

posteriores son externamente filiformes, y las tibias delgadas son lanceoladas en la parte

interna (Schaefer y Panizzi 2000).

15

2.6.2 Importancia económica y ecológica

Las chinches generalmente poseen un hábito alimenticio fitófago. Estos insectos dañan el

cultivo al succionar los jugos de los granos de sorgo en desarrollo y otras partes de la

panícula. El daño mecánico de las semillas provocada por los insectos permite la

infección y colonización por hongos, bacterias y virus, además de reducir el rendimiento y

la germinación de la semilla; puede ser portador de fitopatógenos como: Claviceps

africana, Colletotrichum sp., Fusarium sp., Alternaria sp., Curvularia sp., Bipolaris sp.,

Trichothecium sp., Aspergillus sp. y Rhizopus sp. (Prom y Perumal 2008).

Leptoglossus zonatus es un insecto generalista que se alimenta de cultivos importantes

alrededor del mundo como sorgo, algodón, pitahaya y J. curcas entre otros (Grimm y

Maes 1997). En sorgo provoca daños desde la floración hasta la maduración del grano.

En J. curcas provoca un menor desarrollo de frutos y semillas (Grimm 1999) ya que el

tejido vascular cuando es dañado causa disminución del vigor de la planta o interfiere con

el desarrollo de la semilla debido a que daña el fruto. En este caso el tipo de daño

depende del ambiente y del estado de maduración del fruto.

2.6.3 Ciclo biológico

Su ciclo de vida se divide en tres fases que son huevo, ninfa y adulto (Davis 1991).

Huevo. La hembra oviposita de 20 a más huevos en hileras o cadenas pegados unos con

otros casi siempre cerca de los tallos u hojas (cerca de la vena de la hoja) (Mead 1999),

recién ovipositados son de color verde y con el transcurso de los días tienden a un color

café cobrizo. Son cilíndricos, con la base plana, con abundantes poros en el corión

(Tarango et al. 2007).

16

Ninfa. Presenta cinco estadios, ninfa 1, 2, 3, 4 y 5, miden en promedio 2.78, 5.07, 7.11,

11.25 y 15.79 mm de longitud, respectivamente (Grimm y Somarriba 1999). En los

primeros estadios son de color naranja y a partir del quinto estadio hasta adulto se tornan

a una coloración café obscuro. Las ninfas tienden a ser gregarias en sus primeros

estadios (Mead 1999), encontrándose en el mismo ambiente que los adultos (Xiao y

Fadamiro 2009).

Adultos. La especie presenta como característica distintiva en la parte anterior al pronoto,

dos manchas amarillas redondas, con puntos negros, ocupando más allá del disco

anterior. También presenta una banda amarilla en forma de zigzag como se describe en

el punto 2.6.1.

2.6.4 Daños

Se ha determinado que los adultos y ninfas de L. zonatus se alimentan de pedúnculos y

frutos de J. curcas (Grimm y Maes 1997). El mayor porcentaje de aborto de frutos es

cuando alcanzan un tamaño de 20-25 mm de diámetro, no así para frutos menores a 15

mm, lo cual indica que el adulto prefiere alimentarse de frutos con cierto grado de

madurez, (por el menor contenido de látex). La frecuencia de malformación de semillas de

J. curcas es mayor cuando el daño es causado por adultos de L. zonatus en comparación

con las ninfas. Ocasionalmente la chiche pata de hoja se alimenta de tejido vegetal

posiblemente por la necesidad de absorción de humedad (Grimm 1999). La baja

incidencia de huevos y ninfas en el cultivo comparadas con los adultos indican que el fruto

de J. curcas no es el sitio preferido para la reproducción de dicha chinche (Grimm y

Führer 1998).

2.7 Manejo de plagas y enfermedades en el cultivo de Jatropha curcas

17

La pérdida de rendimiento en los cultivos en general es causada por plagas insectiles

suma alrededor del 10 a 30 % mundialmente. Otras plagas no insectiles como ácaros,

nematodos, moluscos, fitopatógenos, malezas y otros organismos aumentan el daño en la

producción mundial que va del 40 a 48 %. Las pérdidas en postcosecha son del orden

del 10 al 20 % (Helmuth 2000).

En la actualidad el manejo de plagas y enfermedades trata de mantener los niveles que

no causen daño económico, utilizando diversas estrategias, preferentemente aquellas

relacionadas a factores naturales, tales como el uso de agentes de control biológico

(Jacobsen et al. 2004) que incluye a microorganismos antagonistas (Köhl et al. 2011) y

entomopatógenos que no permiten el crecimiento de las poblaciones a niveles que

afectan a los cultivos, disminuyendo así el uso de plaguicidas sintéticos, ya que deben ser

recomendados como una medida de emergencia (Cisneros 1992).

En J. curcas el manejo de plagas y enfermedades ha sido mediante el uso de productos

químicos sintéticos (Kumar et al. 2011). Sin embargo, en la actualidad esa idea se ha ido

cambiando por el uso de agentes de control biológico que pueden suprimir a poblaciones

de fitopatógenos o insectos plaga (Kamal y McSpadden 2006). Latha et al. (2011)

utilizaron dos especies de bacterias aisladas de la rizosfera de J. curcas identificadas

como Pseudomonas fluorecens y Bacillus subtilis combinadas con algunas enmiendas

orgánicas para suprimir a Lasiodiplodia teobromae agente causal de la pudrición de raíz y

cuello de J. curcas en condiciones de campo, mostrando resultados significativos en la

reducción del crecimiento micelial.

2.7.1 Potencial de las bacterias rizosfericas como agentes de control biológico

18

La rizosfera es la región de suelo más cercana a la raíz de la planta, la cual está poblada

por varios microorganismos benéficos y se piensa que es una región de primera línea de

defensa de las raíces contra el ataque de hongos patógenos (Weller et al. 2002). El

término rizosfera se le atribuye al alemán Lorenz Hiltner quien en 1904 lo propuso

(Bringhurst et al. 2001).

Las rizobacterias son consideradas como microrganismos competitivos en la zona de la

raíz, por lo tanto éstas poseen un mayor potencial como agentes de control biológico y

son promotoras del crecimiento vegetal también llamadas Bacterias Promotoras del

Crecimiento Vegetal o PGPR (por sus siglas en inglés) (Kloepper et al. 2004). Las PGPR

son un grupo de microorganismos bacterianos saprófitos de vida libre que viven en la

rizosfera de las plantas que colonizan el sistema de raíces (Saravanakumar et al. 2007).

Tanto las bacterias Gram negativas y Gram positivas han sido previamente aisladas y

probadas para ser eficazes contra enfermedades causadas por diversas especies de

patógenos en varios cultivos. Muchos géneros de bacterias han sido introducidos en

suelos, semillas, raíces tubérculos y otros partes vegetativas para promover el crecimiento

vegetal de las plantas. Éstas bacterias incluyen géneros como Acinetibacter,

Agrobacterium, Arthrobacter, Azospirillum, Bacillus, Pseudomonas, Serratia, Thiobacillus y

otros más. Por otro lado los géneros de bacterias que han sido utilizados en el control

biológico son Pseudomonas, Bacillus, Burkholderia, Lysinibacillus y Serratia.

El control biológico de las enfermedades originadas en el suelo está relacionado a las

PGPR por un fenómeno bien establecido entre los antibióticos que producen y la

supresión de varios patógenos de las plantas. Estas ejercen su actividad de control

biológico directamente a través de la producción de metabolitos tales como antibióticos,

19

cianuro de hidrógeno, sideróforos y degradación de la pared celular por medio de enzimas

(Choudhary y Johri 2009, Kloepper et al. 2004) e indirectamente mediante la inducción de

la resistencia sistémica inducida (ISR por sus siglas en inglés) contra varias

enfermedades de las plantas (Jetiyanon y Kloepper 2002).

2.7.1.1 Bacillus subtilis

Microorganismo cuyo hábitat natural es el suelo, se encuentra ampliamente distribuido en

la naturaleza. Entre sus principales características se encuentra su capacidad para formar

esporas en diversas condiciones de estrés, crecer en un intervalo amplio de temperaturas

(desde 15 hasta 55 ºC). Presenta motilidad, aerotaxis y velocidades de crecimiento

altas/bajas, puede sobrevivir en altas concentraciones salinas (hasta el 7% de NaCl).

Produce una amplia variedad de antibióticos y enzimas hidrolíticas extracelulares

(Nakamura et al. 1999).

