Parte III.

Cinética enzimática

CINÉTICA

Es el estudio de las velocidades de las reacciones, aporta las bases para el entendimiento de cómo ocurre una reacción.

Mecanismo de la reacción La descripción de una reacción en

términos de las etapas implicadas y la velocidad de la reacción se denomina mecanismo de la reacción.

¿Cuántas etapas están implicadas?¿Cuál es la etapa más lenta y que, por tanto, limitaría la velocidad de la reacción total?

La primera clave en cuanto al comportamiento enzimático lo aportaron:

V. Henri (1903) y posteriormente L. Michaelis y Maud L. Menten (1913).

Para explicar la relación observada entre la velocidad inicial (v0) y la concentración inicial de sustrato ([S]0) Michaelis y Menten propusieron que las reacciones catalizadas enzimáticamente ocurren en dos etapas:

En la primera etapa se forma el complejo enzima-sustrato y

En la segunda, el complejo enzima-sustrato da lugar a la formación del producto, liberando el enzima libre

En este esquema, k1, k2 y k3 son las constantes cinéticas individuales de cada proceso y también reciben el nombre de constantes microscópicas de velocidad.

Según esto, podemos afirmar que: v1 = k1 [E] [S] v2 = k2 [ES] v3 = k3 [ES]

Kcat

[ET] = [E] + [ES] la concentración total de enzima

depende de la cantidad de enzima libre (E) y enzima unida al sustrato (ES).

[ET] es constante a lo largo de la reacción

Como [E] = [ET] - [ES] y v1 = k1 [E] [S] resulta que: v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]

MODELO DEL ESTADO ESTACIONARIO

Por tanto, la velocidad de formación del complejo enzima-sustrato (v1) es igual a la de su disociación (v2+ v3)v1 = v2 + v3

k1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES]

Despejando [ES], queda que:

, siendo

Por lo tanto, en el estado estacionario, la velocidad de formación del producto es:

v = v3 = k3 [ES] =

Definición Km Es la concentración de sustrato

para la cual la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima. En efecto, si KM = [S], la ecuación de Michaelis-Menten se reduce a: v = Vmax/2.

Km y afinidad? El valor de KM da idea de la afinidad del enzima

por el sustrato: A menor KM, mayor afinidad del enzima por el sustrato, y a mayor KM, menor afinidad.

KM se define como (k2+k3/k1), donde las reacciones 2 y 3 destruyen el complejo ES, mientras que la reacción 1 lo forma. Así, si KM es grande, el complejo ES es inestable pues predomina la tendencia a destruirlo (poca afinidad hacia el sustrato), y si KM es pequeña, el complejo ES es estable, ya que predomina la tendencia a formarlo (gran afinidad hacia el sustrato).

Qué se necesita para medir la velocidad de reacción enzimática?

Extracto proteico que muchos casos no proviene de una purificación exhaustiva o del aislamiento de la enzima.

La medida se realiza siempre en las “condiciones óptimas” de pH, temperatura, presencia de cofactores, etc, y se utilizan concentraciones saturantes de sustrato.

Vmax En condiciones “óptimas” y

saturantes de la enzima, la velocidad de reacción observada es la velocidad máxima (Vmax).

La velocidad puede determinarse bien midiendo la aparición de los productos o la desaparición de los reactivos.

Reacción que cataliza la lactato deshidrogenasa La reducción del piruvato para formar lactato es

reversible y dependiente de la presencia de una coenzima.

Desarrollo experimental 1 M Amortiguador de fosfatos pH 7.0 10 mM Piruvato de sodio 4 mM NADH Diluciones apropiadas de enzima.

La actividad de una enzima tiene unidades de velocidad.

m: es la pendiente de la recta (Abs/t) en unidades de abs / min: es el coeficiente de extinción molecular para el NADH, 6.22 x 103

M-1 cm-1.b: es la distancia de la celda, que corresponde a 1 cmVensayo: es el volumen total del ensayo.

