Detección y caracterización del virus

del Síndrome Reproductivo y

Respiratorio Porcino en tres granjas

de producción intensiva para el

establecimiento del control local de la

enfermedad

Eliana Mendoza Niño

Universidad Nacional de Colombia Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia

Maestría Salud y Producción Animal Bogotá, Colombia

2015

Detección y caracterización del virus

del Síndrome Reproductivo y

Respiratorio Porcino en tres granjas

de producción intensiva para el

establecimiento del control local de la

enfermedad

Eliana Mendoza Niño

Tesis presentada como requisito parcial para optar el título de:

Magister en Salud y Producción Animal

Director:

Jairo Jaime Correa M.V., M.Sc., Ph.D.

Línea de Investigación

Microbiología y Epidemiología

Grupo de Investigación

Microbiología y Epidemiología

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia

Maestría Salud y Producción Animal

Bogotá, Colombia

2015

Dedicatoria

Esta es la suma de

muchos esfuerzos, en los que

he tenido a mi lado seres que

me han inspirado y otros que

me han retado. Gracias a todos

por que sin ellos no tendría la

satisfacción de ver cumplida

esta meta.

Va dedicado a los seres de luz

que me acompañan siempre: a

mi Mamá, a Lola, a mi Tío.

A mi Papá por forjar el ser que

soy.

A mis amigos y a todo aquel

que tuvo que ver en alguna parte de

esta historia.

Y por supuesto a los animales….

Agradecimientos

A Dios, a mis padres, a mi abuela y tío, por hacer de mí quien soy hoy.

A mis amigos por su constante aliento y buen sentido del humor.

Al Doctor Jairo Jaime Correa, por su dirección y orientación

Al Doctor José Dario Mogollón, por su acompañamiento y aportes técnicos.

A los profesores, compañeros y personal administrativo del Posgrado de Medicina

Veterinaria y de Zootecnia de la Universidad Nacional.

A la Asociación Colombiana de Porcicultores – Fondo Nacional de la Porcicultura, por su

apoyo financiero.

A las compañeras del Laboratorio Nacional de Diagnóstico Veterinario (Laboratorio de

Medicina Porcina y Biología Molecular) del Instituto Colombiano Agropecuario, por su

apoyo técnico.

A todo aquel que vivió conmigo, parte de esta experiencia.

Resumen

El presente estudio se realizó con el fin de evaluar el comportamiento del virus del PRRS

y su evolución en tres granjas de tipo intensivo del departamento del Valle del Cauca,

con el fin de orientar un programa de control específico para la condición en cada una de

dichas granjas. Para tal objetivo se evaluaron tres factores: tres granjas, siete grupos

etáreos (madres, reproductores, reemplazos, lactantes, destetos, preceba y ceba)

durante nueve meses, a partir de septiembre de 2012 a mayo de 2013.

En cada granja se tomaron muestras de suero de cada grupo etareo, muestras de fluido

oral de la preceba y ceba, tejidos y lavados bronquio alveolares (LBA) a partir de las

mortalidades que presentaron sintomatología compatible con el PRRS. Para determinar

la respuesta serológica se utilizó la técnica de ELISA (PRRS X 3 de IDEXX), igualmente

se determinó la presencia del agente viral mediante el uso de la qRT-PCR y aislamientos

en células MA-104. Los productos amplificados fueron secuenciados para determinar la

cepa circulante en cada una de las granjas.

Los resultados indicaron un incremento en la circulación del PRRSV en explotaciones

intensivas del departamento del Valle del Cauca, específicamente dentro de los sistemas

de producción de la preceba y ceba. Se observó que el uso de pruebas serológicas junto

con técnicas moleculares para el diagnóstico de PRRSV, permite conocer la dinámica del

virus dentro de cada granja y grupo etáreo. Mediante la secuenciación, se determinó que

las cepas circulantes correspondían al genotipo americano, confirmando los hallazgos

obtenidos en los primeros estudios filogenéticos para PRRSV realizados en el país.

Todos estos resultados permitieron inferir que el comportamiento en cada granja

respecto a PRRSV fue diferente, por tal razón, las recomendaciones igualmente debieron

ser aplicadas en forma individual con el fin de lograr el control adecuado de la

enfermedad.

Palabras clave: Control; Diagnóstico; PCR; PRRS.

Abstract

This study was conducted to determine the PRRS virus activity and its evolution in three

pig intensive production farms from an Colombian region: Valle del Cauca province; in

order to establish a specific monitoring program for each production system. To this aim,

three factors were evaluated: (i) farms (three), (ii) groups of age (mothers, boars,

replacements, piglest, weaned, pre-fattening and fattening) (iii) time ( nine months, from

September 2012 to May 2013).

In each farm serum samples were collect from each group of age, oral fluid samples were

taken from the pre-fattening and fattening groups, tissues and broncho alveolar lavage

(BAL) was recovered from necropsied pigs with PRRS compatible symptoms. To

determine the serological response an antibodies detection ELISA kit (IDEXX PRRS X3)

was employed, also the presence of viral genome was determined by real time RT-PCR

(qRT-PCR) and PRRSV isolation was performed on MA-104 cells. Aditionally, amplified

products from ORF-5 were sequenced to verify circulating strains into each farm.

Results indicated an increase of PRRSV circulation on Valle del Cauca region,

specifically within pre-fattening and fattening groups. The employment of both serological

and tests with molecular tests for PRRSV diagnostic provide understanding about viral

dynamic within each farm and age group. By sequencing it was found that strains

obtained corresponded to the American genotype, confirming findings from the first

PRRSV phylogenetic studies, conducted in the country. These results allowed to infer that

the PRRSV behavior in each farm was different, for this reason, the recommendations

should also be applied individually in order to achieve an adequate control of the disease.

Keywords: Control; Diagnosis; PCR; PRRS.

Contenido

Resumen y Abstract

Lista de tablas

Lista de figuras

Anexos

Abreviaturas y siglas

Introducción

Objetivos

1. Síndrome Reproductivo y Respiratorio Porcino - PPRS

1.1Historia

1.2 Situación mundial

1.3 Situación Colombia

1.4 Impacto económico

1.5 Agente etiológico

1.5.1 Proteínas no estructurales (NSPs)

1.5.2 Proteínas estructurales

1.6 Patogénesis

1.7 Respuesta Inmune

1.7.1 Respuesta inmune innata

1.7.2 Inmunidad adaptativa

1.7.3 Persistencia

1.8 Diagnóstico

1.8.1 Identificación de los signos clínicos

1.8.2 Lesiones microscópicas

1.8.2.1 Histopatología

1.8.3 Detección del virus

1.8.3.1 Aislamiento viral

1.8.3.2 Reacción en Cadena de la Polimerasa - PCR

1.8.4 Secuenciación

1.8.5 Pruebas serológicas

1.8.5.1 ELISA

1.8.5.2 Inmunofluorescencia indirecta – IFA

1.8.5.3 Seroneutralización

1.9 Control del PRRS

Bibliografía

2. Evaluación de la dinámica de anticuerpos frente al virus del Síndrome

Reproductivo y Respiratorio Porcino (PRRS) en tres granjas del departamento del

Valle del Cauca

Resumen

Abstract

Introducción

2.1 Materiales y Métodos

2.1.1 Ubicación geográfica y características de las granjas

2.1.2 Muestras

2.1.3 Evaluación Serológica

2.1.4 Análisis Estadístico

2.2 Resultados

2.2.1 Granja 1

2.2.2 Granja 2

2.2.3 Granja 3

2.3 Discusión

2.4 Conclusiones

2.5 Recomendaciones

Bibliografía

3. Determinación mediante la técnica de RT-PCR en tiempo real (qRT-PCR) de la

presencia del virus del Síndrome Reproductivo y Respiratorio Porcino (PRRSV) en

tres granjas del Valle del Cauca

Resumen

Abstract

Introducción

3.1 Materiales y Métodos

3.1.1 Ubicación geográfica y características de las granjas

3.1.2 Muestras

3.1.2.1 Sueros

3.1.2.2 Fluidos Orales (FO)

3.1.2.3 Lavado Bronquio alveolar (LBA)

3.1.2.4 Tejidos

3.1.3 Reacción en Cadena de la Polimerasa en Tiempo real (RT-qPCR)

3.1.3.1 Virus

3.1.3.2 Extracción ARN viral

3.1.3.3 Síntesis de ADNc

3.1.3.4 Curva Estándar

3.1.4 Análisis estadístico

3.2 Resultados

3.2.1 qRT-PCR en muestras de sueros

3.2.1.1 Granja 1

3.2.1.2 Granja 2

3.2.1.3 Granja 3

3.2.1.4 Comparación resultados por RT-PCR tiempo real y ELISA

3.2.2 qRT-PCR en muestras de Fluido oral (FO)

3.2.2.1 Granja 1

3.2.2.2 Granja 2

3.2.2.3 Granja 3

3.2.3 qRT-PCR en muestras de pulmón y ganglio linfático

3.2.3.1 Granja 1

3.2.3.2 Granja 2

3.2.3.3 Granja 3

3.2.4 qRT-PCR en lavado bronquioalveolar (LBA)

3.2.4.1 Granja 1

3.2.4.2 Granja 2

3.2.4.3 Granja 3

3.3 Discusión

3.4 Conclusiones

3.5 Recomendaciones

Bibliografía

4. Detección y determinación genotípica del virus del Síndrome Reproductivo y

Respiratorio Porcino (PRRSV) mediante aislamiento en células MA-104 y

secuenciación de muestras provenientes de tres granjas del valle del Cauca

Resumen

Abstract

Introducción

4.1 Materiales y Métodos

4.1.1 Ubicación geográfica y características de las granjas

4.1.2 Muestras

4.1.2.1 Lavado bronquioalveolar (LBA)

4.1.2.2 Tejidos

4.1.3 Virus

4.1.4 Aislamiento viral

4.1.4.1 Células

4.1.5 Secuenciación

4.2 Resultados

4.2.1 Aislamiento

4.2.2 Secuenciación

4.3 Discusión

4.4 Conclusiones

4.5 Recomendaciones

Bibliografía

5. Medidas de Control Propuestas

6. Conclusiones y Recomendaciones

6.1 Conclusiones

6.2 Recomendaciones

A. Anexo: Buffer fosfato salino (PBS) pH 7.2 +/- 0.2

B. Anexo: Solución penicilina-estreptomicina (PEST) – 100X

C. Anexo: Buffer fosfato salino (PBS) 10x para cultivo celular

Bibliografía

Lista de tablas

Tabla 2-1 Ubicación geográfica de las tres granjas y de los sitios productivos por granja

Tabla 2-2 Resultados por ELISA en Granja 1

Tabla 2-3 Resultados por ELISA en Granja 2

Tabla 2-4 Resultados por ELISA en Granja 3

Tabla 3-1 Ubicación geográfica de las tres granjas y de los sitios productivos por granja

Tabla 3-2 Sueros procesados por granja durante el tiempo de estudio

Tabla 3-3. FO procesados por granja durante el tiempo de estudio

Tabla 3-4. LBA procesados por granja durante el tiempo de estudio

Tabla 3-5. Tejidos procesados por granja durante el tiempo de estudio

Tabla 3-6. Comparación resultados obtenidos por qRT-PCR y ELISA en sueros en las

tres granjas

Tabla 3-7. Comportamiento serológico de las muestras positivas por qRT-PCR

Tabla 4-1. Descripción de los Primers utilizados en la secuenciación

Tabla 4-2. Descripción de las cepas americanas y europeas utilizadas en la realización

del árbol filogenético de las muestras concenso

Tabla 4-3. Resultados de aislamientos en células MA-104 en tejidos y LBA

Lista de figuras

Figura 1.1. Estructura del virus y del genoma de PRRS

Figura 2-1 Ubicación geográfica de cada granja dentro del Departamento del Valle del

Cauca

Figura 2-2 Comportamiento de los promedios de resultados del grupo ceba dentro de la

Granja 1 durante el tiempo de estudio

Figura 2-3 Comportamiento de los promedios de resultados serológicos del grupo de las

Madres dentro de la Granja 3 durante el tiempo de estudio

Figura 2-4 Comportamiento de los promedios de resultados serológicos del grupo de los

Lactantes dentro de la Granja 3 durante el tiempo de estudio

Figura 2-5. Comportamiento de los promedios de resultados serológicos del grupo de los

Destetos dentro de la Granja 3 durante el tiempo de estudio.

Figura 2-6 Comportamiento de los promedios de resultados serológicos del grupo de los

Reproductores dentro de la granja 3 durante el tiempo de estudio.

Figura 2-7 Comportamiento de los promedios de resultados serológicos del grupo de la

Preceba dentro de la Granja 3 durante el tiempo de estudio.

Figura 2-8 Comportamiento de los promedios de resultados serológicos del grupo de los

Reemplazos dentro de la Granja 3 durante el tiempo de estudio

Figura 2-9 Comportamiento de los promedios de resultados serológicos del grupo de la

Ceba dentro de la Granja 3 durante el tiempo de estudio

Figura 3-1 Ubicación geográfica de cada granja dentro del Departamento del Valle del

Cauca.

Figura 3-2 Curva Estándar por qRT-PCR.

Figura 3-3. Resultados obtenidos por qRT-PCR en sueros dentro de cada granja

evaluada

Figura 3-4. Resultados por qRT-PCR en sueros de cada grupo etáreo en la granja 1.

Figura 3-5. Resultados de qRT-PCR en sueros durante el tiempo en la granja 1.

Figura 3-6. Resultados por qRT-PCR en sueros de cada grupo etareo en la granja 2

Figura 3-7. Resultados de qRT-PCR en sueros durante el tiempo en la granja 2

Figura 3-8. Resultados por qRT-PCR en sueros de cada grupo etareo en la granja 3.

Figura 3-9. Resultados de qRT-PCR en sueros durante el tiempo en la granja 3.

Figura 3-10. Resultados por qRT-PCR en fluídos orales en las tres granjas

Figura 3-11. Resultados por qRT-PCR en FO por grupo etáreo en la granja 1.

Figura 3-12. Resultados por qRT-PCR en FO durante el tiempo en la granja 1.

Figura 3-13. Resultados por qRT-PCR en FO por grupo etáreo en la granja 2

Figura 3-14. Resultados en el tiempo por qRT-PCR en muestras de FO en la granja 2

Figura 3-15. Resultados por qRT-PCR en FO por grupo etáreo en la granja 3

Figura 3-16. Resultados por RT-PCR en muestras de FO en los grupos etáreos

evaluados en la granja 3.

Figura 3-17. Resultados por qRT-PCR en tejidos en las tres granjas evaluadas

Figura 3-18. Resultados por qRT-PCR en tejidos por grupo etareo en la granja 1.

Figura 3-19. Resultados por qRT-PCR en tejidos a través del tiempo en (A) preceba y (B)

ceba en la granja 1.

Figura 3-20. Resultados por qRT-PCR en tejidos por grupo etáreo en la granja 2.

Figura 3-21. Resultados por qRT-PCR en tejidos a través del tiempo en (A) preceba y (B)

ceba en la granja 1.

Figura 3-22. Resultados por qRT-PCR en tejidos por grupo etáreo en la granja 3.

Figura 3-23. Resultados por qRT-PCR en tejidos a través del tiempo en (A) preceba y (B)

ceba de la granja 3.

Figura 3-24. Resultados por qRT-PCR en LBA para las tres granjas evaluadas

Figura 3-25. Resultados por RT-PCR en LBA por grupo etáreo en la granja 1.

Figura 3-26. Resultados por qRT-PCR en LBA a través del tiempo en la granja 1.

Figura 3-27. Resultados por qRT-PCR en LBA por grupo etáreo en la granja 2

Figura 3-28. Resultados por qRT-PCR en LBA por grupo etáreo en la granja 3.

Figura 3-29. Resultados por qRT-PCR de LBA a través del tiempo en la granja 3.

Figura 4-1. Gel de electroforesis a partir de muestras positivas a qRT-PCR

Figura 4-2. Árbol filogenético realizado en Mega 5, mediante Neighborg-Joining

(Bootstrap 1000).

Anexos

Anexo 1. Buffer fosfato salino (PBS) pH 7.2 +/- 0.2

Anexo 2. Solucion penicilina-estreptomicina (PEST) – 100X

Anexo 3. Buffer fosfato salino (PBS) 10x para cultivo celular

Abreviaturas y Siglas

ADE Antibody dependent enhancement – Aumento dependiente de Anticuerpos

ADNc Acido Desoxirribonucleico complementario

ARNd ARN de doble cadena

EC Efecto citopático

ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay: ensayo por inmunoabsorción

ligado a enzimas

FO Fluido Oral

HP-PRRSV Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus

IFA Inmunofluorescencia indirecta

IFN Interferón

IRF3 Interferon regulator factor 3 - Factor 3 regulador de Interferón

ISG Interferon stimulated gene – Gen estimulador de Interferón

IkBα nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells inhibitor,

alpha

kDa Kilodaltons

LBA Lavado Bronquioalveolar

LNDV Laboratorio Nacional de Diagnóstico Veterinario

LV Lelystad virus

MAPs Macrófagos alveolares porcinos

NF-kB Nuclear factor kappa B

MARC 145 African green monkey kidney derived cells

NSP Non-structural protein - Proteína no structural

ORF Open Reading Frame – marco de lectura abierta

OIE Organisation for Animal Health - Organización mundial para la salud

animal

pb Pares de bases

PI Pos infección

PRRSV Porcine reproductive and respiratory syndrome virus – Virus del síndrome

reproductivo y respiratorio porcino

PCR Reacción en cadena de la polimerasa

qPCR Quantitative PCR

RT-PCR Reverse transcription-PCR

VSN Seroneutralización viral

Introducción

El Síndrome Reproductivo y Respiratorio Porcino (PRRS) es la enfermedad infecciosa de

los porcinos que tiene gran importancia a nivel mundial por su alto impacto a nivel

económico (Holtkman et al., 2013). Esta enfermedad genera altos costos en la

producción porcícola, atribuibles especialmente a pérdidas en la productividad, gastos

veterinarios e implementación de mayores medidas de bioseguridad y cambios en las

características de manejo de los animales. En Estados Unidos, se estimó el impacto

económico del PRRSV entre los años 2005 y 2010, observando que la enfermedad le

costaba a los productores americanos US$ 663,91 millones al año, aproximadamente

US$1.8 millones por día.

En Colombia, los primeros reportes de esta enfermedad, datan de 1996, donde mediante

evidencia serológica se determinó la circulación del PRRSV (Mogollón et al., 2003).

Estudios realizados en 1997, reportaron una prevalencia de la enfermedad del 6.5% en

animales de traspatio y un 22.7% en animales confinados. Estos estudios determinaron

que el virus se encontraba ampliamente distribuido en el país de forma no uniforme,

predominando en los sistemas de producción intensiva (Mogollón et al., 2003). De igual

manera el virus fue aislado de tejidos y sueros en diferentes regiones del país y en los

dos sistemas de producción. Las cepas encontradas en el país se ubicaron dentro del

genotipo americano del virus. Para el año 2006 se observó que la prevalencia de la

enfermedad en explotaciones extensivas se redujo al 4.3%, sin embargo se encontró un

mayor número de departamentos afectados con respecto a estudios previos (Cruz et al.,

2006). En Colombia, actualmente la enfermedad es endémica, constituyendo un factor

limitante en el desarrollo de la industria porcina.

El agente etiológico del PRRS, por su parte, es de difícil control debido a que presenta

una gran variación genómica y la capacidad de producir infecciones persistentes. La alta

variabilidad, se traduce en cambios en los patrones de infectividad y en generación de

una respuesta inmune poco efectiva en el huésped. Los dos genotipos del virus, el tipo I

o Europeo, representado por la cepa Lelystad y el tipo II o Americano, representado por

la cepa VR2332, presentan una alta variabilidad tanto entre estos aislados como entre

genotipos.

Teniendo en cuenta, que en los últimos años no se obtuvo información sobre esta

enfermedad en el país y contando con las experiencias a nivel internacional, se realizó el

presente estudio con el fin de verificar el estatus del PRRSV dentro de tres granjas de

tipo intensivo ubicadas en una de las regiones porcícolas más importantes del país, el

departamento del Valle del Cauca. Se tomaron diferentes tipos de muestras que

incluyeron sueros, tejidos, fluidos orales y lavados bronquio alveolares, en los diferentes

grupos etáreos (madres, reproductores, reemplazos, lactantes, destetos, preceba y

ceba), durante un lapso de nueve meses. De igual manera se emplearon varios métodos

diagnósticos para determinar tanto la dinámica del virus, como las cepas circulantes, con

el fin de conocer el estado actual de la enfermedad en estas granjas y por ende en la

zona y así establecer medidas de control para la condición propia de cada una de ellas.

Los resultados obtenidos confirmaron lo reportado en otros países, donde se observó un

comportamiento diferente del PRRSV dentro de cada granja evaluada, dentro de una

zona o región, por lo tanto las medidas debieron ser aplicadas igualmente de forma

particular. Se priorizó el uso de adecuadas medidas de bioseguridad, un apropiado

manejo de los reemplazos y de los lechones, como la verificación del origen del semen

utilizado en la granja.

El conocimiento del estatus sanitario dentro de una granja, como dentro de un país, con

respecto a enfermedades como el PRRS, permite detectar los factores asociados con su

presentación, con el fin de aplicar las medidas adecuadas para el control, favoreciendo

así un aumento en la productividad y en la admisibilidad de los productos de origen

porcino en diversos mercados internacionales.

OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL

Estudiar el comportamiento del virus del PRRS y su evolución en tres granjas de tipo

intensivo de la zona del Valle del Cauca, con el fin de establecer el control para la

condición particular en cada una de ellas.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

Determinar la dinámica de anticuerpos frente al virus del PRRS en tres granjas de tipo

intensivo y ciclo completo durante un periodo de nueve meses.

Aislar las cepas circulantes en las granjas, en células permisibles a la replicación del

PRRSV, a partir de muestras de tejidos y lavados bronquio alveolares.

Detectar mediante técnicas de qRT-PCR, la presencia del ARN del virus del PRRS en

muestras de suero, tejidos, fluido oral y lavado bronco alveolar, de porcinos provenientes

de tres granjas intensivas del Departamento del Valle del Cauca.

Secuenciar y caracterizar los aislados obtenidos, mediante estudios filogenéticos con el

fin de confirmar su correspondencia con cepas ya reconocidas o establecer si éstas

corresponden a nuevas cepas circulantes en el país.

Establecer medidas de control de acuerdo con los resultados obtenidos.

1. Síndrome Reproductivo y Respiratorio Porcino El Síndrome Reproductivo y Respiratorio Porcino (PRRS) una enfermedad infecciosa que

afecta a la especie porcina, se caracteriza por ocasionar alteraciones respiratorias

especialmente en lechones y fallas reproductivas en hembras gestantes (Benfield et al.,

1999). El virus de PRRS (PRRSV) evolutivamente ha incrementado su virulencia,

causando una generalizada mortalidad en hembras al final de la gestación y en lechones

en crecimiento de todas las edades; es la enfermedad más importante de los porcinos

alrededor del mundo (Neumann et al., 2005; Zhou and Yang, 2010).

1.1 Historia

A finales de los años 80, en los Estados Unidos surgió una enfermedad no antes

reconocida en porcinos, ocasionando pérdidas reproductivas hacia el final de la

gestación, incremento del número de lechones nacidos débiles, neumonía en neonatos y

lechones, reducción en el crecimiento e incremento de la mortalidad (Hill, 1990; Keffaber,

1989; Loula, 1991). Un síndrome similar fue descrito inicialmente en Alemania en 1990

propagándose a otros países de Europa. Como el agente causal de la enfermedad era

desconocido, recibió en los Estados Unidos el nombre de la “enfermedad misteriosa del

cerdo” y en Europa “síndrome respiratorio y aborto epidémico porcino” o “enfermedad de

las orejas azules del cerdo” (Wensvoort et al., 1991). Una vez, el agente etiológico de la

enfermedad fue descubierto se le denominó como el síndrome respiratorio y reproductivo

porcino (SIRS) en Norteamérica y en Europa como el síndrome respiratorio y

reproductivo porcino (PRRS). La enfermedad actualmente se encuentra en muchos

países afectando la industria porcícola y la seguridad alimenticia alrededor del mundo

(Albina, 1997; Blaha, 2000)

1.2 Situación mundial

Actualmente, el PRRSV es considerado endémico y ha sido reportado en la mayoría de

zonas productoras de porcinos a nivel mundial (Zimmerman, 2003). De acuerdo con la

UN-FAO, únicamente Australia, Nueva Zelanda y Suiza han sido declaradas libres del

virus del PRRS (Dietze et al., 2011). Los brotes más recientes se reportaron en Suecia

(2008), Sudáfrica (2004 y 2007), Rusia, Vietnam y China (2006) (Osorio, 2010). En 2006,

una cepa altamente patógena de PRRS (HP-PRRS), también conocida como la

enfermedad de la fiebre alta del cerdo, fue inicialmente reportada en China y desde

entonces se ha diseminado rápidamente ocasionando mortalidades principalmente en

cerdos jóvenes. Esta cepa también ha sido reportada en Vietnam, Laos, Cambodia,

Myanmar, Filipinas y Rusia (Hu et al., 2009; Li et al., 2011; Tian et al., 2007; Zhou et al.,

2008).

La evolución del PRRSV se ha caracterizado por la aparición de cepas con una virulencia

incrementada, como lo ha demostrado la cepa 1-18-2, la cual surgió en 2007 afectando la

zona norte y centro de Estados Unidos (Li et al., 2009, 2011; Zhou et al., 2008)

En Suramérica, Argentina y Brasil son libres de la enfermedad. Chile en 2013 efectuó

una auto declaración oficial como país libre ante la OIE, sin embargo, en octubre del

mismo año, se detectó un brote de PRRS con una nueva cepa, que afectó a planteles

industriales y no industriales (traspatio) (http://www.sag.cl/ambitos-de-accion/sindrome-

reproductivo-y-respiratorio-porcino-prrs).

1.3 Situación en Colombia

En Colombia, la primera evidencia serológica del PRRSV fue encontrada en 1996

(Mogollón et al., 2003). En 1997 se confirmó ésta reactividad (6.5%) en 17

departamentos con alta producción porcina. Entre 1997 y 1999 se realizaron aislamientos

virales a partir de sueros y muestras de tejido pulmonar recolectados en predios con

historial clínico de PRRS y serología positiva. Este estudio permitió recuperar virus en

diferentes regiones del país y en diferentes sistemas de producción porcina. Paralelo a

los estudios citados, en el año 2000, se inició la evaluación molecular de los aislamientos

obtenidos y se concluyó que estos se encontraban dentro del genotipo americano (Tipo

II), sin embargo, no se descartó la presencia del genotipo Europeo en el país, teniendo

en cuenta que en este estudio solo se emplearon primers específicos para detectar

cepas americanas (Mogollón et al., 2003). Para el año 2006 se observó que la

prevalencia de la enfermedad en explotaciones extensivas se redujo al 4.3%, sin

embargo se encontró un mayor número de departamentos afectados con respecto a

hallazgos previos (Cruz et al., 2006).