El ciclo de vida de B. subtilis en laboratorio, comprende una fase vegetativa muy similar al

crecimiento de otras bacterias, sin embargo bajo condiciones de limitación de nutrientes,

de densidad de población o de respuesta a condiciones de estrés, se generan una serie

de señales que modulan el inicio de la esporulación (Lazazzera 2000). El primer evento

morfológico del proceso de esporulación que puede observarse con el microscopio, es la

formación de un septo asimétrico en uno de los polos de la célula. Este estadio se

observa dos horas después de terminado el crecimiento exponencial.

2.7.1.2 Bacillus mojavensis

Es una bacteria endófita y rizosférica (Bacon et al. 2012, Toledo 2013). Fue aislada por

primera vez en el desierto de Mojave, California, se distingue del complejo de B. subtilis

en base a su composición de ácidos grasos, divergencia en la secuencia de ADN y la

20

resistencia a la transformación genética (Roberts et al. 1994). Pertenece a la familia

Bacillaceae es una bacteria Gram positiva, con forma de bacilo con un tamaño de 0.7-0.8

por 2-3 micras, que no se encuentra en cadenas, sin flagelos, se caracteriza por formar

endosporas elípticas con un tamaño que va de 0.8 micras de ancho por 1.5 a 1.8 micras

de largo (Bergey’s 1994), cuando se cultiva en agar nutritivo, las colonias son redondas o

irregulares con superficies de color crema y arrugada.

Todas las cepas de esta especie se han reportado como antagonista a diversos hongos

fitopatógenos. Esta especie sobresale como un agente de biocontrol de endófitos como

Fusarium verticillioides. B. mojavensis es capaz de producir surfactinas que actúan contra

el hongo (Bacon y Hinton 2002).

2.7.1.3 Bacillus thuringiensis

Es una bacteria del suelo, anaerobia facultativa, móvil y esporogénica, perteneciente al

grupo de bacterias Gram positivas (Lecadet 1970). Se caracteriza porque después de la

fase de crecimiento exponencial, las células producen tanto una espora subapical como

uno o varios cuerpos parasporales: inclusiones compuestas de una o más proteínas

cristalinas (Lecadet 1970, Schnepf et al. 1998).

En la mayoría de las subespecies de B. thuringiensis la producción de inclusiones

cristalinas está acoplada a la esporulación (Schnepf et al. 1998, Sedlak et al. 2000). Las

toxinas cristalinas existen en una diversidad de formas: bipiramidal, esférica, romboidal,

cuboidal e irregular, entre otras (Crickmore et al. 2008). El cristal proteínico está

constituido por proteínas denominadas d-endotoxinas también conocidas como proteínas

Cry ó Cyt (Sauka y Benintende 2008). La definición proteína Cry es cualquier proteína

paraesporal de Bt que muestre un efecto tóxico hacia algún organismo, verificable por

21

medio de bioensayos o cualquier proteína que muestre similitud con las proteínas Cry

(Bravo et al. 2011).

2.7.1.4 Lysinibacillus sphaericus

Anteriormente conocido como Bacillus sphaericus fue reasignado al nuevo género

Lysinibacillus por su producción de peptidoglicanos que contienen lisina y ácido aspártico

(Ahmed et al. 2007). Es una bacteria aeróbica, Gram-positiva, con espora circular

terminal, la cual está ampliamente distribuida en el suelo y en ambientes acuáticos. Es un

bacilo que mide 1.5 a 5 micras de largo, con bordes redondos; macroscópicamente puede

observarse que forma colonias beta hemolíticas, color blanco crema traslucido y bordes

regulares (Realpe et al. 2002).

Este microorganismo tiene metabolismo aerobio, se desarrolla en amplios rangos de

temperatura; máxima entre 30 °C y 45 °C y mínima de 5 °C a 15 °C, es catalasa positiva,

no fermenta la glucosa, no reduce nitratos, es fenilalanina positivo sensible a bajas

concentraciones de penicilina y tetraciclina y presenta resistencia al cloranfenicol y a la

estreptomicina (Brock et al. 2000). Es un alcalofilo obligado que produce gran cantidad de

proteasa alcalina extracelular (Singh et al. 2001, 2004). Algunas de las cepas producen

bacteriocinas, antibióticos proteicos que son efectivos en contra de otras cepas de la

misma especie (Cetinkaya et al. 2003) y que pueden ser vistas como toxinas

antibacteriales. Otras toxinas producidas por L. sphaericus son la esferilicosina, toxina

binaria, capa S, y mosquitocidas vegetativas también llamadas Mtx1, Mtx2 y Mtx3 que son

producidas durante la fase de crecimiento.

2.8 Actividad antagonista de las bacterias rizosféricas

22

En los últimos años el uso de herramientas biológicas como el uso de rizobacterias

promotoras del crecimiento ha recibido cada vez más atención por solventar el problema

sobre el crecimiento de la planta. Además de su capacidad de suprimir las enfermedades

a través del antagonismo entre la bacteria y los patógenos del suelo de forma directa e

indirectamente, también inducen la resistencia en la planta contra de patógenos de raíz y

hoja (Leendert et al. 2004) (Cuadro 6).

El antagonismo entre los microorganismos es un fenómeno común; hongos y bacterias

patógenas de las plantas también pueden verse afectados por los antagonistas de hongos

y bacterianas (Cook y Baker 1983). Una inferencia de este tipo que ocurre naturalmente

entre los microorganismos beneficiosos y patógenos de plantas contribuye al regulador

natural de los sistemas de cultivo, lo que impide o limita el desarrollo de la enfermedad.

Esto es más evidente en suelos supresores donde un potencial antagónico se ha

acumulado en la presencia de la población del patógeno (Weller et al. 2002).

El control biológico puede resultar de diferentes tipos de interacciones entre organismos,

los investigadores han caracterizado los mecanismos en diferentes situaciones

experimentales y en todos los casos son actividades antagonistas por la presencia de otro

organismo. Entre los mecanismos de control biológico mediados por rizobacterias

ampliamente reconocidos se encuentran: la competencia por un nicho ecológico o

sustrato, la síntesis de compuestos inhibitorios como sideróforos, antibióticos, enzimas

líticas y detoxificadoras (Bais et al. 2004), así como la inducción de resistencia sistémica

en la planta (Matiru y Dakora 2004, Ryu et al. 2004).

El control de hongos fitopatógenos por agentes de biocontrol depende de una amplia

variedad de características, tales como la producción de metabolitos antifúngicos y

23

enzimas líticas, la inducción de la resistencia sistémica, y de alto mantenimiento

competitivo en la rizosfera, lo que se considera que son requisitos importantes para el

óptimo desempeño de rizobacterias promotoras del crecimiento de plantas (PGPR) hacia

patógenos que atacan a ésta (Haas y Defago 2005). Los metabolitos secundarios

producidos por las bacterias beneficiosas previenen la infección alterarando el medio

ambiente y mejorar de la capacidad de la bacteria para competir con los patógenos,

mediante la inhibición de la actividad de los agentes patógenos, o mediante la activación

de las defensas del huésped (Bloemberg y Lugtenberg 2001, Raaijmakers et al. 2002).

Las bacterias de los géneros Pseudomonas Burkholderia y Bacillus son de los grupos

más estudiados porque tienen la capacidad de producir reguladores del crecimiento

vegetal y otros metabolitos con efecto antagónico y represivo del crecimiento de

patógenos en la rizosfera (Choudhary y Johri 2009). Por lo que resulta de gran

importancia la caracterización y selección de cepas autóctonas de estos géneros, los

cuales muestran efecto antagónico ante patógenos que atacan a cultivos de importancia

económica, de forma tal que se puedan aprovechar sus potencialidades como agentes de

control biológico. Algunos de los bacilos utilizados en el control de hongos fitopatógenos

se muestran en el Cuadro 6.

24

Cuadro 6. Bacillus spp. utilizados en el biocontrol de fitopatógenos

Especie de

Bacillus

Fitopatógeno Efecto Referencia

B. pumilis

B. mycoides

Cercospora beticola inducción de la

resistencia a la

enfermedad

Bargabus et al.

2002, 2004

B. pasteurii

B pumilis

Peronospora

tabacina

menor severidad en

la enfermedad

Zhang et al. 2001,

2004

B. sphaericus Cronartium

quercuum

Induce resistencia a

la enfermedad

Eneback et al. 1998

B. mojavensis F. verticillioides Inhibición en el

crecimiento micelial

Bacon et al. 2012

El biocontrol de fitopatógenos es realizado por diferentes mecanismos de acción que

ejercen las bacterias tales como la inducción de la resistencia sistémica de la planta y en

otras ocasiones por la producción de diversos metabolitos que no permiten el crecimiento

del fitopatógeno (Choudhary y Johri 2009).

