Diagnóstico de Laboratorio en Reumatología
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Una mirada al diagnóstico de laboratorio de las enfermedades autoinmunes Hospital de Especialidades CMN siglo XXI Laboratorio Central de Análisis Clínicos Cristopher Luna Bañuelos
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Una mirada al diagnóstico de laboratorio de las enfermedades
autoinmunes
Hospital de Especialidades CMN siglo XXILaboratorio Central de Análisis Clínicos
Cristopher Luna Bañuelos
INDICE
1. INTRODUCCIÓN
2. DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO PARA UNA EVALUACION INICIAL
3. INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA
Introducción
El sistema inmunitario protege al organismo, contra infecciones por microorganismo, al
detectarlos y eliminarlos, limita el crecimiento de ciertas neoplasias, y elimina las células . Debe
distinguir de forma fiable entre moléculas propias y ajenas. Cualquier trastorno en este
proceso puede llevar a la aparición de autoinmunidad.
Las enfermedades autoinmunes (EA) son provocadas por un daño intrínseco del sistema inmunológico como consecuencia de la pérdida de la autotolerancia que condiciona respuestas
anormales frente estructuras propias, lo que genera un daño tisular que perdura en el
tiempo. En este caso, el sistema se conviertes en el agresor y ataca partes del cuerpo en vez de
protegerlo.
Las causas son multifactoriales y la predisposición genética es poligénica, lo que provoca proteínas diferentes en las células
inmunológicamente activas o en las orgánicas.
La mayor contribución se debe a los genes del sistema principal de histocompatibilidad ya que estos genes pueden influir en la selección de los linfocitos autorreactivos y en el desarrollo de la
autotolerancia.
Las influencias ambientales, principalmente causadas por infecciones, pueden predisponer
para la autoinmunidad a través de varios mecanismos, entre ellos la estimulación de los coestimuladores en los tejidos y las reacciones
cruzadas entre antígenos microbianos y autoantígenos frente a anticuerpos, al
convertirlos en auto-anticuerpos.
1) Enfermedades Órgano específico con auto-anticuerpos órgano específicos, ejemplo: La enfermedad de
Hashimoto.
2) Enfermedades órgano específico con auto-anticuerpos no órgano específicos, ejemplo: La
cirrosis biliar primaria y
3) Enfermedades no-órgano específico o enfermedades autoinmunes sistémicas donde el proceso puede afectar varios órganos, ejemplo: Lupus Eritematoso Sistémico.
Las Enfermedades autoinmunes se clasifican de acuerdo a su extensión en:
Actualmente, el apoyo por el laboratorio para el diagnóstico de las enfermedades autoinmunes
consiste en un gran numero de técnicas que permiten tanto identificar como confirmar el o los anticuerpo(s)
específificos reconocidos. Además, este tipo de técnicas han evolucionado de manera importante en
las úlltimas décadas, ya que se han desarrollado
pruebas con mayor especificidad y sensibilidad.
DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO PARA UNA EVALUACIÓN INICIAL
Las alteraciones más comunes encontradas en las pruebas iniciales de laboratorio, que en gran medida dependen del tipo
de EA que afecta al paciente, son:
La anemia normocítica-normocrómica, la
trombocitopenia, la leucopenia, o ambas, por ejemplo, en los
pacientes con LES.
Alteraciones en enzimas órgano-específicas o en
procesos metabólicos, como son: los niveles elevados de transaminasas, bilirrubina, proteínas séricas totales.
Coagulogramas alterados por incremento del tiempo de tromboplastina activada parcial,
tiempo de protrombina, o ambos, como en el síndrome de anticuerpos anti-fosfolípidos (aFL).
El incremento de los niveles en enzimas musculares como la creatinina cinasa (CK), alanino
aminotransferasa (ALT o TGP) y aspartatoaminotransferasa (AST o TGO), que se pueden
encontrar en las miopatías inflamatorias autoinmunes, como la dermatomiositis, PM y la
miositis con cuerpos de inclusión (MCI).
McPherson RA, Pincus MR. Henry's clinical diagnosis and management by laboratorymethods. 21st ed. Philadelphia: WB Saunders; 2010.
Seshan SV, Jennette JC. Renal disease in systemic lupus erythematosus with emphasison classification of lupus glomerulonephritis. Arch Pathol Lab Med. 2009.
Los niveles de proteínas séricas sirven para pesquisar los
incrementos anormales en los niveles de inmunoglobulinas.
Los niveles de proteínas séricas sirven para pesquisar los
incrementos anormales en los niveles de inmunoglobulinas.
En los análisis de orina se observan alteraciones asociadas a daño renal, como proteinuria,
hematuria o sedimentos activos (leucocitos o eritrocitos), como en la glomerulonefritis y la
nefritis intersticial.
