Tipos de detectores de HPLCLa cromatografa lquida de alta eficacia (HPLC, por sus siglas en ingls) es un mtodo analtico que identifica los componentes de mezclas compuestas o compuestos. Esta tecnologa fue desarrollada en la dcada de 1980 con el desarrollo de programas y distintos tipos de columnas utilizadas para el anlisis complejo. La HPLC se utiliza mayormente en industrias como la farmacutica, ambiental, alimenticia, de bebidas y energa, y para el estudio y desarrollo. El instrumento con el que se lleva a cabo la HPLC consiste en un depsito de solvente, un degasificador (bomba), un inyector, un detector, un integrador y una columna. La columna es un horno de control de temperatura. Los principales fabricantes de instrumentacin para HPLC son Waters, Argilent, Shimadzu y Hewlett Packard. Todos los instrumentos de HPLC pueden funcionar con distintos detectores y programas.Tipos de detectores de HPLCUltravioleta (UV)Los detectores ultravioleta (UV) son econmicos y populares y son ampliamente utilizados en la industria. Este tipo de detector responde a sustancias que absorben luz. El detector de UV es principalmente utilizado en las ciencias biomdica y farmacutica para separar e identificar los principales componentes activos de una mezcla. Los detectores de UV son los ms verstiles, ya que cuentan con la mayor sensibilidad y linealidad. Los detectores de UV no pueden utilizarse para probar sustancias bajas en cromforos (incoloros o prcticamente incoloros) ya que no pueden absorber luz en rangos bajos.FluorescenciaLa fluorescencia es el detector de HPLC ms sensible. Se utiliza prcticamente de manera exclusiva en la cromatografa lquida (LC). Se trata de un detector especfico que detecta solamente aquellas sustancias que emiten luz. Este detector es popular en el anlisis de trazas dentro de la ciencia ambiental. Como es muy sensible, su respuesta es solamente lineal sobre un rango de concentracin relativamente limitado. Como no hay muchos elementos que se tornan fluorescentes, los cientficos necesitan sintetizar muestras para que sean detectables.Espectrometra de masasEl detector de espectrometra de masas junto con la HPLC se denominan HPLC-MS (por sus siglas en ingls). ste forma uno de los mejores conjuntos analticos. El HPLC-MS es el detector ms potente. Tiene particularmente relevancia dentro del mbito de la ciencia mdica y es ampliamente utilizado en laboratorios farmacuticos y en la investigacin y el desarrollo. El principal beneficio del HPLC-MS es su capacidad de analizar y proporcionar la identidad molecular de un amplio rango de componentes.Deteccin del ndice de refraccin (IR)El detector del ndice de refraccin (IR) utiliza un monocromador y es uno de los detectores LC menos sensibles. Es extremadamente til para detectar aquellos componentes que son no inicos. No absorbe la luz ultravioleta y no se torna fluorescente. Algunas muestras que se examinan con este detector son el azcar, el alcohol, los cidos grasos y los polmeros.

Tipos de columnas HPLC

Las columnas de HPLC difieren en el tipo de fase estacionaria que utilizan.

