ENZIMAS USADAS EN CLONAJE MOLECULAR

1- Enzimas de Restricción

2.- Otras enzimas

B. Paz

2011-I ( Ing. Biotecnológica)

MAPA DE RESTRICCION DEL pBR 322

OTRAS ENZIMAS USADAS EN CLONAJE MOLECULAR Recomendaciones para su uso:

Nunca usar una de estas enzimas en una reacción que contiene < 0.1 mg/ml de proteína. En estos casos usar BSA

Trabajan eficientemente sólo cuando la concentración de sustrato es la adecuada. Tratar siempre de trabajar a concentraciones cercanas a la Km.

Usar el pH, Temperatura y los requerimientos iónicos que les corresponde

RELACION DE ENZIMAS(I)

DNA POLIMERASAS: DNA POLIMERASA I (Holoenzima) FRAGMENTO KLENOW DE LA DNA POL I DNA POLIMERASA DE T4 DNA POLIMERASA DE T7 Taq DNA POLIMERASA TRANSCRIPTASA REVERSA DNA POLIMERASA TRANSFERASA TERMINAL

RELACION DE ENZIMAS (II)

RNA POLIMERASAS DNA DEPENDIENTES:

LIGASAS

QUINASAS

FOSFATASAS

RELACION DE ENZIMAS (III) NUCLEASAS:

Nucleasa Bal 31 Nucleasa S1 Ribonucleasa A Ribonucleasa T1 Desoxirribonucleasa I Exonucleasa III

CARACTERISTICAS DE LAS DNA POLIMERASAS

Son usadas en varias etapas del clonaje molecular en donde se sintetiza DNALa mayoría requiere de un molde y sintetizan un producto complementarioPueden también copiar RNA pero lo hacen con muy poca eficienciaLas más usadas son : DNA pol I, fragmento Klenow, DNA pol T4, DNA pol T7, Taq polimerasa, Transcriptasa reversa y DNA pol transferasa terminal

COMPARACION DE LA ACCION DE LAS DNA POLIMERASAS

DNA pol pol I F. K. Taq pol -

R.T.

Polimeriza

5’→3’ +

+ +

+

Exonucleasa

5’→ 3’ + -

+ +

Exonucleasa

3’→ 5’ + + - -

Actividad RNAasa H

+ - - +

P.M.(Kd) 109 76 94 84 y 170

No Unid. 1

1 1 1 y 2

1.1 DNA POLIMERASA I (Holoenzima)

Características:

1. Tiene una sóla cadena polipeptídica

2. P.M de 109,000

3. Actividad polimerizante 5’→ 3’

4. Actividad exonucleásica 5’→3’ y 3’→5’

5. Tiene actividad RNAasa H

DNA POLIMERASA I (Holoenzima)

USOS: Marcación de DNA mediante “nick

translation” Fue usada originalmente para copiar la

cadena complementaria del cDNA en el clonaje del cDNA

Marcar el extremo 3’ del DNA

1.2 FRAGMENTO KLENOW (Fragmento largo de la DNA de la DNA polimerasa I) Características:1. En 1970 Klenow y Henningsen mediante

tratamiento proteolítico limitado de la DNA pol I obtuvieron un fragmento largo (PM 76000) que mantenía la actividad polimerizante y exonucleásica 3’→5’

2. Hoy día se le obtiene al tratarla con subtilisina o mediante clonaje

3. Permite hacer algunos experimentos superando los problemas de la acción exonucleásica 5’→3’ de la DNA pol I

FRAGMENTO KLENOW (USOS I)

USOS:

1. Llenar los terminales 3’ creados por la digestión del DNA con las enzimas de restricción. Generalmente FK trabaja con el mismo tampón que el usado para la RE.