Seshan SV, Jennette JC. Renal disease in systemic lupus erythematosus with emphasison classification of lupus glomerulonephritis. Arch Pathol Lab Med. 2009.
Los Autoanticuerpos
La presencia de AA en un paciente por si sola no significa el diagnóstico de un EA, pero
acompañada de los signos y síntomas asociados ayuda a llegar al diagnóstico definitivo y tienen
una importancia crucial.
Las pruebas serológicas para detectar AA tienen en su contra la presencia de AA en personas
sanas y en pacientes sin EA conocidas y la existencia de métodos de laboratorio
imperfectos.
Los anticuerpos reconocen :
Anticuerpos órgano
específicos: Anticuerpos
antitiroideos.
Antígenos localizados en el
núcleo: Anticuerpos
antinucleares.
Antígenos del citoplasma o de las membranas
celulares.
Proteínas nucleares no
histonas.
PRINCIPALES AUTOANTICUERPOS EN REUMATOLOGÍA
GRUPOS ESTRUCTURAS ANTIGÉNICAS AUTOANTICUERPOS
A. Factor reumatoideo Fragmento Fc de IgG Ig anti IgG (generalmente IgM)
B. Anticuerpos
antinucleares 1) Nucleosoma
Anti ADN
Anti histonas
Anti DPN o complejo ADN -Histona (fenómeno LE)
2) Proteínas no histonas asociadas al ADN
Anticentrómero
Anti Scl 70
Anti Ku
Antiláminas nucleares
3) Proteínas no histonas asociadas al ARN
Anti Sm
Anti U1 RNP
Anti U2 RNP
Anti-hm RNP
Anti Ro/SSA
Anti La/SSB
Anti Jo 1
4) Nucléolos Antinucleolares
C. Anticuerpos anticitoplasma
de neutrófilo (ANCA)Gránulos azurófilos de los neutrófilos
Antiproteasa serina y otros (C-ANCA)
Antimieloperoxidasa
y otros (P-ANCA)
D.Anticuerpos antifosfolípidos Fosfolípidos
Anticardiolipinas
Anticoagulante lúpico
Reaginas causantes de serología luética falsamente
positiva.
GRUPOS AUTOANTICUERPOS ENFERMEDADES
A. Factor reumatoideo IgM anti IgG
Artritis reumatoidea (AR) a títulos altos /
Conectivopatías
Vasculitis
B. Anticuerpos anti- nucleares Anti ADN nativo Lupus Eritematoso Sistémico (LES)
Anti HistonasLES inducido por fármacos / LES / AR / Artritis crónica
juvenil
Anti RNP Enfermedad mixta del tejido conectivo (EMTC) / LES
Anti SM LES
Anti RO/SSA
Síndrome de Sjögren / LES / Lupus neonatal
LES cutáneo subagudo / LES asociado a déficit de
Complemento
Anti LA/SSB Síndrome de Sjögren / LES
Anti SCL 70 Esclerodermia difusa
Anti centrómero Esclerodermia forma CREST
Anti JO 1 Polimiositis (PM) con enf. pulmonar intersticial
Antinucléolo Esclerodermia
C. Anticuerpos
anticitoplasma
de neutrófilos
C -ANCA
P-ANCA
Predictivo en Granulomatosis de Wegener (GW)
Predictivo en otras vasculitis ANCA positivos
D. Anticuerpos
Antifosfolípidos
Anticoagulante Lúpico Anticardiolipina
Anti U1 RNP
Síndrome antifosfolípido primario / LES
EMTC / LES
Correlación clínica de los
autoanticuerposFACTOR REUMATOIDE
(FR)
En general se trata de una IgM anti IgG.Su principal indicación es para diagnóstico de AR.
Es un anticuerpo poliespecífico que puede activar el complemento y que puede reaccionar con diferentes determinantes antigénicos del
fragmento Fc de la IgG
Con neoantígenos formados por la IgG en inmunocomplejos
Con antígenos nucleares
Se detecta por pruebas:
De aglutinaciónCon glóbulos rojos de carnero
sensibilizados (Waaler-Rose) que es de menor sensibilidad.
Métodos de detección cuantitativos.
Aglutinación del Látex: donde se usa látex como soporte de la IgG
de conejo.
Las AR seropositivas tienen con mayor frecuencia:
Nódulos reumatoideos.
Vasculitis.
Afectación pulmonar.
Niveles disminuidos de complemento sérico.
Aumento de inmunocomplejos circulantes.
Las enfermedades reumáticas con FR usualmente negativo son:
OsteoartosisPolimialgia reumática
Enfermedad por depósito de cristales
Enfermedad de Lyme
AmiloidosisEnfermedad de tejidos blandos
ANTICUERPOS ANTIPEPTIDO CITRULINADO
Es especialmente importante en la Artritis Reumatoide (AR), en la que se han producido avances significativos en el tratamiento, con mejores resultados dependiendo de la
precocidad del diagnóstico. El descubrimiento de los anticuerpos anti- péptido citrulinado cíclico o anti-CCP ha marcado un gran avance en este sentido. Éstos son, a la fecha, los anticuerpos más específicos identificados para AR y la precocidad de su aparición en los enfermos hace
hoy en día su uso casi rutinario.