1.4 Impacto económico

Se han realizado dos estudios estimando el impacto económico del PRRS en Estados

Unidos. De acuerdo con Neumann et al (2005), la pérdida anual debida a PRRSV se

estima que excede los 560 millones de dólares, donde el 11.9% corresponde a

gestación/maternidad; 35.9% a recría/destete y el 52.2% a engorde. En un segundo

estudio realizado por Holtkamp et al (2013), el total de costos anuales debidos a pérdida

de la productividad en la cría y crecimiento en cerdos, durante el periodo 2005 a 2010,

excedió en aproximadamente 104 millones de dólares a los 560 millones de costo anual

estimados en 2005. Adicional a estos costos, se encontró que el costo anual debido a

gastos veterinarios, que no fueron contemplados en el estudio de 2005, oscilaba en

477.79 millones de dólares anuales.

1.5 Agente etiológico

En 1991, Wensvoort et al en el Instituto Veterinario Central de Lelystad (Holanda)

aislaron en cultivos primarios de macrófagos alveolares porcinos (MAPs) un nuevo virus

al que se denominó virus Lelystad (LV). Posteriormente, en Estados Unidos se aisló un

virus estructural y patogénicamente relacionado con el LV, el cual recibió la

denominación de VR-2332, considerado como la cepa americana de referencia (Benfield

et al., 1992; Collins et al., 1992). Al comparar las secuencias del virus Lelystad,

posteriormente denominado Tipo I y el Norteamericano o Tipo II, se observó que

compartían propiedades similares a la de los virus del orden Nidovirales, familia

Arteriviridae y género Arterivirus, que incluyen a su vez, el Virus de la Arteritis Equina

(VAE), el Virus Elevador de la Lactato-Deshidrogenasa del Ratón (VLD) y el Virus de la

Fiebre Hemorrágica de los Simios (VFHS) (Benfield et al., 1992; Cavanagh, 1997, Dea et

al., 2000). Los virus de la familia Arteriviridae comparten algunas características como

tropismo por los macrófagos, una elevada variabilidad genética ocasionada por

mutaciones o recombinaciones y la capacidad de causar infecciones persistentes

(Cavanagh, 1997).

Se ha demostrado que la cepa Lelystad y la cepa VR-2332 difieren aproximadamente en

un 40% a nivel de la secuencia del genoma y son antigénicamente distintas (Nelson et

al., 1999). Los dos genotipos poseen solo el 70% de identidad a nivel de nucleótidos y las

cepas dentro de cada genotipo varían hasta en un 20% en sus secuencias (Key et al.,

2001; Meng, 2000). La proteína estructural más variable es la GP5 con una homología de

aminoácidos del 50 a 55% entre aislados Norteamericanos y Europeos (Mardassi et al.,

1996; Meng et al., 1995a).

El PRRSV es esférico, presenta una envoltura lipídica y posee un diámetro promedio de

62 nm (Figura 1.1). Su nucleocápside presenta simetría helicoidal y dentro de ella se

encuentra el genoma constituido por un ARN de cadena sencilla y polaridad positiva con

una longitud promedio de 15 kb. Este a su vez consta de nueve marcos de lectura abierta

(Open Reading Frame - ORFs) solapantes que se transcriben en la célula infectada como

ARNm subgenómicos (Snijder and Meulenberg, 1998).

La longitud completa del ARN (ARNm1) es usada para la traducción de dos ORFs:

ORF1a y ORF1b. La traducción del ORF1a produce la poli proteína pp1a, mientras que el

ORF1b es expresado por medio del desplazamiento del fragmento ribosomal (ribosomal

frame shift) llevando a la formación de la poli proteína pp1ab (Meulenberg et al., 1993).

Las poli proteínas pp1a y pp1ab son procesadas por proteasas virales liberando 14

proteínas no estructurales las que incluyen las proteasas (NSP1α, NSP1β, NSP2 y

NSP4), una RNA polimerasa dependiente de RNA (NSP9), una helicasa (NSP10) y una

endonucleasa (NSP11) (Snijder and Meulenberg., 1998).

Los ORFs 2 a 5, codifican para proteínas glicosiladas de la envoltura: la GP2 a GP5; el

ORF6 codifica para una proteína no glicosilada de membrana (M) y el ORF7 la proteína

de la nucleocápside (N) (Dea et al., 2000; Snijder and Meulenberg, 1998). El ORF2b está

incluido dentro de ORF2 y codifica una pequeña proteína no glicosilada E o 2b (Wu et al.,

2001).

Figura 1.1. Estructura del virus y del genoma de PRRS. En el extremo 5´del genoma

se localizan los ORFs que dan lugar a las proteínas no estructurales (NSPs) y hacia el

extremo 3´ aquellos que dan origen a las proteínas estructurales. En la superficie del

virus se observa la distribución de las proteínas estructurales incluida la nueva proteína

obtenida a partir del ORF5. Imagen que hace parte de la presentación del Doctor Iván

Díaz Luque, Investigador del CRESA. Symposium internacional de porcinocultura II.

SEPOR. 2012.

1.5.1 Proteínas no estructurales (NSPs)

En la terminación N de la poli proteína pp1a se encuentran las proteínas NSP1α y NSP1β

que contienen un dominio proteasa cisteína (Chen et al., 2010a). NSP1α contiene tres

dominios, un dominio dedo de zinc N-terminal, un dominio proteasa cisteína como

papaína (PCPα) con un ion zinc ligado al sitio activo, requerido para la actividad

proteolítica y una extensión C-terminal unida al sitio de unión del sustrato del dominio

PCPα (Sun et al., 2009). NSP1β tiene 4 dominios, un domino nucleasa dependiente de

metal N-terminal, un dominio enlazador, un dominio proteasa cisteína como papaína

(PCPβ) y una extensión C-terminal unida al sitio de unión del sustrato del dominio PCPβ

(Xue, et al., 2010). La inactivación de PCPα en NSP1α, bloquea la síntesis de ARNm

subgenómicos sin alterar la replicación, mientras que cuando la actividad de PCPβ es

eliminada de Nsp1β, no se observa síntesis de ARN viral (Kroese et al., 2008).

NSP2 es una proteína grande que varía en tamaño de 1168-1196 residuos entre

diferentes cepas de PRRSV, contiene además un cluster de epítopes lineales de células

B, que son indispensables para la replicación del virus (Oleksiewicz et al., 2001) y a su

vez modulan la respuesta inmune del huésped (Chen et al., 2010b). Esta es la proteína

no estructural más variable con solo 32% de identidad entre subtipos (Allende et al.,

1999). Contiene un dominio proteasa cisteína N terminal, seguido por una región

hipervariable rica en prolina, una región hidrofóbica que contiene cuatro hélices TM

(transmembrana) y un dominio C terminal conservado (Han et al., 2009). La deleción de

alguno de sus epítopes puede atenuar la replicación y la virulencia del PRRSV (Darwich

et al, 2011). NSP3 contiene cuatro hélices TM, que participan en la formación de los

complejos de replicación y en el anclaje de otras proteínas no estructurales en las

membranas de dicho complejo (Han et al., 2009). NSP4 es activada por la proteasa

NSP2 después del clivaje del complejo NSP2-NSP3. Posee una proteasa 3C (3CLP) que

consta de pliegues de quimo tripsina que pueden estar involucrados en la regulación del

procesamiento de la poli proteína viral (Van Aken, et al., 2006).

Los productos del clivaje de pp1a, como son NSP5, NSP6, NSP8 y NSP12 no han sido

totalmente descritos, desconociéndose su estructura y funciones (Doklan, 2010; Yun and

Lee, 2013).

NSP7 contiene un sitio de clivaje interno que da lugar a dos proteínas NSP7α y NSP7β,

cuyas funciones específicas aún se desconocen (Doklan, 2010; Yun and Lee, 2013).

NSP9 a NSP11 son las proteínas más conservadas dentro de los nidovirus, la NSP9

corresponde a la polimerasa viral dependiente de ARN (Gorbalenya et al., 2006).

NSP10 presenta tres dominios, un dominio de unión al zinc N terminal, un

dominio de unión y un dominio helicasa. El dominio de unión (S2429P) ha sido

implicado en la síntesis de ARNs subgenómicos (Van Dinten et al., 1997). NSP11

contiene el dominio endoribonucleasa (NendoU) específico para uridilato, el cual es el

mayor marcador genético único para nidovirus (Fang and Snijder, 2010; Gorbalenya et

al., 2006). Se ha demostrado que la inmunidad innata del huésped mediada por el

interferón (IFN) es modulada por un conjunto de NSPs (NSP1α, NSP1β, NSP2, NSP4 y

NSP11) del PRRSV (Beura et al., 2010).

1.5.2 Proteínas estructurales

Los ORFs 2a, 2b, 3 y 4 localizados en el extremo 3’ del genoma viral, codifican para las

proteínas asociadas al virión (estructurales) denominadas GP2a, 2b, GP3 y GP4.

(Meulenberg et al. 1995, 1997; Meulenberg y Besten, 1996; Wu et al., 2001, 2005).

La GP2 contiene una secuencia señal N-terminal entre los residuos 1-40, seguida por un

ectodominio de 168 residuos con una hélice TM (transmembrana) y un endodominio de

20 residuos. La GP2 presenta dos sitios de glicosilación conservados (Wissink et al.,

2004) y posee una masa molecular de 29-30 kDa. Una vez es sintetizada se localiza a

nivel perinuclear y citoplasmático en la célula hospedadora y se incorpora a la envoltura

del virión en forma de monómeros. Su función es participar en la replicación viral y se

considera un pobre inmunógeno ya que induce niveles bajos de anticuerpos

neutralizantes (Rogan et al., 2000).

La proteína E o 2b, es expresada a partir del ORF2b que se encuentra totalmente

incrustada dentro del ORF2a que codifica para la proteína GP2 (Wu et al., 2001). La

proteína E es de tipo estructural, no glicosilada y tiene una masa molecular de 10 kDa,

está conformada por 73 aminoácidos y es conservada entre aislados europeos y

americanos (Yoon, 2003); forma un canal iónico que incrustado en la membrana viral,

permite la adhesión del virión y la liberación del genoma en el citoplasma (Lee and Yoo,

2006).

GP3 corresponde a una glicoproteína menor de la envoltura con 27-29 kDa de masa

molecular (Mardassi et al., 1995; Murtaugh et al, 1995). Es la proteína del PRRSV más

altamente glicosilada, con seis puntos de glicosilación localizados en el ectodominio

putativo. La homología de secuencias codificantes para esta proteína entre los genotipos

Europeos y Americanos es del 58% y la más alta divergencia se presenta en la región C-

terminal, donde el genotipo Europeo tiene una extensión adicional de 11 aminoácidos; el

ectodominio es idéntico en un 70% entre los dos genotipos (Gonin et al., 1998; Meng et

al., 1995a). Esta ha sido una de las proteínas más controversiales respecto a su papel

como constituyente de la envoltura de la partícula viral, lo cual ha sido comprobado

debido a su habilidad para producir anticuerpos neutralizantes sola o junto a GP4 y GP5

(De Lima et al., 2009; Jiang et al., 2008). La propiedad de GP3 para producir

inmunogenicidad se explica por su habilidad para ser secretada desde las células

infectadas en forma de homodímero (Mardassi et al., 1995).

La proteína GP4 corresponde a una proteína estructural de la envoltura, con una masa

molecular de 19-20 kDa. Contiene un péptido señal clivado desde el residuo 1 a 21 y una

hélice TM del residuo 156 a 177. Presenta cuatro sitios potenciales de glicosilación que

son altamente conservados entre aislados europeos y americanos (Meulenberg et al.,

1997; Murtaugh et al., 1995; Zhang et al., 1998). Parece estar asociada al proceso de

replicación viral ya que su deleción en clones infecciosos de ADNc hace imposible

obtener una nueva progenie vírica (Welch et al., 2004; Wissink et al., 2005). Se ha

demostrado también que GP4 interactúa con otras glicoproteínas resultando en la

formación de complejos de multiproteínas. GP2, GP3 y GP4 son incorporados como

complejos multiméricos en la cubierta de ambos genotipos (Das et al., 2010).

El ORF 5 codifica la proteína GP5 que es la proteína mayoritaria de la envoltura, tiene un

tamaño de 24-25 kDa (Meulenberg et al., 2000) y posee una secuencia señal N-terminal,

seguida por un ectodominio glicosilado (Meulenberg et al., 1995). La GP5 presenta una

región hidrofóbica que incluye entre uno a tres hélices transmembrana (TM) (Dea et al.,

2000; Mardassi et al., 1996) y un largo endodominio C-terminal, lo cual es característico

de los nidovirus. El corto ectodominio de 30 aminoácidos presenta posiblemente los sitios

de N-glicosilación que varían en número dependiendo de la cepa; los aislados europeos

contienen dos N-glicanos mientras que los americanos tres (Mardassi et al., 1995;

Meulenberg, 2000). Los sitios conservados de glicosilación de la proteína GP5 como el

N46 en aislados Europeos y N44 en Americanos, parecen ser críticos en el proceso de

infección por PRRSV (Ansari et al., 2006; Wissink et al., 2004, citados por Van Breedman

et al., 2010).

GP5 está involucrada en la interacción inicial con la célula huésped posiblemente en la

fusión con las membranas celulares (Wissink et al., 2005). La más efectiva respuesta de

anticuerpos neutralizantes es dirigida contra ésta proteína lo que indica que puede ser el

determinante de inmunidad protectiva y puede estar involucrada en la unión a receptores

(Gonin et al., 1999; Ostrowski et al., 2002). De igual manera, es la proteína más variable

de PRRSV, con solo 51-55% de homología de secuencia entre el genotipo Europeo y

Americano (Meulenberg et al., 2000; Murtaugh et al., 1995). La hipervariabilidad en GP5

es probablemente la responsable de la ausencia de una reacción inmune cruzada entre

virus (Meng, 2000a). Esta proteína también forma heterodímeros con la proteína

codificada por ORF6, los que podrían estar relacionados con los procesos de ensamblaje

viral y su unión a la célula hospedadora (Delputte et al, 2002).

La proteína de membrana (M) no es glicosilada y tiene 18-19 kDa de masa molecular

(Mardasii et al., 1995; Meulenberg et al., 2000). Presenta un corto ectodomino N-terminal,

tres segmentos transmembrana (TM) y un endodominio C-terminal. Es la proteína

estructural más conservada de PRRSV (Meng et al., 1995b). La proteína M de los

aislados Americanos contiene 174 aminoácidos, mientras que en los aislados Europeos

constan de 173 aminoácidos (Meulenberg et al., 2000). Se ha demostrado que la

proteína M es altamente antigénica y produce una respuesta de anticuerpos a los 10 días

siguientes a la infección (Loemba et al 1996; Yoon et al., 1995, citado por Yoon, 2003).

En macrófagos alveolares pulmonares porcinos (MAPs) la adhesión inicial del virión es

mediada por interacción de la proteína M viral con el proteoglicano heparan sulfato

(Delputte et al., 2002). Forma heterodímeros con la proteína GP5 lo que podría estar

relacionado con la infectividad del virus, ya que este complejo se une a los macrófagos

por medio de uniones dependientes de ácido siálico a la sialodhesina (Van Breedman et

al., 2010).

El ORF7 codifica para la proteína N de la cápside del virus. Esta no es glicosilada y tiene

una masa molecular de 14-15 kDa. Corresponde al 20-40% del contenido proteíco del

virión, siendo la más abundante (Dea et al., 2000, citado por Yoon, 2003). La mayoría de

anticuerpos producidos en la infección son específicos para esta proteína ya que cuenta

con varios epítopes, algunos específicos para aislados europeos o norteamericanos,

mientras que otros son conservados en ambos grupos. Además, existe un antígeno

inmunodominante en la región central de esta proteína entre los aminoácidos 50-66 y 80-

90 (Meulenberg et al., 2000), siendo adecuada para el diagnóstico de la enfermedad. Se

ha sugerido que esta proteína juega un papel en la citopatogénesis del virus (Rowland et

al., 1999, citado por Yoon, 2003) y de igual manera se ha relacionado su presencia en el

núcleo y nucléolo de la célula con la capacidad replicativa del virus y con la ausencia de

inducción de anticuerpos neutralizantes (Pei et al., 2008). Cepas con mutaciones en la

señal de localización nuclear de la proteína N producen una viremia con bajos títulos

virales, de corta duración pero a su vez produce altos niveles de anticuerpos

neutralizantes y reducida persistencia viral en tonsilas (Lee and Yoo, 2006; Pei et al.,

2008).

Recientemente, Murtaugh et al (2011a), empleando espectrometría de masas

descubrieron un nuevo polipéptido de 51 aminoácidos, que es codificado por un

fragmento de lectura alternativo de mRNA5 subgenómico (sgmRNA5), que está presente

en el PRRSV y en otros arterivirus y se presume está relacionado con la replicación del

virus (Murtaugh et al., 2011b).

1.6 Patogénesis viral

El PRRSV es transmitido por vía horizontal mediante el contacto entre cerdos o por vía

vertical por medio de infección transplacental durante el último tercio de la gestación

(Christianson et al., 1992). La transmisión horizontal del PRRSV se produce

frecuentemente por contacto directo de animales susceptibles con animales infectados a

través de la vía oro-nasal, por heridas en la piel o de las superficies mucosas

(Zimmerman et al., 2006) y mediante el uso de semen contaminado o por medio de la

monta directa (Christopher-Hennings et al., 1996; Reiner et al., 2009). La transmisión

indirecta involucra el contagio a través de fómites como botas y overoles; el empleo de

equipo contaminado como agujas; por personal de la granja y visitantes; vehículos de

transporte contaminados; agua y alimentos; moscas, mosquitos y aerosoles (Cho & Dee,

2006; Dee et al., 2002; Desrosiers, 2011).

En la transmisión vertical, el PRRSV puede atravesar la placenta e infectar el feto hacia

los 90 días de la gestación, siendo el timo el sitio preferencial de replicación, reportes de

campo sugieren que luego de una falla reproductiva inducida por PRRSV, las hembras

desarrollan una inmunidad protectiva, esto se basa en que hembras afectadas tienen

camadas normales a pesar de la circulación del virus dentro de la granja (Stevenson et

al., 1993, citado por Karniychuk and Nauwynck, 2013). Las hembras seropositivas

pueden transmitir anticuerpos maternos a sus camadas vía calostro, sin embargo la

inmunidad pasiva declina y puede llevar a infección luego del destete cuando los

animales son mezclados (OIE, 2008; Rowland, 2010).

El PRRSV se replica principalmente en los macrófagos alveolares porcinos (MAPs),

también en células de la línea germinal monocítica, incluyendo macrófagos

intravasculares, subconjuntos de macrófagos en nódulos linfoides o bazo y macrófagos

intravasculares de la placenta y del cordón umbilical (Lawson et al., 1997).

El primer paso en la infección de los macrófagos, es una débil unión del virus vía heparan

sulfato, este último actúa como un factor de unión de baja afinidad que concentra las

partículas virales sobre la superficie celular (Delputte et al., 2002, 2005, 2007).

Posteriormente el complejo proteína M y GP5 se une al extremo N-terminal de la

sialodesina (CD169), esta interacción es dirigida por el dominio de unión al ácido siálico

en el extremo N-terminal de CD169 y el ácido siálico sobre la superficie del virión (Van

Breedam et al., 2010). Esta unión es seguida por un proceso de endocitosis mediada por

clatrina (Nauwynck et al., 1999). Otros factores del huésped, como la vimentina, una

proteína filamento intermediaria (intermediate-filament (IF) protein) (Kim et al., 2006) y

CD151 un miembro de la superfamilia tetraspanina (Shanmukhappa et al., 2007) han sido

identificados como receptores en células MARC-145, la línea celular susceptible a

PRRSV (Kreutz, 1998).

Una vez internalizadas las partículas virales, estas son transportadas a los endosomas

tempranos donde el genoma viral es liberado en el citoplasma en una reacción que

requiere acidificación endosomal y el receptor scavenger CD163 (Calvert et al., 2007;

Van Gorp et al., 2008; Welch and Calvert, 2010). El papel de CD163 es mediado a través

del dominio 5 rico en cisteína y por la interacción con GP2 y GP4 (Das et al., 2010).

Una vez el genoma entra al citoplasma, ORF1a y ORF1b son traducidos produciendo dos

largas poli proteínas pp1a y pp1ab, las cuales a su vez dan lugar a las NSPs, proceso

que es mediado por proteasa virales (NSP1α, NSP1β, NSP2 y NSP4) (Snijder et al.,

1996). El ensamble de las NSPs se produce bajo un complejo de replicación y

transcripción (RTC) el cual a su vez dirige la amplificación del genoma y la síntesis de

ARNm sub genómicos (Fang and Snijder, 2010). A través de seis de los ARNm sub

genómicos, son expresados los ORFs superpuestos y localizados en la región proximal

3´, los cuales a su vez codifican las proteínas estructurales (Doklan, 2010). En el último

estado de la replicación viral, múltiples copias de proteína N se unen al ARN genómico

sintetizado, formando la nucleocápside (Tijms et al., 2002) la cual surge en el lumen del

retículo endoplasmático y/o complejo de Golgi para luego adquirir las demás proteínas

estructurales (Wissink et al., 2005). Finalmente la progenie de viriones acumulados en los

compartimentos de la membrana intracelular, son liberados en el espacio extracelular

mediante exocitosis (Dea et al., 1995).

En adición, la exitosa infección por el PRRSV depende de la presencia de proteasas

localizadas en el endosoma como son la catepsina E y la serina proteasa (Misinzo et al.,

2008). El rol de las proteasas es escindir y liberar el péptido de fusión de las proteínas de

la envoltura a fin de iniciar la fusión de las membranas (Harrison, 2008).

Posterior a la exposición con el PRRSV, la replicación se presenta primariamente en los

macrófagos alveolares, a partir de los cuales se disemina rápidamente siendo los

pulmones y nódulos linfáticos los sitios con la más alta carga viral. La viremia

generalmente dura cuatro semanas con un pico en el título de virus entre el día 7 y 14

pos infección (PI), este pico usualmente corresponde a la fase clínica de la enfermedad.

Posterior a la fase de viremia el virus persiste en varios tejidos de origen linfoide como

tonsilas y nódulos linfáticos hasta los 157 días PI (Allende eta al., 2000). El ARN viral ha

sido detectado hasta los 250 días PI (Wills et al., 2003). Horter et al (2002) detectaron

virus infeccioso de PRRS en el 84% de animales entre los 63 y 105 días post inoculación.

Rowland et al. (2003) aislaron el PRRSV de la tonsila y nódulos linfoides de cerdos

infectados in útero a los 132 días pos nacimiento. En muchos casos la infección es

eliminada entre los 3 a 4 meses (Molina et al., 2008)

1.7 Respuesta inmune

De forma general, la exposición al PRRSV involucra un largo periodo de viremia

aproximadamente de un mes, seguido por una fase de persistencia de al menos 3 a 4

meses o más. Los cerdos infectados se recuperan de la infección hacia el final de esta

fase de persistencia, lo cual indica un retraso en el desarrollo de una respuesta inmune

adaptativa. Presentan a su vez, una respuesta inmune protectiva contra la re-exposición

a la misma cepa viral (Murtaugh et al., 2002).

1.7.1 Respuesta inmune innata

La respuesta inmune al PRRSV, comienza con una respuesta antiviral innata en el

citoplasma de un macrófago infectado, donde la presencia de una doble cadena de ARN

(ARNds) induce una cascada de eventos intracelulares que inician con la producción de

interferón tipo I (α y β) (Murtaugh et al., 2003). El PRRSV modifica la respuesta inmune

innata del huésped al afectar la inducción de interferón tipo I, por medio de varios

mecanismos: reduce la expresión de TLR3 (Toll-like-receptor) el cual normalmente

produce la activación del factor 3 regulador de interferón (IRF3), de IRF7 y NF-Kb

(Nuclear factor kB) (factor nuclear potenciador de las cadenas ligeras kappa de las

células B activadas) (Wang and Zhang, 2014). Afecta por lo tanto la producción de

citoquinas proinflamatorias y quimioquinas como la IL-6, IL8, el factor de necrosis tumoral

α (TNF- α), RANTES (regulated on activation, normal T cell expressed and secreted) y el

interferón tipo I (IFN α/β) (Yoo et al., 2010).

El PRRSV inhibe la síntesis de interferón tipo I por medio de las proteínas NSP1, NSP2,

NSP11 y N (Kim et al., 2010; Shi et al., 2011). NSP1 se cliva en las subunidades NSP1α

y NSP1β que se van a ubicar en el núcleo de la célula inhibiendo la expresión de IFN-β,

interfiere con la fosforilación y translocación nuclear de IRF3, de igual manera inhibe la

asociación de IRF3 con la proteína de unión (CBP) a CREB (cAMP response element-

binding) y aumenta la degradación de CBP (Chand et al., 2012; Wang and Zhang, 2014).

De igual forma, la proteína NSP2, bloquea la fosforilación y translocación nuclear de IRF3

(Sun et al., 2012b).

NSP11 es una endonucleasa y antagonista del IFN. Esta proteína suprime la activación

del promotor de IFN-β y la expresión de IRF3-mediated genes, de igual manera inhibe la

fosforilación y translocación nuclear de IFR3 (Nedialkova et al 2009; Wang and Zhang,

2014). La proteína N por su parte interfiere con la fosforilación inducida por ARNds y con

la translocación de IRF3 (Wang and Zhang, 2014).

De otro lado, PRRSV inhibe la señalización de NF-kB, inhibiendo la fosforilación de IkBα

(nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells inhibitor, alpha)

llevando al bloqueo de la translocación nuclear de NF-kB (Lee et al., 2005; Song et al.,

2010; Sun et al., 2012a). Inhibe la señalización JAK-STAT y la expresión de ISG

(interferon stimulated gene), por medio de las proteínas no estructurales NSPA1β, NSP7,

NSP12, GP3 y N. Estas proteínas bloquean la translocación nuclear de STAT 1 que

activa el IFN e inhiben la función antiviral de ISG15 (Patel et al., 2010; Wang et al., 2013).

PRRSV interfiere activamente con la inducción de apoptosis lo cual puede ser debido a

su habilidad para inhibir la producción de IFN tipo I especialmente en los estados

tempranos de infección (Sun et al., 2012a). El IPS-1 (IFN-b promoter stimulator-1) induce

la vía de señalización RIG-1(retinoid-inducible gene 1), lo cual lleva a la expresión de IFN

tipo I y a su vez a la apoptosis. La proteína no estructural NSP11 tiene la capacidad de

degradar al ARNm IPS-1 resultando en la supresión de IFN tipo I y por lo tanto inhibiendo

el mecanismo de apoptosis (Sun et al., 2012a). El PRRSV estimula vías antiapoptóticas

en macrófagos al comienzo de la infección pero por otro lado macrófagos infectados

pueden morir por apoptosis al final de la misma (Costers et al., 2008), interfiriendo con la

presentación de antígenos (Loving et al., 2007; Wang et al., 2007), ya que su replicación

en células dendríticas (DC) derivadas de monocitos (Mo-DC), lleva a la muerte de la

célula vía apoptosis y necrosis, lo cual lleva a su vez a una reducida expresión del

complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) clase I y clase II y de CD14 y CD11b/c

(Mendoza et al., 2009; Wang et al., 2007).

