Dr. DANTE FLORES

H P L C

HIGH –PRESSURE LIQUID-SOLID CHROMATOGRAPHY

CROMATOGRAFIA DE LIQUIDOS DE ALTA RESOLUCION

CROMATOGRAFIA DE LIQUIDOS DE ALTA EFICACIA

VENTAJASVENTAJAS

El proceso cromatográfico es rápido pudiéndose resolver mezclas muy complejas en minutos.

Permite la separación de sustancias termolábiles.

Se puede lograr resolución de sustancias con peso molecular de 54 a 450.000

Diagrama de los componentes Diagrama de los componentes del HPLCdel HPLC

InstrumentaciónInstrumentación

Reservorio de solventes Desgasificador Bomba

Inyector automático Termostato de columna Detectores

Instrumentación Instrumentación

BOMBASBOMBASLos instrumentos de HPLC deben tener un sistema que suministre la presión adecuada, para que se alcance un caudal suficiente a su salida.

•Bombas reciprocas

•Bombas de jeringas o desplazamiento

•Bombas neumáticas o de presión constante

Requisitos para un sistema de bombeo•Generación de presión por encima de 6000 psi

•Flujo libre de pulsaciones

•Intervalo de caudal de 0.1 ml a 10 ml

•Componentes resistentes a la corrosión

Funciones de la bomba Funciones de la bomba

LA BOMBA TIENE TRES FUNCIONES BASICAS

Proveer al sistema un flujo exacto y constanteProveer una fase móvil de composición exactaProveer la fuerza necesaria para impulsar la

fase móvil a través de la columna

Gradiente:

Isocrático

Gradiente de caudal:

Es la variación del caudal durante el proceso cromatográfico.

Muestras de características hidrosolubles

VITAMINAS

INYECTORES

Actualmente se disponen de inyectores automáticos.

Los manuales son:

* Sistema de bucle

* Resistencia hidrodinámico

Volumen de muestra de 5 a 500 ul.

7000 psi

Jeringas Hamilton

COLUMNAS PARA HPLCCOLUMNAS PARA HPLC

Se construyen de acero inoxidable.Presentan una longitud de 10 y 30 cm. El

mas frecuente es de 25 cm.El diámetro es 4 a 10 mm.El tamaño de la partícula de la fase

estacionaria es de 3.5 y 10um

Precolumna

Aumenta la vida de la columna analíticaSatura la fase móvil con la fase

estacionaria.La composición de la fase estacionaria

debe ser semejante a la columna analíticaEl tamaño de partícula es mayor

Precolumna

Clasificación de la columna Clasificación de la columna según su rellenosegún su relleno

En función de su consistenciaSegún la porosidad de las partículas En función de la forma de la partículaEn función del diámetro medio de la

partícula.

Partículas del soporte fijo tomadas con un microscopio electrónico

Columnas Columnas

La parte interna de las columnas presentan surcos concéntricos revestidos con una capa de glicerina para dar uniformidad a la fase estacionaria empacada.

Cromatografía de fase Cromatografía de fase normalnormal

Retardo por interacción de la superficie polar de la fase estacionaria con partes polares de las moléculas.

SIO2, Al2 O3, AMINO,-CN, -NO2

Cromatografia de fase normalCromatografia de fase normal

Heptano, hexano, ciclohexano, cloroformo diclorometano, dioxano, metanol

Separación de sustancias no iónicas apolares hasta semipolares (hidrocarburos --- Ac. Carbónicos)

Cromatografía fase inversaCromatografía fase inversa

Retardo por interacción de la cadena apolar hidrocarbonada de la fase estacionaria con partes apolares de las moléculas de la prueba

Cromatografía fase inversaCromatografía fase inversa

n – octadecilo (RP-18) n-octilo , etilo fenilo polímeros hidrófobos.

Metanol o Acetonitrilo/agua o tampón Separación de sustancias no iónicas

apolares hasta semipolares. Mayor resolución de separación.

Condiciones que debe reunir Condiciones que debe reunir el detectorel detector

Respuesta universal con todos los solutosSensibilidad alta (10-12 – 10-11g/mlRuido de fondo muy bajoCelda del detecto de menor volumenNo debe destruir la muestraDebe ser capaz de funcionar durante mucho

tiempo.

Clasificación de los detectoresClasificación de los detectores

AbsorbanciaFluorescenciaElectroquímicoÍndice de refracciónConductividadEspectrometría de masas

Detector de absorbanciaDetector de absorbancia

Definida por la ley de Lambert-BeerUtiliza lámparas de vapor de mercurioCelda de flujo para 10 ulSon de doble hazDeberá tener regiones electromagnéticas de

la luz ultravioleta y visible.

Detectores de diodos en serie Detectores de diodos en serie photodiode arrayphotodiode array

Detectan dos tipos de compuestos que absorben a distintas longitudes de onda

Los datos espectrales se registran en la memoria del computador en fracciones de segundo.

Proporciona gráficos tridimensionalesSistema de diodos

diodos

Campos de aplicacionCampos de aplicacion

Acidos biliares, colorantes biliaresAlcaloidesAnestésicos locales AnticarcinógenosAnticuagulantesAntimicrobianosAzucareshormonas

LípidosNucleósidos /nucleotidosSustancias cardioactivasVitaminas Extractos de orinaMetabolitos de drogasVenenosPlaguicidas

CREATININA

Benzodiacepinas en suero

Clorodiacepóxido

Benzodiacepinas en suero

Nitracepan

Oxacepan

Diacepan