Van Venrooij WJ, Zendman AJ, Pruijn GJ. Autoantibodies to citrullinated antigens in (early) rheumatoid arthritis. Autoimmun Rev 2006; 6(1):37-41.
La citrulinación no es un evento específico de la membrana sinovial, sino que se puede ver en diversos tejidos asociada a inflamación, como en músculos de
pacientes con polimiositis, tejido colónico en pacientes con enfermedades inflamatorias intestinales y amígdalas
en pacientes con tonsilitis crónica.
Caspi D, et al. Synovial fluid levels of anti-cyclic citrullinated peptide anti- bodies and IgArheumatoid factor in rheumatoid arthritis, psoriatic arthri- tis, and osteoarthritis. Arthritis
Rheum 2006; 55(1):53-6.
En cambio, es específica la respuesta humoral a la citrulinación, con producción de autoanticuerpos sólo en AR. Estos anticuerpos serían producidos localmente por células plasmáticas contra proteínas citrulinadas de la sinovial
inflamada.
La citrulinación no es un evento específico de la membrana sinovial, sino que se puede ver en diversos tejidos asociada a inflamación, como en músculos de
pacientes con polimiositis, tejido colónico en pacientes con enfermedades inflamatorias intestinales y amígdalas en pacientes con tonsilitis crónica.
Caspi D, et al. Synovial fluid levels of anti-cyclic citrullinated peptide anti- bodies and IgArheumatoid factor in rheumatoid arthritis, psoriatic arthri- tis, and osteoarthritis. Arthritis
Rheum 2006; 55(1):53-6.
En cambio, es específica la respuesta humoral a la citrulinación, con producción de autoanticuerpos sólo en AR. Estos anticuerpos serían producidos localmente por células
plasmáticas contra proteínas citrulinadas de la sinovial inflamada.
Estos anticuerpos se pueden encontrar tanto en líquido sinovial como en la sangre; los valores en ambos fluidos se correlacionarían.
Se le ha atribuido a la citrulinación un papel patogénico, vinculándola al epítope compartido
del HLA. En la presentación antigénica a las células T la presencia de alelos HLA-DRB1 confiere especial susceptibilidad para el
desarrollo de la AR.
Los resultados se expresan en unidades/mililitro (U/mL), y los valores de corte dependen del kit
usado.
En aquellos de mayor uso en nuestro país, se considera positivo sobre 25 U/mL y
definitivamente positivo sobre 50 U/mL, por lo que el rango entre 25 y 50 U/mL debe ser
interpretado por el médico en el contexto clínico del paciente.
Las modificaciones postraduccionales (MPT) son cambios químicos que sufren las proteínas
después de ser sintetizadas. Una de las MPT es la citrulinación (conversión del residuo arginina a citrulina), la cual es catalizada por la enzima
peptidil arginina deiminasa (PAD).
Dentro de los procesos fisiológicos, se incluye la diferenciación terminal de células epiteliales, la regulación en la expresión de genes y la apoptosis; en tanto que en los procesos patológicos, las proteínas citrulinadas se han relacionado con la progresión de la enfermedad en AR, esclerosis múltiple y Alzheimer, entre
otros.
La conversión de arginina en citrulina es capaz de activar la respuesta inmune. Dicha
conversión da como resultado un cambio en la carga del aminoácido.
Trabajos posteriores mostraron que tanto la cadena alfa como la beta de la fibrina citrulinada
son los antígenos reconocidos por los anticuerpos APC y que están presentes en
pacientes con AR.
Anticuerpos anti-RA-33
Son anticuerpos que reaccionan de forma específica con la ribonucleoproteína
heterogénea nuclear A2 (hnRNP-A2) y sus isoformas (B1 y B2), así como la forma
homóloga, A1, del núcleo de las células HeLa. Su presencia en suero, sin la aparición
concomitante de anticuerpos anti-U1-RNP o Sm, es altamente específica para la AR.
La detección de anticuerpos anti-RA33 se ha propuesto como marcador serológico de AR
temprana, con una sensibilidad del 27- 28,6%. Asimismo se ha descrito la pérdida de
positividad cuando se alcanza la remisión clínica.
También se han descrito en pacientes con LES en su forma erosiva asociados a anticuerpos anti-Sm. En la enfermedad mixta del tejido
conectivo se asocian a los anticuerpos anti-U1 RNP.
Anticuerpos anti-Sa
Sa es una proteína de 48-50 kDa presente en la placenta, el bazo y el tejido sinovial de
articulaciones de pacientes con AR.