2. Marcar el terminal de un fragmento de DNA usando dNTPs marcados con P-32.

3. Marca terminal en la cola 3’ del DNA

FRAGMENTO KLENOW (Usos II)

Usos:

4.- Sintetizar la hebra complementaria del cDNA en experimentos de clonaje del cDNA

5.- Secuenciación del DNA por el método de Sanger (Método del dideoxi)

6.- En PCR

1.3 DNA POLIMERASA DEL T4CARACTERÍSTICAS:

1. A semejanza del FK la DNA polimerasa del bacteriófago T4 tiene acción polimerizante 5’→3’ y acción exonucleásica 3’→5’, que es más activa en el DNA de una hebra que el de doble hebra.

2. La actividad exonucleásica de la DNA pol del T4 es 200 veces más activa que la del FK

DNA POLIMERASA DEL T4 USOS ADEMAS DE LOS SEÑALADOS

PARA EL FK:1. Marcación de fragmentos de DNA para

pruebas de hibridización, pudiendo los fragmentos ser convertidos en pruebas específicas mediante el uso de enzimas de restricción.

2. Extensión de primers oligonucleotídicos mutagénicos que se han unido a moldes de DNA de una sola hebra.

1.4 DNA POLIMERASA DEL BACTERIOFAGO T7 CARACTERÍSTICAS Es la DNA polimerasa que se induce después de la

infección de E. coli por el bacteriófago T7 Esta polimerasa se presenta como la unión de 2

proteínas, la proteína del gen 5 del T7 y la proteína del hospedero tiorredoxina

Tiene actividad polimerizante 5’→3’, carece de actividad exonucleásica 5’→3’; pero tiene una actividad exonucleásica 3’→5’ mil veces más activa que la del fragmento Klenow.

1.5 Taq DNA POLIMERASA

CARACTERISTICAS(I): Es una DNA polimerasa (PM 94000)

termoestable purificada inicialmente del Thermus aquaticus (Chien et al. 1976) y posteriormente obtenida mediante ingeniería genética (AmpliTaqTM Perkin Elmer Cetus)

Estas enzimas tienen actividad exonucleásica dependiente de la polimerización 5’→3’.

Taq DNA POLIMERASA

CARACTERISTICAS (II): En la incorporación de nucleótidos la enzima

trabaja mejor entre 75 a 80o C.

La actividad polimerizante se reduce a la mitad a 60o

C. y en 1/10 a 37o C. Requiere de iones Mg Los tampones fosfato inhiben a la Taq

polimerasa, debe usarse tampón Tris-HCl pH 8.3

AMIGOS

HERMANOS

Taq POLIMERASA

USOS

1. Para la secuenciación del DNA

2. Amplificación mediante PCR

A causa de la significativa amplificación que determina, puede utilizar cantidades muy pequeñas de DNA. Con sólo 100 ul de sangre podemos retirar suficiente DNA para PCR y para la detección de cualquier mutación.

1.6 TRANSCRIPTASA REVERSA

CARACTERISTICAS (I): Se conocen dos formas comercialmente

disponibles de transcriptasa reversa (TR):1. Una preparación obtenida del virus de la

mieloblastosis aviaria (AMV)

2. Una enzima aislada de una cepa de E. coli que expresa una copia clonada del gen de la TR del virus de la leucemia murina de Moloney (Mo-MLV)

TRANSCRIPTASA REVERSA

CARACTERÍSTICAS (II): Ambas enzimas carecen de actividad

exonucleásica 3’→5’ La aviaria (AMV) tiene 2 polipéptidos que

tienen tanto la actividad polimerizante y una poderosa actividad RNAasa H.

La murina (Mo-MLV) es una simple cadena polipeptídica (PM 84000), tiene actividad polimerizante y su actividad RNAasa H es más débil

TRANSCRIPTASA REVERSA

CARACTERISTICAS (III): La aviaria trabaja eficientemente a 42o C., que es

una temperatura normal para las aves; en tanto que la murina se inactiva rápidamente a esta temperatura.