Con respecto a la inmunidad innata de tipo celular, esta se caracteriza por ser débil, la

respuesta de IFNα, la producción de citoquinas inflamatorias y la activación de células

natural killer (NK) es mínima. A su vez la reducida activación de las NK, reduce la

producción de IFNγ, del factor de necrosis tumoral (TNF) y la actividad citotóxica antiviral

(Murtaugh et a., 2003).

1.7.2 Inmunidad adaptativa

Los anticuerpos anti-PRRS pueden ser detectados en la primera semana PI (Mulupuri et

al., 2008) mientras que los anticuerpos neutralizantes no se detectan antes de 4

semanas PI. Los títulos máximos se alcanzan entre la 10 a 18 semana PI (Yoo et al.,

2010).

Las primeras inmunoglobulinas en aparecer son tipo M detectables desde el día 5-7 con

un pico el día 14 y declinando hasta el día 42 PI (Park et al., 1995). Los niveles de la IgG

presentan un pico entre el día 21 a 35 PI, persistiendo posteriormente en bajas

concentraciones (Mulpuri et al., 2008). Algunos reportes indican que la viremia y la

replicación viral pueden persistir incluso en presencia de anticuerpos neutralizantes

(López et al., 2007), igualmente, la viremia puede ser resuelta aun antes de que los

anticuerpos neutralizantes sean detectados (Mateu and Díaz., 2008; Vezina et al., 1996).

Los anticuerpos específicos son dirigidos específicamente contra las proteínas N y M del

virus, estos aparecen hacia el día 7 PI., seguidos por anticuerpos contra la proteína

GP5. De igual manera, se presenta una respuesta temprana de animales infectados

frente a epitopes de la proteína nsp2 probable proteína inmunodominante del PRRSV

(De Lima et al., 2006; Loemba et al., 1996; Nelson et al., 1994). Muchas pruebas

diagnósticas detectan anticuerpos solamente contra la proteína N. Estos aparecen en la

primera semana PI y permanecen por varios meses (Mateu et al., 2008).

El desarrollo temprano de anticuerpos no neutralizantes tiene un efecto significante en el

desarrollo de la enfermedad. Se ha observado que este tipo de anticuerpos favorecen la

replicación viral en los MAPs a través de un mecanismo denominado “incremento

dependiente de anticuerpos” (antibody-dependent enhancement - ADE) (Yoon et al.,

1996, 1997) donde los anticuerpos no neutralizantes aumentan la replicación viral en los

MAPs. Los blancos de esos anticuerpos no neutralizantes son las proteínas GP5 y N

(Cancel-Tirado et al., 2004; Yoon et al., 1996). De igual manera, este tipo de respuesta

humoral puede actuar como un mecanismo de evasión del sistema inmune mediante la

estrategia del caballo de Troya, ya que los virus son opsonizados e internalizados en los

macrófagos vía endocitosis y las partículas virales son liberadas antes de sufrir el

proceso de degradación a nivel del fagolisosoma, continuando su ciclo replicativo (Mateu

and Díaz, 2008).

Los anticuerpos neutralizantes, son detectados hacia el día 28 PI y están dirigidos

principalmente contra la proteína GP5 la cual posee el epítope mayor de neutralización o

epítope B (Gonin et al., 1999; Nelson et al., 1994; Plagemann et al., 2002). El papel que

juegan los anticuerpos neutralizantes en el control de la infección por PRRSV, ha sido

materia de debate debido a la presencia de viremia en el huésped junto con una actividad

neutralizante. Se han postulado diversas hipótesis para explicar el retraso en el

desarrollo de anticuerpos neutralizantes, dentro de estas se encuentran: la variación en

la expresión de moléculas relacionadas con la presentación de antígeno, lo cual conlleva

a una demora en la movilización de células del sistema inmune resultando en una baja

respuesta de anticuerpos neutralizantes (Chang et al., 2008; Flores-Mendoza et al.,

2008). Una de las hipótesis más aceptadas es la presencia de un “epítope trampa”

(Ostrowski et al., 2002), el cual se localiza cerca al epitope neutralizante de GP5

produciendo una respuesta inmune no protectiva. De otro lado se encuentra el número

de glicosilaciones las cuales actúan como un blindaje ocultando al epítope B, evadiendo

así una respuesta inmune neutralizante; la pérdida de glicosilaciones en el ectodominio

de GP5 puede aumentar la inmunogenicidad y la susceptibilidad a la neutralización

(Jiang et al., 2007).

La respuesta proliferativa de células T se caracteriza principalmente por la expresión de

IFN-γ e IL-2 (López Fuertes et al., 1999). Las células que secretan IFN-γ son

principalmente CD4+ CD8+ y células T citotóxicas CD4-/CD8αβ (Meier et al., 2003).

1.7.3 Persistencia

El mecanismo de persistencia depende de una combinación de factores como son la

presencia de una gruesa superficie glicosilada en la estructura del virión, la redirección

de la respuesta humoral hacia proteínas no superficiales, el drift genético y antigénico y

la subversión del gen que induce interferón (Chand et al., 2012).

El mecanismo por el cual se presenta una débil respuesta contra la proteína GP5 está

vinculado a la presencia de varios sitos de N-glicosilación. El ectodominio de la proteína

posee dos sitos conservados de N-glicosilación, localizados en la posición N44 y N51 en

los virus tipo 2 y en N46 y N53 en los virus tipo I (Plagemann et al., 2002; Wissink et al.,

2004). Adicionalmente, el dominio rico en serina-asparagina entre los aminoácidos 30 y

38 posee una pequeña región que contiene un número variable de potenciales sitios de

N-glicosilación. La infección de cerdos con el PRRSV que presentaban ausencia de N34

y/o N51 resultó en un incremento en la producción de anticuerpos neutralizantes. El

mecanismo básico del blindaje glicano en la resistencia a los anticuerpos se debe a la

protección del conservado epítope B localizado entre los residuos 37-45 (Ostrowski et

al., 2002).

La diversidad genética del PRRSV involucra un drift genético por medio de puntos de

mutación y un shift genético por medio de recombinaciones. La tasa de sustitución de

nucleótidos para PRRSV se encuentra en un rango de 4.7 a 9.8 x 10-2/sitio/año, que es la

más alta encontrada para cualquier virus ARN (Hanada et al., 2005; Jenkins et al., 2002).

Las más altas variaciones en las secuencias de péptidos se encuentran en el

ectodominio de la GP5, flanqueando dos sitios conservados de N-glicosilación. La

hipervariabilidad de GP5 está vinculada a la presencia de un epítope trampa localizado

entre amino ácidos 27 y 30. Otra región que presenta variación en la secuencia peptídica

cercana a un epítope neutralizante se encuentra en la proteína GP4 (Chand et al., 2012).

Mutaciones en NSP1 y NSP2 pueden contribuir a la persistencia, alterando el nivel

general de replicación viral dentro de la célula (Chand et al., 2012).

1.8 Diagnóstico

Con el fin de conocer la actividad del PRRSV en granja, el estatus sanitario por animal y

lograr el control de la enfermedad, se han implementado varios tipos de técnicas

diagnosticas. Inicialmente, las pruebas de rutina se limitaban al aislamiento viral y a las

técnicas serológicas como seroneutralizacion viral (VSN) y la fluorescencia indirecta de

anticuerpos (IFA), pero en los últimos años los avances tecnológicos han permitido

mejorar la detección del virus, estos incluyen el enzimoinmunoanálisis (ELISA), la

reacción en cadena de la polimerasa (PCR), el polimorfismo de longitud de fragmentos

de restricción (RFLP) y el análisis de secuencias nucleotídicas y de aminoácidos

(Christopher-Henings et al., 2002).

Cuando la historia clínica y los hallazgos patológicos sugieren una infección por PRRSV

se requiere la detección del antígeno, del genoma viral o el aislamiento del mismo, a

partir de las muestras de los animales infectados, apoyado a su vez por los niveles de

anticuerpos en el momento del episodio clínico (Yoon et al., 2003)

1.8.1 Identificación de los signos clínicos

La enfermedad se caracteriza inicialmente por un episodio agudo con letargia, apetito

reducido y propagación rápida en la piara entre 7 a 10 días. Los signos clínicos

reproductivos incluyen infertilidad, agalactia, reducción en la tasa de partos, marcado

incremento de abortos en el último tercio de la gestación, lechones nacidos muertos,

momificaciones o lechones nacidos vivos débiles; signos respiratorios también pueden

estar presentes y las cerdas pueden transmitir vía transplacentaria el PRRSV a los

lechones. En lechones que superan la preñez y las fases neonatales, el PRRS se

manifiesta como una enfermedad respiratoria y se acompaña de infecciones secundarias,

con Pasteurella multocida, Circovirus tipo 2 (PCV2), Mycoplasma hyopneumoniae,

Streptococcus suis, Salmonella cholerasuis, Haemophilus parasuis y virus de la influenza

porcina. En lechones pos-destete y cerdos en crecimiento, los signos clínicos incluyen

disnea, anorexia, letargia, hiperemia cutánea y disminución en la ganancia de peso. Las

infecciones secundarias son comunes. Los cerdos adultos presentan un menor impacto a

nivel del sistema respiratorio. La infección subclínica ocurre a menudo en cerdas de

descarte, en la ceba, reproductores, cerdas jóvenes y cerdas adultas; en algunas granjas

la infección es asintomática. En machos infectados, el PRRSV puede aparecer en el

semen, afectando la morfología y función de los espermatozoides (Dietze et al., 2011;

OIE 2008).

1.8.2 Lesiones microscópicas

1.8.2.1 Histopatología

Aunque el PRRSV produce infección multisistémica, las lesiones más características son

usualmente observadas en piel, tejido respiratorio y tejido linfoide, dependiendo de la

cepa viral involucrada, factores iatrogénicos y la presencia de infecciones secundarias

(Dietze et al., 2011). La neumonía intersticial multifocal es la lesión histológica más

característica de infección por el PRRSV. Las lesiones pulmonares se caracterizan por

tres cambios: aumento de grosor de la pared alveolar, hipertrofia e hiperplasia de

neumocitos tipo II con acumulación de material necrótico y células inflamatorias en los

espacios alveolares (Collins et al., 1996; Dietze et al., 2011). Los ganglios linfáticos se

muestran hemorrágicos, con hiperplasia folicular, focos de necrosis folicular y residuos en

los folículos (OIE, 2008, Dietze et al., 2011).

La condición corporal de fetos abortados en el último tercio de gestación varía de frescos

a autolizados, la hemorragia umbilical se reporta como una lesión característica de

infección por PRRS (Dietze et al., 2011).

1.8.3 Detección del virus

La identificación del PRRSV puede obtenerse mediante el aislamiento del virus, la

detección del genoma viral y la detección de proteínas víricas (OIE 2012). Tras la

infección, los cerdos desarrollan una viremia e infección pulmonar que pueden persistir

durante semanas en los animales más jóvenes y días en los adultos, lo cual hace que las

muestras de suero y los lavados pulmonares bronco alveolares sean ideales para

detectar este agente (OIE, 2012).

1.8.3.1 Aislamiento viral

Esta es una prueba confirmatoria en casos sospechosos de PRRS, permitiendo detectar

el virus en muestras de tejidos y sueros. El virus se replica tanto en MAPs que

constituyen el sistema de cultivo más susceptible para los virus de ambos tipos

antigénicos, como en las células MARC-145, un clon de la línea celular MA-104 (ICA,

2014; OIE 2012).

En casos agudos, las muestras de elección son el fluido broquioalveolar, pulmón y suero.

En animales persistentemente infectados, la tonsila, secreción orofaringea y fluido

bronquioalveolar. En caso de aborto, las muestras deben colectarse de las momias,

cerdos abortados y nacimientos débiles (ICA, 2014).

Los cambios típicos (efecto citopático) que presentan las células MARC-145 debido a la

infección con PRRSV, son redondeamiento celular, agrupamiento y lisis, estos cambios

ocurren entre los 2 a 5 días PI. La positividad de la prueba se determina al observar el

efecto citopático del virus en las células. (ICA, 2014).

1.8.3.2 Reacción en cadena de la polimerasa - PCR

Permite la amplificación de diferentes regiones del genoma del PRRSV (ORF5, ORF6 y/o

ORF7) a partir de diferentes tipos de muestras que incluyen tejidos, suero, semen, lavado

bronquio alveolar, fluidos orales e hisopos oro faríngeos (Christopher-Henings., et al.,

2002).

La detección del ácido nucleico del PRRSV puede llevarse a cabo por medio de la

reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR), la RT-PCR

anidada y la RT-PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) (Drew, 1995; Kleiboeker et

al., 2005; Larochelle & Magar, 1997; Mardassi et al., 1994; Wasilk et al., 2004, citados

por OIE 2012). Estas pruebas se usan frecuentemente para detectar el ácido nucleico

viral en tejidos, suero o semen (Christopher-Hennings et al., 1997 citado por Manual OIE

2012). Igualmente, se ha diseñado una técnica de PCR múltiple para diferenciar las

cepas tipo I de las de tipo II (Gilbert et al., 1997 citado por OIE 2012).

La qRT-PCR se caracteriza por completar la amplificación y el análisis en un sistema

cerrado lo cual disminuye la contaminación, igualmente permite medir cuantitativamente

el ARN, utiliza menos tiempo y cuenta con alta sensibilidad (Chung et al., 2005; Tian et

al., 2010; Wasilk et al., 2004). La qRT-PCR basado en SYBR Green utiliza un fluoróforo

que se une al ADN bicatenario que se va generando, sin tener en cuenta el origen de la

secuencia de ADN (Martínez et al., 2008).

1.8.4 Secuenciación

La secuenciación del PRRSV comenzó en los años 90, esta técnica permite obtener la

secuencia exacta de una serie de nucleótidos del ORF bajo análisis (Christopher-Henings

et al., 2002). Kapur et al (1996) demostraron la utilidad del análisis de secuencias en

diferenciar aislados del PRRSV. A partir de sus hallazgos se determinó que el gen ORF5

es el gen mas variable y ORF6 el más conservado, esta es la razón por la cual el ORF5

es el gen blanco dentro de esta técnica.

La información de las secuencias de los aislados de PRRS permite diferenciar cepas de

campo de cepas vacunales y monitorear cepas dentro de un sistema de producción ya

que permite determinar la introducción de una variante diferente a las que se encuentran

circulando en granja (Yoon et al.,2003; Murtaug, 2012).

1.8.5 Pruebas serológicas

La serología se lleva a cabo generalmente mediante técnicas como el IPMA, la

inmunofluorescencia, o el enzimoinmunoanálisis- ELISA, sobre el cual se han descrito

varias modificaciones (Albina et al. 1992; Cho et al., 1997; Denac et al., 1997, citados por

OIE 2012).

1.8.5.1 ELISA

La ELISA comercial para detección de anticuerpos contra el virus de PRRS ELISA

(HerdChek: IDEXX Laboratories Inc.Westbrook. Maine) usa un formato indirecto para

detectar anticuerpos en suero contra ciertos antígenos del virus de PRRS. De acuerdo

con las instrucciones del fabricante una muestra se considera positiva cuando el cociente

M/P (muestra/positivo) es igual o superior a 0.40 lo cual indicaría presencia de

anticuerpos (Christopher-Henings et al., 2002). Esta técnica presenta alta sensibilidad y

especificidad, los valores de sensibilidad y especificidad corresponden al 98.8% y 99.9%

respectivamente (HerdChek PRRS (package insert) Westbrook, Maine. IDEXX

Laboratories, 2011).

Los anticuerpos detectados por la técnica de ELISA aparecen entre los 9 a 13 días PI,

alcanzando un máximo entre los 30 a 50 días para luego descender. Se estima que los

anticuerpos pueden ser aún detectados por esta técnica hasta los 4 a 10 meses post

infección (Collins et al., 1996).

En la actualidad existen varios enzimoinmunoanálisis (ELISA) comerciales: ELISA

indirecta, ELISA de bloqueo y ELISA doble, que permiten distinguir entre las reacciones

serológicas a los virus europeo y americano (OIE, 2012).

1.8.5.2 Inmunofluorescencia indirecta - IFA

Esta técnica altamente específica (99.5%) detecta anticuerpos a partir de los 7 a 15 días

hasta los 2 a 3 meses PI. (Yoon et al., 1995) y de igual manera permite determinar el

título del suero. La IFA se utiliza como prueba confirmatoria de muestras que hayan sido

positivas por ELISA (ICA, 2014) en microplacas de 96 pozos utilizando la línea celular

MARC-145, donde las células infectadas con el virus de PRRS se fijan y son usadas

como sustrato celular. Se consideran positivos animales con títulos ≥1:16 y negativos

con títulos ≤ 1:16 (ICA, 2014; OIE, 2012).

1.8.5.3 Seroneutralización

Se basa en la detección de anticuerpos neutralizantes en el suero de animales

sospechosos utilizando cultivos celulares y un título conocido de virus, el cual es

incubado con varias diluciones de las muestras de suero. Después de la incubación, el

suero es adicionado sobre una línea celular sensible para determinar el titulo de

anticuerpos que es capaz de neutralizar el PRRSV. Su sensibilidad es menor que la de

IFA o ELISA debido a que los anticuerpos neutralizantes contra el PRRSV se desarrollan

lentamente posterior a la infección (> 21 días) (Christopher-Henings et al., 2002; OIE,

2012).

1.9 Control del PRRS

El control y prevención del virus se debe basar en (i) minimizar la circulación del PRRSV

dentro de una granja, (ii) limitar los efectos de la circulación viral y co-infecciones

bacterianas secundarias y (iii) maximizar y estabilizar la inmunidad de la piara (Dee,

2003). De igual manera se busca evitar la introducción del virus a una granja negativa o

limitar la introducción de nuevas cepas en granjas ya infectadas, por lo tanto la

bioseguridad debe ser revisada interna y externamente (OIE, 2008).

Las rutas directas de transmisión dentro y entre poblaciones incluyen animales infectados

y semen contaminado, por esta razón todos los machos y hembras primerizas deben

provenir de granjas negativas a PRRSV y ser aislados en cuarentena por lo menos 30

días durante los cuales se practican pruebas serológicas antes de ser introducidos en la

granja, a su vez el semen debe proceder de machos negativos a PRRSV (Papatsiros,

2012).

La introducción de hembras de reemplazo consta de tres periodos: el periodo de

aislamiento, la aclimatación y la recuperación (Pesente et al., 2006; Vashisht et al.,

2008). La duración de cada periodo puede variar entre 30 a 60 días dependiendo de la

edad de la hembra de reemplazo, el estatus dentro como entre granjas, el tipo y tamaño

de la granja. El periodo de aislamiento incluye la realización de pruebas serológicas con

el fin de determinar el estatus de infección por PRRSV de los animales entrantes. La

aclimatación comienza 30 días después de la introducción de las hembras de reemplazo,

con el fin de exponerlas a la cepa circulante en la granja y para tal fin se han reportado

varios métodos que incluyen, la exposición a tejidos de lechones nacidos débiles y de

mortinatos, uso de vacunas, exposición por contacto entre las cerdas jóvenes y cerdos

de destete, que se utilizan como fuentes de virus y la inoculación de los animales de

reemplazo negativos con el suero de cerdos virémicos de la misma granja (Dee, 2003;

Vashisht et al., 2008). Esta última práctica se ha incrementado debido al aumento de la

heterogeneidad genética entre cepas de PPRSV y a que las vacunas no inducen

suficiente protección contra las nuevas cepas identificadas (Fano et al., 2005). De otro

lado la inoculación de una cepa homóloga provee una alto nivel de protección frente a la

exposición con la misma cepa viral (Batista et al., 2002). El desarrollo de un período de

aclimatación de reemplazos lleva a la estabilización de los signos clínicos, a la

producción de lechones negativos a PRRSV al destete, a la prevención de brotes

asociados con cepas endémicas, al desarrollo de una inmunidad específica a las cepas

homólogas de la granja y a la mejora de los parámetros de producción (Pesente et al.,

2006; Vashisht et al., 2008).

Otra estrategia de control es la denominada piara cerrada, que es utilizada para eliminar

la circulación viral reduciendo la diseminación viral y los portadores, en este caso se

finaliza la introducción de reemplazos a la granja durante 4 a 8 meses, esto dependerá

del estatus sanitario de la misma y el flujo de animales. Este sistema puede ocasionar

efectos como una inadecuada distribución de los partos, sin embargo esto se puede

minimizar aplicando proyectos de cría de cerdas jóvenes de reemplazo en instalaciones

apartadas (Torremorel and Christianson, 2002; Cho y Dee, 2006; Zimmerman et al.,

2006).

De otro lado el flujo todo dentro y todo fuera (TD/TF), es efectivo para controlar una

variedad de patógenos respiratorios en cerdos destetos. Consiste en dividir las

instalaciones en áreas individuales lo que permite una limpieza profunda y desinfección

de las instalaciones entre cada grupo de cerdos. Este método reduce la propagación

horizontal del PRRSV desde los cerdos más adultos a aquellos recientemente ingresados

al área (Dee, 2003).

Las medidas McREBEL (Management Changes to Reduce Exposure to Bacteria to

Eliminate Losses) propuestas por McCaw en 1995, constan de una serie de pasos para

reducir la diseminación del PRRSV entre lechones, estos incluyen:

1. Evitar el intercambio de lechones entre camadas

2. Realizar atetes o adopciones sólo en las primeras 24 horas de vida

3. Solo mover los lechones o las cerdas entre las mismas salas.

4. Evitar el uso de nodrizas para salvar a los lechones enfermos o retrasados.

5. Evitar el manejo innecesario de medicamentos en los lechones

6. Evitar el movimiento de los animales retrasados a otras habitaciones con animales

más jóvenes o nodrizas.

7. Aplicar el sistema de todo dentro-todo fuera (TD/TF) en los precebos, dejando 2 o 3

días de vacío sanitario entre lotes.

8. Hacer adopciones de lechones sólo cuando sea absolutamente necesario y en los

casos en que exista la seguridad de que han recibido suficiente calostro.

9. Sacrificar a los lechones enfermos o que tengan un peso significativamente inferior al

normal en el destete.

10. No practicar el "feed-back" (retroalimentación con heces).

11. Las cerdas deben ser lavadas antes de entrar en la sala de partos.

12. El personal debe lavarse las manos o llevar guantes desechables después de

manipular cada camada.

13. Las agujas hipodérmicas y las hojas de los bisturís deben cambiarse después de

cada camada.

14. En camadas grandes, se puede hacer una supervisión de las lactancias, separando

lechones para asegurarse de que todos los lechones reciben calostro de su madre.

Estas medidas facilitan y optimizan el crecimiento de los lechones lactantes, reducen la

mortalidad antes del destete y favorecen la ganancia de peso al destete (McCaw, 2003).

La despoblación parcial por su parte, se basa en el principio que la circulación del

PRRSV se presenta en un grupo específico de producción. Permite interrumpir la

transmisión horizontal y es una buena medida para controlar la enfermedad pos destete o

eliminar el virus desde la población destetada (Dee, 2003).

Los programas regionales de control y eliminación han ganado popularidad a nivel

mundial. En Suecia y Loire en Francia la eliminación de la enfermedad fue posible

minimizando el movimiento de los animales, de vehículos y practicando la despoblación-

repoblación de las piaras infectadas (Le Potier et al., 1997, Carlsson et al., 2009). En

Ontario (Canadá), se han presentado varias iniciativas de control regional (Waddell,

2010). En México-Sonora se realizó un control regional del PRRS que incluía la

participación activa y capacitación constante de los técnicos (Batista et al., 2010). A nivel

de América latina, se han presentado tentativas de control y eliminación regional pero los

resultados aún son preliminares (Corzo et al., 2010).

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Evaluación de la dinámica de anticuerpos

frente al virus del Síndrome Reproductivo y

Respiratorio Porcino (PRRSV) en tres granjas

del departamento del Valle del Cauca

Resumen

El Síndrome Reproductivo y Respiratorio Porcino (PRRS), es una enfermedad endémica

en Colombia. A partir del año 1997 se comenzaron a realizar estudios serológicos para

determinar la actividad del virus en los sistemas de producción y los diferentes grupos

etáreos. Estos estudios demostraron la presencia de actividad del PRRSV en el país,

especialmente en sistemas intensivos. El presente estudio fue realizado entre 2012 y

2013, en una zona de producción intensiva como el Valle del Cauca, utilizando diferentes

granjas en cuanto a manejo y medidas de bioseguridad, diferentes grupos etáreos y

muestreos durante el tiempo, utilizando como prueba serológica la técnica de ELISA de

IDEXX, PRRS x 3. Los resultados obtenidos confirmaron las diferencias en cuanto a

actividad viral dentro de cada granja, identificando el grupo de la ceba como el de mayor

seropositividad. De igual manera, se evidencio la necesidad de utilizar conjuntamente

con las técnicas serológicas, técnicas moleculares para determinar la dinámica de la

infección y por ende tomar las medidas adecuadas de control.

Palabras clave: Diagnóstico, ELISA, PRRS, Serología

Abstract

Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS), is an endemic disease in

Colombia. Since 1997 serological studies began to determine virus activity in the

production systems and on the different groups of age. These studies showed the

presence and different activity levels of PRRSV on the country, especially in production

intensive systems. The present study was carried out between 2012 and 2013, on the

Valle del Cauca province, one of the most important pig production region in Colombia.

Three farms were selected based on different practices of management and measures of

biosafety. It was colleted serum samples during nine months and on differents groups of

age. An antibodies detecting ELISA kit (IDEXX, PRRS ELISA test x 3) was employed to

evaluate humoral immune response. Results confirmed differences in terms of viral

activity within each farm, identifying the fattening group as this that presented higher

seropositivity.

As in Colombia there is not vaccination against PRRS, any serological response is proof

of viral activity; in this study all farms had PRRSV antibodies response confirming viral

presence and disease manifestation. We recommended to employ both serological and

molecular techniques to determine infection dynamics and thus to take appropriates

control measures.

Key words: Diagnostic, ELISA, PRRS, Serology.

Introducción

El Síndrome Reproductivo y Respiratorio Porcino (PRRS) es una enfermedad infecciosa

que ocasiona importantes pérdidas económicas a la industria porcina alrededor del

mundo (Holtkamp et al., 2013). Se caracteriza, por ocasionar abortos en el último tercio

de la gestación y producir neumonía intersticial en lechones (Collins et al., 1992;

Wensvoort et al., 1991). El virus de PRRS (PRRSV) se divide en dos genotipos, Europeo

o Tipo I y Americano o Tipo II, representados por las cepas Lelystad (LV) y VR-2332,

respectivamente (Allende et al., 1999; Nelsen et al., 1999).

El PRRSV es un Arterivirus, que posee un genoma ARN de cadena sencilla y polaridad

positiva de 15 kb de longitud, presenta 10 marcos de lectura abierta (ORFs). Los ORF1a

y ORF1b abarcan el 80% del genoma y codifican para enzimas involucradas en la

replicación viral; los polipéptidos de estos ORFs dan origen a 14 proteínas no

estructurales (NSPs) que incluyen NSP1α, NSP1β, NSP2, NSP2TF y NSP3 a NSP12.