La presencia de anti- cuerpos anti-Sa en pacientes con AR, la sensibilidad de estos
anticuerpos en el diagnóstico de la AR llega al 40%, mientras que la especificidad es del 99%.
Un estudio reciente mostró que la presencia de estos anticuerpos en suero se asociaba con una
subpoblación de varones con AR y curso agresivo.
Sa es un antígeno transportador de haptenos donde la vimentina es el transportador y la citrulina es el
hapteno.
La citrulinación de la vimentina está estrechamente relacionada con la apoptosis, dado que la vimentina
citrulinada es extremadamente sensible a la digestión por las caspasas, enzimas fundamentales
en el proceso de apoptosis.
Med Clin (Barc) 2003;121(16):619-24
ANTICUERPOS ANTINUCLEARES
Son un Grupo de autoanticuerpos no especie específicos dirigidos contra componentes del
núcleo celular.
Los títulos mayores a 1/160 sobre tejido congelado y a 1/640 sobre células Hep-2, suelen verse en
pacientes con enfermedades reumáticas sistémicas.
Los diferentes autoanticuerpos producen imágenes (patrones de tinción que les son característicos) estos patrones pueden sugerir la presencia de
autoanticuerpos específicos que pueden diferenciarse entre sí por patrones de tinción.
Reacción positiva
Una muestra es considerada positiva si la imagen nuclear específica observada es mayor
que la del control negativo.
Patrones de ANA detectados mediante IFI
A continuación se describen las características de los patrones que con mayor frecuencia se
detectan por IFI en células HEp-2 en sueros de pacientes con enfermedades autoinmunes.
García Hernandez JL, et al. Caracterización inmunoquímica de los patrones de inmunofluorescencia (IFI) moteado fino y moteado grueso en pacientes con enfermedades autoinmunes. Reumatol Clin. 2009;5:55.
El patrón homogéneo se caracteriza por una tinción
homogénea en el núcleo, cuya intensidad puede variar
dependiendo de la concentración de los
anticuerpos presentes en le suero.
La placa de la cromatina en células en división puede estar teñida de manera compacta ,
delineada o difusa y los nucléolos pueden o no estar
teñidos.
El patrón periférico se caracteriza por tinción
regular alrededor del núcleo; el centro de este patrón
muestra menos tinción. La placa de la cromatina se tiñe
de forma delineada o compacta.
Los patrones de ANA que se observan con mayor frecuencia son los moteados, tanto finocomo grueso. La descripción de estos patrones
ha generado confusión, en el sentido de que varios autores definen el patrón moteado grueso como aquel en el que el núcleo se observa teñido con gránulos gruesos y el
patrón moteado fino lo definen como núcleo teñido con gránulos finos.
El patrón moteado grueso se debe definir como tinción en el núcleo con gránulos finos o gruesos, los nucleolos están
teñidos y la placa de la cromatina en células en
división no se tiñe, es decir, no hay reconocimiento de los
componentes de la cromatina.
El patrón moteado fino, este se caracteriza por tinción del núcleo con gránulos finos o gruesos, los nucleolos no se tiñen así como tampoco se
tiñe la placa de la cromatina en células en división.
El patrón centromérico tiene como características que los
núcleos se tiñen con puntos finos distribuidos de manera homogénea en el citoplasma de las células en interfase. La
tinción en las células en división muestra un
punteado fino localizado en la placa de la cromatina.
El patrón nucleolar tiene como característica una
tinción intensa de los nucleolos. La placa de la
cromatina en las
células en división se tiñe de manera difusa debido a
reactividad cruzada de los anticuerpos dirigidos contra los RNA nucleolares con el
ADN de la cromatina.
El patrón de la lámina nuclear o laminar es aquel en el que
se observa tinción concentrada alrededor del
núcleo y no se extiende hacia el citoplasma. A diferencia
del patrón periférico, la placa de la cromatina en las células
en división es negativa.
El patrón centriolar se identifica por la tinción intensa de los centriolos en células en
división. Las estructuras teñidas se pueden identificar
desde la fase G2, donde se ven dos puntos muy juntos, y en metafase, donde se localizan
en los polos de la célula.
Cuando se tiñen los centriolos, los filamentos del huso acromático y las células en interfase tienen un patrón
moteado fino. El patrón se define como NuMA-1(del
inglés, nuclear mitoticapparatus) B . La tinción de
los centriolos y del huso mitótico sin tinción del
citoplasma en células en interfase se define como
NuMA-2 C.
El patrón citoplásmico que se conoce como patrón de
filamentos intermedios o de músculo liso y se caracteriza por tinción en forma de hilos en el citoplasma. Un patrón de filamentos intermedios
con título mayor a 1:160, se debe interpretar como un
resultado positivo para anticuerpos antimusculo liso.