Por lo anterior, los RNAs con una importante estructura secundaria se copian mejor con la enzima aviaria; sin embargo las preparaciones de AMV pueden estar contaminadas con una endonucleasa que corta el DNA

TRANSCRIPTASA REVERSA

CARACTERISTICAS (IV): La enzima aviaria trabaja más eficientemente a pH

8.3 que a pH 7.3 que es el más adecuado para la murina

Es tan crítico lo del pH que la longitud del cDNA sintetizado por ambas enzimas se reduce cuando el pH es diferente en tan sólo 0.2 unidades de pH del recomendado. Como el pH del tampón Tris, varía con la temperatura, se debe chequear el pH a la temperatura usada para la incubación

TRANSCRIPTASA REVERSA

USOS:

1. Su principal empleo es en la transcripción del mRNA en cDNA de doble cadena que puede ser insertada en los vectores procarióticos; aunque también puede ser usada tanto con DNA de una hebra o RNA para pruebas usadas en hibridización.

2. Para secuenciar DNA por el método del dideoxi cuando las otras polimerasas están fallando.

- :

TRANSCRIPTASA REVERSA

PARA LA FABRICACION DE “PRIMERS” PARA LA T.R., SE PUEDE USAR: Oligo dT ( 12 a 18 nucleótidos) Oligonucleótidos de secuencia al azar Oligonucleótidos de secuencia definida

LA Km DE LA T.R. PARA LOS dNTP ES MUY ALTA (rango milimolar); PARA PREVENIR LA TERMINACION PREMATURA DEL DNA QUE SE FORMA, SE DEBE USAR ALTAS CONCENTRACIONES DE dNTP

2. RNA POLIMERASAS DNA DEPENDIENTES RNA POLIMERASAS DE LOS FAGOS SP6, T7 y

T3.CARACTERÍSTICAS Los fagos señalados sintetizan una RNA polimerasa

DNA dependiente que reconocen e inician la síntesis de RNA sobre moldes de DNA de doble hebra, que llevan el promotor apropiado específico del fago

Los genes de estas enzimas han sido clonados y se expresan en E.coli y levadura

RNA POLIMERASAS DNA DEPENDIENTES USOS1. Síntesis de RNA de una hebra para ser usado

como prueba para hibridización2. Síntesis de RNA para ser usado como mRNA

funcional para traducción “in vitro”3. Síntesis de RNA para ser usado para estudiar

el “splicing” “ in vitro”4. Para transcripción de genes clonados en

bacterias y levaduras

RNA POLIMERASAS DNA DEPENDIENTESACCION DE LAS RNA POL. DE SP6,T3 y T7Actividad : Polimeriza el RNA en sentido 5’→ 3’

Sustrato : DNA de doble hebra conteniendo el promotor

específico.

Ejemplo:

5’ SP6 G A T C A T C A T C A T C G A T C

PROMOTOR

3’ C T A G T A G T A G T A G C T A G

Mg2* RNA pol de SP6

rATP,rGTP,rUTP y rCTP ↓

5’ppp G A U C A U C A U C A U C G A U C

3. DNA LIGASAS Las DNA Ligasas son enzimas usadas para

unir dos piezas de DNA Las más usadas son:

DNA ligasa del bacteriófago T4 DNA ligasa de E. coli

DNA LIGASA 3.1 DNA LIGASA DEL BACTERIOFAGO T4

Polipéptido de 68 000 daltons de P.M. que cataliza la formación de enlaces fosfodiéster entre el 3’ hidroxilo y el 5’ fosfato terminal en el DNA

USOS: Unir moléculas de DNA con terminales cohesivos

-Esta acción es estimulada por PEG a bajas concentraciones y requiere de ATP y iones Mg

Unir moléculas de DNA con terminales romos- Es más lenta que la acción anterior pero aumenta su

velocidad en presencia de NaCl 200 mM

DNA LIGASA

3.2.- DNA LIGASA de E. coli Cataliza la formación de enlaces diéster fosfóricos en

los terminales cohesivos del DNA Los estudios iniciales indicaron que no unía terminales

romos, pero se ha mostrado que en presencia de PEG puede hacerlo

No une segmentos de RNA Es de menos uso que la DNA ligasa de T4

RNA LIGASA DE BACTERIÓFAGO T4 Características:

La RNA ligasa del bacteriófago T4 cataliza la unión covalente de fragmentso de RNA o de DNA de una hebra.