Los ORF2a, ORF2b, ORF3 a ORF7 y ORF5a, codifican para 8 proteínas estructurales,

GP2, proteína E, GP3, GP4, GP5, proteína de la membrana (M), proteína de la

nucleocápside (N) y proteína ORF5a (Faaberg et al., 2011; Snijder and Meulenberg,

1998; Snijder et al., 2013).

La exposición inicial con el PRRSV se caracteriza en muchos casos por la presencia de

síntomas clínicos a nivel respiratorio y una abundante replicación en macrófagos

alveolares y tisulares. Esta fase aguda se caracteriza por una alta carga viral en tejidos

como tonsila, pulmón, órganos linfoides y presencia de viremia. Posterior a la fase aguda,

sobreviene una fase de infección persistente que involucra un bajo nivel de replicación

viral a nivel del tejido linfoide (Zimmerman et al., 1992). El virus eventualmente es

eliminado del organismo; el proceso de infección por PRRSV se estima que tiene una

duración de al menos 150 días (Allende et al., 2003).

Las principales células blanco para la infección por el PRRSV son los macrófagos

alveolares pulmonares porcinos (MAPs) los cuales juegan un papel importante en la

inmunidad del huésped, sin embargo una vez estos son infectados, el PRRSV desarrolla

mecanismos para interferir con la respuesta inmune celular (Sun et al., 2012a). Uno de

los mayores componentes de la inmunidad innata antiviral es el interferón (INF) tipo I (α

y β) que cumple diversas funciones, entre ellas, la generación de proteínas antivirales

(PAVs) y la estimulación de la actividad citotóxica de las células T-CD8 (Pestka, 2007); el

PRRSV puede obstaculizar la producción del IFN tipo I de varias formas entre ellas,

reduciendo la expresión de TLR3 (Toll-like receptor 3) (Sang et al., 2008), antagonizando

la inducción de IFN por medio de proteínas no estructurales como las NSP1, NSP2,

NSP11 y N (Kim et al., 2010; Shi et al., 2011), interfiriendo con las vías de señalización

JAK/STAT (Patel et al., 2010), inhibiendo la señalización NF-kB (nuclear factor-kappa-

beta), suprimiendo la respuesta del IFN tipo I o activando esta señalización para

optimizar la replicación viral, la apoptosis y la modulación de citoquinas (Lee et al., 2005).

Igualmente, inhibe la función antiviral de ISG15 (IFN- stimulated gene 15) (Sun et al.,

2012 b) y modifica la expresión de moléculas involucradas en la presentación de

antígeno (Mateu and Díaz, 2008).

En el desarrollo de la inmunidad adaptativa contra PRRSV, los anticuerpos circulantes

son detectables entre los días 5 a 7 post infección (PI), con seroconversión a los 14 días

PI (Yoon et al., 1995 citado por Mateu and Díaz, 2008). Las primeras inmunoglobulinas

en surgir son tipo M (IgM) detectables entre el día 5 a 7 con un pico el día 14 declinando

hacia el día 42 PI. La inmunoglobulina tipo G aparece hacia la segunda semana PI, con

un pico entre los días 21 y 42 (Vezina et al., 1996 citado por Mateu and Díaz, 2008).

Para el caso de PRRS, los anticuerpos de aparición temprana son dirigidos

específicamente contra las proteínas N y M, estos aparecen hacia el día 7 PI, seguidos

por anticuerpos contra la proteína GP5. De igual manera, en animales infectados, se

presenta una respuesta temprana frente a epítopes de la proteína nsp2, probablemente

la proteína inmunodominante del virus (De Lima et al., 2006; Oleksiewicz et al., 2001).

Distintas pruebas diagnósticas detectan anticuerpos principalmente contra la proteína N,

estos persisten por varios meses pero no están relacionados con protección

inmunológica (Mateu and Díaz, 2008).

De otro lado, los anticuerpos no neutralizantes son responsables del aumento de

replicación viral dependiente de anticuerpos (ADE) (Yoon et al., 1996, 1997, citado por

Darwich et al., 2010), este fenómeno se describe como un incremento en la

internalización de partículas virales en los macrófagos como resultado de la

opsonización. Los epítopes responsables de inducir anticuerpos relacionados con ADE

se ubican en las proteínas N y GP5 (Cancel-Tirado et al., 2004; Gonin et al., 1999;

Nelson et al., 1994; Ostrowski et al., 2002). El efecto de esta respuesta inmune no

neutralizante actúa como mecanismo de evasión del sistema inmune mediante la

estrategia de caballo de Troya, ya que permite el aumento de la internalización de las

partículas virales en los macrófagos (Mateu and Díaz, 2008). Estos anticuerpos son

detectables hacia el día 28 post infección (PI) (Diaz et al., 2005; Meier et al., 2003; Yoon

et al., 1994).

Se han postulado varias hipótesis sobre el retraso y el bajo título de anticuerpos

neutralizantes, entre ellas se propone la presencia de un epítope denominado “trampa”

(epítope A) localizado cerca al epítope neutralizante (epitope B) de la glicoproteína GP5,

los anticuerpos generados contra el epitíope A no inducen una respuesta inmune

protectiva (Ostrowski et al., 2002). De otro, lado la glicosilación puede afectar la

antigenicidad de GP5, esto se conoce como "blindaje glicano", el cual posiblemente

reduce la capacidad de los anticuerpos para neutralizar PRRSV. Se ha observado, que

la eliminación de los sitios de glicosilación N34, N51y N34+51 produce una mayor

sensibilidad a la neutralización por anticuerpos (Ansari et al., 2006).

El PRRSV induce una inmunidad protectiva contra la re-exposición a la misma cepa viral,

de igual manera ocasiona una prolongada viremia e infección persistente durante la cual

el huésped puede continuar eliminando el virus (Murtaugh et al., 2002).

Las técnicas serológicas para el diagnóstico del PRRSV, permiten evaluar el estatus y la

dinámica de la infección en las explotaciones porcícolas donde no se evidencian signos

clínicos de la enfermedad y en este caso técnicas como ELISA permiten monitorear la

presencia del virus en granja (Mattheu et al., 2006; Wellenberg, 2006).

En Colombia en 1996, se evidenció por primera vez la circulación del PRRSV

empleando la técnica de ELISA, demostrando la presencia de anticuerpos contra este

virus. Posteriormente, el virus fue aislado a partir de muestras de suero y de tejido

pulmonar. Estudios de caracterización molecular situaron los aislados virales dentro del

genotipo Americano (Mogollón et al., 2003).

Teniendo en cuenta el tiempo transcurrido desde la realización del último estudio

serológico en diferentes zonas del país, el presente proyecto se desarrolló con el fin de

establecer la dinámica de anticuerpos frente al PRRSV en tres granjas localizadas en

una zona de alta producción porcícola del país, determinando así el comportamiento del

virus dentro de cada granja, entre granjas y en diferentes grupos etáreos durante un

periodo de nueve meses.

2.1 Materiales y Métodos

2.1.1 Ubicación geográfica y características de las granjas

El estudio se realizó en tres granjas de tipo intensivo y ciclo completo, ubicadas en el

Departamento del Valle del Cauca, localizado en el sur occidente del país a una altitud de

1400-1600 msnm, una temperatura promedio de 23-24°C y una humedad relativa del

65% a 75%. Esta zona se caracteriza por una producción porcícola de tipo intensivo, que

presentó en los meses previos al estudio, reportes de animales con sintomatología

compatible con PRRS. Dos de las tres granjas fueron previamente diagnosticadas como

positivas a PRRS mediante pruebas serológicas, la otra granja fue negativa. Cabe

anotar, que en Colombia desde el año 2006 no se vacuna contra PRRS.

Tabla 2-1 Ubicación geográfica de las tres granjas y de los sitios productivos por

granja

GRANJA SITIO 1 Y 2 SITIO 3 DISTANCIA ENTRE SITIOS

1 Cartago Candelaria 175 km

2 La Unión La Unión 1 km

3 Palmira Candelaria 70 km

Figura 2-1 Ubicación geográfica de cada granja dentro del Departamento del Valle

del Cauca

El color rojo indica la ubicación de los sitios 1-2 (Cartago) y 3 (Candelaria) de la granja 1;

el color violeta señala la ubicación de los 3 sitios productivos de la granja 2 (La Unión) y

el color amarillo la localización de los sitios 1-2 (Palmira) y 3 (Candelaria) de la granja 3.

SITIO 1 - 2

SITIO 3

SITIO 1-2-3

SITIO 3

SITIO 1 - 2

2.1.2 Muestras

Se tomaron muestras de sangre mediante venopunción (vena cava), en tubos

individuales (BD Vacutainer), éstas fueron enviadas el mismo día al Laboratorio de

Virología de la Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia de la Universidad

Nacional. Fueron centrifugadas a 1000xg durante 10 minutos, el suero obtenido se

almacenó a -20°C, hasta su procesamiento. Los sueros provenían de los diferentes

grupos etáreos presentes en las granjas: madres, reproductores, reemplazos, lactantes,

lechones destetos (20-21 días), preceba (7-9 semanas) y ceba (12-14 semanas y 18-22

semanas). Se obtuvieron 5 muestras de suero por cada grupo etáreo, por granja y por

cada mes, durante los 9 meses en que se desarrolló el muestreo, desde septiembre de

2012 a mayo de 2013.

2.1.3 Evaluación serológica

Con el fin de evaluar la presencia y comportamiento de los anticuerpos frente al PRRSV,

se utilizó el kit comercial de ELISA HerdCheck* IDEXX PRRSx3, realizándose el

procedimiento especificado en el inserto por el laboratorio productor.

Se emplearon placas revestidas con antígenos recombinantes del virus del PRRS donde

fueron adicionados 100 µl de una predilución 1:40 de cada muestra y posteriormente 100

µl de los controles negativo y positivo, se incubaron y se realizaron tres lavados,

posteriormente se adicionaron 100 µl de anticuerpo anti porcino conjugado con

peroxidasa (HRPO) y se incubó durante 30 minutos. Luego de tres lavados se

adicionaron 100 µl de substrato TMB durante quince minutos y se detuvo la reacción con

la solución de frenado. La lectura se realizó en un lector de micro placas BioTekPower

Wave HT, a una densidad óptica (DO) de 650 nm. La presencia o ausencia de

anticuerpos contra el virus del PRRS se determinó calculando el cociente

muestra/positivo (M/P). Una muestra se consideró negativa si el cociente M/P fue inferior

a 0.40 y positiva si el cociente M/P fue igual o superior a 0.40.

2.1.4 Análisis estadístico

Para la variable M/P se realizó un análisis de varianza utilizando el programa SAS,

teniendo como fuentes de variación, granja (1, 2 y 3), grupo etáreo (madres,

reproductores, reemplazos, lactantes, destetos, preceba y ceba) y meses (septiembre de

2012 a mayo de 2013). Al presentarse efectos significativos, se empleó una prueba de

comparación múltiple de Tukey.

2.2 Resultados

Al evaluar el nivel de significancia de las fuentes de variación, se observó una interacción

altamente significativa entre los tres factores analizados en el estudio: granja, grupo

etáreo y tiempo. Se observaron diferencias altamente significativas entre grupo y granja

durante los meses del estudio específicamente en las granjas 1 y 3; la granja 2 no

presentó interacciones significativas entre estos factores. En total, se analizaron 910

muestras de suero; se evaluaron 45 muestras por grupo etáreo. En la granja 2 no se

analizaron muestras del mes de Septiembre. Los datos fueron analizados por grupo

etáreo, por granja, durante un lapso de nueve meses.

2.2.1 Granja 1

Se analizaron 315 muestras y siete grupos etáreos. De acuerdo con los promedios de

resultados obtenidos, la ceba presentó el mayor número de muestras positivas (Tabla 2-

2). Con relación a la interacción grupos etareos-granjas-meses, se observó una

diferencia altamente significativa (<.0001) dentro de la granja 1 con respecto al grupo de

la ceba durante los meses del estudio.

Tabla 2-2 Resultados por ELISA en Granja 1

Figura 2-2 Comportamiento de los promedios de resultados del grupo ceba dentro

de la Granja 1 durante el tiempo de estudio

Al observar los promedios de resultados M/P para la ceba, por mes durante el tiempo del

estudio en la granja 1 (Figura 2-2), se obtuvieron valores por encima del punto de corte a

partir del mes de inicio del estudio, con un pico hacia el mes de noviembre, estos

descendieron por debajo del punto de corte para el mes de enero. Después de un

ascenso en febrero, descienden de nuevo en marzo y en los dos últimos meses del

estudio los promedios permanecieron por encima de 0.40.

GRANJA 1

GRUPO ETAREO RESULTADO ELISA MES ESTUDIO

Madres Negativas Durante todos los

meses

Reproductores 1 muestra positiva

Abril (M/P 1.5)

Reemplazos 1 muestra positiva

Noviembre (M/P 0.467)

Lactantes, Destetos y Preceba

Negativas Durante todos los

meses

Ceba 24 muestras positivas Durante todos los

meses

2.2.2 Granja 2

Se analizaron 280 muestras y siete grupos etáreos durante 8 meses de estudio a partir

del mes de octubre de 2012. Se evaluaron 45 muestras por grupo etáreo. Como se

observa en la tabla 2-3, en esta granja solo se obtuvo un resultado positivo en el grupo

de la ceba durante el mes de noviembre.

Tabla 2-3 Resultados por ELISA en Granja 2

GRANJA 2

GRUPO ETAREO

RESULTADO ELISA MES ESTUDIO

Madres, Reproductores, Reemplazos,

Lactantes, Destetos y Preceba

Negativas Durante todos los

meses

Ceba 1 muestra positiva

(M/P 0.644) Noviembre

El análisis de variación no mostró diferencias significativas entre grupo etáreo y granja

con respecto a los diferentes meses del estudio.

2.2.3 Granja 3

Se analizaron 315 muestras de los siete grupos etáreos, 45 muestras por cada grupo. En

la tabla 2-4, se observa el número de muestras que fueron positivas durante el estudio.

Tabla 2-4 Resultados por ELISA en Granja 3

GRUPO

ETAREO

RESULTADO

ELISAMES ESTUDIO

Madres 25 positivasEn 6 de los 9

meses de estudio

Reproductores 25 positivasEn 7 de los 9

meses de estudio

Reemplazos 34 positivasEn 8 de los 9

meses de estudio

Lactantes 25 positivasEn 5 de los 9

meses de estudio

Destetos 13 positivasEn 4 de los 9

meses de estudio

Preceba 12 positivasEn 6 de los 9

meses de estudio

Ceba 34 positivasEn 8 de los 9

meses de estudio

GRANJA 3

De acuerdo con la tabla 2-4, se observó que todos los grupos etáreos de la granja 3

presentaron resultados positivos, en mayor número dentro del grupo de los reemplazos y

la ceba. El análisis de variación mostró diferencias altamente significativas (<.0001) entre

grupo etáreo y granja con respecto a los diferentes meses del estudio.

En las figuras 2-3, 2-4, 2-5, correspondientes a los grupos de las madres, lactantes y

destetos, respectivamente, se observa un promedio de resultados de M/P superior a 0.40

a partir del mes de inicio del estudio, presentando un pico entre octubre y noviembre, con

un descenso hacia diciembre y enero con valores cercanos o por debajo del punto de

corte, posteriormente vuelven a incrementarse, con un descenso hacia el final del

estudio.

Figura 2-3 Comportamiento de los promedios de resultados serológicos del grupo

de las madres dentro de la granja 3 durante el tiempo de estudio

Figura 2-4 Comportamiento de los promedios de resultados serólogicos del grupo

de los lactantes dentro de la granja 3 durante el tiempo de estudio

Figura 2-5. Comportamiento de los promedios de resultados serológicos del grupo

de los destetos dentro de la granja 3 durante el tiempo de estudio.

Los grupos de reproductores y preceba (Figuras 2-6 y 2-7), presentaron un promedio de

resultados por encima del punto de corte a partir del mes de septiembre, que descienden

hacia noviembre. En el grupo de reproductores, este descenso continuó hasta febrero,

con un ascenso en marzo y abril. En la preceba se observó una respuesta de descenso-

ascenso hasta el mes de marzo. Al final del estudio, los promedios se localizaron por

debajo del punto de corte.

Figura 2-6 Comportamiento de los promedios de resultados serológicos del grupo

de los reproductores dentro de la granja 3 durante el tiempo de estudio.

Figura 2-7 Comportamiento de los promedios de resultados serológicos del grupo

de la preceba dentro de la granja 3 durante el tiempo de estudio.

En las gráficas 2-8 y 2-9, se observa que los grupos de los reemplazos y ceba,

conservaron los promedios de resultados durante cada mes por encima del punto de

corte, excepto en la ceba que presentó para el mes de Mayo un descenso por debajo de

0.40.

Figura 2-8 Comportamiento de los promedios de resultados serológicos del grupo

de los reemplazos dentro de la granja 3 durante el tiempo de estudio

Figura 2-9 Comportamiento de los promedios de resultados serológicos del grupo

de la ceba dentro de la granja 3 durante el tiempo de estudio

2.3 Discusión

La primera evidencia serológica de la infección por el PRRSV en Colombia se presentó

en el año de 1996 y posteriormente en los años 1997 y 2000. En los estudios realizados,

se evalúo la presencia de anticuerpos contra el virus en muestras de suero de cerdos

confinados y no confinados, utilizando la técnica de ELISA HerdChek PRRS (IDEXX

Laboratories Inc., Westbrook Maine). Estos estudios iniciales permitieron determinar que

PRRSV estaba ampliamente distribuido en el país de forma no uniforme, predominando

en los sistemas de producción intensiva. Para el caso particular del Valle del Cauca, en

1997 se evaluaron 544 muestras procedentes de 7 granjas, donde se obtuvieron 93

muestras positivas (17.1%) (Mogollón et al., 2003). Para el año 2006 se realizó un nuevo

estudio serológico con el fin de actualizar la situación de PRRSV en el país, se incluyeron

para este caso los departamentos donde se manejaban producciones extensivas o de

traspatio, tomando muestras en mataderos (cerdos de descarte y de ceba). Las muestras

se analizaron con el kit HerdChek ELISA PPRS x 2 (Laboratorios IDEXX), obteniéndose

un total de 71 reactores positivos de 1.658 sueros analizados y una prevalencia del 4.3%.

Específicamente, en el departamento del Valle se encontraron 6 reactores en 170

muestras evaluadas y una prevalencia de la enfermedad del 3.5% (Cruz et al., 2006).

En el presente estudio realizado en el departamento del Valle del Cauca, se analizaron

tres factores dentro de una misma zona: granja (3), grupo etáreo (7) y tiempo (9 meses),

los que presentaron una interacción estadística altamente significativa, particularmente

en las granjas 1 y 3. Por su parte la granja 2, no presentó esta interacción

permaneciendo seronegativa durante el tiempo de estudio. Es de notar el

comportamiento diferente entre granjas dentro de una misma zona geográfica. En

general, se obtuvo un porcentaje de positividad del 21.43% de un total de 910 muestras

evaluadas en las tres granjas y un 44.26% de positividad de 130 muestras evaluadas en

la ceba, lo cual, con respecto a los resultados obtenidos en los años 2000 y 2006 (Cruz

et al., 2006; Mogollón et al., 2003), evidencia un aumento en los porcentajes de

positividad, especialmente dentro de este grupo etáreo. Lo anterior indica inicialmente

que hay una mayor actividad del PRRSV en la zona, posiblemente asociado al

crecimiento de la industria porcina intensiva como extensiva

(http://asoporcicultores.co/porcicultores/), que conllevó a la presencia de un mayor

número de granjas colindantes, lo que incrementa las posibilidades de trasmisión del

virus. Igualmente, debe tenerse en cuenta que no existen protocolos de bioseguridad

unificados entre granjas, como también que hay una mayor movilización de animales.

Las diferencias encontradas entre granjas podrían estar relacionadas con varios factores,

entre ellos los tipos de manejo productivo en cada una de ellas; en Colombia la

producción se hace mayoritariamente en flujo continuo y no bajo el concepto de todo

dentro todo fuera. Así, las granjas 1 y 3, que presentaron la mayor positividad tienen el

sitio 1 (madres, lactantes, destetos, reemplazos y reproductores) y el sitio 2 (preceba) en

un solo lugar, mientras que el sitio 3 (ceba) se encuentra en otra ubicación geográfica, en

este caso a 175 Km y 70 Km para las granjas 1 y 3 respectivamente (Figura 2-1). Por el

contrario, la granja 2 presenta los tres sitios en un solo lugar y fue negativa durante todo

el estudio. Esto puede llevar a plantear que la movilización de los animales entre sitios

puede ser un factor que posibilita la transmisión indirecta del PRRSV. Este tipo de

transmisión ha sido controversial, sin embargo datos recolectados durante un brote en

Inglaterra evidenciaron que el virus se puede diseminar por medio de aerosoles en un

radio de hasta 3 Km. (Edwards et al., 1992). Información obtenida de un estudio

epidemiológico a gran escala en Dinamarca, sugirió a los aerosoles como una potencial

ruta de transmisión indirecta dentro de regiones productoras de porcinos (Mortensen et

al., 2002). De otro lado, también se plantea que las movilizaciones por largos trayectos a

temperaturas muy elevadas, como es el caso de estas granjas, pueden estar

relacionadas con cuadros de estrés, lo que puede generar una inmunosupresión que

favorecería la infección por diferentes patógenos, entre ellos PRRSV.

El proceso de transporte, per se, ha sido considerado como un factor de riesgo

importante para la entrada de patógenos en granjas porcícolas. Esto debido al probable

contacto de porcinos susceptibles con virus como el de PRRS, al interior de camiones

contaminados (Dee et al., 2004; 2005). De acuerdo con Poumian (1995), todos los

camiones, trailers y otros vehículos usados para transportar animales, productos

animales, productos alimenticios o equipos contaminados, son un riesgo potencial en la

diseminación de enfermedades.

En lo referente a factores intrínsecos en una granja seropositiva, es posible encontrar

otras fuentes de transmisión, como fómites, insectos y otras especies animales (Cho and

Dee, 2006). Igualmente, se ha demostrado que el uso de agujas o instrumental

contaminado con fluidos orgánicos puede transmitir el PRRSV (Otake et al., 2002a,

2002b). Con respecto a los insectos, en algunos estudios se ha evaluado el papel del

mosquito Aedes vexans en la transmisión del virus, para esto, mosquitos capturados a

partir de planteles de cerdos infectados y puestos en contacto con cerdos centinelas,

demostraron dicha transmisión (Otake et al., 2002c). Por otra parte, Shurrer et al. (2004)

revelaron que las moscas pueden contaminarse con el virus y transportarlo a una

distancia de 1.7 km. Se puede inferir por lo tanto, que los insectos pueden convertirse en

posibles agentes diseminadores del virus entre planteles porcinos bajo condiciones de

campo. Con respecto a otras especies animales (perros, ratones, gatos) no se ha

demostrado su capacidad como vectores mecánicos o biológicos del virus de PRRS

(Wills et al, 2000). En Colombia, no se han realizado estudios sobre estos factores que

pueden ser determinantes para la diseminación y mantenimiento del PRRSV,

particularmente por la condición tropical del país donde la diversidad de insectos y

roedores es muy amplia.

Con respecto al comportamiento de los anticuerpos en la granja 1, se observó

seropositividad en el sitio 3, mientras que el grupo de la preceba fue seronegativo

durante todo el estudio. Se podría inferir, que los animales del sitio 2 se infectaron

durante el transporte o directamente en el sitio 3. Sin embargo, al correlacionar los

resultados de serología con los de qRT-PCR (datos presentados en el siguiente capítulo),

se pudo establecer la presencia del genoma del PRRSV en el sitio 2 más no en el sitio 3;

esto indica que los animales ya se encontraban infectados y seroconvirtieron en el sitio 3.

De acuerdo con lo anterior, la serología permitió establecer la circulación viral pero no fue

eficiente para determinar el momento de la infección, lo que nos lleva a proponer que el

diagnóstico de PRRSV debe soportarse en la serología como también en la detección del

agente viral, esto con el fin de hacer un análisis más preciso de la dinámica del virus y de

la respuesta inmune, conducente a tomar las medidas de control adecuadas.

Como se observa en la Figura 2-2, el grupo de la ceba en la granja 1, presentó

seropositividad en los primeros cuatro meses (septiembre a diciembre), descendiendo a

zona de seronegatividad a partir del mes de enero y marzo, ascendiendo hacia el final del

estudio. Aquí es importante tener en cuenta que en Colombia hacia el final de año se

incrementa significativamente el consumo y comercialización de carne de cerdo, lo que

se traduce en una gran salida de animales de la granja, esto puede explicar el hecho de

la reducción en el número de seropositivos en el mes de enero. Una vez se reactivó la

producción en la ceba, se volvió a presentar un M/P mayor a 0.4 en abril y mayo, lo que

lleva a pensar que la infección continuo a partir del sitio 2 y se reactivó en el sitio 3 al ser

incrementada la población. Este nuevo episodio de seropositividad igualmente pudo estar

relacionado con la infección con una cepa heteróloga posiblemente por ingreso de

animales. Esto último puede sustentarse en el hecho de que este virus induce una

inmunidad protectiva efectiva contra la re exposición a la misma cepa viral (Murtaugh et

al., 2002).

De otro lado, teniendo en cuenta el kit de ELISA empleado en este estudio sobre el cual

se ha reportado que detecta anticuerpos principalmente contra la proteína N y de

acuerdo con Nelson et al (1994) quienes estudiaron la cinética de la respuesta humoral

del cerdo frente al genotipo americano del PRRSV, donde se determinó que los

anticuerpos tempranos fueron dirigidos contra la proteína N (15 KDa), se puede sugerir

que los anticuerpos detectados en este estudio, fueron indicativo del comienzo de una

infección por PRRSV en la granja. Adicionalmente, en un estudio llevado a cabo en la

Universidad de Hannover, donde se evalúo la respuesta de anticuerpos seguida a la

vacunación, se compararon nueve kits para diagnóstico de PRRS de los cuales

HerdChek PRRS 2xR y PRRSx3, detectaron la exposición temprana al virus (Strutzberg-

Minder et al. 2012).

De igual manera, el descenso en la seropositividad en la ceba de la granja 1 durante el

tiempo, pudo obedecer a que los anticuerpos circulantes en este momento no fueron

detectados por la técnica de ELISA empleada, ya que no correspondían a una respuesta

a una infección temprana por el PRRSV. De otro lado, esta seropositividad pudo

igualmente corresponder a una infección pasada si se tiene en cuenta el tiempo de

persistencia de los anticuerpos antiPRRSV. Estos son detectables por ELISA entre los 9

a 13 días PI (Yoon et al., 1995, citado por Evans et al., 2008) y decaen en el tiempo

pudiendo persistir hasta por 28 meses (Desrosiers and Boutin, 2002). También se sabe

que muchos cerdos liberan el virus durante 3 a 4 meses pos exposición (Wills et al.,

2003) así, los animales seropositivos al PRRSV, pueden ser negativos a la presencia del

virus y en consecuencia la seropositividad es indicativa de una infección pasada (Evans

et al., 2008).