Se considera con títulos positivos si éstos son mayores a 1/20. Se informa como positivo o
negativo.
La presencia de Ac anti ADN nativo se considera como patognomónica de LES.
Se detecta en 60 - 70 % de casos. Este porcentaje puede aumentar si se considera sólo
en enfermedad activa.
ANTICUERPOS ANTI ADN NATIVO
Su presencia se correlaciona con:
Nefropatía lúpica
Manifestaciones neurológicas
lúpicas.
El aumento es inversamente proporcional a la disminución
de C3.
Los niveles persistentes aumentan o
disminuyen y parecen
asociarse a un mejor
pronóstico.
ANTICUERPOS ANTIHISTONAS
Pueden reaccionar con fracciones aisladas del complejo ADN histonas o con el octámero formado por los dímeros
H1, H2A, H2B, H3, H4.Son característicos del LES inducido por fármacos en un
90 %.
En lupus inducido por procainamida y en lupus espontáneo predominan los anticuerpos dirigidos contra
H1 y H2A-H2B y en el lupus inducido por hidralazinasuelen reaccionar con H3-H4.
Es frecuente la reacción cruzada entre anticuerpos anti-histona y FR.
Puede dar positivo en AR y Síndrome de Feltyocasionalmente.
ANTI Ku
El antígeno correspondiente está formado por dos proteínas ligadas covalentemente formando un heterodímero que une DNA, con un posible
papel en la activación transcripcional, replicación del DNA y proliferación celular.
Aparece en LES y en las enfermedades musculares.
ANTICUERPOS CONTRA ANTÍGENOS NUCLEARES EXTRAIBLES (ENA)
Dirigidos contra antigenos nucleares , o sea su blanco son antígenos nucleares no histonas o complejos RNA proteínas:
SSA/RO SSB/LAMi 2RNP Scl 70 Jo-1
ANTICUERPOS ANTI-SM Y ANTI-RNP
Los antígenos Sm y RNP están muy relacionados.Pueden diferenciarse mediante digestión enzimática, ya
que el Sm es resistente a ARNsa y tripsina y el RNP es sensible.
Están compuestos por ribonucleoproteínas nucleares de pequeño tamaño "SMALL NUCLEAR RIBONUCLEO
PROTEIN" (snRNP).
Los anticuerpos anti Sm precipitan snRNP que contienen varios tipos de ARN (U1, U2, U4, U5 y U5-ARN).
Reaccionan con una fracción libre del antígeno Sm y con otra asociada al antígeno RNP.
Los anticuerpos anti-Sm son específicos en un 99 % para LES y forman parte de los criterios
diagnósticos.
Se relacionan con actividad de la enfermedad.
Los anticuerpos anti-RNP se detectan en un 95 -100 % de pacientes con EMTC, pero no son específicos.
La Nefropatía es poco frecuente.
ANTICUERPOS ANTI SCL - 70 Y ANTICENTRÓMERO
El antígeno Scl-70 es una proteína cromosómica identificada como la enzima ADN topoisomerasa 1.Una enzima nuclear que actúa en el ADN rompiendo transitoriamente el esqueleto fosfodiéster del ADN y
recomponiendo los finales del ADN libre.
Son específicos para esclerodermia y aparecen en hasta un 40 % en la esclerodermia difusa y en un 10 -
15 % en el síndrome de CREST.
Se asocian con la esclerosis cutánea difusa y con mayor riesgo de fibrosis pulmonar.
Estos anti cuerpos dan lugar al patrón nuclear difusamente granular en la IF.
La positividad de estos anticuerpos implica un peor curso (difuso) de la enfermedad, con
afectación cutánea más grave y mayor frecuencia de afección articular y pulmonar.
Los anticuerpos anticentrómero reconocen proteínas laminares del cinetocoro cromosómico.
Son responsables de un patrón moteado característico en la IFI
Se detectan en pacientes con:
Síndrome de CREST (70 - 85 %)
Esclerodermia difusa (10 - 30 %)
En un pequeño número con otras conectivopatías.
ANTICUERPOS ANTI-RO/SSA Y ANTI-LA/SSB
Los antígenos Ro/SSA y La/SSB son complejos ribonucleoproteicos de pequeño tamaño que se localizan en el núcleo y en citoplasma (scRNPs).
Los anticuerpos anti Ro producen IFI nuclear .
Los anticuerpos anti La precipitan los mismos ARN y otros de origen humano y vírico.
Reconocen una proteína muy susceptible a la degradación proteolítica.
Los anticuerpos anti Ro detectan:
Síndrome de Sjögren primario (60 - 70 %)LES (30 - 40 %)
Otras conectivopatías
Son característicos del:
Lupus neonatal Lesiones cutáneas
Bloqueo cardíaco congénito
En recién nacidos cuya madre presentaanticuerpos anti Ro.