2.9 Actividad entomopatógena de las bacterias rizosféricas

Actualmente se han descrito alrededor de 300 bacterias entomopatógenas, la más

importante desde el punto de vista comercial pertenece al género Bacillus que incluye 51

especies. Cuatro especies de este género han sido estudiadas como insecticidas

microbianos: Bacillus popilliae, Bacillus moritai, Lysinibacillus sphaericus, Bacillus

thuringiensis (Bt) (Cuadro 7), ésta última representa el entomopatógeno de mayor

producción en el mundo, debido a su rápida acción y a la posibilidad de producirlo in vitro

25

en forma industrial. Las células esporuladas y cristales de Bt pueden producirse con

métodos convencionales haciéndolas competitivas en costo con relación a los insecticidas

químicos (Gallegos 2003).

Cuadro 7. Bacillus spp. utilizados en el biocontrol de plagas insectiles

Especie de Bacillus Insecto Daño Referencia

B. cereus,

Paenibacillus

Tylopili

Brahmina coriacea Se alimenta de

tubérculos de papa

Sharma et al. 2013

Lysinibacillus

sphaericus

Culex

quinquimafaciatus,

Blatella germanica,

spodoptera litura

Problemas a la

salud humana

Defoliador

Lozano et al. 2011

Nishiwaki et al. 2007

Bacillus thuringiensis Aedes aegypti Problemas a la

salud humana

Ochoa y

Arrivillaga 2009

El modo de acción de Bacillus thuringiensis depende de la actividad de la protoxina que

debe ser ingerida por el insecto susceptible, cuyo intestino posee un pH alcalino superior

a 9,5 lo cual es esencial para la disolución de las protoxinas, su activación se da gracias a

la proteólisis causada por las enzimas digestivas del insecto. La especificidad de la δ-

endotoxina a un tipo de insecto en particular implica la presencia de receptores celulares

específicos, la toxina se inserta de forma irreversible a la membrana plasmática de las

células intestinales creando poros o lesiones que conduce a una variación en la

permeabilidad celular, alterando el transporte de iones potasio destruyéndola, causando

26

así la disrupción de la integridad del intestino y la muerte del insecto en 24 a 48 horas

posteriores a la ingesta (Ibiza-Palacios et al. 2008).

La acción entomopatógena de Lysinibacillus sphaericus depende de factores como: dosis

de aplicación, ingestión de la toxina por la larva y velocidad de alimentación de la larva.

Desde que se descubrió L. sphaericus en 1965 como entomopatógeno de mosquitos

(Kellen et al. 1965), han surgido nuevos reportes que indican actividad en contra de otras

especies incluyendo efectos letales sobre huevecillos del nematodo Trichostrongus

colubriformis (Bone y Tinelli 1987). Lysinibacillus sphaericus no tiene efectos sobre otros

organismos que incluyan insectos benéficos, como por ejemplo las abejas. Ensayos de

campo han demostrado la ausencia de efectos sobre invertebrados no blanco de este

microorganismo como crustáceos, dípteros, langostinos y escarabajos, además de

algunos vertebrados acuáticos como renacuajos, en lugares donde se ha utilizado como

larvicida (Brown et al. 2004, Lacey 2007).

La proteína Mtx1 es tan tóxica como la proteína cristal y puede ser procesada en el

intestino por proteasas a derivados de 27 y 70 kDa siendo ambos fragmentos necesarios

para una total actividad de la toxina.

La toxina binaria comprende dos proteínas BinA (448 aminoacidos 42 kDa) y BinB (448

aminoacidos de 51 kDa) es depositada en forma de cristal paraesporal y su principal

característica es su alta toxicidad en mosquitos (Baumann et al. 1998, Hindley y Berry

1987). Esta toxina se forma en la fase exponencial y al inicio de la esporulación (Ahmed

et al. 1995). Las cepas bloqueadas en su estado inicial de esporulación no acumulan

cristales de la toxina (Charles et al.1988, El-Bendary et al. 2005). Su sitio de acción es el

intestino del insecto una vez ingerida la toxina ésta se solubiliza y activa uniéndose a las

27

células epiteliales del intestino ciego e intestino posterior en mosquitos de Culex. El

receptor es mediado por la toxina proteica BinB la cual puede ser ligada a distintas

regiones del intestino donde puede dañar los nervios y tejidos musculares (Davidson

1989, Oei et al. 1992).

La esferilicosina es producida por algunas cepas de L. sphaericus la cual muestra un

efecto sobre la cucaracha Blattella germanica y el gusano cortador del tabaco Spodoptera

litura (Nishiwaki et al. 2007). La esferilicosina es una proteína de 53 kDa producida en

medio de cultivo, miembro de la familia de las citolisinas, es un miembro de la familia de

las citolisinas y es capaz de producir poros de aproximadamente 35 nm de diámetro en

los eritrocitos.

La capa S es una estructura proteíca paracristalina sobre la superficie de muchas

bacterias compuesta por monómeros de glicoproteína. Sus funciones están envueltas en

la interacción entre la célula bacteriana y el ambiente, por ejemplo como capa protectora o

tamiz molecular en la adhesión de la célula y reconocimiento de receptores en el control

biológico (Sidhu y Olsen 1997). Esta capa ha sido encontrada en las especies del género

Bacillaceae. La capa S ha mostrado actividad tóxica contra el mosquito Culex

quinquefasciatus vector de la Filariasis (Lozano et al. 2011).

L. sphaericus requiere ser ingerida por el insecto para actuar y así desarrollar la infección

dentro de las larvas de los mosquitos. La evidencia principal con que se cuenta se basa

en histología. Por lo general las cepas afectan la membrana peritrófica del intestino medio

hasta que muere la larva. La mayoría de las larvas de dípteros se alimentan normalmente

de bacterias y algas. Las cepas específicas de L. sphaericus, al ser introducidas en

medios acuáticos, son ingeridas por las larvas. Una vez en el intestino medio, la bacteria

28

comienza a degradar las células de la membrana epitelial. Al mismo tiempo en que la

bacteria crece y esporula se produce una toxina que atraviesa la membrana epitelial de

las células sensibles que se encuentran en el lumen de la larva, lo que da lugar a la

intoxicación de las mismas. Después de la muerte de la larva, las células vegetativas de

L. sphaericus (junto con la flora normal del intestino) crecen hacia afuera de los tejidos

finos de la larva muerta. En consecuencia, la región posterior del intestino medio aparece

inflamada en las larvas infectadas, las que también llegan a manifestar temblores, lentitud

y no pueden mudar (Davidson et al. 1990).

En dípteros la inclusión cristalina denominada toxina binaria A y B es liberada en el

intestino en su fase larvaria y al ser solubilizada por el pH alcalino en el intestino medio,

ésta es activada por las proteasas causando deshidratación y muerte a los vectores.

Provoca daños al sistema nervioso y los tejidos musculares (Singh et al. 2004). En

cucarachas adultas la toxina esfericolisina afecta a los ganglios que son el sistema

nervioso de estos insectos (Nishiwaki et al. 2007).

29

3. OBJETIVOS

3.1 Objetivo general

Evaluar la actividad de bacterias rizosféricas de Jatropha curcas contra Fusarium

verticillioides y Leptoglossus zonatus.

3.2 Objetivos específicos

Establecer las cinéticas de crecimiento de las bacterias rizosféricas Bacillus

subtilis, Bacillus mojavensis, Bacillus thuringiensis y Lysinibacillus sphaericus.

Evaluar el efecto de bacterias rizosféricas en el crecimiento micelial de Fusarium

verticillioides.

Determinar el efecto de bacterias rizosféricas sobre la morfología hifal de Fusarium

verticillioides.

Evaluar la actividad tóxica de Bacillus thuringiensis y Lysinibacillus sphaericus

sobre la mortalidad de Leptoglossus zonatus.

Evaluar el efecto de Bacillus thuringiensis y Lysinibacillus sphaericus sobre el peso

de Leptoglossus zonatus.

30

4. MATERIALES Y MÉTODOS

4.1 Material biológico

El presente trabajo se realizó en el Laboratorio de Fitopatología y en el Laboratorio de

Ecología Química de Insectos del Departamento de Interacciones Planta-Insecto del

Centro de Desarrollo de Productos Bióticos (CeProBi-IPN).