Con relación a los resultados serológicos en la granja 2 (Tabla 2-3), donde se observó

seropositividad únicamente en una muestra en la ceba durante los 9 meses de estudio,

se puede especular en primer lugar que dicho resultado (0.64) correspondió a un falso

positivo ya que ocurrió al inicio del estudio, mientras que durante el resto del muestreo, la

granja y este grupo etáreo en particular fue negativo. De otro lado, las prácticas de

manejo en esta granja, donde no se realizó movilización de animales de un sitio a otro; la

aplicación de medidas de bioseguridad con respecto al control de insectos y roedores; el

manejo de las hembras de reemplazo, las cuales fueron monitoreadas y comprobadas

como seronegativas al entrar a la granja y durante el periodo de cuarentena, llevaron a

identificar a esta granja como negativa dentro de este estudio.

Con respecto a la granja 3, se encontró seropositividad en todos los grupos etáreos

(Tabla 2-4). La presencia de anticuerpos en el grupo de animales jóvenes de la granja,

reveló la presencia del PRRSV y una transmisión activa del virus. En el grupo de las

madres, los reproductores, los reemplazos y ceba, la seropositividad pudo estar

relacionada, ya sea con la introducción viral, generalmente por el ingreso de animales de

reemplazo a la granja o a la presencia de animales persistentemente infectados dentro

de la misma (Evans et al., 2008).

La introducción viral pudo originarse por la entrada de hembras de reemplazo que

presentaron previa exposición al virus e ingresaron a la granja transmitiendo el agente a

los animales susceptibles; de otro lado, que siendo seronegativas se infectaron con la

cepa viral circulante en la granja ya sea por contacto directo con los porcinos de la granja

o por medio de la exposición con muestras (placentas) procedentes de animales

positivos como parte de las prácticas de infección que se realizan para el control de la

enfermedad.

Es posible que en la granja 3 se encontraran animales persistentemente infectados,

entendiéndose la persistencia como la presencia del virus infectivo durante periodos

prolongados en determinados órganos como tonsilas y nódulos linfáticos a partir de los

cuales continua siendo eliminado en niveles bajos, presentando una posterior

disminución durante el transcurso del tiempo (Allende et al., 2000). Se ha detectado virus

en tonsilas y nódulos linfoides a los 132 días después del nacimiento en cerdos

infectados in útero (Rowland et al., 2003) y desde los 105 a 157 días PI en cerdos

jóvenes (Horter et al., 2002). A su vez, Evans et al (2008), concluyeron que la

persistencia está asociada con granjas de gran tamaño, localizadas en regiones con alta

densidad en cerdos y una continua introducción de lotes de animales infectados. La

granja 3 es considerada una granja intensiva con más de 7000 animales, ubicada en una

zona de alta producción porcícola del país, además de acuerdo con los resultados por

qRT-PCR (datos presentados en el siguiente capítulo) se obtuvieron muestras positivas

en ganglios linfáticos, órgano donde se produce la persistencia del virus, lo cual podría

relacionarse de igual manera con la presencia de animales con esta condición,

ocasionada por el PRRSV.

Con relación al grupo de las madres, reportes de campo sugieren que luego de una falla

reproductiva inducida por PRRSV, las hembras desarrollan una inmunidad protectiva,

esto se basa en que hembras afectadas tienen camadas normales a pesar de la

circulación del virus dentro de la granja (Stevenson et al., 1993, citado por Karniychuk

and Nauwynck, 2013). Las hembras seropositivas pueden transmitir anticuerpos

maternos a sus camadas vía calostro, sin embargo la inmunidad pasiva declina y puede

llevar a infección luego del destete cuando los animales son mezclados (OIE, 2008), Esto

puede explicar los resultados positivos obtenidos dentro del grupo de los destetos en el

presente estudio.

De igual manera, no se descarta la posibilidad de transmisión del PRRSV por medio de

semen contaminado o por medio de la monta directa con machos de las granjas, que

igualmente fueron seropositivos (Christopher-Hennings et al., 1996).

En general, en el grupo de las madres, lactantes y destetos (Figuras 2-3, 2-4, 2-5) en la

granja 3, se observó un comportamiento de anticuerpos similar durante los meses de

estudio. Básicamente en el mes de enero comenzaron a descender los valores de M/P

manteniéndose por debajo del punto de corte 0.40 hasta el mes de mayo. Esta reducción

de los niveles de anticuerpos detectables por ELISA, puede indicar que la infección

avanzo a la fase crónica de la enfermedad caracterizada por disminución en los niveles

de anticuerpos; de otro lado, el estudio de Evans et al. (2008) indico que cerdas de varios

partos, que habían sido seropositivas debido a una pasada transmisión viral, presentaron

posteriormente una disminución gradual del virus y por lo tanto de dicha seropositividad.

En el grupo de los reproductores y preceba (Figura 2-6, 2-7), se observó de igual manera

un descenso en el nivel de anticuerpos para los meses de Febrero y Enero

respectivamente, sin embargo se vuelve a presentar seropositividad en los meses

siguientes, lo cual pudo estar asociado a reinfección con una cepa viral diferente o con la

misma cepa circulante en granja si se tienen en cuenta los valores de M/P cercanos al

punto de corte.

Para el caso de los reemplazos y ceba (Figura 2-8, 2-9), se presentó seropositividad

durante ocho de los nueve meses del estudio. La presencia de anticuerpos en hembras

de cría se relaciona con previa exposición al virus e introducción en una granja; a la

exposición con la cepa circulante en la granja y a su vez al contacto con muestras de

animales positivos a PRRSV como parte de las técnicas de manejo de reemplazos. Con

respecto a los resultados en la ceba, los cerdos del sitio 2 pudieron infectarse en el sitio 3

o estar previamente infectados y durante el traslado o la posible presentación de un

cuadro de estrés, seroconvertir en el sitio 3, presentando estos resultados seropositivos.

A pesar de la seropositividad observada durante la mayor parte de tiempo del estudio,

todos los grupos presentaron seronegatividad para el mes de Mayo cuando culmino el

muestreo, lo cual pudo obedecer a la aplicación de medidas de bioseguridad y manejo

adecuadas.

En general, aun cuando las granjas se encontraban localizadas en una misma zona

productiva y geográfica, mediante el presente estudio se observó un comportamiento

serológico diferente dentro de cada una, lo cual podría estar relacionado con las

condiciones de bioseguridad y/o manejo particulares. De igual manera, cada grupo

etáreo exhibió una respuesta específica, donde el grupo de la ceba presentó los valores

de positividad más significativos, debido posiblemente a las diferencias en manejo y

movilidad de los animales hacia los sitios correspondientes. Los hallazgos de este

estudio igualmente, concordaron con aquellos encontrados por Salinas et al., (2008)

quienes evaluaron cinco granjas (Nuevo León-México) en diferentes etapas de

producción (destete, iniciación, finalización, gestantes, lactantes y monta-servicio), donde

encontraron diferencias en cuanto a la seroprevalencia entre granjas (6.7% a 45%), lo

cual se relacionó básicamente con factores de manejo y bioseguridad. La mayor

prevalencia de seropositivos al PRRSV se encontró en el área de producción en

comparación con el área de reproducción. La etapa con más alta seroprevalencia

correspondió a la finalización con 56%, seguida del inicio con 36%.

Lo anterior, confirma las diferencias existentes en cuanto a actividad viral, no solo dentro

de las granjas sino entre las mismas y dentro de grupos etáreos, por lo anterior y

teniendo en cuenta la variabilidad genética del virus, es conveniente revisar el

comportamiento del PRRSV en forma particular para cada granja.

2.4 Conclusiones

Se confirman la circulación del PRRSV en explotaciones porcícolas de tipo intensivo en

el país. Se observó un incremento en la actividad del virus tanto en la zona del Valle del

Cauca, como en los diferentes grupos etáreos evaluados, principalmente en la ceba.

2.5 Recomendaciones

El estudio demostró que el comportamiento del virus de PRRS en Colombia es particular

para cada granja, por tal razón, es importante revisar las medidas de bioseguridad, el

impacto de las movilizaciones a grandes distancias entre los sitios productivos de los

animales y realizar junto con estudios serológico pruebas moleculares con el fin de

determinar la dinámica el PRRSV dentro de cada granja.

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Determinación mediante la técnica de RT-

PCR en tiempo real (qRT-PCR) de la

presencia del virus del Síndrome

Reproductivo y Respiratorio Porcino (PRRSV)

en tres granjas del Valle del Cauca

Resumen El Síndrome Reproductivo y Respiratorio Porcino (PRRS), ocasiona un alto impacto

económico en las explotaciones porcícolas a nivel mundial, para su control se requiere de

la implementación de técnicas diagnósticas que permitan la detección temprana del

agente viral dentro de una explotación. El objetivo de este estudio fue detectar mediante

la técnica de PCR tiempo real (qRT-PCR) la presencia del ARN del PRRSV en muestras

de suero, tejidos, fluido oral y lavado bronco alveolar de porcinos proveniente de tres

granjas intensivas del Departamento del Valle. Los resultados permitieron determinar la

presencia de actividad viral en las tres granjas, con mayor carga viral en aquellas que

realizaban desplazamientos entre sitios productivos y dentro de los grupos de la preceba

y ceba. Los diferentes tipos de muestra evaluadas y el uso de la técnica de qRT-PCR,

evidenciaron diferentes estados de la infección por el PRRSV en cada una de las

granjas, lo que indica que aún en la misma región o zona, el comportamiento de la

enfermedad es particular para cada una, por lo tanto, el control y medidas de manejo

deben ser aplicados de igual forma.

Palabras clave: ARN, Diagnóstico, PCR, PRRS.

Abstract

Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS), causes a high economic losses

on pig farms around the world, its control requires the implementation of diagnostic

techniques that allow early viral detection within farms. The objective of this study was to

detect PRRSV genome through the PCR technique using real-time (qRT-PCR,). Viral

RNA was measured in samples of serum, tissues, oral fluids and broncho alveolar lavage

(BAL) coming from three intensive productión farms from the Valle del Cauca province.

The results allowed the presence of viral genome whitin the three farms with higher viral

loads, especially on those who travel between production sites and within the pre-

fattening and fattening groups. The qRT-PCR technique on different kind of samples,

showed different stages of infection by PRRSV in each one of the farms, which indicates

that even on the same region or zone, the behavior of the disease is particular to each

farm and therefore control and management measures must be applied in the same way.

Keywords: Diagnostic, PCR, PRRS, RNA.

Introducción El Síndrome Reproductivo y Respiratorio Porcino (PRRS) es actualmente una de las

enfermedades con mayor impacto económico que afecta a la industria porcina alrededor

del mundo (Neumann et al., 2005). Esta enfermedad que emergió casi simultáneamente

entre los años 1980 y 1990 en Norteamérica y Europa, se caracteriza por ocasionar

enfermedad respiratoria en lechones y fallas reproductivas en cerdas, estos últimos

síntomas incluyen abortos, muerte fetal y nacimiento de lechones débiles (Benfield et al.,

1992; Wensvoort et al., 1991).

El PRRSV, se divide principalmente en genotipo I o tipo Europeo y genotipo II o tipo

Norteamericano. Estos comparten un 60% de identidad entre nucleótidos (Allende et al.,

1999; Nelsen et al., 1999). Las cepas representativas de cada uno de los genotipos,

Lelystad (LV) y VR-2332, respectivamente (Benfield et al., 1992; Wensvoort et al., 1991)

difieren aproximadamente en 40% a nivel genómico (Meulenberg et al., 1993; Nelson et

al., 1993; Nelsen et al., 1999). De igual manera, los aislados dentro de cada genotipo

pueden variar aproximadamente en el 20% a nivel de nucleótidos (Meng, 2000; Nelsen et

al., 1999).

El genoma del PRRSV es ARN de cadena sencilla y polaridad positiva, con una longitud

promedio de 15 kb. Pertenece a la familia Arteriviridae, género Arterivirus. Dentro de esta

familia también se encuentran el virus de la Arteritis Equina (EAV), el virus Elevador de la

Lactato deshidrogenasa del ratón (LDV) y el virus de la Fiebre Hemorrágica del Simio

(SHFV) (Cavanagh, 1997). El genoma viral consta de una región UTR- 5´ no traducida,

10 marcos de lectura abierta (ORFs) y una región UTR- 3´ (Britton and Cavanagh, 2008;

Johnson et al., 2011). Los ORFs 1a y 1b constituyen aproximadamente el 75% del

genoma y codifican para dos poli proteínas, las replicasas pp1a y pp1b. Estas a su vez,

son clivadas en 14 proteínas no estructurales (NSPs) que están involucradas en la

replicación y en la transcripción del ARNm subgenómico viral, además presentan

actividad replicasa, proteasa y polimerasa. Las GP2a, GP2b, GP3 y GP4, son proteínas

menores de la envoltura, son N-glicosiladas y forman heterotrímeros mediante uniones

disulfuro (Wissink et al., 2005). Las proteínas GP5 y M, proteínas mayores de la cubierta,

forman heterodímeros mediante uniones disulfuro a nivel del retículo endoplasmático

(ER). La proteína de la nucleocápside (N) es la más abundante, corresponde al

componente inmunogénico del virión y existe como dímero. Recientemente fue

descubierto un polipéptido de 51 aminoácidos el cual es codificado por un ORF

alternativo del ARNm5, el cual precede al sitio de iniciación de la proteína mayor de la

cubierta, GP5 (Johnson et al., 2011). El ORF5a, está presente en una amplia variedad de

aislados del genotipo I y II del PRRSV y su función está relacionada con la replicación del

virus. De otro lado, se ha evidenciado la expresión de bajos niveles de anticuerpos anti-

proteína ORF5a posterior a la infección de cerdos con PRRSV y no se descarta que ésta

induzca una respuesta inmune mediada predominantemente por células (Jeong et al.,

2010).

El ORF6 es altamente conservado entre los aislados norteamericanos con un 100% de

identidad entre aminoácidos y a su vez es el más conservado entre aislados americanos

y europeos con 70-81% de identidad (Allende et al., 1999; Murtaugh et al., 1995). El

ORF7 es igualmente conservado entre aislados Norteamericanos con 95-100% de

homología y el 57-59% de identidad de secuencia de aminoácidos con el virus Lelystad

(Allende et al., 1999; Meng et al., 1995a, 1995b; Murtaugh et al., 1995). Por lo anterior, el

ORF7 es un blanco robusto para diagnosticar PRRSV a través de la amplificación por

RT-PCR y para diferenciar entre los genotipos americano y europeo (Le Gall et al., 1998;

Suárez et al., 1996, citados por Martínez et al., 2008).

La alta tasa de mutación, rápida evolución y variabilidad genética de las cepas de

PRRSV, han dificultado el desarrollo de técnicas diagnósticas seguras a largo plazo y

como consecuencia de esto, resultados falsos negativos han sido reportados mediante

las pruebas disponibles comercialmente (Harmon et al., 2012; Wernike et al., 2012). Por

tal razón, desde 1995 varios métodos de RT-PCR convencional han sido desarrollados

para la detección rápida y específica de PRRSV en cerdos, no obstante, estos requieren

manipulación post PCR ya que el análisis y visualización de los productos se verifican

posteriormente mediante la utilización de electroforesis en gel de agarosa, lo que puede

aumentar el riesgo de contaminación.

En contraste, el RT-PCR tiempo real (qRT-PCR), completa la amplificación y el análisis

en un sistema cerrado permitiendo detectar y cuantificar las secuencias específicas de

ácidos nucleicos mediante el uso de reporteros fluorescentes en la reacción. La qRT-

PCR ha sido ampliamente empleada para el diagnóstico temprano de enfermedades

animales de origen viral (Shaw et al., 2007) ya que los datos de la curva melting permiten

verificar los productos de amplificación, disminuyendo así mismo el potencial riesgo de

contaminación y por lo tanto la presentación de resultados falsos positivos (García et al.,

2007; Mackay et al., 2002; Tian et al., 2010).

Un método no específico para la detección de los productos amplificados por qRT-PCR,

incluye el uso de moléculas intercalantes que tienen afinidad por ADN de doble cadena y

que al ser oxidados generan una señal fluorescente; esta fluorescencia emitida es

capturada en la etapa de extensión de cada ciclo y es proporcional al número de copias

de ADN de doble cadena obtenidas en la PCR. El reportero más usado para este fin es el

SYBR Green (Zipper et al., 2004), molécula cargada positivamente que al unirse al surco

menor del ADN incrementa su fluorescencia (Martínez et al., 2008). Este método a su vez

se ha relacionado con la detección de virus ARN que presentan alta variabilidad

genómica y ha permitido diferenciar cepas altamente patógenas de PRRSV (HP-PRRSV)

de cepas clásicas del genotipo II del virus (Chai et al., 2013).

La curva de disociación de la técnica, permite distinguir entre positivos, negativos y

dímeros, corrigiendo el error que comete el SYBR al unirse a todo ADN bicatenario

(Rubio et al., 2007). El SYBR Green qRT-PCR, puede detectar pequeñas variaciones en

la secuencia blanco y esas variaciones pueden indicar la presencia de una nueva cepa

de PRRSV, esto genera una ventaja sobre el PCR convencional basado en gel, con el

cual no se detectan estas diferencias; de igual manera ha demostrado ser un sistema de

detección temprana de PRRSV, ya que ha permitido detectar y tipificar el virus en suero a

los dos días post infección (Martínez et al., 2008).

Las muestras más comunes usadas para monitorear PRRSV incluyen suero, hisopos

sanguíneos, fluidos orales y semen. Estudios han mostrado que el ARN de PRRSV

puede ser detectado en suero, fluido oral e hisopos sanguíneos entre 24 y 48 horas PI y

en muestras de semen entre 48 a 120 horas PI (Kittawornrat et al., 2010).

Colecciones de sueros, son usados regularmente para monitorear el estatus de PRRSV

por RT-PCR, sin embargo, un estudio relacionado demostró un decremento en la

sensibilidad cuando fueron utilizados pooles de tres a cinco muestras de suero y sangre,

especialmente durante los primeros días de infección (Rovira et al., 2007).

Recientemente, el uso de las muestras de fluido oral para vigilancia y diagnóstico se ha

incrementado debido a la facilidad en el método de colección (Ramirez et al., 2012). La

presencia del PRRSV en fluido oral fue reportado por primera vez en 1997, a partir de

hisopados bucales colectados de cerdos jóvenes infectados experimentalmente (Wills et

al., 1997). Otros estudios han revelado tasas de detección del ARN de PRRSV similares,

tanto en suero como fluido oral de animales infectados experimentalmente (Kittawornrat

et al., 2010). Se ha reportado que el fluido oral contiene factores endógenos antivirales y

antibacteriales que pueden teóricamente afectar la estabilidad de la PCR (Shugars,

1999). Sin embargo, de acuerdo con Prickett et al (2010), el ARN del PRRSV es

relativamente resistente a la degradación en fluidos orales, no se requiere el uso de

antimicrobianos para preservar la muestra, es suficiente un adecuado manejo de

almacenamiento y transporte a temperaturas de congelación o refrigeración a 4°C para

mantener la integridad del ARN en la muestra de fluido oral.

En general, las pruebas basadas en PCR son útiles para detectar circulación inmediata

de patógenos, mientras que las pruebas basadas en anticuerpos, brindan información

con respecto a la inmunidad de la granja y a la historia de la infección en una población

(Olsen et al., 2013). Es por lo anterior y teniendo en cuenta las ventajas diagnósticas del

qRT-PCR en la detección de infecciones por el PRRSV, que se realizó el presente

estudio, con el fin determinar la actividad viral en tres granjas intensivas del Valle del

Cauca, utilizando muestras de suero, tejidos (pulmón y ganglios), lavados bronco

alveolares y fluido oral durante un periodo de nueve meses.

3.1 Materiales y Métodos

3.1.1 Ubicación geográfica y características de las granjas

El estudio se realizó en tres granjas de tipo intensivo y ciclo completo, ubicadas en el

departamento del Valle del Cauca, localizado en el sur occidente de Colombia, con una

altura de 1400-1600 msnm, una temperatura promedio de 23-24°C y una humedad

relativa del 65% a 75%. Esta zona se caracteriza por una producción porcícola de tipo

intensivo, que presentó en los meses previos al estudio reportes de animales con

sintomatología compatible con PRRS. En la Tabla 3-1 y Figura 3-1, se indican cómo se

encuentran distribuidas cada una de las granjas, su localización y distancia dentro del

departamento. Cabe aclarar, que en Colombia desde el año 2006 no se vacuna contra

PRRS.

Tabla 3-1 Ubicación geográfica de las tres granjas y de los sitios productivos por

granja

GRANJA SITIO 1 Y 2 SITIO 3 DISTANCIA ENTRE SITIOS

1 Cartago Candelaria 175 km

2 La Unión La Unión 1 km

3 Palmira Candelaria 70 km

Figura 3-1 Ubicación geográfica de cada granja dentro del Departamento del Valle

del Cauca

El color rojo indica la ubicación de los sitios 1-2 (Cartago) y 3 (Candelaria) de la granja 1;

el color azul señala la ubicación de los 3 sitios productivos de la granja 2 (La Unión) y el

color amarillo la localización de los sitios 1-2 (Palmira) y 3 (Candelaria) de la granja 3.

3.1.2 Muestras Se tomaron muestras de sueros, fluidos orales (FO), lavados bronquio alveolares (LBA) y

tejidos (pulmón y ganglios). Los sueros empleados se seleccionaron a partir de aquellos

que por ELISA mostraron los resultados positivos más altos (mayor a 0.4) y negativos

más bajos (menor a 0.4), en cada grupo etareo y en cada granja. Las muestras se

seleccionaron de los grupos de madres, reproductores, reemplazos, lactantes, destetos

(20-21 días), preceba (7-9 semanas) y ceba (12-14 semanas y 18-22 semanas). Los FO

se tomaron de la preceba (semana 4-8) y ceba (semana 10- 14, 18 y 22), en cada una de

las tres granjas. Los LBA y los tejidos se obtuvieron a partir de las mortalidades que se

SITIO 1 - 2

SITIO 1 - 2

SITIO 1 – 2 - 3

SITIO 3

SITIO 3

presentaron en los días de muestreo o a través del sacrificio voluntario en cada granja

(proceso aprobado por el Comité de Bioética de la Facultad de Medicina Veterinaria y de

Zootecnia de la Universidad Nacional de Colombia), lo que correspondió a 2 ó 3 animales

durante cada mes. Las muestras se recolectaron a partir de Septiembre de 2012 hasta

Mayo de 2013.

3.1.2.1 Sueros

La muestra de sangre fue colectada mediante venopunción (vena cava), en tubos

individuales (BD Vacutainer). Las muestras fueron centrifugadas a 1000 x g durante 10

minutos y almacenadas a -70°C hasta su posterior procesamiento. Se evaluaron un total

de 355 muestras, en la tabla 3-2, se discrima el número de sueros evaluados dentro de

cada granja.

Tabla 3-2. Sueros procesados por granja durante el tiempo de estudio

Granja Número sueros

1 112

2 81

3 162

Total 355

3.1.2.2 Fluidos Orales (FO)

Estas muestras se obtuvieron mediante el uso de un lazo de algodón suspendido durante

30 minutos en corrales que alojaban entre 20 a 25 animales. Se recolectó la muestra

presionando el lazo dentro de una bolsa y posteriormente el contenido se trasladó a un

tubo de 15 ml, este se mantuvo en refrigeración hasta su ingreso al laboratorio. Las

muestras de fluido fueron centrifugadas a 1000 x g durante 10 minutos, se alicuotaron y

almacenaron a -70°C hasta su procesamiento. Se evaluaron en total 305 muestras, en la

tabla 3-3, se especifica el número de FO procesados por cada granja.

Tabla 3-3. FO procesados por granja durante el tiempo de estudio

Granja Número FO

1 98

2 107

3 100

Total 305

3.1.2.3 Lavado Bronquio alveolar (LBA)

Los LBA se obtuvieron mediante perfusión de la cavidad pulmonar con una solución

salina bufferada (PBS pH 7.2) (Anexo 1). Se cerró la tráquea con un fórceps y se lavaron

los pulmones externamente con agua destilada. Posteriormente, se introdujeron 500-600

ml de solución salina bufferada, se masajearon los pulmones durante 2-3 minutos, al

cabo de los cuales se recuperó el líquido en un frasco estéril, este proceso se repitió 2-3

veces. El líquido obtenido se centrifugó a 500 x g por 10 minutos, resuspendiéndose 2

veces más en la solución de lavado y se almacenó a -70°C hasta su utilización. Se

evaluaron un total de 98 muestras, en la tabla 3-4, se discrimina el numero de LBA

procesados por granja.

Tabla 3-4. LBA procesados por granja durante el tiempo de estudio

Granja Número LBA

1 43

2 19

3 36

Total 98

3.1.2.4 Tejidos

De las mortalidades presentadas, se colectaron muestras de tonsila, pulmón, bazo y

ganglio linfáticos, cada uno de 2x2 cm de diámetro, los cuales se conservaron en bolsas

nazco y en congelación -70°C hasta su utilización. Para el estudio en particular, se

utilizaron únicamente las muestras de pulmón y ganglio, las que se descongelaron,

tomando de cada una 1 g, posteriormente fueron sonicadas durante 1 minuto en un

Ultrasonic homogenizer Cole-Parmer Instruments Co y fueron alicuotadas para su

empleo en las pruebas de RT-qPCR y aislamiento viral. Se evaluaron 205 muestras (103

pulmones y 102 ganglios linfáticos). En la tabla 3-5, se especifica el número de tejidos

evaluados dentro de cada granja.

Tabla 3-5. Tejidos procesados por granja durante el tiempo de estudio

Granja Tejido Número

1

Pulmón 43

Ganglio 45

2

Pulmón 23

Ganglio 17

3

Pulmón 37

Ganglio 40

Total 205

3.1.3 Reacción en Cadena de la Polimerasa en Tiempo real (qRT-

PCR)

3.1.3.1 Virus

Se utilizó la cepa viral PRRS 3P (genotipo americano) Referencia PDV0401, Lote 1,

proveniente del National Veterinary Service Laboratories (NVSL) APHIS-USDA.

3.1.3.2 Extracción ARN viral

La extracción del ARN se realizó con el QIAamp Viral RNA Mini kit (QIAGEN®, Cat. No.

52906). Para la preparación de los reactivos y purificación del ARN viral se siguieron las

instrucciones del productor contenidas en el inserto.

3.1.3.3 Síntesis de ADNc

Se preparó la mezcla maestra utilizando el High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit

(Cat. 4368813). Para un volumen total de 20 µl se utilizaron 2.0 µl de 10X RT buffer, 0.8

µl de 25XdNTP Mix (100Mm), 2.0 µl de 10X RT Random Primers, 1.0 µl de la

transcriptasa reversa Multiscribe RNase Inhibitor, 4.2 µl de agua y 10 µl de ARN. Las

muestras fueron procesadas en un termociclador BIO-RAD, DNA Engine, Peltier Thermal

Cycler. Se emplearon las siguientes condiciones: un ciclo a 25°C por 10 minutos, un ciclo

a 37°C por 120 minutos y un ciclo a 85°C por 5 minutos.

