Fijacin y tcnicas de preparacin de extendidos citolgicos

IntroduccinCitologa es parte de la biologa que estudia las clulas y sus organelas, su desarrollo ha sido paralela al del microscopio. Desde hace muchos aos ha sido de gran valor en el campo de la medicina para la deteccin del cncer cervico-uterino y de otros sitios del cuerpo. Los laboratorios de citologa deben estar dotados de varias reas de trabajo: -Citologa ginecolgica -Citologa de lquidos o derrames -Puncin aspiracin con aguja fina(PAAF)

Interpretacin celularMtodos de recoleccinFijacin y fijadores Preservacin de lquidos antes de ser procesados Preparacin de material citolgico para el examen

microscpico Tincin y montaje de la muestra celular

Mtodos de recoleccin Citologa ginecolgica:

Citologa convencional es recolectada del crvix por el personal mdico o enfermera Puncin Aspiracin con aguja

Citologa de lquidos

Fina pueden ser recolectadas por patlogos (as) con experiencia en este campo.

corporales como orina y esputo pueden ser recolectada por el mismo paciente siguiendo las recomendaciones mdicas o del laboratorio Para la recoleccin de los derrames como pleural, peritoneal, LCR y otros , el paciente debe estar ingresado y el medico debe realizar la recoleccin adecuada.

Citologa cervico-vaginal

Puncin aspiracin con aguja fina (PAAF=BAAF)

Derrames corporales

Toracocentesis y paracentesis

Fijacin La fijacin inmediata de las muestras es necesaria

para preservar los detalles celulares en los extendidos citolgicos. Si las muestras se dejan secar al aire antes de la fijacin las clulas pueden sufrir distorsin en su arquitectura.

Fijadores Para preservar muestras ginecolgicas : Alcohol al 95%- ter. Alcohol 95% en atomizador o citospray. Metanol al 100% Propanol 80% Isopropanol 80% Pre-fijador para muestras de lquidos corporales: alcohol 50%. Para las PAAF se pueden utilizar: Alcohol 95% Formalina buferada al 10% Secado al aire.

Fijacin inmediata

Liq. Pleural fijado en alcohol 95%

Liq. Pleural fijado en formalina al 10%

Muestra de liq. Peritoneal fijada en alcohol al 95%

Fijadores especiales

Solucin de formalina buferada neutral: Formalina 37-40%100ml Agua 900ml Fosfato de sodio monobsico . 4 g Fosfato de sodio bibsico 6.5 g. Solucin de Bouin Solucin acuosa de cido pcrico 1.2 %50mlFormol 37-40% 250ml

Fijador de Carnoy -Etanol 95% 60 ml -Cloroformo 30 ml -Acido actico glacial 10 ml (en este fijador la muestra no debe permanecer ms de 15 min)Vapor de formalina: este fijador hemolisa los glbulo rojos y encoge las clulas Fijador cido Pcrico -Acido pcrico 1.3 g -Alcohol etlico 70% 1000ml

Acido actico glacial 50ml

Preservacin de Lquidos antes de ser procesados Preservar la morfologa celular hasta que la muestra sea

procesada es esencial para la correcta interpretacin. Los especimenes pueden ser sometidos al laboratorio sin preservacin si se facilita la inmediata preparacin de los extendidos. El tiempo entre la recoleccin de la muestra y la preparacin antes de sufrir dao celular depende del PH, protenas, actividad enzimtica y la presencia o ausencia de bacterias. Ejemplo: Lavado Gstrico

Preparacin del material citolgico para el examen microscpico Muestras lquidas como orina , derrames pleurales, peritoneales o LCR., se deben someter al mtodo de sedimentacin en centrifuga por 5 min a 1500 o 2000rpm , del material obtenido se realiza los extendidos. Muestras con alto contenido mucoso como Esputo, aspirado bronquial o lquido de mucocele deben realizarse los extendidos citolgicos directamente seleccionando partculas slidas, decoloradas o con sangre.

Mtodo de sedimentacin celular

Preparacin del extendido citolgico de esputo

Preparacin con filtro de membrana o millipore Los filtros de millipore son elaborados de celulosa

aproximadamente de 140milimicras, especialmente utilizado en muestra con poco contenido celular como LCR.

Preparacin de bloque celular La tcnica de bloque celular o inclusin en agar

parafina se realiza a partir del sedimento celular decantando liquido sobrenadante y agregando agar lquido, este mtodo es til para complementar diagnostico del citolgico .

Tincin Papanicolaou Tincin de rutina elaborada por el Dr. Georges

Papanicolaou, tienen un valor prctico en la diferenciacin celular tanto citoplasmtica como nuclear y sus modificaciones. Para este mtodo se necesitan 3 soluciones especificas: Hematoxilina de Harris Orange 6 (OG6) Eosina Azur 36, 50 65 (EA-50) Cada una de estas soluciones deben de ser filtradas antes de utilizarla.

Pasos de tincin Pap1. 2.

.

Re fijacin en alcohol al 95% 10 min Hidratacin en alcohol 80%, 70%, 50% agua una sumersin en cada una 3. Tincin Nuclear en Hematoxilina de Harris 6 min 4. Enjuague en agua 5. Extraccin diferencial en cido clorhdrico al 0,25%. 6. Enjuague y deshidratacin en agua, alcohol 50%, 70%, 80% y 95% 7. Tincin citoplasmtica en Orange 6 1 min 8. 3 enjuague en alcohol al 95% 9. Tincin citoplasmtica en EA 36, 50 o 65 1 a 3 min. 10. Enjuague en 3 alcoholes 95% 11. Deshidratacin total en etanol absoluto 12. Clarificacin celular en Xilol

Tinciones especiales Tincin para evaluacin Mtodo de la tincin:

hormonal: Tincin de Shorr1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Alcohol al 50%100ml Biebrich Scarlet 0.5 gr Orange G-6 0.25gr Fast-Green 0.075gr Acido fosfotngstico 0.5gr Acido fosfomolbdico 0.5gr Acido actico 1.0ml

1. Teir la Mx., en solucin de Shorr por 1 min. 2. Enjuagar en alcohol al 70%, 95% y alcohol absoluto 3. Aclarar en xilol y montaje permanente

Otras tincionesMtodo de Rakoft:

Tincin para cromatina

sexual: Light Green 83ml Solucin acuosa de eosina

al 1 % 17ml La muestra tomada de la pared vaginal se coloca en 2 cc., de solucin salina y se le agrega 1 gota de la mezcla de Rakoft, se deposita esta muestra en la lamina.

1. Tincin de Biebrich Scarlet-Fast-Green 2. Tincin de Orceina actica 3. Tincin Cresil Violeta

Montaje de la muestra procesada Los medios de montajes crean un capa permanente

entre la lmina y el cubreobjetos protegindola del medio ambiente, daos mecnicos, disecacin celular, logrando as almacenarlas luego de haber sido visualizadas o diagnosticadas . Se coloca una gota del medio de montaje sobre la muestra Se diluye con Xilol y antes de que se seque colocar el cubre objeto tratando de que la muestra quede protegida

Algunas recomendaciones Muestras citolgicas hemorrgicas antes de proceder a

tincin deben de sumergirse por 5 seg., en solucin acuosa de cido actico al 2% Extendidos citolgicos cervicovaginal sin fijar se re hidrataran sumergiendo la laminilla en glicerina al 50% por 2 seg., y luego sumergir en alcohol al 95% .