F: es el factor de dilución para la enzima

11

11 min**

*.*min

mgmmolproteínamgcmbcmM

FmLensayoVolAbs

mActividad

Tabla de purificación de proteínas

Tabla 3.2. Tabla de purificación de la LDH de músculo esquelético de bovino. Procedimiento Volumen

de la fracción

(mL)

Proteína total en la fracción

(mg)

Actividad enzimática

(mmol min-1mg-1)

Actividad específica

mmolmin-1mg-1total

de la fracción

Veces de purificación

Rendimiento

Homogeneizado (F1)

1 100

Sobrenadante de la precipitación con sulfato de amonio

45% (F2)

Precipitado obtenido de la pp

con sulfato de amonio 70% (F3)

Primera Fracción que salió de la cromatografía*

(FPA)

Segunda Fracción que salió de la cromatografía*

(FPB)

ESPECIFICIDAD. Es la capacidad que tiene una enzima de discriminar entre posibles sustratos.

AFINIDAD. Estabilidad del complejo ES. Nos indica la capacidad que tiene la enzima para formar un complejo con un determinado sustrado. Kd del complejo ES o Km

Especificidad vs afinidad

Representación de dobles recíprocos

Representación de Eadie-Hofstee

pendiente

Inhibidores Una de las formas de regulación de la actividad

de una enzima es a través de moléculas que disminuyen su velocidad de reacción:

Naturales Artificiales

Muchos compuestos tóxicos como antibióticos, pesticidas o herbicidas son inhibidores de enzimas que son responsables de reacciones vitales para la célula

Interacción inhibidor-enzima

La interacción de un inhibidor y la enzima no es siempre la misma, ya que depende de la naturaleza química del inhibidor así como de la reacción química que cataliza la enzima.

Para dilucidar el tipo de interacción entre ambas moléculas se recurre a determinar el efecto del inhibidor en las constantes cinéticas de la enzima.

Inhibidores competitivos. Son moléculas que tienen una similitud estructural y

química al sustrato de la enzima. El inhibidor se puede unir al sitio activo de la enzima.

Pero como el inhibidor no es idéntico al sustrato, la enzima no es capaz de convertir el inhibidor a producto.

El inhibidor bloquea el sitio activo. El inhibidor y el sustrato no se encuentran al mismos tiempo en el sitio activo.

El aumento en la concentración de sustrato reduce la inhibición.

Inhibidor competitivo

Similaridad estructural

Inhibición competitiva

Diferentes gráficos nos pueden ayudar a determinar la

constante de inhibición (Ki).

                                                                                                                              

Gráficos comparados de la actividad con y sin inhibidor

En la gráfica de dobles recíprocos:

No cambio en Vmax

Si cambia Km

Inhibidor no competitivo. El inhibidor no se une al sitio activo de

la enzima sino a un sitio alejado del sitio activo y ocasiona un cambio conformacional en el sitio activo de la enzima.

Un inhibidor no competitivo puro es aquel en el que sólo se altera la capacidad de unir al sustrato.

Inhibidores NO competitivos La mayoría da una inhibición de

tipo mixta, es decir, no sólo se afecta la unión del sustrato sino también la conversión del sustrato a producto.

Los inhibidores mixtos alteran tanto la Vmax como la Km de la enzima.

INHIBICIÓN NO COMPETITIVA

PURA MIXTA

Inhibidor acompetitivo.

Es un inhibidor que no es capaz de unirse a la enzima libre, es decir sólo se une al complejo Enzima-Sustrato.

Lo anterior puede deberse a que la unión del sustrato expone o crea sitios de acceso o unión para el inhibidor, en el o fuera del sitio activo.

Una vez que el inhibidor se une la enzima se previene la formación de producto.

El inhibidor acompetitivo altera la Km de la enzima.

http://www-biol.paisley.ac.uk/kinetics/Chapter_3/contents_chap3.html

Diferentes tipos de efectos de los inhibidores sobre los parámetros cinéticos de las enzimas