3.1.3.4 Curva Estándar

Para la curva patrón para la qRT-PCR, se empleó la cepa viral VR-2332. Inicialmente, se

realizó una RT-PCR convencional para amplificar una porción del genoma de 197 pb,

ubicada entre el ORF6 y el ORF7. Se empleo el primer forward (AAC CAC GCA TTT

GTC GTC) y reverse (TGG CAC AGC TGA TTG ACT GG), sugeridos por el Doctor

Michael Murtaugh (ICA, 2012). Para un volumen final de 25µl se utilizaron 14.25 µl agua,

2,5 µl de 10X Buffer, 1,25 µl de MgCl, 1,25 µl dNTPS, 1.25 µl de cada primer, 0.25 µl de

taq-pol y 3 µl cDNA. Las muestras se sometieron a las siguientes condiciones : 1 ciclo a

94°C por 5 minutos, 30 ciclos a 94°C por 1 minuto; 57.8°C por 1 minuto; 72°C por 1

minuto; 1 ciclo 72°C por 1 minuto y 4°C por 1 minuto. Una vez se obtuvo un producto de

197 pb, se realizó su purificación a partir de electroforesis en gel de agarosa (1.5%) y

posteriormente, mediante cuantificación (Nanodrop NYXTechnik Iluminyx) se obtuvieron

20.25 ng/µL lo cual correspondió según el programa (www.scienceprimer.com/copy-

number-calculator-for-realtime-pcr) a 9.38 x 1010 número de copias de la secuencia.

Posteriormente, a partir de este producto se realizaron diluciones desde 10-1 hasta 10-10.

Se preparó la mezcla maestra para qPCR. Para un volumen de 20 µl: 7.2 µl agua, 0.4 µl

de cada primer, 10 µl de la SYBR® Green PCR Master Mix (SYBR® Green I Dye,

AmpliTaq Gold® DNA Polymerase, dNTPs con dUTP, Passive Reference y optimized

buffer) y 2 µl del ADNc. La qRT-PCR basada en SYBR Green, fue realizada en un

termociclador Lightcycler 480 II Roche, usando las siguientes condiciones: 1 ciclo de

95°C por 1 minuto, 45 ciclos de 95°C por 3 segundos, 60°C por 30 segundos, 72°C por

30 segundos, 1 ciclo 95°C por 30 segundos y 70°C por 1 minuto, 1 ciclo de 37°C por 10

segundos. Las diluciones se prepararon por duplicado y fueron detectables hasta 10-8. De

acuerdo con la curva estándar (Figura 3.2), los valores de Ct (cycle threshold)

considerados positivos se encontraron entre 15 y 32 (La estandarización de la curva

patrón fue realizada por Mancipe, L.F., datos no publicados).

Figura 3-2 Curva Estándar por qRT-PCR

(Mancipe, 2013)

3.1.4 Análisis estadístico Se realizó un análisis de varianza utilizando el programa SAS, teniendo como fuentes de

variación, granja (1, 2 y 3), grupo etáreo (madres, reproductores, reemplazos, lactantes,

destetos, preceba y ceba) y meses (Septiembre de 2012 a Mayo de 2013). Al

presentarse efectos significativos, se empleó una prueba de comparación múltiple de

Tukey.

3.2 Resultados Con respecto a los resultados estadísticos, en las muestras de suero y FO se obtuvieron

resultados significativos del mes para cada granja y grupo (p<0.05 y p<.0001

respectivamente). Con respecto a los tejidos, en los pulmones, no se presentó efecto

significativo ni interacción (p>0.05). En los resultados de las muestras de ganglios, el

único efecto significativo fue mes (p<.0001) y no se presentaron significancias en las

interacciones (p>0.05). En los LBA, se presento efecto significativo del mes en la granja

1 en los dos grupos etareos (p=0.0026 y p=0.0157) y en la granja 3 grupo 7 (p<.0001).

3.2.1 qRT-PCR en muestras de sueros Se evaluaron en total 355 muestras de sueros, las cuales para su análisis fueron

divididas en dos grupos, las negativas y positivas por ELISA (valor M/P por debajo y por

encima de 0.40 respectivamente). En la figura 3-3 se comparan los resultados obtenidos

teniendo en cuenta todos los grupos etareos en las tres granjas.

Figura 3-3. Resultados obtenidos por qRT-PCR en sueros dentro de cada granja

evaluada

En la figura 3-3, se observa que el promedio de valores Ct encontrados en las tres

granjas estuvo por encima del punto de corte 15-32; sin embargo, las desviaciones

estándar muestran que se encontaron valores dentro del punto de corte o muy próximos

al mismo, lo que indica presencia de genoma viral tanto en muestras de ELISA positivas

como negativas.

3.2.1.1 Granja 1

Se evaluaron 112 muestras de sueros encontrándose 11 (9.82%) positivos por qRT-PCR.

En la figura 3-4, se observa el comportamiento de resultados por qRT-PCR, de acuerdo

al resultado por ELISA y por grupo etareo.

Figura 3-4. Resultados por qRT-PCR en sueros de cada grupo etáreo en la granja 1.

En la granja 1 se encontró que tanto las muestras que fueron positivas como negativas

por ELISA no evidenciaron detección de virus por qRT-PCR. Sin embargo, el grupo ceba

se acercó al limite Ct 15-32.

Figura 3-5. Resultados de qRT-PCR en sueros durante el tiempo en la granja 1.

Los resultados obtenidos en el tiempo para los sueros ELISA positivos y negativos,

indican que no se presentaron Cts por debajo de 32 durante los nueve meses de estudio

y la aproximación al rango de positividad se presentó en el periodo comprendido entre

febrero y mayo.

3.2.1.2 Granja 2

En esta granja, por medio de la técnica de ELISA no se encontraron sueros positivos. Se

evaluaron 81 muestras de suero, de éstas 7 (8.64%) fueron positivas por qRT-PCR. En

la figura 3-6, se observa el comportamiento de estos resultados.

Figura 3-6. Resultados por qRT-PCR en sueros de cada grupo etareo en la granja 2.

En esta granja, el promedio de resultados de los Cts muestran que se encontraban por

encima del punto de corte (Ct 15-32), sin embargo, las desviaciones estándar indican que

en todos los grupos etáreos se encontraron sueros con presencia de genoma viral. Llama

la atencion el hecho que no haya actividad de anticuerpos y se evidencia la presencia del

virus.

Figura 3-7. Resultados de qRT-PCR en sueros durante el tiempo en la granja 2

Teniendo en cuenta el comportamiento en el tiempo, los meses donde se presentaron los

resultados positivos por qRT-PCR en sueros de la granja 2, fueron febrero y abril.

3.2.1.3 Granja 3

Se evaluaron 162 muestras, donde 16 (9.88%), presentaron resultado positivo por qRT-

PCR. En la figura 3-8, se observa el comportamiento de resultados de qRT-PCR, por

grupo etareo.

Figura 3-8. Resultados por qRT-PCR en sueros de cada grupo etareo en la granja

3.

De acuerdo con la figura 3-8, se encontró que en la granja 3 el promedio de resultados Ct

fue negativo a la presencia viral tanto en animales con serología negativa como positiva.

Sin embargo, se puede observar que muestras con serología negativa y qRT-PCR

positivos se presentaron en el grupo de las madres, reproductores, reemplazos (Ct 15-

32). Las muestras positivas por ELISA, se mantuvieron lejos del punto de corte de qRT-

PCR.

Figura 3-9. Resultados de qRT-PCR en sueros durante el tiempo en la granja 3.

En el tiempo, los resultados para la granja tres mostraron positividad a la presencia de

genoma viral en los meses de marzo y abril.

3.2.1.4 Comparación resultados por PCR tiempo real y ELISA

Tabla 3-6 Comparación resultados obtenidos por qRT-PCR y ELISA en sueros en las tres

granjas evaluadas

RESULTADO GRANJA 1 GRANJA 2 GRANJA 3 TOTAL

+PCR +ELISA 1 0 10 11 (3.13%)

+PCR -ELISA 10 7 6 23 (6,6%)

-PCR +ELISA 24 1 85 110 (31.3%)

-PCR -ELISA 77 73 57 207 (59%)

TOTAL 112 81 158 351

De acuerdo con la tabla 3-6, se encontraron todas las posibilidades de asociación entre

resultados positivos y negativos por ELISA con resultados positivos y negativos por qRT-

PCR. El resultado mas frecuente fue la asociación de negatividad en las dos pruebas

(59%); posteriormente la asociación animales positivos por ELISA y negativos por qRT-

PCR con el 31.3%. El 6.6% de las muestras que fueron negativas por ELISA en qRT-

PCR fueron positivas a la presencia viral.

Llama la atención que solamente un 3.13% de las muestras correspondieron a muestras

positivas tanto por ELISA como por qRT-PCR. El comportamiento serológico de las

muestras positivas por qRT-PCR se presentan en la siguiente tabla:

Tabla 3-7. Comportamiento serológico de las muestras positivas por qRT-PCR

GRANJA RESULTADOS qPCR POSITIVOS

SERONEGATIVOS M/P < 0.40

SEROPOSITIVOS M/P > 0.40

1 11 10 1

2 7 7 0

3 16 6 10

TOTAL 34 23 11

Como se observa en la tabla 3-7, en la granja 1 y 2 la mayoría de las muestras positivas

por qRT-PCR tuvieron resultado negativo mediante la técnica serológica, mientras que en

la granja 3, el mayor número de muestras positivas por qRT-PCR presentaron resultados

seropositivos por ELISA.

3.2.2 qRT-PCR en muestras de Fluido oral (FO)

Se evaluaron en total 305 muestras de FO correspondientes a la preceba (105) y ceba

(200) en cada una de las tres granjas evaluadas durante los nueve meses de estudio. En

la figura 3-10, se observan los promedios de resultados (Ct) obtenidos en cada una de

las granjas evaluadas.

Figura 3-10. Resultados por qRT-PCR en fluídos orales en las tres granjas

El promedio de resultados Ct para las tres granjas, se encontró por encima del punto de

corte 15-32, sin embargo las desviaciones estándar mostraron que en las tres granjas

hubo presencia de genoma viral en los fluidos orales. Particularmente en la granja 3 se

encontraron muestras con Ct dentro del punto de corte positivo, indicativo de un alta

carga viral.

3.2.2.1 Granja 1

Se procesaron 98 muestras (34 de preceba y 64 de la ceba). De estas, 19 (19.39%)

fueron positivas a la presencia de genoma viral. En la figura 3-11, se observa el promedio

de resultados Ct en FO dentro de los grupos etareos evaluados.

Figura 3-11. Resultados por qRT-PCR en FO por grupo etáreo en la granja 1.

Se encontró que los promedios de Ct para los dos grupos etáreos evaluados se ubicaron

por encima de 32, pero las desviaciones indicaron la presencia de resultados positivos en

ambos grupos.

Figura 3-12. Resultados por qRT-PCR en FO durante el tiempo en la granja 1.

De acuerdo con la figura 3-12, se observa que la mayor parte de resultados positivos en

FO se encontraron en los meses de octubre, enero, marzo y abril, para ambos grupos

etareos.

3.2.2.2 Granja 2

Se evaluaron 107 muestras de FO (38 de preceba y 69 de la ceba ). De estas, 13

(12.15%) mostraron un Ct cercano al punto de corte. En la figura 3-13, se observa el

promedio de resultados dentro de los grupos etáreos evaluados.

Figura 3-13. Resultados por qRT-PCR en FO por grupo etáreo en la granja 2.

Los promedios de resultados se encontraron por encima de 32, sin embargo dentro de

cada grupo etáreo se encontraron muestras donde se detectó ácido nucleíco de PRRSV.

Figura 3-14. Resultados en el tiempo por qRT-PCR en muestras de FO en la granja

2

Con respecto al comportamiento del promedio de resultados en el tiempo, se encontró

que los meses con mayor número de positivos fueron octubre y marzo, para ambos

grupos etareos.

3.2.2.3 Granja 3 En la granja 3 se evaluaron 100 muestras de FO (33 preceba y 67 de ceba), De estas,

24 (24%) fueron positivas por qRT-PCR. En la figura 3-15 se observa el promedio de

resultados dentro de los grupos etáreos evaluados.

Figura 3-15. Resultados por qRT-PCR en FO por grupo etáreo en la granja 3

Los promedios de resultados obtenidos por qRT-PCR en FO en la granja 3 se

encontraron por encima del Ct 15-32, sin embargo las desviaciones indican la presencia

de muestras positivas en los dos grupos evaluados, especialmente en la ceba.

Figura 3-16. Resultados por RT-PCR en muestras de FO en los grupos etáreos

evaluados en la granja 3.

Los meses donde se presentó el mayor número de resultados positivos en la preceba

correspondió a noviembre, febrero, marzo y abril; mientras que para la ceba fue

noviembre, marzo, abril y mayo.

3.2.3 RT-qPCR en muestras de pulmón y ganglio linfático

Se evaluaron un total de 205 muestras correspondientes a 103 muestras de pulmón y

102 de ganglio linfático, obtenidas de la preceba y ceba en cada una de las tres granjas,

durante los nueve meses de desarrollo del estudio. En la figura 3-17, se observan los

promedios de resultados (Ct) obtenidos en cada una de las granjas evaluadas,

discriminando los tipos de tejidos evaluados.

Figura 3-17. Resultados por qRT-PCR en tejidos en las tres granjas evaluadas

De acuerdo con los promedios de los Ct obtenidos en cada tejido evaluado, se encontró

que estos tenían un Ct por encima de punto de corte positivo, sin embargo las

desviaciones estándar indican que hay muestras positivas en las tres granjas tanto en

pulmón como en gánglio linfático.

3.2.3.1 Granja 1

En la granja 1, se evaluaron 88 muestras de tejidos incluyendo 43 pulmones y 45

ganglios. El porcentaje de positividad fue del 13.95% para pulmón y 13.33% para ganglio

por qRT-PCR. En la figura 3-18, se observa el promedio de resultados en tejidos dentro

de los grupos etareos evaluados.

Figura 3-18. Resultados por qRT-PCR en tejidos por grupo etareo en la granja 1.

Los resultados promedios para los dos grupos etáreos se encontraron por fuera del limite

de positividad. Las desviaciones muestran que para los dos grupos se encontró

positividad, particularmente cuando se evaluaron pulmones.

Figura 3-19. Resultados por qRT-PCR en tejidos a través del tiempo en (A) preceba

y (B) ceba en la granja 1.

De acuerdo con los promedios de Ct obtenidos en el transcurso del tiempo en la preceba,

se observó la presentación de resultados positivos en muestras de pulmón en

septiembre, diciembre y febrero. En ganglios linfáticos no se encontró positividad para

presencia de genoma de PRRV. Con respecto a la ceba, el mayor número de resultados

positivos en pulmón se presentaron en el mes diciembre y enero, mientras que en

ganglios el genoma viral se encontró en el mes de abril. La alta respuesta de las

muestras de pulmón durante el mes de octubre, coincidió primordialmente con una alta

variación dentro de los valores de los resultados durante este mes.

3.2.3.2 Granja 2

En esta granja se evaluaron 40 muestras en total, 23 muestras de pulmón y 17 de

ganglio. El porcentaje de positividad fue del 4.4% para pulmón y del 11.8% para ganglio,

por qRT-PCR. En la figura 3-20, se observa el promedio de resultados en tejidos dentro

de los dos grupos etáreos evaluados.

(A) (B)

Figura 3-20. Resultados por qRT-PCR en tejidos por grupo etáreo en la granja 2.

De acuerdo con la figura anterior, se evidenció que los promedios de resultados se

encontraron por encima del rango Ct (15-32) y las desviaciones estándar no muestran

que hayan muestras de tejido que entren en el rango de positividad. En el tiempo, el

comportamiento ratificó ausencia de genoma viral en éstos tejidos durante el estudio.

Figura 3-21. Resultados por qRT-PCR en tejidos a través del tiempo en (A) preceba

y (B) ceba en la granja 1.

3.2.3.3 Granja 3

Se analizaron 77 muestras correspondientes a 37 pulmones y 40 ganglios. El porcentaje

de positividad correspondió al 13.51% para pulmones y 12.5% para ganglios por qRT-

PCR. En la figura 3-21, se observa el promedio de resultados en tejidos dentro de los

grupos etáreos evaluados.

(A) (B)

Figura 3-22. Resultados por qRT-PCR en tejidos por grupo etáreo en la granja 3.

Se encontró que la preceba presentó resultados dentro del rango de Ct positivo, tanto en

pulmones como en ganglios. En la ceba las muestras positivas correspondieron a los

ganglios linfáticos.

Figura 3-23. Resultados por qRT-PCR en tejidos a través del tiempo en (A) preceba

y (B) ceba de la granja 3.

Se encontró en la preceba la presencia de genoma de PRRSV en muestras de pulmón

en los meses de octubre, noviembre, febrero y mayo. Las muestras de ganglios positivas

se identificaron en abril. Para el caso de la ceba, se encontraron muestras positivas en

abril para los ganglios, mientras las muestras de pulmón permanecieron fuera del rango

positivo.

3.2.4 qRT-PCR en lavado bronquioalveolar (LBA)

Se evaluaron un total de 98 muestras de lavado bronquio alveolar en la preceba y ceba

dentro de las tres granjas durante los nueve meses de estudio. En la figura 3-24, se

(A) (B)

observan los promedios de resultados (Ct) obtenidos en cada una de las granjas

evaluadas.

Figura 3-24. Resultados por qRT-PCR en LBA para las tres granjas evaluadas

Para los LBA se encontraron resultados promedios por encima del rango de positividad

Ct (15-32) y las desviaciones muestran que hubo pocos resultados dentro del rango de

Ct positivo, en cada granja.

3.2.4.1 Granja 1

Se evaluaron 43 muestras, donde se encontró un porcentaje de positividad del 18.60%

(8) por qRT-PCR. En la figura 3-25, se observa el promedio de resultados en LBA dentro

de los dos grupos etáreos evaluados.

Figura 3-25. Resultados por RT-PCR en LBA por grupo etareo en la granja 1.

Con respecto a los promedios de resultados en la granja 1, se observa que se

encontraron por encima del rango de Ct positivo.

Figura 3-26. Resultados por qRT-PCR en LBA a través del tiempo en la granja 1.

Con respecto al comportamiento de los resultados en el tiempo se observa en la preceba

mayor número de positivos en septiembre y diciembre. La ceba presentó resultados

positivos en noviembre y diciembre.

3.2.4.2 Granja 2

Se evaluaron 19 muestras. En la figura 3-27, se observa el promedio de resultados en los

LBA dentro de los grupos etáreos evaluados.

Figura 3-27. Resultados por qRT-PCR en LBA por grupo etáreo en la granja 2

Se encontró que los promedios de los Ct en los grupos etáreos evaluados, se localizaron

por encima del rango de positividad. No se presentaron resultados positivos en LBA para

esta granja en ningún momento del estudio.

3.2.4.3 Granja 3

Se analizaron 36 muestras, donde 4 muestras (11.11%) fueron positivas. En la figura 3-

28 se observa el promedio de resultados en LBA dentro de los grupos etareos evaluados.

Figura 3-28. Resultados por qRT-PCR en LBA por grupo etareo en la granja 3.

Los promedios de Ct se encontraron por encima del rango del Ct positivo, al igual que las

desviaciones estándar. Sin embargo hubo muestras positivas tanto en la preceba como

en la ceba.

Figura 3-29. Resultados por qRT-PCR de LBA a través del tiempo en la granja 3.

Se encontró en la preceba presencia de genoma de PRRSV en diciembre, mientras que

para la ceba se encontaron en noviembre y mayo.

3.3 Discusión

Al comparar los resultados de las muestras de sueros de las tres granjas procesadas por

qRT-PCR (Figura 3-3) y dividendo las muestras con base en los resultados obtenidos por

ELISA fuesen positivos o negativos, se encontraron varias posibilidades de resultado

(Tabla 3-6). Uno de ellos fue la presencia de anticuerpos sin detección viral, lo cual

puede indicar que el periodo de viremia fue superado, se produjo una respuesta inmune

efectiva (particularmente de tipo humoral) y posiblemente el virus se localizó en tejidos,

tal y como se observa en la Figura 3-17, donde se determinó la presencia de genoma

viral tanto en pulmón como ganglio, en las tres granjas.

De otro lado, una infección típica por PRRSV se caracteriza por un estado inicial de

viremia aguda que permanece aproximadamente 4 semanas, seguida por un estado

donde alcanza niveles indetectables (Islam et al., 2013). La seropositividad en los

animales puede ser producto de una infección antigua si se tiene en cuenta el tiempo de

persistencia de los anticuerpos antiPRRSV en un animal. Estos son detectables por

ELISA entre los 9 a 13 días PI (Yoon et al., 1995, citado por Evans et al., 2008) y decaen

en el tiempo pudiendo persistir hasta por 28 meses (Desrosiers and Boutin, 2002).

También se sabe que muchos cerdos liberan el virus durante 3 a 4 meses pos exposición

(Wills et al., 2003) así, los animales seropositivos al PRRSV, pueden ser negativos a la

presencia del virus y en consecuencia la seropositividad es indicativa de una infección

pasada (Evans et al., 2008). Al no haber evidencia de la presencia de genoma viral en

las muestras que por ELISA fueron positivas se puede afirmar que no hay animales en

estado de viremia y que la respuesta humoral no se puede asociar con presencia activa

de enfermedad.

Otra posibilidad de respuesta encontrada, fue la presencia de virus en sueros que por

ELISA fueron negativos. Mediante PCR, la viremia puede ser detectada desde el día 1

hasta la semana 4 o 5 PI (Wasilk et al., 2004), aunque la presencia de estos resultados

positivos por PCR no indican necesariamente la presencia de virus viable (Wills et al.,

2003).

Al respecto de la viremia en diferentes grupos, Boddicker et al (2012), al desafiar cerdos

con una cepa altamente virulenta, demostraron sustanciales diferencias entre los perfiles

virémicos individuales y totales, clasificando los animales en dos categorías (non-

rebounders y rebounders) de acuerdo con los perfiles virales en suero. Esto lleva a

especular en el presente estudio, que algunos animales al momento de tomar la muestra

no presentaban viremia, pero días más tarde pudieron diseminar virus infeccioso y

presentar posiblemente resultados positivos a la prueba de qRT-PCR. Lo anterior se

explica ya que cerdos expuestos al PRRSV presentan una prolongada viremia donde

luego de una inicial remoción del PRRSV en la sangre, la viremia periódicamente re-

aparece con los tejidos linfoides como el sitio primario de replicación (Chand et al., 2012).

Lo anterior, en el caso del presente estudio, implicaría que las viremias detectadas no

corresponderían únicamente al producto de una infección temprana, si no a un estado de

infeccion persistente.

En un estudio llevado a cabo por Martínez et al (2008), encontraron por RT-qPCR -

SYBR Green, la detección temprana del PRRSV en suero a los 2 días PI. Chai et al

(2013) por su parte, reportaron que la tasa de detección de positivos por qRT-PCR-SYBR

Green fue mucho más alta que la obtenida con la PCR convencional. Teniendo en

cuenta lo anterior y los resultados obtenidos en el presente estudio en sueros, donde se

utilizo qRT-PCR-SYBR Green, se estableció la presencia de viremia y por lo tanto, la

posibilidad de una infección temprana dentro de los grupos etareos en las tres granjas

evaluadas al igual que la posible presencia de virus en bajas cantidades, que podría no

ser infeccioso (Figura 3-4, 3-6 y 3-8).

Al analizar la presencia de virus en los reemplazos y madres, se puede especular que

esta se encuentra relacionada ya sea con la introducción de una nueva cepa viral o con

la posible presencia de animales persistentemente infectados. En el caso de los

reemplazos, estos pudieron ingresar infectados a la granja o fueron expuestos a la cepa

viral circulante mediante las practicas de manejo tradicionales como el uso de placentas

de animales enfermos. Es importante tener en cuenta que dentro de las granjas el virus

se mantiene endémico por medio de un ciclo de transmisión de animales portadores a

susceptibles a través de nacimientos o compra de los mismos (Horter et al., 2002). En

cuanto a las madres, la viremia en éstas, puede llevar a la replicación del PRRSV en el

endometrio con la subsecuente infección fetal a través de la placenta (Karniychuk and

Nauwynck, 2013). A su vez, las madres seropositivas pueden transmitir anticuerpos

maternos a sus camadas vía calostro, sin embargo, cuando la inmunidad pasiva declina

puede llevar a infección luego del destete cuando los animales son mezclados (OIE,

2008) como se observó en este caso en la preceba y posteriormente en la ceba. De otro

lado, las cerdas que se infectan en la fase final de la gestación pueden infectar a sus

crías de manera transplacentaria lo cual propicia el nacimiento de animales

persistentemente infectados; de igual manera el PRRSV, puede ser eliminado a través

del calostro y la leche (Wagstrom et al., 2000), favoreciendo así la diseminación, lo cual

fue evidente en los resultados positivos obtenidos en destetos y lactantes de este

estudio.

Los resultados positivos obtenidos en la preceba y la ceba dentro de las tres granjas,

indican la circulación del virus dentro de las mismas, aun sin la presencia de signos

clínicos, por lo anterior, la técnica de RT-PCR tiene ventajas para determinar la presencia

de dicha circulación viral (Duinhof et al., 2011).

Teniendo en cuenta la presencia de diferentes sitios productivos (Tabla y Figura 3-1) que

implicaba desplazamientos entre diferentes municipios, se puede inferir que algunos

animales previamente infectados o en estado virémico, al ingresar al sitio 3, evidenciaron

la enfermedad, esto como parte del traslado y las condiciones de estrés asociadas con el

mismo. La diseminación del PRRSV entre granjas es causada por la introducción de

animales infectados o por el uso de semen contaminado, mientras que la diseminación

dentro de las granjas es debida principalmente al movimiento entre corrales de animales

portadores o infectados o cuando los cerdos son mezclados durante los diferentes

periodos de producción (Kittawornrat et al., 2011).

Evans et al. (2008) y Zimmerman et al. (2006) caracterizaron la diseminación del PRRSV

dentro de las granjas bajo dos diferentes patrones: el primero donde al menos el 90 % de

los animales destetos son infectados a las 8.5 semanas de edad y el segundo donde,

entre el 20 al 40%, son infectados entre las 10 a 12 semanas de edad. Lo anterior

confirma los hallazgos obtenidos en el presente estudio donde los grupos de los

destetos, preceba y la ceba presentaron resultados positivos . Por otro lado, en un

estudio llevado a cabo en 10 granjas porcícolas en Holanda, se encontró que los grupos

con edades entre 9 a 16 semanas presentaron el más alto Odds Ratio (posibilidad que

una condición o enfermedad se presente en un grupo de población frente al riesgo de

que ocurra en otro), indicando a su vez que estos grupos son los más adecuados para la

detección de la circulación de PRRSV por RT-PCR (Duinhof et al., 2011).

Los meses de mayor presentación de resultados positivos en este estudio fueron febrero,

marzo y abril, lo que pudo coincidir con el movimiento de animales destetos o al traslado

al sitio 3 donde se presentaba la mezcla de animales infectados con animales

susceptibles. De igual manera, hacia el mes de abril se presentan normalmente cambios

climáticos en la zona tropical (incremento de lluvias) que posiblemente podrían estar

relacionados con la diseminación de patógenos en esta zona. Los anteriores hallazgos

coinciden con los obtenidos en el análisis de varianza donde se encontró un efecto

significativo del mes para cada granja y grupo etareo, donde la situación de bioseguridad

y manejo propia de cada granja se ve reflejada en los resultados obtenidos en los

diferentes grupos etareos y a su vez en los meses de mayor presentación de positivos.