4.1.1 Cepas bacterianas

La cepas de las bacterias Bacillus subtilis, Bacillus mojavensis, Bacillus thuringiensis y

Lysinibacillus sphaericus fueron provistas por la colección de hongos y bacterias del

Laboratorio de Fitopatología del CEPROBI. Las bacterias fueron conservadas en medio

agar nutritivo (AN) a una temperatura de 4 °C. Posteriormente se realizaron resiembras

periódicas.

4.1.2 Cepa fúngica

La cepa de Fusarium verticillioides fue provista de la colección de hongos del Laboratorio

de Fitopatología del CEPROBI. El hongo fue resembrado en medio Papa Dextrosa Agar

(PDA). Posteriormente se realizaron resiembras periódicas para conservar la cepa a una


4.1.3 Establecimiento de la cría de Leptoglossus zonatus

Las ninfas y adultos de Leptoglossus zonatus fueron colectados manualmente en un

cultivo de sorgo ubicado en la colonia Diego Ruíz, municipio de Yautepec, Morelos

(18°49´22.85 N y 99°06´13.68 O) (Fig. 1) y de una plantación experimental de piñón

mexicano en el CeProBi-IPN (18°49´45.48 N y 99°05´35.73 O). Los insectos colectados

fueron depositados en jaulas de acrílico (27 x 23 x 25 cm) cuyas entradas estuvieron

31

cubiertas con tela de organza y se llevaron al Laboratorio de Ecología Química del Centro

de Desarrollo de Productos Bióticos del I. P. N.

En el laboratorio tanto los adultos como las ninfas se alimentaron con vainas tiernas de

frijol (ejote) y elote (Grimm 1999) y se les adicionó miel diluida en agua al 10 % en tubos

Eppendorf perforados en la base para que los insectos se alimentaran. Todos los días se

revisaron las jaulas con la finalidad de eliminar el material vegetal descompuesto y los

desechos producidos por los insectos. El alimento se cambió cada tercer día, el pie de

cría se mantuvo de forma permanente para tener los diferentes estados ninfales y adultos

para asegurar su conservación en condiciones de laboratorio.

Figura 1. Ninfas de Leptoglossus zonatus alimentándose de los granos de sorgo en condiciones de campo.

32

Para su apareamiento se colocaron parejas de machos y hembras en jaulas de vidrio de

15x15x15 cm. Las hembras que lograron aparearse se aislaron en otras jaulas similares a

las descritas para la obtención de los huevecillos, los cuales se contaron y separaron en

jaulas similares hasta la emergencia de las ninfas. Las ninfas obtenidas se separaron de

acuerdo a su estado de desarrollo y se alimentaron como se describió anteriormente

hasta que alcanzaron el grado de desarrollo deseado (ninfa 4) para realizar los

bioensayos. La limpieza de las jaulas fue la misma que en el caso de los insectos

colectados en campo (Fig. 2).

4.2 Establecimiento de las cinéticas de crecimiento de Bacillus subtilis, Bacillus

mojavensis, B. thuringiensis y Lysnibacillus sphaericus.

Se preparó un inóculo de 50 mL de caldo nutritivo a partir de una asada de cada cepa

bacteriana (B. subtilis, B. mojavensis, B. thuringiensis y L. sphaericus) crecidas en medio

agar nutritivo y se dejó incubar durante 12 horas en agitación a 150 rpm a una

temperatura de 28 ± 2°C.

Figura 2. Cría de Leptoglossus zonatus en condiciones de laboratorio a una temperatura de 28 ± 2 °C.

33

4.2.1 Cinética en medio caldo nutritivo

Para conocer las fases de crecimiento bacteriano se procedió a preparar un inóculo de la

forma mencionada en el punto anterior y se tomó una alícuota de 0.5 mL para inocular un

total de 18 matraces que contenían 50 mL de caldo nutritivo (8 g/ L). El cultivo bacteriano

se dejó crecer durante 32 h en agitación a 150 rpm a 28 ± 2°C. Se tomaron muestras de

1 mL del cultivo bacteriano cada cuatro horas de dos matraces y se llevaron al

espectrofotómetro (Shimadzu UV-160) en donde se midió la absorbancia a una densidad

óptica a 590 nm. Con los datos obtenidos se realizaron las gráficas de cinética de

crecimiento en SigmaPlot versión 11.0 (2008).

4.2.2 Cinética en medio caldo nutritivo más extracto de levadura suplementado con

sales para Bacillus thuringiensis y Lysinibacillus sphaericus

A partir del inóculo en medio caldo nutritivo de B. thuringiensis y L. sphaericus

mencionado en el punto 4.2 se tomó una alícuota de 0.5 mL para inocular cada uno de los

matraces que contenían 50 mL de caldo nutritivo más extracto de levadura (0.05 % o 0.5

g/L) y suplementado con sales (CaCl 7 X10 -4M, MnCl 5X10-5 M y MgCl 10-3 M) (Dussán

2002). El cultivo bacteriano se dejó crecer durante 32 horas en agitación a 150 rpm a una

temperatura de 28 ± 2°C, la toma de muestras y elaboración de graficas de la cinética de

crecimiento se realizaron de igual forma que en el punto anterior.

4.3 Observación de cristales de Bacillus thuringiensis y Lysinibacillus sphaericus

La observación de los cristales se realizó mediante la técnica de tinción simple con cristal

violeta al 0.5 % para lo cual se tomaron alícuotas de 100 µL y se colocaron sobre un

portaobjetos, posteriormente se colocó una gota de cristal violeta y se dejó por un minuto

para después lavar con agua corriente hasta que no quedaran restos de colorante (Boone

34

et al. 2001). Las muestras se tomaron cada cuatro horas a partir de las ocho horas hasta

las 20 horas de crecimiento bacteriano en los medios de cultivo ya mencionados en los

puntos 4.2.1 y 4.2.2. Las muestras se llevaron al laboratorio de microscopia óptica

ubicado en el CEPROBI para realizar la toma de fotografías digitales en un Microscopio

Óptico Nikon Eclipse 80i (Japón), el cual cuenta con cabezal y zoom digital de 4X, con

cámara de video, controlador e interfase acoplada a PC (Data image DS33, Japón) con un

acercamiento de 100X.

4.4 Bioensayos de antagonismo in vitro

4.4.1 Cultivo dual de bacterias rizosféricas y Fusarium verticillioides. Cultivo

bacteriano en agar nutritivo

Las pruebas de antagonismo se realizaron utilizando el método dual en cajas Petri con

agar nutritivo, mediante una asada de cultivo bacteriano se inocularon cuatro puntos

equidistantes, esparciéndolas en un área de 1 cm2 de cada punto del borde de la caja y

en el centro se colocó un disco de 5 mm de diámetro del hongo fitopatógeno F.

verticillioides. El testigo constó solo de un disco de 5 mm del hongo en medio agar

nutritivo. El experimento se incubó a una temperatura de 28 ± 2 °C hasta que el testigo

llenó la caja con micelio. El diámetro de la colonia fue medido empleando un vernier

digital. Con las medidas obtenidas se calculó el porcentaje de inhibición del crecimiento

micelial mediante la ecuación descrita por Gou et al. (2006):

Porcentaje de inhibición micelial= 1 – (Da /Db) X 100

En donde:

Da: Diámetro de la zona de crecimiento micelial de los tratamientos.

Db: Diámetro de la zona de crecimiento micelial del testigo.

35

Se realizaron 5 repeticiones por tratamiento en un diseño completamente al azar y el

experimento se replicó tres veces.

4.4.2 Cultivo dual de bacterias rizosféricas y Fusarium verticillioides. Bacterias

crecidas en caldo nutritivo

Se preparó un inóculo de 50 mL de caldo nutritivo a partir de una asada de cada cepa

bacteriana (B. subtilis, B. mojavensis, B. thuringiensis y L. sphaericus) crecidas en medio

agar nutritivo y se dejó incubar durante 12 horas en agitación a 150 rpm a una

temperatura de 28 ± 2°C. Posteriormente se tomó una alícuota de 0.5 mL de cada cultivo

bacteriano para inocular ocho matraces de 50 mL de caldo nutritivo, cuatro de ellos fueron

incubados en agitación a 150 rpm a una temperatura de 28 ± 2 °C durante 12 horas y los

otros cuatro fueron incubados durante 24 horas de la misma manera. Utilizando el mismo

método dual mencionado en el punto anterior en cajas Petri con medio AN se utilizó una

micropipeta para colocar cuatro gotas del cultivo bacteriano, cada una de ellas de 5 µL de

la bacteria y en el centro se colocó un disco de 5 mm del hongo F. verticillioides. El testigo

constó solo de un disco de 5 mm del hongo fitopatógeno colocado en el centro de caja

Petri con medio AN. Las cajas Petri se incubaron hasta que el testigo llenó la caja con

micelio a 28 ± 2 °C. Los datos de diámetro micelial al igual que el porcentaje de inhibición

de crecimiento micelial fueron obtenidos de la forma ya mencionada en el punto anterior.