Lupus cutáneo subagudo
Los anticuerpos anti Ro se han asociado a LES con mayor frecuencia de lesiones cutáneas
fotosensibles, trombocitopenia, FR y vasculitis cutánea.
Los anticuerpos anti La pueden aparecer junto a los anticuerpos anti Ro.
ANTICUERPOS ANTI Jo 1
En pacientes con polimiositis se han identificado diferentes anticuerpos:
• anti PM1 • anti Mi 1 y 2 • anti Jo 1
La mayoría reconocen enzimas sintetasas t-ARN y se asocian con miositis y enfermedad intersticial
pulmonar.
Los más frecuentes son los anticuerpos anti-Jo 1, que reconocen una subunidad de la enzima histidil-
t ARN sintetasa.
El antígeno puede expresarse en el núcleo y en el citoplasma.
Los anticuerpos anti Jo-1 son específicos de polimiositis, se detectan en 20 - 30 % de los
casos.
Enfermedad intersticial pulmonarArtritis
y Fenómeno de Raynaud
Se asocian con una mayor incidencia de:
Anticuerpos Antinucleares Anti Mi-2
Está dirigida contra un antígeno nuclear y asociado casi exclusivamente con
Dermatomiositis .
También se ve este autoanticuerpo en 10% de los pacientes con Dermatomiositis juvenil. Los
pacientes con anti Mi-2 suelen tener inicio agudo de la enfermedad y una buena respuesta
al tratamiento.
Anticuerpos anti-mitocondriales (AMA)
Estos anticuerpos son marcadores de diagnóstico para CBP y están dirigidos contra el
complejo enzimático de las 2-oxo-ácido deshidrogenasas.
Los AMA en los pacientes con CBP son los anticuerpos con mayor sensibilidad de todas las enfermedades hepáticas y su especificidad para distinguir pacientes con CBP de pacientes con
hepatitis autoinmune es de 92%.
Los antígenos blanco son la dihidrolipoamidaaciltransferasa (subunidad E2) del complejo
enzimático piruvato deshidrogenasa e incluyen las subunidades E2 de la piruvato deshidroge-
nasa (PDC-E2), 2-oxo-ácido deshidrogenasa (OADC-E2) y la 2-oxoglutamato deshidrogenasa
(OGDC-E2).
Algunas consideraciones sugieren que los AMA no son patogénicos, ya que estos auto-
anticuerpos presentan reactividad contra las mitocondrias de todos los tejidos y no solo las
que se encuentran en el epitelio biliar.
Es posible que el estímulo inicial para la producción de anticuerpos, sea una infección
que provoque una modificación de los antígenos mitocondriales, lo que podría contribuir a la
inducción de la enfermedad.
Ed Con Lab Clín 2004;7:44-52
Anticuerpos antifibrilina
La fibrilina es una proteína básica nucleolar loca-lizada en la ribonucleoproteína U3, un complejo
pro- teico involucrado en la síntesis de RNA ribosomal. Los anticuerpos anti-fibrilina se asocian
con compromiso cutáneo difuso, hipertensión pulmonar y compromiso del tracto gastrointestinal.
Desencadenan también la diferenciación de los fibroblastos con fenotipo normal hacia uno de tipo
profibrótico, a través de un mecanismo TGF-β (factor de crecimiento)
Anticuerpos Anti-Th
Los anticuerpos anti-Th/To, dirigidos directamente contra proteínas nucleolares que interactúan con el RNA, se detectan sólo en el
4% de los pacientes y se asocian con compromiso cutáneo limitado, compromiso
pulmonar y gastrointestinal. Sin embargo, éstos no son específicos.
Rev. chil. reumatol. 2009; 25(1):17-2
ANTICUERPOS ANTICITOPLASMA DE NEUTRÓFILOS (ANCA)
Los ANCA fueron definidos mediante IFI como anticuerpos contra estructuras citoplasmáticas de neutrófilos en sueros de pacientes con vasculitis.
Los ANCA reaccionan con diferentes proteínas de los gránulos azurófilos del neutrófilo.
La IFI sobre neutrófilos fijados con etanol muestra dos patrones fundamentales.
Son también ANCA positivos la granulomatosis de Wegener y la poliarteritis nodosa microscópica
porque comparten algunos mecanismos patogénicos.
La negatividad de los ANCA no excluye ninguno de los diagnósticos.
En la granulomatosis de Wegener el patrón es C-ANCA y pueden detectarse en más de un 90 % de
pacientes con enfermedad activa.
En las formas limitadas el porcentaje depositivos disminuye a un 60 - 70 %.
Estos patrones P-ANCA están dirigidos contra mieloperoxidasa en el 61 % de los casos, pero hay
un 39% que presenta patrones C-ANCA.