Con respecto a las muestras de FO (Figura 3-10), las tres granjas presentaron resultados

dentro del punto de corte (15-32). Estos resultados indican la presencia de uno o más

animales infectados dentro de las diferentes poblaciones muestreadas, preceba y ceba,

lo cual confirma la circulación del PRRSV dentro de las granjas. A este respecto, en un

estudio llevado a cabo por Ramírez et al (2012) quienes realizaron vigilancia

epidemiológica en poblaciones porcinas usando FO, observaron mediante muestreos

consecutivos en el tiempo, que el estado sanitario dentro de los establos era muy

variable incluso entre establos en un mismo sistema productivo, como se observa en el

presente estudio.

En la infección temprana, la cantidad de virus en el FO es menor que en sangre, mientras

que en las etapas posteriores de viremia se encuentra más virus en el FO (Kittawornrat et

al., 2010). Esto puede sugerir que algunos de los animales con resultados de FO

positivos por qRT-PCR, presentaban una infección con PRRSV más avanzada,

pudiéndose encontrar igualmente dentro de las granjas, grupos de animales virémicos y

otros diseminando virus por medio de FO. Los datos obtenidos en un estudio reportado

por Kittawornrat et al (2014), donde evaluaron muestras de FO en el pre destete,

indicaron el estado endémico de la enfermedad, la cual involucra infección subclínica en

lactantes con la posterior transmisión a la población en crecimiento que ocurre cuando

son trasladados o mezclados después del destete. Con respecto a estas observaciones,

es posible especular que los grupos de lactantes y destetos evaluados en el estudio del

Valle, pudieron presentar resultados positivos al qRT-PCR en FO, favoreciendo la

circulación viral y explicando los resultados positivos en la preceba y ceba.

Los fluidos orales en forma inherente contienen factores endógenos antivirales y

antibacteriales que pueden afectar la estabilidad de los blancos de la PCR (Prickett et al.,

2010), sin embargo los virus RNA son relativamente resistentes a la degradación en

fluidos orales y el adecuado manejo de la muestra como el almacenamiento a -70°C

mantiene la integridad del genoma del PRRSV, tal como se realizó en el presente

estudio.

Los meses en los cuales se presentaron los resultados positivos para FO fueron octubre,

noviembre, abril y marzo, correspondiendo al inicio y al final del estudio lo que pudo

coincidir con el traslado de los animales al sitio 3 donde se obtuvo la mayor cantidad de

resultados positivos; a los cambios en el clima asociados con el comienzo de épocas de

lluvia y a la salida de animales para comercialización. Tal como se observó en los

hallazgos del análisis de varizanza, se presentó un efecto significativo del mes para cada

granja y grupo etáreo en estas muestras.

Las muestras de tejidos, como ya se mencionó, se tomaron de las mortalidades y de los

sacrificios de animales enfermos, si se tiene en cuenta que el origen de las muestras de

tejidos proceden de la preceba y ceba, se confirma la circulación del PRRSV dentro de

las granjas. Sin embargo, se observaron diferencias con respecto a los promedios de Ct

por granja, lo cual puede estar asociado a las diferencias de manejo, bioseguridad y al

desplazamiento entre sitios.

La detección del PRRSV en pulmón se presume asociada con la replicación del virus en

los MAPs durante la fase aguda de infección tal como se observa en la figura 3-17,

donde aunque los Ct se encontraron por encima del punto de corte, las desviaciones

indicaron presencia de genoma viral en pulmón en la granja 1, 3 y en mayor proporción

en la preceba. La cantidad de PRRSV en animales infectados, alcanza un máximo en

pulmón y sangre ente los 5 a 9 días PI y luego declina. En el pulmón la infección declina

hacia el día 20 PI, aunque el virus puede ser aislado de fluidos pulmonares por periodos

extendidos de tiempo (Johnson et al., 2004). Posterior a esta fase aguda de infección,

continua un período de persistencia viral en nódulos linfoides en un proceso que

involucra replicación. Los sitios primarios de persistencia incluyen tonsila y nódulos

linfáticos (Horter et al., 2002: Xiao et al., 2004). Se ha reportado PRRSV en tonsilas y

nódulos linfáticos hacia los 132 días después del nacimiento, en cerdos infectados in

útero (Rowland et al., 2003) y desde los 105 a 157 días en cerdos jóvenes PI (Horter et

al., 2002).

De acuerdo con los resultados obtenidos, se comprobó la presencia del virus a nivel

pulmonar lo cual pudo estar relacionado con el posible comienzo de la infección en la

preceba y ceba. A su vez, se presentaron resultados positivos en ganglios lo cual podría

corresponder a la presencia de animales persistentemente infectados en estos sitios

productivos. De acuerdo con lo observado en la figura 3-17, las granjas 1 y 3 presentaron

la presencia de genoma viral en pulmón y ganglio lo cual podría indicar, la presencia de

una posible persistencia y/o infección dentro de las mismas; por su parte la granja 2

evidenció presencia de virus en pulmón, indicando posiblemente la presencia únicamente

de infección. Lo anterior puede deberse a los efectos de los diferentes tipos de manejo

en cada una de las granjas.

Se observaron resultados positivos en las muestras de pulmón en diferentes meses del

estudio lo cual, teniendo en cuenta los resultados del análisis de varianza, indican que no

se presentó un efecto significativo del mes para cada granja y grupo etáreo analizado.

Con respecto a la respuesta de los ganglios, la positividad se evidenció principalmente

hacia abril en las tres granjas y al tener en cuenta el análisis de varianza el único efecto

significativo fue mes sin otras interacciones significativas entre los demas factores, granja

y grupo etáreo. Con respecto a lo anterior, lo que se evidencia en las muestras de tejidos

es que el mes donde se presentaron los resultados no tiene efecto sobre los resultados

obtenidos en cada una de las granjas y las interacciones obtenidas no son tan

significativas como aquellas observadas en los sueros y FO, quizá por que las muestras

de tejidos no fueron representativas en cada una de las granjas y tampoco dentro de

cada uno de los grupos etáreos presentes.

Con relación a los lavados bronquio alveolares, las tres granjas presentaron un promedio

de Ct fuera del punto de corte, donde la granja 2 fue negativa para detección viral en esta

muestra. Las desviaciones estuvieron muy cerca del punto de corte en granja 1 y 3

(figura 3-25 y 3-28). Las muestras positivas se hallaron hacia final del año en noviembre

y diciembre (Figura 3-29), lo cual pudo estar relacionado con el transporte hacia el sitio 3

o ceba para su comercialización durante el fin de año, por lo tanto, los animales podrían

estar comenzando la infección o encontrarse en la fase de persistencia. Estos hallazgos

coincidieron con los obtenidos en el correspondiente análisis estadistico, donde se

presentó un efecto significativo del mes en la granja 1, tanto para preceba como para

ceba y en la granja 3 específicamente en la ceba.

Es evidente, con relación a los diferentes tipos de muestras y técnicas, las diferencias

encontradas con cada una de ellas. A nivel serológico, es posible evidenciar que

resultados negativos por si solos no indican que la granja no presenta circulación viral, a

su vez, resultados positivos pueden estar indicando una antigua infeccion, por tal razón

es necesario usar técnicas conjuntas como ELISA con RT-PCR para conocer la

dinámica de la infección por el PRRSV. Con respecto al FO, esta es una muestra

representativa, fácil de obtener y que permite conocer la situación sanitaria de una

población, que en el caso del presente estudio permitió determinar la presencia del virus

principalmente en la preceba y ceba en las granjas 1 y 3, las cuales a su vez mostraron

condiciones de manejo similares. La presencia de virus en las muestras de tejidos y LBA,

permitió evidenciar diferentes fases de infeción en cada una de las granjas. Por lo

anterior, un programa de control podría establecerse inicialmente con la toma rutinaria de

muestras de FO para monitorear primordialmente poblaciones de destetos, preceba y

ceba por qRT-PCR. Los tejidos a partir de las mortalidades, sacrificios de animales

enfermos o colas, permitirían conocer el estado de infección en que se encuentra la

granja, ya sea en el inicio de la enfermedad o en la fase de persistencia, por tal razón

tanto el pulmón como los ganglios son muestras que permiten orientar el estado de

infección en el cual se encuentra una población dentro de una explotación. Con respecto

a los sueros, se podrían analizar rutinariamente los correspondientes a las madres,

reproductores, reemplazos, lactantes, de igual manera serían útiles para monitorear la

población en general cuando ya se han tomado diferentes medidas de bioseguridad y de

manejo, o cuando se han obtenido resultados positivos en FO y tejidos.

3.4 Conclusiones Es necesario el uso conjunto de técnicas serológicas y moleculares en el diagnóstico de

PRRSV, ya que la evaluación de cada una permite conocer la fase de infección en la cual

se encuentra el virus en una explotación. Por otro lado, las tres granjas evaluadas en

este estudio presentaron resultados positivos por qRT-PCR en diferentes tipos de

muestras lo que demostró la presencia del PRRSV en diferentes estados de la

enfermedad, donde los grupos más afectados fueron la preceba y ceba confirmando la

circulación del virus dentro de cada granja. La detección de ARN en tejidos como pulmón

y ganglios linfáticos indicaron a su vez la presencia tanto de animales virémicos, como

persistentemente infectados dentro de los grupos productivos. Los diferentes tipos de

muestras analizadas pueden ser utilizadas en las diferentes fases de un programa de

control del PRRSV.

3.5 Recomendaciones Utilizar las técnicas moleculares junto con pruebas serológicas que permitan reflejar las

diferentes fases de la infección y permitan conocer la dinámica del virus en una población

con el fin de tomar las acciones de control adecuadas.

Se recomienda hacer uso de los diferentes tipos de muestras como FO para monitoreo

rutinario de los grupos productivos de la preceba y ceba especialmente por qRT-PCR; los

tejidos como pulmón y ganglios de las mortalidades o animales enfermos o colas, que

permiten orientar el estado de infección en el cual se encuentra una población dentro de

una granja. Por otro lado, los sueros permiten monitorear las madres, reemplazos,

reproductores y lactantes, o la población total cuando se han establecido diferentes

medidas de manejo y bioseguridad o en el caso de obtenerse resultados positivos en FO

y/o tejidos.

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Detección y determinación genotípica del

virus del Síndrome Reproductivo y

Respiratorio Porcino (PRRSV) mediante

aislamiento en células MA - 104 y

secuenciación de muestras provenientes de

tres granjas del Valle del Cauca.

Resumen En Colombia a finales de los años noventa, se realizó un estudio para determinar el

genotipo al cual correspondían las cepas circulantes en granjas intensivas y extensivas

del país, los resultados indicaron que estas pertenecían al genotipo americano, al mismo

tiempo se obtuvieron aislados en MAPs y células MARC 145, lo cual demostró la

capacidad de recuperación del virus en diferentes regiones y sistemas de producción. El

presente estudio buscó aislar las cepas actualmente circulantes en tres granjas de una

zona de alta produción porcícola en el país y con condiciones de manejo y bioseguridad

diferentes. Para lo anterior se tomaron muestras de sueros, tejidos y lavados

bronquioalveolares. De igual manera se intentó aislar el virus en estas muestras

utilizando la línea celular MA104. Los resultados obtenidos confirmaron que las cepas

aisladas en estas granjas correspondían al genotipo americano, sin embargo estos

estudios deben ser realizados frecuentemente para determinar las variaciones de las

cepas existentes. De igual manera aunque la línea celular utilizada fue susceptible al

PRRSV, es conveniente utilizar adicionalmente otro tipo celular, para aislar

eficientemente cepas de campo.

Palabras clave: Análisis filogenético, PRRSV, Secuenciación.

Abstract

In Colombia at the end of the 1990s, a study was conducted to determine the PRRSV

genotype circulating in intensive and extensive farms of the country. Results indicated

that isolated strains obtained on MAPs and MARC 145 cells belonged to the American

genotype, which showed resilience of the virus in different regions and production

systems. The goal of the present study was to isolate viral strains currently circulating

within three farms with different management and biosecurity conditions in an area of high

pig production in Colombia. Samples of tissues and broncho alveolar lavages were

employed to try viral isolation on MA104 cells. Them Results confirmed that strains

isolated in these farms corresponded to the American genotype, however these kind of

studies must be performed frequently to determine variations on existing strains. In the

same way, although the cell line employed is susceptible to the PRRSV infection it is

convenient to use another cell types as primary culture of pulmonary macrophages to

obtain a more efficient system to isolate PRRSV field strains.

Keywords: Phylogenetic analyses, PRRSV, Sequencing

Introducción

El Síndrome Reproductivo y Respiratorio Porcino (PRRS) es una enfermedad que afecta

a la especie porcina alrededor del mundo ocasionando significativas pérdidas

económicas (Neumann et al., 2005). Las manifestaciones clínicas de la enfermedad

incluyen fallas reproductivas caracterizadas por presencia de abortos, mortinatos y

momificaciones, como alteraciones respiratorias asociadas a neumonía intersticial linfo-

mononuclear (Rossow et al., 1994).

El virus del PRRS pertenece a la familia Arteriviridae, orden Nidovirales que incluye el

virus de la Arteritis Equina (EAV), el virus Elevador de la Deshidrogenasa Láctica del

Ratón (LDV) y el virus de la Fiebre Hemorrágica del Simio (SHFV) (Conzelman et al.,

1993). El PRRSV fue identificado a finales de los años ochenta, simultáneamente en

Europa (Wensvoort et al., 1991) y en los Estados Unidos (Benfield et al., 1992), desde

entonces las diferencias genómicas y antigénicas han llevado a distinguir dos diferentes

genotipos, el Europeo o tipo I (cepa Lelystad) y el Americano o tipo II (cepa VR-2332)

(Meng et al.,1995). Los dos genotipos comparten alrededor del 70% de identidad a nivel

de nucleótidos (Allende et al., 2000) y 50-80% de similaridad entre aminoácidos

(Forsberg, 2005). El genotipo II ha sido rutinariamente aislado en células de simio MA-

104 y su subclon MARC-145 mientras que el genotipo I ha presentado dificultades para

adaptarse a estas células (Murtaugh et al., 2010). Con respecto a la presentación clínica,

el tipo I se ha caracterizado por causar enfermedad reproductiva en el último tercio de la

gestación, mientras que el II causa enfermedad tanto reproductiva como respiratoria. Las

formas más virulentas se han observado en las cepas del genotipo II y la mayor

diversidad genética se presenta en el genotipo I (Stadejek et al., 2006, 2008). La

divergencia no solo se presenta entre los dos genotipos, los aislados individuales de

PRRSV y los subtipos dentro de cada genotipo puede variar aproximadamente en un

20% a nivel de nucleótidos (Han et al.,2006), por ejemplo variantes de PRRSV tipo I

(subtipos 2, 3 y 4) identificadas en el oriente de Europa (Stadejek et al., 2006, 2002) son

más virulentas que el subtipo I, debido probablemente a un aumento en la actividad de

citoquinas en el huésped (Morgan et al., 2013; Weesendorp et al., 2013). Una

manifestación importante de la variabilidad genómica del PRRSV, especialmente dentro

de las poblaciones de cerdos que albergan múltiples genotipos circulantes, es la

diversidad antigénica resultante (Liao et al., 2013).

El genoma viral es lineal, ARN de cadena sencilla y polaridad positiva, con una

estructura CAP en el extremo 5´y un tallo poly (A) en el extremo 3´. Posee al menos diez

fragmentos de lectura abierta (ORFs) (Johnson et al., 2011; Firth et al., 2011). Los

primeros ORF´s (ORF1a y ORF1b) codifican poli-proteínas no estructurales relacionadas

con la transcripción y replicación del genoma (Snijder and Meulenberg., 2001). Las

proteínas estructurales codificadas en ORF2 a ORF7 son expresadas a partir de seis

RNAm que presentan estructuras CAP y son poliadenilados. La mayor proteína de la

cubierta es la glicoproteína GP5 codificada por ORF5 del genoma viral (Mardassi et al.,

1995; Meulenberg et al., 2000).

El PRRSV se caracteriza por su inestabilidad genética en ciertos segmentos del genoma;

las secuencias de nucleótidos cambian frecuentemente debido a puntos de mutación,

deleciones, inserciones o recombinaciones. El ORF5 es usado para diferenciar el

PRRSV, ya que esta porción de la cubierta del virus se expone tanto al sistema inmune

como a la presión del medio y permite así diferenciar aquellas cepas que mantienen su

proceso replicativo de otras cepas o de otros patógenos (Dee et al., 2001; Chang et al.,

2002). De igual manera la diversidad genética que muestra el gen ORF5, es utilizado

como blanco principal en secuenciación del PRRSV permitiendo diferenciar aislados de

campo de aislados vacunales (Murtaugh, 2012).

El PRRSV infecta in vivo células de la línea macrófago-monocito en particular

macrófagos alveolares porcinos (MAPs); in vitro, el virus ha sido aislado en cultivos

primarios de MAPs y líneas celulares inmortalizadas como MARC-145 y CL2621

(subclones de MA-104 línea celular de riñón de mono) (Bautista et al., 1993; Kim et al.,

1993; Mengeling et al., 1996). El PRRSV se une a las células blanco mediante la

interacción entre la glicoproteína viral GP5 y la sialodhesina porcina, mientras que la

internalización y decapsidación requieren la presencia del trímero formado por las

proteínas GP2, GP3 y GP4 que interactúan con el CD163 del huésped (Lu et al., 2014).

En Colombia entre los años de 1997 y 1999 se realizaron aislamientos del PRRSV a

partir de muestras de sueros y pulmones en células MARC-145; se obtuvieron un total de

45 aislamientos, de los cuales 24 correspondieron a animales confinados y 9 a no

confinados; 14 aislamientos se obtuvieron de muestras de sueros provenientes de

animales con edades entre 6-8 semanas. A su vez se realizaron análisis filogenéticos

que demostraron que en ese momento las cepas circulantes en el país correspondían al

genotipo Americano (Mogollón et al., 2003).

Debido al tiempo transcurrido desde la realización de dichos aislamientos y análisis

filogenético, se estableció la realización de este estudio con el fin de aislar las cepas del

PRRSV circulantes en tres granjas ubicadas en el Valle del Cauca, con el fin de

determinar posteriormente mediante secuenciación el genotipo predominante dentro de

cada una de ellas y asÍ confirmar los hallazgos obtenidos previamente.

4.1 Materiales y Métodos

4.1.1 Ubicación geográfica y características de las granjas

El estudio se realizó en tres granjas de tipo intensivo y ciclo completo, ubicadas en el

Departamento del Valle del Cauca, localizado en el sur occidente del país con una altura

de 1400-1600 msnm, una temperatura promedio de 23-24°C y una humedad relativa del

65% a 75% (Figura 2-1). Esta zona se caracteriza por una producción porcícola de tipo

intensivo, que presento en los meses previos al estudio reportes de animales con

sintomatología compatible con PRRS.

4.1.2 Muestras Las muestras utilizadas fueron tejidos (pulmón - ganglios) y lavados bronquioalveolares;

estos se obtuvieron a partir de las mortalidades que se presentaron en los días de

muestreo o a través del sacrificio voluntario en cada granja. Este procedimiento fue

avalado por el Comité de Bioética de la Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia

de la Universidad Nacional de Colombia. Se tomaron muestras de 2 o 3 animales en

cada mes durante la duración del estudio. Las muestras se recolectaron a partir de

Septiembre de 2012 hasta Mayo de 2013.

4.1.2.1 Lavados Bronquioalveolares (LBA)

Las muestras de LBA se obtuvieron por perfusión de la cavidad pulmonar mediante

lavado bronco alveolar con un Buffer Fosfato Salino (PBS) pH 7.2+/-0.2 (Anexo 1), más

solución de penicilina-estreptomicina (PEST) (Anexo 2). Una vez expuesta la cavidad

torácica, se cerró la tráquea con un fórceps y los pulmones se lavaron externamente con

agua destilada. Posteriormente, se introdujeron 500-600 ml de solución salina, se

frotaron los pulmones durante 2-3 minutos al cabo de los cuales el líquido del lavado se

recuperó en un frasco estéril, este proceso se repitió 2-3 veces. El líquido obtenido se

centrifugo a 5000 x g por 10 minutos, se elimino el pellet y se repitió dos veces más,

posteriormente se almaceno a -70°C hasta su utilización.

4.1.2.2 Tejidos

De las mortalidades presentadas, se colectaron muestras de tonsila, pulmón, bazo y

ganglio linfáticos, cada uno de 2x2 cm de diámetro que se conservaron en bolsas nazco

y en congelación -70°C hasta su utilización. Para el estudio en particular, se utilizaron

únicamente las muestras de pulmón y ganglio (1 g), las que se sonicaron durante 1

minuto en un Ultrasonic homogenizer Cole-Parmer Instruments Co., adicionando luego 1

ml de medio MEM 199 (Gibco-Ref 31100-035) sin suplementar. En el caso de las

muestras para aislamiento se prepararon previamente, adicionando a 1 ml de muestra, 9

ml de MEM con 1% de PEST (Pen Strep-Gibco-Ref 15140), se centrifugaron a 3000 g x

10 minutos, el sobrenadante se filtro en membrana 0.40, para la posterior inoculación de

las células. Las muestras para qRT-PCR fueron centrifugadas a 5000 g x 3 minutos y el

sobrenadante fue utilizado para el proceso de extracción correspondiente.

4.1.3 Virus

Se utilizó la cepa viral PRRS 3P (genotipo americano), Referencia PDV0401, Lote 1,

proveniente del National Veterinary Service Laboratories (NVSL) APHIS-USDA. Se

realizó una dilución 1:10 del virus con medio MEM sin suplementar para su posterior uso

como control positivo en la prueba de aislamiento.

4.1.4 Aislamiento viral

4.1.4.1 Células

Se utilizaron monocapas de células MA-104 a una concentración inicial de 2 x 106 en

placas de 24 pozos. Estas fueron cultivadas en en medio MEM 199 (Gibco-Ref 31100-

035) y suplementadas con 10% de Suero Fetal Bovino (SFB) (Gibco-Cat 26250-084) y

0.1% de Penicilina-Estreptomicina, (Pen Strep-Gibco-Ref 15140). Luego de 24-48 horas

de incubación, y con un 80% de confluencia, las células fueron inoculadas con las

muestras previamente preparadas (ítem 4.1.2) de pulmón, ganglio, lavado bronquio

alveolar y con el control del PRRSV.

Los inoculos se utilizaron tanto puros como en dilución 1:10, en medio MEM sin

suplementar. Para la inoculación, inicialmente se eliminó el medio de cultivo y se realizó

el lavado de las celulas con 200 µl de Buffer Fosfato Salino (PBS) para cultivo celular

(Anexo 3), posteriormente se adicionaron 200 µl de los inoculos (puros y 1:10). Se

emplearon dos pozos como control positivo y dos como control celular. Luego de una

hora de adsorción a 37°C y 5% de CO2 se adicionó 1 ml por pozo del medio MEM

suplementado con 5% de SFB y 1% de antibióticos (penicilina-estreptomicina) (Anexo 2).

Las muestras se incubaron entre 48-72 horas a 37°C y 5% de CO2, observando

diariamente la monocapa para determinar la presencia de efecto citopático. Se colectó el

sobrenadante por muestra, se conservó a -70°C para la posterior infección de nuevas

monocapas de MA-104. Se realizaron tres pasajes para cada muestra. No se realizo

congelación de células ya que no se contaba con el correspondiente anticuerpo

monoclonal para la detección mediante fluorescencia.

4.1.5 Secuenciación A partir de las muestras de sueros, tejidos, fluidos y lavados bronquio alveolares positivas

por qRT-PCR, se realizó la extracción del ARN viral con el kit RNeasy mini (74106) de

QUIAGEN. Para la realización de la transcripción reversa se utilizó el kit M-MLV Reverse

Transcriptase (28025-013) de Invitrogen, donde para un volumen final de 10 µl se

adicionaron 5 µl de los Hexámeros (7.5 ng/µl) y 5 µl de ARN. Las condiciones dadas

fueron 1 ciclo a 75°C por 3 minutos. Posteriormente para un volumen final de 20 µl se

mezclaron 4 µl de Agua, 4 µl de Buffer 5x, 1 µl de dNTPs 10mM. 0.5 µl de Inhibidor de

RNAsas, 0.5 µl de Enzima MMLV 200U/ µl y 10 µl de ARN más hexámeros. Las

condiciones dadas fueron 1 ciclo a 37°C por 50 minutos y 1 ciclo a 70°C por 15 minutos.

Los primers utilizados en la PCR convencional fueron los siguientes:

Tabla 4-1. Descripción de los Primers utilizados en la secuenciación

PRIMER SECUENCIA (5´- 3´) ORF5 FEd (Ext) ATG TGC GRY TGC TYC ATT TCA TGA CAC C (R= A, G – Y= C, T)

ORF5 REd (Ext) AGG TGC ARA AGC CCY AGC AGT CGG CCG C (R= A, G – Y= C, T)

ORF5 FId (Int) TCA TGA CAC CTG ARR CCA TGA GGT GGG C (R=A,G)

ORF5 RId (Int) GCC AAD AKC ACC TTT TST GGA GSC GTG C (K=G,T) (D=A,G,T) (S=G,C)

Se realizó una PCR anidada con el kit Go Taq Flexi DNA Polymerase (M829) de

Promega. Para la PCR externa se mezclaron 10.66 µl de agua, 5 µl de Buffer Green 5x,

2 µl de Cloruro de Magnesio 25 mM, 0.5 µl de dNTPs 10mM, 0.87 µl de primer FEd

20pmol/ µl, 0.87 µl de primer REd 20pmol/ µl, 0.1 µl de Enzima 5U/ µl y 5 µl de ADNc

para un volumen final de 25 µl. Las condiciones utilizadas fueron: 1 ciclo a 94°C durante

2 minutos, 30 ciclos a 94°C por 30 segundos, 60 °C por 30 segundos, 72°C por 45

segundos, 1 ciclo por 72°C por 10 minutos. Para la PCR interna se mezclaron 30.52 µl de

agua, 11 µl de Buffer Green 5X, 4.4 µl de Cloruro de Magnesio, 1.1 µl de dNTPs, 1.914 µl

de primer FId, 1.914 µl de primer RId, 0.22 µl de Enzima Taq Polimerasa y 4.4 µl del

producto de la PCR externa, para un volumen final de 55 µl. Las condiciones utilizadas

fueron: 1 ciclo a 94°C durante 2 minutos, 30 ciclos a 94°C por 30 segundos, 65 °C por 30

segundos, 72°C por 45 segundos, 1 ciclo por 72°C por 10 minutos.

A partir de la PCR se tomo un volumen de 3 µl, que se utilizó para la realización de la

electroforesis en gel de agarosa al 1.5%, con el fin de determinar la banda de 729 pb

correspondientes al amplicon de la región ORF5. Para la purificación se tomaron 50 µl

de producto de la PCR interna utilizando el QIAquick PCR purification kit (Quiagen, Cat.