4.5 Evaluación del efecto de bacterias rizosféricas sobre la morfología hifal de

Fusarium verticillioides mediante microscopia óptica

Después de realizar las pruebas de antagonismo mediante la técnica de cultivo dual

descrita en el punto anterior, se cortó un disco de aproximadamente 5 mm de diámetro de

la zona de inhibición entre el hongo y la bacteria, este disco fue colocado sobre un

36

portaobjetos. Posteriormente, se realizó una tinción con azul de algodón a una proporción

de 0.5 g / 100 mL de lactofenol y se le colocó un cubreobjetos, de igual forma se colocó

un disco del hongo sin tratamiento para contrastar las diferencias morfológicas. Una vez

preparada la muestra, ésta se llevó al laboratorio de microscopia óptica del CEPROBI

para realizar la toma de fotografías digitales en el Microscopio Óptico Nikon Eclipse

80i (Japón) con un acercamiento de 20 y 40X.

4.6 Evaluación del efecto de Bacillus thuringiensis y Lysinibacillus sphaericus

sobre la mortalidad de la ninfa 4 de Leptoglossus zonatus

Las ninfas en su cuarto estadio se colocaron en forma individual dentro de vasos de

plástico del número 4 sin alimento por cuatro horas previo a los bioensayos.

Posteriormente, se les colocó un tubo Eppendorf perforado en la base, en el cual se

depositó 1 mL de la bacteria según correspondiera, crecida en caldo nutritivo más extracto

de levadura suplementado con sales (CaCl, MnCl y MgCl) durante 16 horas, más dos

granos de elotes que fueron cambiados cada dos días (Fig. 3). El número de ninfas por

tratamiento fue de 30. En las ninfas testigo se añadió 1 mL de caldo nutritivo sin la

bacteria. La evaluación de la mortalidad se realizó cada 24 horas durante los cinco días

posteriores de iniciado el experimento. Las observaciones preliminares permitieron

determinar que la duración de este estado ninfal es de cinco días.

37

El efecto de Bacillus thuringiensis y L. sphaericus sobre la mortalidad de L. zonatus fue

analizado usando la prueba estadística Chi cuadrada con el programa estadístico

SigmaPlot versión 11.0 (2008).

4.7 Evaluación del efecto biológico de Bacillus thuringiensis y Lysinibacillus

sphaericus sobre el peso de la ninfa 4 a ninfa 5 de Leptoglossus zonatus

Siguiendo la misma metodología mencionada en el punto 4.6 se tomaron datos de peso

del cuarto y quinto estado ninfal de L. zonatus, además se determinó si había algún

cambio morfológico o retraso en el ciclo biológico.

El efecto de Bacillus thuringiensis y Lysinibacillus sphaericus sobre el peso de L. zonatus

fue analizado usando la prueba estadística ANOVA de una vía (P=0.349) con el

programa estadístico SigmaPlot versión 11.0 (2008).

Figura 3. Ninfa en vaso de plástico en el

laboratorio de Ecología Química de

Insectos del CEPROBI-IPN.

38

5. RESULTADOS

5.1 Cinéticas de crecimiento de Bacillus subtilis, Bacillus mojavensis, Bacillus

thuringiensis y Lysnibacillus sphaericus en medio caldo nutritivo.

Se obtuvieron las cinéticas de crecimiento de bacterias rizosféricas para conocer las

diferentes fases de crecimiento de cada una de estas cepas bacterianas y determinar la

producción de metabolitos primarios y secundarios, se menciona el tiempo en el que

alcanzan cada una de estas fases de crecimiento en medio caldo nutritivo.

B. subtilis en medio caldo nutritivo inició su fase lag o de adaptación de las cero a cuatro

horas, la fase logarítmica va de las cuatro a 16 horas, la fase estacionaria va de las 16

hasta las 24 horas, su fase de declinación va de las 24 horas en adelante (Fig. 4a).

Bacillus mojavensis en medio caldo nutritivo inició su fase lag o de adaptación de las cero

a cuatro horas, la fase logarítmica va de las cuatro a las 16 horas, la fase estacionaria va

de las 16 hasta las 28 horas, su fase de declinación va de las 28 horas en adelante (Fig.

4b).

Figura 4. Cinética de crecimiento de Bacillus subtilis (a) y Bacillus mojavensis (b) en caldo nutritivo. Cultivo bacteriano a una temperatura de 28 ± 2 °C en agitación a 150 rpm.

b

a b

Tiempo (horas)

0 5 10 15 20 25 30 35

Densid

ad ó

ptica (590 n

m)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

Tiempo (horas)

0 5 10 15 20 25 30 35

Densid

ad ó

ptica (590 n

m)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

a

b

39

Bacillus thuringiensis en medio caldo nutritivo inició su fase lag o de adaptación de las

cero a las cuatro horas, la fase logarítmica va de las cuatro a las 12 horas, la fase

estacionaria va de las 12 hasta las 25 horas, su fase de declinación va de las 25 horas en

adelante (Fig. 5a).

Lysinibacillus sphaericus en medio caldo nutritivo inició su fase lag o de adaptación de las

cero a cuatro horas, la fase logarítmica va de las cuatro a 13 horas, la fase estacionaria va

de los 13 a las 24 horas, su fase de declinación va de las 26 horas en adelante (Fig. 5b).

Figura 5. Cinética de crecimiento Bacillus thuringiensis (a) y Lysinibacillus sphaericus (b) en caldo nutritivo. Cultivo bacteriano a una temperatura de 28 ± 2 °C en agitación a 150 rpm.

Tiempo (horas)

0 5 10 15 20 25 30 35

Densid

ad ó

ptica (590 n

m)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

Tiempo (horas)

0 5 10 15 20 25 30 35

Densid

ad ó

ptica (590 n

m)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

a b

40

5.2 Cinéticas de crecimiento y observación de cristales de Bacillus thuringiensis y

Lysnibacillus sphaericus en medio caldo nutritivo más extracto de levadura

suplementado con sales

Se obtuvieron las cinéticas de crecimiento de los B. thuringiensis y L. sphaericus para

conocer la fases crecimiento y observación de producción de cristales. Bacillus

thuringiensis inicia su fase lag o de adaptación de las cero a las cuatro horas, la fase

logarítmica va de las cuatro a las 13 horas, la fase estacionaria va de las 13 hasta las 26

horas, su fase de declinación va de las 26 horas en adelante (Fig. 6a).

Lysinibacillus sphaericus inicia su fase lag o de adaptación de las cero a las cuatro horas,

la fase logarítmica o exponencial va de las cuatro a las 16 horas, la fase estacionaria va

de las 16 hasta las 32 horas, su fase de declinación va de las 32 horas en adelante (Fig.

6b).

Figura 6. Cinética de Bacillus thuringiensis (a) y Lysinibacillus sphaericus (b) en medio caldo nutritivo más extracto de levadura y suplementado con sales. Cultivo bacteriano a una temperatura de 28 ± 2 °C en agitación a 150 rpm.

a

Tiempo (horas)

0 5 10 15 20 25 30 35

Densid

ad ó

ptica (590 n

m)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

Tiempo (horas)

0 5 10 15 20 25 30 35

Densid

ad ó

ptica (590 n

m)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

a b

41

La producción de cristales en ambas bacterias fue observada en la fase logarítmica, se

apreció una fuerte tinción con cristal violeta en las células bacterianas en la hora 16 de

crecimiento de las bacterias B. thuringiensis y L. sphaericus (Fig. 7).

d

a b

f

c

d e

Figura 7. Observación de cristales de Bacillus thuringiensis mediante tinción con

cristal violeta. (a) 12 h, (b) 16 h, (c) 20 h y Lysinibacillus sphaericus (d) 12 h, (e) 16

h, (f) 20 h. (100X).