En el 80 % de los pacientes con glomerulonefritis necrotizante segmentaria dentro o fuera del
contexto de una vasculitis necrotizante sistémica, se detectan P-ANCA.
También la glomerulonefritis necrotizante puede estar asociada a hemorragia pulmonar o síndrome
pulmonar-renal.
c-Anca : patrón de fluorescencia citoplasmático (clásico). En este caso los anticuerpos
anticitoplasma de neutrófilos muestran un patrón de tinción citoplasmático difuso y
granular. El antígeno diana es más frecuentemente la proteinasa 3 (PR3).
P-Anca: patrón de fluorescencia perinuclear (tinción protoplasmática) los anticuerpos anticitoplasma de neutrófilos muestran un patrón de fluorescencia en
forma de anillo, rodeando al núcleo. El antígeno diana es generalmente la mieloperoxidasa (MPO).
ANTICUERPOS ANTIFOSFOLÍPIDOS, ANTICOAGULANTE LÚPICO Y ANTICARDIOLIPINAS
Son anticuerpos que reaccionan cruzadamente con varios fosfolípidos, como:
• fosfatidiletanolamina• fosfatidilserina• fosfatidilinositol
Son anticuerpos poliespecíficos de clase IgG o IgM que reaccionan cruzadamente con ADN y En el 80 % de los
pacientes con glomerulonefritis necrotizante segmentaria dentro o fuera del contexto de una vasculitis necrotizante
sistémica, se detectan P-ANCA.
Anticoagulante lúpicoFactores capaces de inhibir en vitro las pruebas de coagulación
dependientes de fosfolípidos, pero in vivo carecen de efecto anticoagulante.
Actúan a nivel del complejo de conversión de protrombina en trombina, inhibiendo la formación de protrombina y trombina.
Anticuerpos responsables de falsos positivos en la serología luéticaDirigidos contra antígenos como el VDRL o el RPR.Formados por: lecitina, cardiolipina y colesterol.
Anticuerpos anticardiolipinasSe unen in vitro a fosfolípidos cargados negativamente
(fosfatidilserina, fosfatidilglicerol o fodfatidilinositol)
Otras enfermedades AutoinmunesAnemia hemolítica autoinmune
Tiroiditis de HashimotoPúrpura trombopénica idiopática.
La presencia de anticuerpos antifosfolípidos se debe sospechar ante cualquier falso positivo en la serología de
lúes o en presencia de alargamiento en el tiempo de tromboplastina parcial activada por anticoagulante
lúpico.
Las manifestaciones asociadas a la presencia de anticuerpos antifofolípido son:
Trombopenia
Trombosis venosas o arterialesAnemia hemolítica Livedo reticularis Migrañas
Úlceras en miembros inferiore Valvulopatías ACV agudos
Abortos recurrentes
Este síndrome asociado a la presencia de anticuerpos antifosfolípidos puede aparecer en el curso de LES u otras patologías, pero muchos pacientes con estos anticuerpos no presentan ninguna de las patologías asociadas. En estos
casos se habla de síndrome antifosfolípidoprimario.
Criterios diagnósticos para el anticoagulante lúpico:
a) Prolongación del tiempo de coagulación in vitro en una prueba fosfolípido dependiente.
b) Evidencias negativas usando mezclas con plasma normal: el tiempo de coagulación no se corrige.
c) Evidenciar la dependencia de fosfolípidos: el tiempo de coagulación se corrige cuando se agrega al sistema una
fuente de fosfolípidos que pueden ser plaquetas o fosfolípidos puros.
d) Ausencia de déficit de algún factor de coagulación o de otro inhibidor específico.
Principales técnicas dependientes de fosfolípidos que se realizan en el laboratorio:
KPTTTiempo de coagulación con caolín (KCT)
Tiempo de veneno de víbora de Rusell diluido (DRVVT)Los anticuerpos anticardiolipinas se estudian por RIA y
ELISA.
Estos anticuerpos se dirigen a cardiolipinas puras y hacia un cofactor plasmático, la ß2 glicoproteína I, unido o no a
las cardiolipinas.
Se deben determinar junto con el anticoagulante lúpicoante la sospecha de síndrome antifofolipídico.
Técnicas de detección de autoanticuerpos
Inmunofluorescencia Indirecta
(IFI)
Radioinmunoanalisis(RIA)
Aglutinación
ELISA
Nefelometría
D.F. Hernández Ramírez, J. Cabiedes / Reumatol Clin. 2010;6(3):173–177174
Inmunofluorescencia indirecta
La técnica se basa en el reconocimiento de los anticuerpos que reconocen estructuras
antigénicas celulares nativas. La interacción se evidencia por medio de un anticuerpo
antiinmunoglobulina humana, producido en conejo, cabra o cobayo, dirigido contra las
fracciones constantes (Fc) de las inmunoglobulinas IgG, IgA y/o IgM.