281206). La seuenciacion se hizo utilizando el kit Big Dye Terminator v 1.1, v 3.1, 5x

Sequencing Buffer (Applied Biosystems, Ref. 4336697), donde el producto se purifico de

nuevo utilizando el BigDye X Terminator (Applied Biosystems, Cat. 4376486),

posteriormente se sometió a agitación durante una hora a 1200 rpm por 1 minuto, se

centrifugó a 3000 rpm por 3 minutos y a partir de aquí se tomaron 10 µl que se llevaron a

una placa de 96 pozos para secuenciar en una Analizador genético 3130 Applied

Biosystems. Una vez obtenidos los correspondientes concensos de las muestras

analizadas, estos fueron alineados frente a varias cepas tanto americanas como

europeas mediante el programa Clustal W2 y posteriormente se realizó el árbol

filogenético por medio del programa Mega 5 (Figura 4-2). Las muestras fueron

secuenciadas en el Laboratorio Nacional de Diagnóstico Veterinario (LNDV) del ICA.

Tabla 4-2 Descripción de las cepas americanas y europeas utilizadas en la realización del

árbol filogenético de las muestras concenso IDENTIFICACION NCBI CEPAS

EF442773.1|:1716-2318

Porcine respiratory and reproductive syndrome virus strain JA142 glycosylated minor envelope protein (GP2a), non-glycosylated minor envelope protein (GP2b), glycosylated minor envelope protein (GP3), glycosylated minor envelope protein (GP4), major envelope protein (GP5), membrane protein (M), and nucleocapsid protein (N) genes, complete

cds

DQ988080.1|:13790-14392 Porcine respiratory and reproductive syndrome virus isolate Ingelvac ATP, complete genome

AY424271.1|:13790-14392 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus strain JA142, complete genome

AF494042.1|:13772-14374 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolate P129, complete genome

EF112445.1|:13698-14300 Porcine respiratory and reproductive syndrome virus strain JXA1, complete genome

AY032626.1|:13789-14391 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus strain CH-1a, complete genome

AF184212.1|:13897-14499 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus strain SP, complete genome

DQ176019.1|:13396-13998 Porcine respiratory and reproductive syndrome virus isolate MN184A, complete genome

83588787|gb|DQ306878.1| Porcine respiratory and reproductive syndrome virus isolate 98-3403 glycoprotein 5 gene, complete cds

83588785|gb|DQ306877.1| Porcine respiratory and reproductive syndrome virus isolate 98-3298 glycoprotein 5 gene, complete cds

83588789|gb|DQ306879.1| Porcine respiratory and reproductive syndrome virus isolate 99-3584 glycoprotein 5 gene, complete cds

AF331831.1|:13786-14388 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus BJ-4, complete genome

AF066183.4|:13789-14391 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus RespPRRS MLV, complete genome

AF176348.2|:13788-14390 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolate PA8 complete genome

U87392.3|PRU87392:13788-14390 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus strain ATCC VR-2332, complete genome

343795953|gb|JN411262.1| Porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolate snu100057 major envelope protein gene, complete cds

63109218|gb|DQ009647.1| Porcine respiratory and reproductive syndrome virus strain CRESA-VP21 envelope glycoprotein (ORF5) gene, complete cds

M96262.2|LEYPOLYENV:13494-14099

Lelystad virus, complete genome

58532741|gb|AY743931.1| Porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolate Porcilis GP5 gene, complete cds

JF802085.1|:13405-14010 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus strain lena, complete genome

GU047345.1|:13464-14069 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolate NMEU09-1, complete genome

EU076704.1|:13470-14075 Porcine respiratory and reproductive syndrome virus isolate HKEU16, complete genome

AY366525.1|:13443-14048 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus strain EuroPRRSV, complete genome

KC862567.1|:13494-14099 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolate DK-2011-05-11-14, complete genome

AF325691.1|:13766-14368 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolate NVSL 97-7985 IA 1-4-2, complete genome

KC862577.1|:13788-14390 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolate DK-2011-030311-1, complete genome

DQ473474.1|:13788-14390 Porcine respiratory and reproductive syndrome virus isolate LMY, complete genome

192806901:13778-14380 Porcine respiratory and reproductive syndrome virus genomic RNA, complete genome, strain: EDRD-1

JN660150.1|:13345-13947 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus strain NADC31, complete genome

KF611905.1|:13397-13999 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolate HENAN-XINX, complete genome

EU807840.1|:13786-14388 Porcine respiratory and reproductive syndrome virus isolate CH-1R, complete genome

EU262603.1|:13584-14186 Porcine respiratory and reproductive syndrome virus strain Em2007, complete genome

KF287140.1|:13764-14366 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolate HK13, complete genome

JQ715697.1|:13661-14263 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus strain NVDC-GD2-2011, complete genome

EU939312.1|:13698-14300 Porcine respiratory and reproductive syndrome virus strain JSyx, complete genome

GQ374442.1|:13698-14300 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus strain GDBY1, complete genome

JQ663556.1|:13698-14300 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus strain 10-10QN, complete genome

HQ315837.1|:13698-14300 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolate SY0909, complete genome

EF635006.1|:13698-14300 Porcine respiratory and reproductive syndrome virus strain HUN4, complete genome

FJ889130.1|:13697-14299 Porcine respiratory and reproductive syndrome virus strain CWZ-1-F3, complete genome

JX512910.1|:13698-14300 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus strain SRV07, complete genome

JQ663545.1|:13698-14300 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus strain 10-10BJ-5, complete genome

GQ857656.1|:13698-14300 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus strain SX-1, complete genome

FJ349261.1|:13434-14039 Porcine respiratory and reproductive syndrome virus strain KNU-07, complete genome

AY588319.1|:13494-14099 PRRSV LV4.2.1, complete genome

DQ489311.1|:13443-14048 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus strain SD01-08, complete genome

GQ461593.1|:13494-14099 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus strain SHE, complete genome

EF484033.1|:13789-14391 Porcine respiratory and reproductive syndrome virus clone pMLV, complete genome

CONCENSO 1 Lavado bronquioalveolar Granja 1 preceba

CONCENSO 2 Lavado bronquioalveolar Granja 1 ceba

CONCENSO 3 Lavado bronquioalveolar Granja 3 Ceba

4.2 Resultados

4.2.1 Aislamiento Se analizaron 205 muestras de tejidos (103 pulmones y 102 ganglios linfáticos) y 98

muestras de LBA. Las muestras donde fue posible el aislamiento del virus se presentan

en la Tabla 4-4.

Tabla 4-3. Resultados de aislamientos en células MA-104 en tejidos y LBA

IDENTIFICACION GRANJA MES GRUPO ETAREO

LBA 2 1 Septiembre Preceba

LBA 24 1 Noviembre Ceba

LBA 33 3 Noviembre Ceba

LBA 36 1 Diciembre Preceba

LBA 43 3 Diciembre Preceba

LBA 106 3 Mayo Ceba

LBA 107 3 Mayo Ceba

1PULMON 1 Septiembre Preceba

Como se observa, los aislamientos se obtuvieron principalmente en las granjas 1 y 3 en

la preceba y ceba. Con respecto a las muestras las que presentaron una mejor respuesta

al aislamiento fueron en primer lugar los lavados bronquioalveolares y luego pulmón. A

partir de las muestras de ganglios no fue posible aislar el PRRSV. Los meses donde se

evidenciaron estos hallazgos fueron Septiembre, Noviembre, Diciembre y Mayo.

4.2.2 Secuenciación Las muestras de sueros, fluidos orales, tejidos (pulmón, ganglios) y lavados

bronquioalveolares que fueron positivas por qRT-PCR, se sometieron a secuenciación

mediante la técnica de Sanger modificada. Se analizaron 32 muestras: 11 muestras de

pulmón, 13 de ganglio y 8 de lavado bronquioalveolar.

Las muestras secuenciadas correspondieron a muestras de lavado bronquioalveolar

(LBA): LBA2 con 578 pb, LBA24 con 591 pb y LBA33 con 635 pb, pertenecientes a la

preceba de la granja 1, ceba de la granja 1 y ceba de la granja 3, respectivamente

(Figura 4-1). Las secuencias obtenidas fueron enfrentadas a cepas tanto Americanas

como Europeas incluyendo a su vez aislados de campo obtenidos en el LNDV, como

cepas vacunales. Como se observa en el árbol filogenético obtenido, las muestras

secuenciadas se localizaron dentro del grupo de las cepas americanas. Adicionalmente,

se observó que las dos cepas correspondientes a la granja 1 presentaron un alto

porcentaje de similitud entre ellas, con respecto a la cepa de la granja 3, esta similitud

fue del 93%. Se observa de igual manera una alta similitud entre las muestras del estudio

con otro grupo de cepas, dentro de las cuales se encuentran un aislado obtenido en

China, el aislado MLV RespPRRS/Repro, el clon pMLV (obtenido a partir de PRRS MLV),

la cepa ATCC VR-2332, un aislado obtenido en Canadá y otro en Dinamarca (Figura 4-

2).

Figura 4-1. Gel de electroforesis a partir de muestras positivas a qRT-PCR.

Número 1 (LBA 2) preceba granja 1. Número 2 (LBA24) ceba granja 1. Nmero 3 (LBA

33) ceba granja 3. Control positivo Se utilizó la cepa viral PRRS 3P, Referencia

PDV0401, Lote 1, proveniente del National Veterinary Service Laboratories (NVSL)

APHIS-USDA.

578 pb 591 pb 635 pb

Figura 4-2. Árbol filogenético realizado en Mega 5, mediante Neighborg-Joining

(Bootstrap 1000).

gb|FJ889130.1| 13697-14299 gb|EF112445.1| 13698-14300 gb|EF635006.1| 13698-14300 gb|EU939312.1| 13698-14300

gb|JX512910.1| 13698-14300 gb|HQ315837.1| 13698-14300 gb|GQ857656.1| 13698-14300 gb|JQ663556.1| 13698-14300

gb|JQ663545.1| 13698-14300 gb|GQ374442.1| 13698-14300

gb|JQ715697.1| 13661-14263 gb|KF287140.1| 13764-14366

gb|EU262603.1| 13584-14186 gb|EU807840.1| 13786-14388

gb|AY032626.1| 13789-14391 gb|AF494042.1| 13772-14374

gb|AF325691.1| 13766-14368 gb|EF442773.1| 1716-2318 gb|AY424271.1| 13790-14392

gb|DQ988080.1| 13790-14392 gi|192806901 13778-14380 gb|AF184212.1| 13897-14499

gb|DQ473474.1| 13788-14390 Colombia LBA2 Colombia LBA24

Colombia LBA33 gb|KC862577.1| 13788-14390 gb|AF176348.2| 13788-14390

gb|U87392.3|PRU87392 13788-143 gb|AF066183.4| 13789-14391 gb|EF484033.1| 13789-14391 gb|AF331831.1| 13786-14388

gb|JN660150.1| 13345-13947 gb|DQ176019.1| 13396-13998

gb|KF611905.1| 13397-13999 gi|83588787|gb|DQ306878.1| gi|83588785|gb|DQ306877.1|

gi|83588789|gb|DQ306879.1| gb|JF802085.1| 13405-14010

gb|GU047345.1| 13464-14069 gi|343795953|gb|JN411262.1|

gb|FJ349261.1| 13434-14039 gb|EU076704.1| 13470-14075

gb|AY366525.1| 13443-14048 gb|DQ489311.1| 13443-14048

gi|63109218|gb|DQ009647.1| gb|GQ461593.1| 13494-14099

gb|KC862567.1| 13494-14099 gi|58532741|gb|AY743931.1|

gb|M96262.2|LEYPOLYENV 13494-1 gb|AY588319.1| 13494-14099

100

96

100

97 70

69

43

86

39

59

40

100

93 100

87

93

48 41

96

100

85

48 100

64

88

57

100

17 34

27

99

38 64

85

46

37

99

81 89

85

54 42

26

42

0.05

El color naranja corresponde a cepas aisladas en Asia de origen americano, el color

violeta a las cepas aisladas en América y las azules a las cepas Europeas. En color rojo

y verde se encuentran las muestras aisladas dentro del estudio, denominadas Colombia

LBA2, LBA24 y LBA33.

4.3 Discusión Del total de las muestras empleadas para intentar aislamiento, solo 8 fueron viables para

obtener resultados positivos evidenciados por la presencia de efectos citopáticos típicos

de la infección, caracterizados por pérdida de continuidad de la monocapa,

redondeamiento celular y agrupamiento. Como ya se ha documentado, el genotipo II de

PRRSV es rutinariamente aislado en células MA-104 y su subclon MARC-145, mientras

que el genotipo I no se ha adaptado a estas líneas celulares (Murtaugh et al., 2010) esto

confirma inicialmente que estas cepas pertenecían al genotipo americano, lo cual fue

posteriormente verificado mediante los resultados de la secuenciación.

Con respecto al tipo celular utilizado existen varias referencias al respecto. En un estudio

realizado por Bautista et al (1993) donde se evaluaron las diferencias en el aislamiento

de PRRSV en células MA104 (también denominadas CL2621) y macrófagos alveolares

pulmonares (MAPs), se logró concluir que aunque los MAPs son relativamente más

sensibles para el aislamiento de PRRSV, ambos tipos celulares pueden ser empleados.

En un estudio más reciente (Fuentes de Abin, et al., 2009) reportaron diferencias en la

eficiencia de infección por PRRSV tanto en células MA-104 como en PAMs; al día 6 post

inoculación el 70% de las cepas de campo crecieron en los MAPs mientras solo el 2% en

células MA104. También se ha evidenciado que las células MA-104 no son permisivas al

PRRSV de tipo silvestre, esto ha sido relacionado a la insuficiente presencia de CD163

para producir la infección en las células huésped (Calvert et al., 2007). En un hallazgo

reportado por Fuentes de Abin et al (2009), se aislaron 20 cepas de campo en PAMs a

las 72 horas de incubación y 25 cepas adicionales a los 6 días de incubación, solo una

cepa de campo fue aislada en células MA104 a los 14 días. Con relación a lo anterior y a

los resultados obtenidos en este estudio, se podría asegurar que no todas las cepas

obtenidas a partir de las granjas se pudieron replicar en las células MA-104, esto pudo

deberse a factores como una baja sensibilidad de las células a los virus de campo y/o a

una concentración baja de virus. Se debe tener en cuenta el número de pasajes hechos

(3) para obtener la manifestación del EC, ya que se ha reportado que se puede encontrar

efecto en periodos de incubación de hasta 14 días por pasaje en células MA-104

(Fuentes de Abin et al., 2009).

Los aislados se obtuvieron a partir de lavados bronquioalveolares y pulmón, lo cual

puede indicar que en el momento de la toma de las muestras, los animales se

encontraban en la fase aguda de la enfermedad y el virus se encontraba replicando a

nivel de MAPs, esto a su vez indica circulación del PRRSV en las granjas 1 y 3. El grupo

de la preceba pudo adquirir el virus a partir de reemplazos o de los animales adultos de

los sitios 1 y 2 transportándolo posteriormente al sitio 3 o adquiriendo el virus que allí se

encontraba circulando.

Dentro del presente estudio, al comparar los resultados obtenidos de los aislados en MA-

104 por qRT-PCR, se comprueba la presencia de ARN viral en las muestras. Sin

embargo, resultados qRT-PCR positivos no siempre indican la presencia de virus viable

(Wills et al., 2003). De otro lado la prueba qRT-PCR es más sensible que el aislamiento

viral para identificar cerdos infectados por el PRRSV (Wills et al., 2003).

Los aislamientos se obtuvieron a partir de muestras tomadas al comienzo del estudio,

básicamente hacia el final del año (Septiembre, Noviembre, Diciembre) y al final del

estudio en Mayo. Estas circunstancias pudieron obedecer posiblemente al traslado y

mezcla de animales ya sea durante el destete o cuando fueron trasladados al sitio 3, o a

la comercialización que se presenta durante el fin del año. Lo anterior pudo conllevar al

inicio de la infeccion y por ende a una mayor carga viral a nivel pulmonar o a la presencia

de persistencia a nivel de los líquidos pulmonares.

En cuanto a las secuencias obtenidas en el estudio, al ser enfrentadas con cepas

aisladas en Asia (primordialmente americanas), América y Europa, éstas se ubicaron

dentro del grupo de las cepas de origen americano, lo que corrobora los hallazgos de los

estudios realizados en Colombia entre 1997 y 1999, donde se concluyó que las cepas

circulantes en el país correspondían a este mismo genotipo. Sin embargo, del total de

muestras secuenciadas solo se lograron amplificar tres, lo cual, no corresponde a una

muestra representativa que permita determinar que únicamente se encuentran circulando

cepas americanas en la población evaluada. De igual manera, se requeriría la

caracterización continua del virus en la zona para identificar posibles nuevas variantes

(Torrison et al, 2003), ya que los cambios en el virus de PRRS se presentan a una tasa

de 0.5% a 1% por año en campo (Murtaugh, 2012). En el año 2012, en el Taller

Internacional de Diagnóstico Virológico y Molecular para PRRSV realizado en el

Laboratorio Nacional de Diagnóstico Veterinario del ICA, se secuenciaron una serie de

muestras que incluyeron sueros, fluidos orales y tejidos positivos por RT-PCR, en las

cuales se identificaron cepas de alta virulencia dentro de los clusters, sin embargo el

doctor Murtaugh, aclaró que estos resultados correspondían a datos preliminares y

debían ser interpretados cuidadosamente (Murtaugh, 2012a).

Las diferencias en similitud indican por un lado, que la misma cepa se encuentra

circulando entre la preceba y ceba de la granja 1, pero existe variación con respecto a la

cepa ubicada en la granja 3, aun cuando las granjas se localizan en la misma zona.

De igual manera, se observó similitud con otro grupo de cepas dentro de las cuales se

encuentran la cepa representativa del genotipo americano ATCC-VR 2332 y una cepa

vacunal viva modificada (MLV) Resp/PRRS Repro que fue posiblemente utilizada en las

granjas, ya que actualmente no se vacuna en Colombia contra PRRSV.

4.4 Conclusiones

Se confirmó en las granjas evaluadas, la presencia del genotipo Americano del PRRSV,

confirmando los hallazgos obtenidos en los muestreos realizados a finales de los años

noventa. La movilización, medidas de manejo y bioseguridad en las granjas influyeron en

las diferencias en cuanto a resultados positivos obtenidos en cada una. Por su parte, los

grupos etáreos de la preceba y ceba fueron los grupos donde fueron aisladas las cepas

del PRRSV, confirmando que existe circulación viral en las granjas 1 y 3.

4.5 Recomendaciones

Realizar los aislamientos en células MARC-145 y/o MAPs, las cuales son más sensibles

a las cepas de campo. De igual manera realizar secuenciaciones periódicamente con el

fin de descartar la posibilidad de circulación de cepas de tipo Europeo.

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5. Medidas de Control Propuestas

El presente estudio, permitió evidenciar la presencia de circulación del PRRSV en las

granjas evaluadas, con particularidades para cada una de ellas. Es significativo que la

granja 2 fue seronegativa y no se evidenció presencia de genoma viral en muestras de

de sueros y tejidos.

Los resultados obtenidos, permiten sugerir medidas de control a ser implementadas en

estas granjas, las que incluyen evitar que haya infección o reinfección en la granjas y/o

disminuir la circulación del virus, evitar la entrada de una nueva cepa viral, así como

evitar la propagación de la enfermedad a otras explotaciones. Para lo anterior, se

recomienda aplicar y/o extremar las medidas de bioseguridad y manejo, las cuales fueron

mencionadas en el numeral correspondiente al control del PRRS (1.9), sin embargo se

hará mención de algunas en particular.

Es aconsejable extremar las medidas de bioseguridad en las tres granjas, limitando la

entrada de visitantes a las mismas e imponer el baño y cambio de ropa al entrar y salir de

estas. Ya que se cuenta con sitios productivos que requieren el transporte continuo de

animales e insumos, se debe instaurar el lavado y desinfección de camiones al entrar y

salir de las instalaciones. Establecer control de roedores e insectos mediante el uso de

rodenticidas, trampas o láminas adherentes, a su vez mantener una adecuada limpieza y

desinfección de las instalaciones. Igualmente, se recomienda evitar el ingreso de

animales domésticos a las instalaciones y asegurar que estos se encuentren en

adecuadas condiciones sanitarias. También emplear machos certificados como negativos

a PRRSV para la monta, o semen procedente de centros negativos a la enfermedad.

De otro lado se deben obtener reemplazos a partir de granjas negativas a PRRSV y

llevar a cabo adecuadas medidas de manejo para dichos reemplazos las cuales fueron

citadas en el numeral 1.9 del presente estudio. Exponer los animales de reemplazo al

virus circulante en la granja mediante el contacto con animales confirmados como

positivos, solicitando asistencia técnica para el uso de otro tipo de prácticas como

exposición a las placentas o inoculación de suero. Incluir el uso de las Medidas McRebel,

ya que como se evidenció, los grupos productivos más jóvenes evidenciaron la presencia

del PRRSV.

De igual manera, se deben establecer flujos de animales como un sistema todo dentro-

todo fuera para evitar la diseminación del virus al momento de la mezcla de los animales

al destete, en la preceba y ceba. De igual manera se debería plantear la posibilidad de

disponer adecuadamente de los animales positivos mediante sacrificio, con el fin de

evitar la diseminación de la enfermedad.

Los resultados de este trabajo, permiten igualmente proponer dentro de las medidas de

control de la enfermedad, la importancia del monitoreo del PRRSV en las granjas,

mediante el uso conjunto de técnicas diagnósticas serológicas y moleculares. Esto para

confirmar con exactitud la presencia del virus en la explotación, ya que se pueden

presentar casos como el de la granja 2, la cual fue negativa por serología pero a través

de qRT-PCR se demostró la presencia del genoma viral en en muestras de FO; de igual

forma, por serología se determinó como positivo el grupo de la ceba en la granja 1, sin

embargo, se evidenció la presencia del virus en la preceba y destetos los cuales fueron

seronegativos. Se recomienda igualmente, realizar un monitoreo de la presencia del virus

a partir de la toma y evaluación de diferentes tipos de tejidos provenientes de las

mortalidades y sacrificios, así es posible establecer la presencia de animales virémicos

como persistentemente infectados en las granjas, como también la fase de infección en

la cual se encuentra la población, lo que permite determinar cuál podría ser el origen de

dicha infección y asi establecer medidas de eliminación de la población persistente para

evitar la continua diseminación viral.

6. Conclusiones y recomendaciones

6.1 Conclusiones

Se confirmó la circulación del PRRSV en explotaciones porcícolas de tipo intensivo en el

país. De igual manera, se encontró un incremento en la actividad del virus tanto en la

zona del Valle del Cauca, como en los diferentes grupos etáreos evaluados,

principalmente en la ceba.

Es necesario el uso conjunto de técnicas serológicas y moleculares en el diagnóstico de

PRRSV, ya que los resultados que arroja cada una, permite conocer la fase de infección

en la cual se encuentra el virus en una explotación.

Las tres granjas evaluadas en este estudio presentaron resultados positivos por qRT-

PCR en diferentes tipos de muestras, lo que demostró la presencia del PRRSV en

diferentes estados de infeccion. Los grupos más afectados fueron la preceba y ceba

confirmando la circulación del virus dentro de cada granja.

La detección de ARN viral en sueros, tejidos como pulmón y ganglios linfáticos indicaron

la posible presencia de animales virémicos como persistentemente infectados dentro de

los grupos productivos. Los diferentes tipos de muestras analizadas pueden ser utilizadas

en las diferentes fases de diagnóstico, dentro de un programa de control del PRRSV.

Se confirmó la presencia, en las granjas evaluadas, del genotipo Americano del PRRSV,

confirmando los hallazgos obtenidos en los muestreos realizados a finales de los años

noventa. La movilización, medidas de manejo y bioseguridad en las granjas influyeron en

las diferencias en cuanto a resultados positivos obtenidos en cada una.

La preceba y ceba fueron los grupos donde fueron aisladas las cepas del PRRSV,

confirmando la circulación viral en las granjas 1 y 3.

6.2 Recomendaciones El estudio demostró que el comportamiento del virus de PRRS en Colombia es particular

para cada granja, por tal razón, es importante revisar las medidas de bioseguridad, el

impacto de las movilizaciones a grandes distancias entre los sitios productivos de los

animales y realizar junto con estudios serológico pruebas moleculares con el fin de

determinar la dinámica el PRRSV dentro de cada granja para aplicar las medidas de

control adecuadas.

Utilizar las técnicas moleculares junto con pruebas serológicas que permitan reflejar las

diferentes fases de la infección y que permitan conocer la dinámica del virus en una

población con el fin de tomar las acciones de control adecuadas.

Se recomienda hacer uso de los diferentes tipos de muestras como FO para monitoreo

rutinario de los grupos productivos de la preceba y ceba especialmente por qRT-PCR.

Los tejidos como pulmón y ganglios de las mortalidades o animales enfermos o colas,

permiten orientar el estado de infección en el cual se encuentra una población dentro de

una granja. Por otro lado, los sueros permiten monitorear las madres, reemplazos,

reproductores y lactantes, o la población total cuando se han establecido diferentes

medidas de manejo y bioseguridad o en el caso de obtenerse resultados positivos en FO

y/o tejidos.

Realizar los aislamientos en células MARC-145 y/o MAPs, las cuales son más sensibles

a las cepas de campo, de igual manera, se deben realizar secuenciaciones periódicas

con el fin de descartar la posibilidad de circulación de cepas de tipo Europeo.

Es de importancia determinar mediante estudios regionales, las cepas que se encuentran

circulando, ya que como se ha evidenciado en este estudio existen diferencias incluso

dentro de una misma granja y esto influye en los mecanismos de control que deben ser

utilizados. De igual manera, debe establecerse un programa de monitoreo periódico para

establecer tanto la dinámica del virus en una zona, como las cepas circulantes y sus

variaciones en el tiempo.

Anexos

Anexo A. Buffer fosfato salino (PBS) pH 7.2 +/- 0.2

Cloruro de sodio (NaCl) 8.00 g

Cloruro de Potasio (KCl) 0.20 g

Fosfato dibásico de sodio anhidro (Na2HPO4) 1.15 g

Agua destilada csp 1 litro

Ajustar pH 7.2 +/- 0-2

Esterilizar

Almacenar a 4°C

Anexo B. Solución penicilina-estreptomicina (PEST) –

100X

Penicilina 1.000.000U 1 frasco

Estreptomicina 1 g

Agua destilada csp 100 ml

Filtrar por millipore 0.22u

Envasar en fraco de vidrio y mantener en congelación (-22°C).

Anexo C. Buffer fosfato salino (PBS) 10x para cultivo

celular

Cloruro de sodio (NaCl) 8.00g

Cloruro de potasio (KCl) 16 g

Fosfato dibásico de sodio anhidro (Na2HPO4) 1.92 g

Fosfato monobásico de potasio (KH2PO4) 2.40 g

Glucosa 80 g

Rojo de fenol 0.80 g

Bicarbonato de sodio (NaHCO3) 12 g

Agua destilada csp 4 litros

Diluir a 1x tomando 1 litro de PBS 10x más 9 litros de agua

Filtrar por millipore 0.22u

Envasar en frasco de vidrio

Realizar control de esterilidad

Mantener en refrigeración

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