42

5.3 Evaluación del efecto de bacterias rizosféricas en el crecimiento micelial de

Fusarium verticillioides en cultivo dual (bacteria crecida en agar nutritivo)

El antagonismo fue observado debido a la capacidad de las cepas bacterianas para

impedir un crecimiento radial normal del hongo hacia la ubicación de la bacteria. La

inhibición del crecimiento del hongo por el efecto antagónico de los bacilos impidió el

crecimiento radial del micelio, por lo que los tratamientos no lograron cubrir la superficie

total de la caja Petri en comparación con el testigo. Dentro de las bacterias rizosféricas en

cultivo dual con el hongo Fusarium verticillioides, fue Lysinibacillus sphaericus el que

causó mayor porcentaje de inhibición de crecimiento micelial (Cuadro 8). Además se

observó que en algunos de los tratamientos el micelio cambió de color con respecto al

testigo (Fig. 8).

Cuadro 8. Efecto antifúngico in vitro de bacterias rizosféricas crecidas en agar nutritivo sobre el crecimiento micelial de Fusarium verticillioides

Tratamiento Crecimiento micelial (mm) % inhibición micelial

Testigo 85.31 ± 0.54 a 0

B. subtilis 43.04 ± 3.46 c 50

B. mojavensis 39.89 ± 1.74 c 54

B. thuringiensis 63.98 ± 3.71 b 26

L. sphaericus 38.79 ± 4.68 c 55

ANOVA de una vía, con una F= 199.65; g.l. 4, 5; P ≤ 0.001. Comparación de medias por el método Holm-Sidak alpha= 0.05. Letras diferentes entre columnas indican diferencias estadísticas significativas.

43

B. subtilis inhibió el crecimiento micelial del hongo F. verticillioides en un 50 % (Cuadro 8).

El crecimiento micelial en el tratamiento fue de forma cuadrada, con aspecto algodonoso y

de color blanquecino en el centro y en menor intensidad hacia los bordes. El testigo

presentó un crecimiento radial micelial y con un color blanquecino y algodonoso uniforme

(Fig. 8).

B. mojavensis inhibió el crecimiento micelial del hongo Fusarium verticillioides en un 54 %

(Cuadro 8). El crecimiento micelial en el tratamiento fue de forma cuadrada, con aspecto

algodonoso en el centro y menos en su periferia, el color del micelio fue más blanquecino

que el testigo (Fig. 9).

a b

Figura 8. Cultivo dual de Bacillus subtilis y Fusarium verticillioides (a)

Testigo, (b) Tratamiento. Incubadas a una temperatura de 28 ± 2 °C.


44

B. thuringiensis inhibió el crecimiento micelial del hongo Fusarium verticillioides en un 26

% (Cuadro 8). El crecimiento micelial en el tratamiento fue de forma cuadrada, con

aspecto algodonoso en el centro y un poco menos en su periferia y menos denso, el color

fue más blanquecino al del testigo (Fig. 10).

Figura 9. Cultivo dual de Bacillus mojavensis y Fusarium verticillioides

(a) Testigo, (b) Tratamiento. Incubadas a una temperatura de 28 ± 2

°C durante siete días.

b

a

Figura 10. Cultivo dual de Bacillus thuringiensis y Fusarium

verticillioides (a) Testigo, (b) tratamiento. Incubadas a una


b

a

45

Lysinibacillus sphaericus inhibió el crecimiento micelial del hongo Fusarium verticillioides

del 55 % (Cuadro 8). El crecimiento micelial en el tratamiento fue de forma radial, con

aspecto algodonoso y con una amplia distancia entre la bacteria y con un color

ligeramente menos intenso que el testigo (Fig. 11).

5.4 Evaluación del efecto de bacterias rizosféricas en el crecimiento micelial de

Fusarium verticillioides en cultivo dual (bacteria crecida caldo nutritivo)

El antagonismo fue observado debido a la capacidad de las cepas bacterianas para

impedir un crecimiento radial normal del hongo hacia la ubicación de la bacteria. La

inhibición del crecimiento del hongo por el efecto antagónico de los bacilos impidió el

crecimiento radial del micelio, por lo que los tratamientos no lograron cubrir la superficie

total de la caja Petri en comparación con el testigo. Dentro de las bacterias probadas en

cultivo dual con el hongo Fusarium verticillioides fueron Bacillus mojavensis, Bacillus

subtilis y Lysinibacillus sphaericus los que causaron el mayor porcentaje de inhibición de

Figura 11. Cultivo dual de Lysinibacillus sphaericus y Fusarium verticillioides

(a) Testigo, (b) Tratamiento. Incubadas a una temperatura de 28 ± 2 °C durante

siete días.

b

a

46

crecimiento micelial a las 12 y 24 horas sin presentar diferencia significativa entre ellos

(Cuadros 9 y 10). Además se observó que en algunos de los tratamientos el micelio

cambió de color con respecto al testigo.

Cuadro 9. Efecto antifúngico in vitro de bacterias rizosféricas crecida en caldo nutritivo (12 horas) sobre el crecimiento micelial de Fusarium verticillioides

Tratamiento Crecimiento micelial (mm) % inhibicion micelial

Testigo 85.43 ± 0.74 c 0

Bacillus subtilis 52.57 ± 2.46 a 38.5

Bacillus mojavensis 50.92 ± 2.48 a 40.4

Bacillus thuringiensis 62.03 ± 7.04 b 27.4

Lysinibacillus sphaericus 51.67 ± 4.11 a 39.6

ANOVA de una vía, con una F= 81.021; g.l. 4, 5; P ≤ 0.001. Comparación de medias por el método Holm-Sidak, alpha= 0.05. Letras diferentes entre columnas indican diferencias estadísticas significativas.

Cuadro 10. Efecto antifúngico in vitro de bacterias rizosféricas crecidas en caldo nutritivo (24 horas) sobre el crecimiento micelial de Fusarium verticillioides

Tratamiento Crecimiento micelial (mm) % inhibicion micelial

Testigo 85.43 ± 0.74 a 0

Bacillus subtilis 47.68 ± 3.57 c 44.2

Bacillus mojavensis 48.78 ± 4.58 c 43

Bacillus thuringiensis 61.18 ± 3.15 b 28.4

Lysinibacillus sphaericus 50.08 ± 2.90 c 41.4

ANOVA de una vía, con una F= 144.25; g.l. 4, 5; P ≤ 0.001. Comparación de medias por el método Holm-Sidak, alpha= 0.05. Letras diferentes entre columnas indican diferencias estadísticas significativas.

47

B. subtilis inhibió el crecimiento micelial del hongo F. verticillioides en un 38.5 % en el

tratamiento de cultivo bacteriano de 12 horas (Cuadro 9) y un 44.2 % en el tratamiento de

cultivo bacteriano de 24 horas (Cuadro 10). El crecimiento micelial en ambos tratamientos

fue de forma cuadrada y sin espaciamiento entre este y el crecimiento bacteriano, sin

embargo en el tratamiento de 12 horas el micelio se observó más algodonoso que

tratamiento 24 horas, mientras que el color del micelio fue más blanquecino en ambos

tratamientos y similar al del testigo (Fig. 12).

B. mojavensis inhibió el crecimiento micelial del hongo F. verticillioides en un 40.4 % en el

tratamiento de cultivo bacteriano de 12 horas (Cuadro 9) y un 43 % en el tratamiento de

cultivo bacteriano de 24 horas (Cuadro 10). El crecimiento micelial en ambos tratamientos

fue de forma cuadrada irregular y sin margen de limitación entre el crecimiento bacteriano,

sin embargo en el tratamiento de 24 horas el micelio se observó más algodonoso que el

Figura 12. Bacillus subtilis (a) Testigo, (b) Tratamiento en fase exponencial (12 h), (c)

Tratamiento en fase estacionaria (24 h). Incubadas a una temperatura de 28 ± 2 °C durante

siete días.

a

c

b

48

tratamiento a las 12 horas, mientras que el color del micelio fue blanquecino en ambos

casos muy similares al del testigo (Fig. 13).

B. thuringiensis inhibió el crecimiento micelial del hongo F. verticillioides en un 27.4 % en

el tratamiento de cultivo bacteriano de 12 horas (Cuadro 9) y un 28.4 % en el tratamiento

de cultivo bacteriano de 24 horas (Cuadro 10). El crecimiento micelial en ambos

tratamientos fue de forma casi radial sin espaciamiento entre este y el crecimiento

bacteriano, el aspecto poco algodonoso fue el mismo para ambos casos, mientras que el

color blanquecino de los tratamientos fue similar al del testigo (Fig. 14).