Este anticuerpo antiinmunoglobulina humano está conjugado o acoplado a un fluoróforo
(generalmente isotiocianato de fluoresceína[FITC]). Los resultados del reconocimiento de los antígenos por los autoanticuerpos presentes en
el suero, plasma o cualquier otro líquido, se evaluán en un microscopio de epifluorescencia.
Para la detección de anticuerpos que reconocen antígenos nucleares se utilizan como sustratos líneas celulares epiteliales humanas como las
células HEp-2 o las células HeLa.
En el caso de los anticuerpos contra componentes de los gránulos primarios y específicos de los polimorfonucleares o
anticuerpos anticitoplasma de neutrófilos(ANCA), se utilizan neutrófilos fijados con etanol
y formalina.
Ensayo inmunoenzimático
Como se mencionó anteriormente, el ELISA es una de las técnicas más utilizadas para
identificar o confirmar la especificidad de los anticuerpos presentes en las muestras de los pacientes con enfermedades autoinmunes.
Si bien existen diferentes tipos de ELISA, el más utilizado en el laboratorio de diagnóstico de
autoinmunidad es el ELISA indirecto.
El cual se fundamenta en el reconocimiento de los anticuerpos específicos presentes en las
muestras de los pacientes, mediante un anti-cuerpo dirigido contra la región Fc humana de cualquier isotipo (IgG, IgA o IgM) e inclusive de cualquier subclase (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1
o IgA2).
Los anticuerpos anti-Fc están unidos a enzimas como la peroxidasa o la fosfatasa alcalina.
Los antígenos utilizados en las placas de ELISA pueden ser nativos, recombinantes (antígeno
completo o epítopo específico) o sintéticos (epítopo específico). Después de permitir la
interacción de los anticuerpos de las muestras de los pacientes con el antígeno pegado a la
placa de ELISA
Se realizan lavados para eliminar los anticuerpos inespecíficos y se agrega el anticuerpo antiinmunoglobulina humana unido a enzima, permitiendo la
interacción por un tiempo determinado.
Posteriormente, se adiciona la solución que contiene el sustrato cromogénico específico de la
enzima (Tetrametilbenzidina [TMB] para la peroxidasa o p-nitrofenilfosfato para la fosfatasa
alcalina) el cual cambiará de color en función de la cantidad de anticuerpos conjugados con la enzima y
cuya cantidad depende de los anticuerpos del paciente que reconocieron al antígeno pegado a la
placa.
La intensidad de coloración es directamente proporcional a la cantidad de anticuerpo del
paciente unido al antígeno.
Engvall E, Perlman P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantita- tive assay of immunoglobulin. G Immunochem. 1971;8:871–4.
Electroinmunotrasferencia
La EIT, junto con el ELISA son las técnicas de mayor sensibilidad y especificidad para la
detección de anticuerpos contra antígenos específicos.
Se fundamenta en el reconocimiento de anticuerpos que tienen especificidad por
antígenos que se absorben en una membrana (de nitrocelulosa o nylon).
Los antígenos adsorbidos en la membrana fueron previamente separados en geles de
poliacrilamida-dodecil sulfato de sodio (PAGE-SDS) y transferidos a las membranas.
La unión de los anticuerpos a los antígenos específicos se detecta mediante la adición de un
anticuerpo que reconoce la región Fc de las inmunoglobulinas humanas, el cual está
acoplado a una enzima (fosfatasa alcalina o peroxidasa).
La unión se revela con la adición de un sustrato-cromogénico soluble (alfa-naftol/Fast red o NBT/
BCIP [cloruro de azul de tretrasodio/sal de toluidina de 5-bromo-4- cloro-3-indolfosfato], para cada enzima, respectivamente) el cual se precipita en el sitio en donde se encuentra el
complejo antígeno- anticuerpo por la acción de la enzima.
Neal W. Western blotting: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-
polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radio- graphic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal Biochem. 1981;112:195–203.
NEFELOMETRÍANefelometría deriva del griego Nephele, significa nube o neblina. Se define como la detección de la energía lumínica dispersa o reflejada hacia un
detector que no se encuentra en el camino directo del haz luminoso.
Las mediciones se realizan en un determinado ángulo en relación con dicho haz. La intensidad de luz dispersa en un determinado ángulo está
en función de la longitud de onda del rayo incidente, del tamaño y forma de las partículas.
La formación de inmunocomplejos se ha relacionado con la cuantía de dicha dispersión y se ha empleado como fundamento para cuantificar
antígenos.
La nefelometría tiene aplicación para la determinación de fracciones del complemento, inmunoglobulinas, transferrina, haptoglobina,
cadenas kappa y lambda, albúmina, pre-albúmina, proteína C reactiva, factor reumatoide, alfa 2
macroglobulina y otras proteínas.
GRACIAS!!!
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