Denis Viera Julio 2012

Análisis de los Azúcares Glicósidos Diterpénicos de las

hojas de Stevia Rebaudiana Bertoni y la utilización de

equipos HPLC como método analítico

Stevia rebaudiana es una planta originaria de Paraguay productora de glicósidos de tipo diterpenoide, los cuales son considerados 300 veces más dulce que la sacarosa y su aporte energético es bajo, además de presentar otras propiedades terapéuticas.

Stevia Rebaudiana

Bertoni

Estos glicósidos son considerados como dietéticos porque su estructura no es metabolizada por el organismo humano. Presentan características de estabilidad al calor (198-200°C) y no se fermentan.

El contenido de glicósidos en la planta se encuentra en mayor concentración en las hojas, siendo aproximadamente de 15%, según la variedad.

Los principales componentes hasta ahora aislados e identificados son: Steviósido, Rebaudiósido A y C (denominado también Dulcósido B).

Los componentes menores son Steviolbiósido, Rebaudiósido B, D, E y Dulcósido A.

La existencia de Steviolbiósido, Rebaudiósido B, algunos autores postulan que estos son productos que se originan en el proceso de extracción.

Compuestos de Interés

Desde el punto de vista de su empleo como edulcorante, nos interesa en especial el Steviósido y el Rebaudiósido A.

El contenido medio aproximado de estos componentes en las hojas es de 7% y 3% respectivamente.

El poder edulcorante relativo, tomando como comparación el dulzor de la sacarosa, es 300 veces mayor para el Steviósido y 450 veces mayor para el Rebaudiósido A.

Tanto el Steviolbiósido como el Rebaudiósido B son débilmente dulces, en tanto que el Steviol es insípido.

Reactivos: Metanol y cloroformo (grado

analítico). Metanol, acetonitrilo y Agua (grado

HPLC)

Equipo: HP series 1100 sistema HPLC

(Hewlett-Packard, Avondale, PA), también con una columna amina NH2 column Zorbax, 5 um, 150 X 4.6 mm (Du Pont, Wilmington, DE), automuestrador G1313A, UV-DAD detection y un software (Chemstation integration Software).

Equipo HPLC y Reactivos a

utilizar

Preparación de la Muestra

Las hojas son secadas en un horno con una temperatura aproximada de 60°C.

10 muestras de polvo (dp<30 mesh ASTM) 0.595mm de hojas secas de S. rebaudiana son replicadas en tamaño de 1g.

Se procede a una extracción en un sistema soxhlet secuencialmente con cloroformo (200mL) por 3 horas y metanol (200mL) por 5 horas

Preparación de la muestra

Equipo Soxhlet en serie

Se debe tener en cuenta que las hojas de stevia es una mezcla compleja de varios compuestos por lo cual se debe hacer extracciones según las polaridades de los componentes y de solventes.

Las etapas secuenciales de extracción se realizan con una primera extracción con un solvente de polaridad intermedia para remover impurezas , su extracto esta libre de glicósidos diterpénicos. Normalmente se utiliza Cloroformo (grado analítico).

Justificación del procedimiento de

Extracción con sistemas soxhlet

Secuencialmente se realiza una segunda extracción con un solvente de polaridad alta, para poder tener en el extracto los glicósidos diterpénicos. Normalmente se utiliza Metanol (grado analítico).

Los extractos de metanol son evaporados en un rotovaporador para secado en vacío

Se disuelve en porciones de 50mL de metanol grado-HPLC.

Alicuotas (2mL) de cada solucion son filtradas (Syringe Filter, Nylon, 0.22 um)

Luego son pasados a través de una pre-columna de limpieza

Finalmente podemos ingresarlo al equipo HPLC, inyectando 5uL.

Para optimizar la separación de los azúcares glicósidos diterpénicos , steviósido y Rebaudiósido A, utilizamos la siguiente condición de operación HPLC:

Elución Gradiente: 84:16 a 70:30, v/v, acetonitrilo/agua(pH 5),el gradiente lineal cambia dentro del periodo de 15 min, , flujo 2mL/min; UV detector 210nm, Temperatura ambiente

Elución Isocrática: 80:20, v/v, acetonitrilo/agua(pH 5), flujo 2mL/min; UV detector 210nm, Temperatura ambiente

High-Performance Liquid

Chromatography (HPLC)

Los compuestos en cada muestra son identificados mediante la comparación de sus tiempos de retención con los de los estándares de referencia (Patrones).

Características cromatográficas del esteviósido y rebaudiósido A se muestran en la Tabla 1.

Ejemplo de un Cromatograma de Stevia

Se ha analizado varios procedimientos para la separación de azúcares glicósidos diterpénicos para poder inyectar al equipo HPLC y poder tener un cromatograma de nuestros analítos, hemos escogido este procedimiento ya que ha sido comprobado y consta en varios papers, este documento nos ayudará para su posterior uso en diferentes etapas de investigación para la industria de Stevia.

Conclusión