Figura 13. Bacillus mojavensis (a) Testigo, (b) Tratamiento en fase exponencial (12

h), (c) Tratamiento en fase estacionaria (24 h). Incubadas a una temperatura de 28 ±

2 °C durante siete días.

c b a

Figura 14. Bacillus thuringiensis (a) Testigo, (b) Tratamiento en fase exponencial (12

h), (c) Tratamiento en fase estacionaria (24 h). Incubadas a una temperatura de 28 ±

2 °C durante siete días.

c b a

49

L. sphaericus inhibió el crecimiento micelial del hongo F. verticillioides en un 39.6 % en el

tratamiento de cultivo bacteriano de 12 horas (Cuadro 9) y un 41.4 % en el tratamiento de

cultivo bacteriano de 24 horas (Cuadro10). El crecimiento micelial en ambos tratamientos

fue de forma cuadrada, en el tratamiento de 12 horas se observó que el micelio invadió

parte del cultivo bacteriano, el aspecto algodonoso fue el mismo para ambos casos,

mientras que el color blanquecino del micelio de los tratamientos fue muy similar al del

testigo (Fig. 15).

5.5 Efecto de bacterias rizosféricas sobre la morfología hifal de Fusarium

verticillioides

El efecto de los bacterias rizosféricas sobre la morfología hifal de F. verticillioides fue

observada a los siete y 14 días, mostrando que todos los tratamientos causaron

aparentes anormalidades en hinchamientos, rugosidad y cambio en el contenido celular

con respecto a las hifas del testigo.

Figura 15. Lysinibacillus sphaericus. (a) Testigo, (b) Tratamiento en fase exponencial

(12 h), (c) Tratamiento en fase estacionaria (24 h). Incubadas a una temperatura de 28

± 2 °C durante siete días.

c b a

50

B. subtilis provocó anormalidades en las hifas a partir de los siete días, algunas de las

observaciones fueron aparentes hinchamientos y un crecimiento rugoso (Fig. 16), a los 14

días se observó micelio con aparente pérdida de contenido celular e hifas menos

hinchadas (Fig. 17).

b a

Figura 16. Morfología hifal de Fusarium verticillioides a los siete días (40X). (a) Testigo, (b) Tratamiento Bacillus subtilis en cultivo dual incubado a una temperatura de 28 ± 2 °C. Corte en zona de inhibición.

b a

Figura 17. Morfología hifal de Fusarium verticillioides a los 14 días (40X). (a) Testigo, (b) Tratamiento Bacillus subtilis en cultivo dual a una temperatura de 28 ± 2 °C. Corte en zona de inhibición.

51

B. mojavensis provocó anormalidades en las hifas con respecto al testigo. A partir de los

siete días se observó aparentemente un mayor grosor y crecimiento ligeramente rugoso

(Fig. 18), a los 14 días se observaron hifas con septos más cortos aparentemente y de

mayor grosor, además de una tinción no uniforme que podría indicar pérdida de contenido

celular (Fig. 19).

Figura 18. Morfología hifal de Fusarium verticillioides a los siete días (40X). (a) Testigo, (b) Tratamiento Bacillus mojavensis en cultivo dual a una temperatura de 28 ± 2 °C. Corte en zona de inhibición.

b a

Figura 19. Morfología hifal de Fusarium verticillioides a los 14 días (40X). (a) Testigo a las 14 días (b) Tratamiento Bacillus mojavensis en cultivo dual a una temperatura de 28 ± 2 °C. Corte en zona de inhibición.

a b

52

B. thuringiensis provocó anormalidades en las hifas con respecto al testigo. A partir de

los siete días las observaciones fueron aparentemente septos más cortos, con un mayor

grosor y un crecimiento ligeramente rugoso (Fig. 20), a los 14 días se observaron hifas

aparentemente sin engrosamiento, ligeramente rugosas y sin pérdida de contenido celular

(Fig. 21).

b a

Figura 20. Morfología hifal de Fusarium verticillioides a los siete días (40X). (a) Testigo, (b) Tratamiento Bacillus thuringiensis en cultivo dual a una temperatura de 28 ± 2 °C. Corte en zona de inhibición.

Figura 21. Morfología hifal de Fusarium verticillioides a los 14 días (40X). (a) Testigo, (b) Tratamiento Bacillus thuringiensis en cultivo dual a una temperatura de 28 ± 2 °C. Corte en zona de inhibición.

a b

53

L. sphaericus provocó anormalidades en las hifas con respecto al testigo. A partir de los

siete días las observaciones fueron aparente engrosamiento de los septos y con

hinchamientos en la parte central de cada septo, un crecimiento rugoso y con aparente

pérdida de contenido celular (Fig. 22), a los 14 días se observan hifas con una fuerte

deformación, sin septos definidos y con una mayor pérdida de contenido celular (Fig. 23).

b a

Figura 22. Morfología hifal de Fusarium verticillioides a los siete días (40X). (a) Testigo (b) Tratamiento Lysinibacillus sphaericus en cultivo dual a una temperatura de 28 ± 2 °C. Corte en zona de inhibición.

b a

Figura 23. Morfología hifal de Fusarium verticillioides a los 14 días (40X). (a) Testigo, (b) Tratamiento Lysinibacillus sphaericus en cultivo dual a una temperatura de 28 ± 2 °C. Corte en zona de inhibición.

54

De forma general, las observaciones de la morfología hifal de F. verticillioides a los 14

días de incubación por efecto de todas las bacterias rizosféricas estudiadas se muestra en

la Fig. 24. En la que se aprecia una gran cantidad de hifas con anormalidades causadas

por las bacterias rizosféricas tales como aparentes hinchamientos, rugosidad y una tinción

no uniforme que puede deberse a una pérdida en el contenido celular.

Figura 24. Morfología hifal de Fusarium verticillioides a los 14 días (20X). (a) Testigo, (b) Bacillus subtilis, (c) Bacillus mojavensis, (d) Bacillus thuringiensis, (e) Lysinibacillus sphaericus. Incubación a una temperatura de 28 ± 2 °C.

e d

c

a

b a

55

5.6 Evaluación de Bacillus thuringiensis y Lysinibacillus sphaericus sobre la

mortalidad de Leptoglossus zonatus

La aplicación de las bacterias B. thuringiensis y L. sphaericus no mostraron tener efecto

sobre la mortalidad de la ninfa 4 de L. zonatus, de acuerdo al análisis estadístico no hay

diferencia significativa entre los tratamientos y el testigo como se muestra en el Cuadro

11.

5.7 Evaluación del efecto biológico de Bacillus thuringiensis y Lysinibacillus

sphaericus en el peso de la ninfa 4 a ninfa 5 de Leptoglossus zonatus

La aplicación de las bacterias B. thuringiensis y L. sphaericus no mostraron tener efecto

sobre el peso de la ninfa 4 a ninfa 5 de L. zonatus. De acuerdo a la comparación de pesos

por grupo de ninfas con los tratamientos y el testigo no hubo diferencias significativas

(Cuadro 11).

Además, se dió seguimiento del ciclo de vida de las ninfas hasta su estado adulto. Éstas

continuaron mudando hasta su estado adulto y se reprodujeron generando huevecillos

fértiles.

Cuadro 11. Efecto de Bacillus thuringiensis y Lysinibacillus sphaericus sobre la

mortalidad y peso (ninfa 4 a ninfa 5) de Leptoglossus zonatus

Tratamiento €Mortalidad (%) ¥Peso N4 a N5 (mg)

ANOVA

Testigo 33.33 a 50.168 ± 18.807 a

Bacillus thuringiensis 46.66 a 42.612 ± 12.048 a

Lysinibacillus sphaericus 36.66 a 44.021 ± 17.212 a

€ Chi cuadrada. ¥ ANOVA de una vía, con una F= 1.075; g.l. 2, 30; P = 0.349. Comparación de medias por el método Holm-Sidak, alpha= 0.05. Letras iguales en la misma columna indican que no hay diferencias significativas.

56

6. DISCUSIÓN

Se obtuvieron las diferentes fases de crecimiento de las bacterias rizosféricas (Bacillus

subtilis, Bacillus mojavensis, Bacillus thuringiensis y Lysinibacillus sphaericus) en medio

caldo nutritivo. Diversos metabolitos son producidos en cada una de las fases de

crecimiento y probablemente están relacionados al control de fitopatógenos e insectos

plaga. Además, se obtuvieron las cinéticas de crecimiento de las bacterias Bacillus

thuringiensis y Lysinibacillus sphaericus en medio caldo nutritivo más extracto de levadura

suplementado con sales (CaCl, MnCl y MgCl) y se determinó que estas bacterias

producen una gran cantidad de cristales proteicos (toxinas) en su fase logarítmica.