blue particles image by Christopher Ursitti from Fotolia.comLa cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) es un tipo de cromatografa en columna diseada para separar y clasificar los componentes de una muestra sobre la base de sus interacciones con una columna especfica. HPLC es distinta, ya que utiliza un entorno ms presurizado para propulsar las muestras lquidas a travs de la densa columna de manera ms eficiente. Tres tipos de columnas de HPLC estn en uso comn hoy en da, pero difieren en la naturaleza de la capa de material que recubre la columna e interacta con la muestra.Columna de intercambio inicoLos experimentadores utilizan cromatografa de intercambio inico al separar muestras ionizables, o muestras que se puede cargar. La fase estacionaria, que es el material slido que recubre la columna e interacta con la muestra, posee una carga opuesta a la de la muestra de inters, de manera que la muestra ser atrada a las paredes de la columna. Esta atraccin ralentiza el tiempo de elucin e la muestra, o el tiempo que se necesita para pasar todo la columna en la fase mvil. Mientras ms cargadas estn las partculas de la muestra, ms atradas estarn por la fase estacionaria, lo que resulta en un tiempo de elucin ms lento. El tiempo de elucin representan la intensidad de la carga de las partculas, y por lo tanto es el medio principal de clasificacin de los distintos compuestos dentro de la muestra.Columna de adsorcinComo su nombre lo indica, la cromatografa de adsorcin funciona a travs de una fase estacionaria adsorbente. La adsorcin, que no debe confundirse con la absorcin, implica la unin temporal de las partculas de la muestra a la fase estacionaria de la columna. El grado en el que una partcula de la muestra puede adsorberse a la fase estacionaria est determinada por la polaridad relativa, o carga, que la partcula puede poseer en un momento dado. Esto vara de la cromatografa de intercambio inico en que las partculas no se cargan de manera explcita, sino que a veces son ligeramente positivas o negativas a medida que la partcula gira y vibra. Mientras la partcula se mueve hacia abajo en la columna, se adsorbe y de-adsorbe en diversos grados en funcin del nivel de polaridad que posee. Los tiempos de elucin proporcionan una medida del nivel de polaridad de las partculas de la muestra.Columna de exclusin por tamaoLa cromatografa de exclusin por tamao utiliza una tcnica de separacin diferente a la de intercambio inico o de adsorcin. Este tipo de columna es menos comn que las otras dos, pero es til cuando se separan biomolculas grandes como protenas o hidratos de carbono. La fase estacionaria se compone de partculas no cargadas, que son de tamao controlado y porosas. Cuando la muestra se dispara a travs de la columna, las partculas de tamao ms pequeo son absorbidos temporalmente en el recubrimiento de la columna, mientras que las partculas ms grandes pasan directamente a travs de l y se eluyen primero. La fase estacionaria est diseada de manera que cuanto ms pequea sea la partcula, ms profundamente penetra en el recubrimiento de la columna, lo que significa que a las partculas ms pequeas les tomar la mayor cantidad de tiempo para volver a la superficie y eluir. Las muestras se pueden clasificar de acuerdo con el tiempo de elucin, lo que se corresponde directamente con tamao de partcula.Desventajas y ventajas de un HPLC

Desventajas y ventajas de un HPLCComstock Images/Comstock/Getty Images

La cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) ha sido un gran avance para los bioqumicos tratando de identificar los distintos compuestos presentes en las muestras de material biolgico rpidamente. La automatizacin de este proceso una vez impulsado por la gravedad ha llevado a varios mtodos divergentes de cromatografa, pero el avance de la tecnologa todava tiene algunas desventajas asociadas con su conveniencia moderna.ProcesoLa cromatografa lquida de alto rendimiento se utiliza en las ramas de la bioqumica para separar e identificar compuestos en base a su polaridad. El dispositivo emplea una bomba que acta para crear una presin lo suficientemente alta como para forzar al compuesto a separarse en partculas polarizadas a travs del dispositivo.VentajasEl HPLC es un proceso automtico que toma slo unos pocos minutos para producir resultados. Esta es una marcada diferencia en la cromatografa lquida que utiliza la gravedad en lugar de una bomba de alta velocidad para forzar compuestos a travs de un tubo densamente empaquetado. Los resultados obtenidos son de una alta resolucin y son fciles de leer, y las pruebas se reproducen con facilidad a travs del proceso automatizado.DesventajasEs difcil de detectar coelucin (dos compuestos que escapan de la tubera a la vez) con HPLC, lo que puede dar a la categorizacin de compuesto incorrecto. Existe un alto costo para el equipo necesario para llevar a cabo HPLC. Su funcionamiento puede ser complejo y requiere un tcnico entrenado para operar. Debido a la velocidad del proceso, el equipo tiene una baja sensibilidad a algunos compuestos.Tipos de bombas Se utilizan tres tipos de bombas, cada una con sus propias ventajas y desventajas: bombas recprocas, bombas de jeringa o de desplazamiento y bombas neumticas o de presin constante. Las bombas recprocas, que se utilizan en aproximadamente el 90% de los sistemas de HPLC comercializados, consisten, por lo general, en una pequea cmara en la que el disolvente es impelido por el movimiento de vaivn de un pistn accionado por un motor. Dos vlvulas con cierre de bola, que se abren y cierran alternativamente, controlan el flujo del disolvente hacia dentro y hacia afuera de un cilindro. Las bombas recprocas tienen la desventaja de que producen un flujo con pulsaciones, las cuales se han de amortiguar dado que su presencia se manifiesta como ruido en la lnea base en el cromatograma. Entre las ventajas de las bombas recprocas se pueden citar su pequeo volumen interno (35 a 400 mL), sus altas presiones de salida (por encima de los 500 kg/cm2), su fcil adaptacin a la elucin con gradiente, y sus caudales constantes, que son prcticamente independientes de la contrapresin de la columna y de la viscosidad del disolvente.

La utilizacin de disolventes ms polares en la fase mvil disminuye el tiempo de retencin de los compuestos mientras que los disolventes ms hidrofbicos tienden a aumentar el tiempo de retencin.