Los resultados obtenidos en este estudio demostraron que B. subtilis, B. mojavensis, B.

thuringiensis y L. sphaericus tienen actividad antagonista contra el hongo Fusarium

verticillioides. Estas especies bacterianas inhibieron el crecimiento micelial y afectaron la

morfología hifal de este hongo fitopatógeno. Se ha demostrado que las semillas de J.

curcas son propensas al ataque de diversos hongos fitopatógenos durante su

almacenamiento, que ocasionan degradación de los ácidos grasos, proteínas y por lo

tanto pérdida de la calidad de las semillas. En particular, F. verticillioides se ha reportado

que disminuye la cantidad de lípidos, contenido de ácidos grasos libres y la viabilidad de

las semillas (Worang et al. 2008, Dharmaputra et al. 2009). Es importante disponer de

antagonistas bacterianos para el manejo de F. verticillioides, en trabajos previos se

demostró que diversas rizobacterias son antagonistas de varios géneros de hongos

fitopatógenos tales como Curvularia, Fusarium, Rizoctonia, entre otros (Liu et al. 2007,

Mojíca-Marín et al. 2009, Bacon et al. 2012, Kadyan 2013). En particular, en la rizosfera

57

de J. curcas se han aislado bacterias del género Enterobacter que producen sideróforos

(Kumar et al. 2011).

Cabe señalar, que las cepas empleadas en esta investigación fueron obtenidas de la

rizosfera de J. curcas en una plantación de Morelos, México. Trabajos previos

demostraron que B. subtilis, B. mojavensis y B. thuringiensis tienen un efecto antifúngico

in vitro en la inhibición del crecimiento micelial de hongos fitopatógenos como Fusarium

equiseti y Curvularia lunata, además se realizaron trabajos para conocer algunos de los

mecanismos de acción dentro de su actividad antagonista, algunos de estos fueron

producción de sideróforos, ácido cianhídrico, enzimas líticas, compuestos difusibles y

volátiles (Toledo 2013).

En algunos estudios realizados en la India se aisló B. subtilis de la rizosfera de J. curcas

y se demostró que en condiciones de campo inhibió al hongo fitopatógeno Lasiodiplodia

theobromae (Latha et al. 2011). Por otra parte, se conoce que B. mojavensis produce

proteasas, sideróforos y compuestos volátiles que inhiben el crecimiento micelial de F.

verticillioides (Bacon y Hinton 2002, Bacon et al. 2012). B. mojavensis posee un

mecanismo antagonista complejo aún no conocido por completo, donde además de

producir los compuestos mencionados anteriormente se relaciona la producción de

surfactinas con la actividad antifúngica de este microorganismo (Bacon et al. 2012).

En el presente estudio se evaluó el efecto de bacterias rizosféricas sobre la morfología

hifal de F. verticillioides. En base a los estudios de microscopía realizados, se observó

que la morfología de las hifas fue afectada aparentemente en grosor, hinchamientos,

rugosidad y probablemente salida de material celular debido a que se observaron algunas

hifas prácticamente vacías. Trabajos realizados con bacterias rizosféricas han

58

demostrado tener efecto en la morfología de C. lunata (Basha y Ulaganathan 2002). En

este trabajo se demostró que Bacillus sp. presentó actividad antagonista contra el hongo

F. verticillioides y que afecta en diferentes grados de daño a su morfología hifal.

Bacillus thuringiensis que también inhibió el crecimiento micelial del hongo F. verticillioides

produce enzimas líticas como proteasas y quitinasas, además de tener la capacidad de

producir compuestos volátiles (Toledo 2013), lo que le proporciona una actividad

antagonista contra algunos hongos fitopatógenos como Rhizoctonia solani y Fusarium

oxysporum (Mojíca-Marín et al. 2009, Reyes-Ramírez et al. 2004, Gomaa 2012). Por otro

lado, esta bacteria ha sido ampliamente utilizada en el control de plagas insectiles debido

a la presencia de genes cry que se relacionan con la producción de cristales y que

particularmente le permiten tener un efecto entomopatógeno (Carreras 2011). De igual

forma se ha demostrado una actividad entomopatógena por un mecanismo similar para L.

sphaericus. En este estudio se observó la presencia de cristales proteicos mediante las

tinciones realizadas.

Reportes anteriores mencionaron que esta especie de bacteria producen sideróforos

(Kadyan et al. 2013). Además de tener la capacidad de producir toxinas que provocan un

efecto entomopatógeno en contra de algunos insectos del orden Diptera, Lepidoptera y

Blattodea (Singh et al. 1999, Centinkaya et al. 2002, Nishiwaki et al. 2007). Este el primer

trabajo en evaluar la actividad entomopatógena de las bacterias B. thuringensis y L.

sphaericus sobre un insecto del orden Hemíptera en este caso particular sobre L. zonatus,

ya que hasta la fecha no existen reportes de trabajos realizados de bacterias

entomopatógenas contra hemípteros.

59

En este trabajo se realizaron pruebas para determinar si las bacterias B. thuringiensis y L.

sphaericus presentan actividad entomopatógena sobre L. zonatus, ya que se ha

demostrado en diversos estudios para especies de insectos de diferente orden que estas

bacterias son capaces de producir toxinas en forma de cristal, por lo que se realizaron

cinéticas de crecimiento en medio específico para la producción de cristales y que tienen

efecto sobre especies de insectos de diversos ordenes tales como Lepidoptera, Diptera y

Coleoptera. Sin embargo, cabe mencionar que no hay una metodología establecida para

aplicaciones de bacterias entomopatógenas contra insectos hemípteros.

En la literatura no existen estudios que reporten el control de chinches mediante la

aplicación de Bacillus thuringiensis. Se considera que las chinches son insectos

chupadores que se alimentan con fluidos internos de los tejidos de las plantas por lo que

las proteínas insecticidas de B. thuringiensis no interaccionan con su tracto digestivo. Sin

embargo, recientemente se ha logrado expresar en plantas transgénicas de algodón, una

proteína insecticida de 35 kDa de B. thuringiensis la cual afecta la sobrevivencia y el

desarrollo de la chinche Lygus hesperus (Baum et al. 2012). Lo anterior significa que

pueden existir proteínas insecticidas contra chinches pero se tiene que investigar la

manera para que estas proteínas puedan interaccionar con el tracto digestivo de las

chinches.

Otra de las razones por las cuales no se obtuvo efecto podría ser porque la mayoría de

las bacterias entomopatógenas invaden a sus hospederos al ser ingeridas las esporas

proteicas tóxicas, éstas se insertan en las membranas del intestino medio, aumentando la

conductividad del potasio de las membranas apicales de las células columnares en donde

se lleva a cabo la ruptura de los gradientes eléctricos de potasio y aumentando el pH. En

la mayoría de los estudios sobre esta actividad entomopatógena de las bacterias han

60

sido probadas sobre insectos con un tipo de metamorfosis completa u holometábola,

corroborándose su efectividad en la etapa larval. Sin embargo, el sistema digestivo de los

hemípteros es inusual entre los insectos en diferentes aspectos: ciertas enzimas

digestivas hidrolíticas, tales como la tripsina, están ausentes además de que el intestino

medio carece de membrana peritrófica. Estas características reflejan el tipo de dieta

líquida y el modo de alimentación por absorción sujeto a restricciones evolutivas y que se

ve reflejada en la diferencia de dieta, modo de alimentación, biología y bioquímica

digestiva de insectos masticadores de hojas y los hemípteros que se alimentan de fluidos

(Stockhoff y Conlan 2003). Por lo tanto es importante incursionar en trabajos posteriores

en buscar la forma de proporcionarles las bacterias a estos insectos de una manera

efectiva.

61

7. CONCLUSIONES

Se establecieron las cinéticas y se determinaron las fases de crecimiento de las

bacterias rizosféricas B. subtilis, B. mojavensis, B. thuringiensis y L. sphaericus.

Las bacterias rizosféricas estudiadas inhibieron el crecimiento micelial de F.

verticillioides; el mayor efecto lo causaron B. subtilis, B. mojavensis y L.

sphaericus.

Todas las bacterias rizosféricas afectaron la morfología de las hifas de F.

verticillioides caracterizada por formas anormales, aparente ensanchamiento y

rugosidad.

Las bacterias rizosféricas presentaron actividad antagonista contra F. verticillioides

con independencia del medio de cultivo empleado y de las fases de crecimiento

probadas.

B. thuringiensis y L. sphaericus no afectaron la mortalidad ni el peso de L.

zonatus.

En general, las bacterias rizosféricas evidenciaron actividad antagonista contra F.

verticillioides y no tuvieron actividad entomopatógena contra L. zonatus.

62

8. LITERATURA CITADA

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