Usos:- Como puede usar como sustratos mononucleótidos

(ejemplo pNp) se le puede usar para marcar el 3’ terminal del RNA

- Síntesis de oligodesoxirribonucleótidos

4. POLINUCLEOTIDO QUINASA DEL BACTERIOFAGO T4 CARACTERISTICAS:

Cataliza la transferencia del fosfato γ del ATP al extremo 5’ terminal del DNA y RNA

USOS:

-Marcación del extremo 5’ terminal del DNA para la secuenciación de DNA por el método de Maxam-Gilbert

-Forforilación de linkers sintéticos

5. FOSFATASAS ALCALINAS

CARACTERISTICAS Se usa con mayor frecuencia la fosfatasa

alcalina bacteriana (BAP) y la fosfatasa alcalina de intestino de ternero (CIP).

Catalizan el retiro del residuo 5’ fosfato del DNA tanto del RNA, DNA y de rNTPs y dNTPs

FOSFATASAS ALCALINAS

USOS: Retiro de los fosfato 5’ del DNA y

RNA antes de sustituirlo por fosfato marcado con P-32

Retiro de los 5’ fosfato del DNA para prevenir su unión.

6. NUCLEASAS: Nucleasa Bal 31

CARACTERISTICAS: BAL 31 es predominantemente una exonucleasa

3’ que retira mononucleótidos de ambos extremos 3’ de las dos hebras del DNA.El DNA de una hebra que va dejando es degradado por su acción endonucleásica

La reacción es estrictamente dependiente de calcio y por lo tanto puede ser detenida en cualquier momento por la adición de agentes quelantes del Ca como el EGTA

NUCLEASAS: Nucleasa Bal 31

USOS: Remoción de nucleótidos del extremo terminal

del DNA en una manera controlada. Mapear sitios de restricción en el DNA Mapear estructura secundaria del DNA( lugares

de unión entre B-DNA y Z-DNAy sitios de modificaciones covalentes y no covalentes en el DNA e doble hebra)

Remoción de nucleótidos de RNA de doble hebra

NUCLEASAS: Nucleasa Bal 31

DETERMINACION DE LA VELOCIDAD DE REMOCION DE LOS NUCLEÓTIDOS:

2Vmáx . Mn V = ---------------------------

( Km + (S))

Donde : Vmax de la reacción

Mn el P.M, promedio de un

mononucleótido

(S) Moles/L de DNA en el tiempo O

NUCLEASAS: Nucleasa Bal 31

OBSERVACION IMPORTANTE:Cuando los productos de la digestión de Bal 31 serán ligados, se debe tener muy en cuenta que la actividad exonucleásica 3’ de la enzima es 20 veces más eficiente que la actividad endonucleásica.

Lo anterior determina que el tratamiento con DNA polimerasa de T4 o el fragmento Klenow deben ser usados para digerir las colas de una hebra que van quedando.

Almacenar la enzima a cero grados, no congelada.

ACCION DE LA NUCLEASA BAL 31

5’ ----------------------------- 3’ 3’ ----------------------------- 5’ ↓ ------------------ ------------------ ↓ ------- ------- (10 A 20% )

NUCLEASA S1 CARACTERISTICAS:

La nucleasa S1 degrada DNA y RNA de hebra simple para dar nucleótidos 5 fosfato ( dN ó rN)

Los DNA y RNA de doble hebra y los híbridos DNA-RNA son relativamente resistentes a la enzima; pero esto se supera cuando se usan concentraciones grandes de la enzima

PROTECCION DEL ADN CON NUCLEASA S1

RIBONUCLEASA A DE PANCREAS DE BOVINO CARACTERISTICAS:

RNAasa A es una endorribonucleasa que ataca especificamente RNA de una hebra en el extremo 3’ de sus nucleótidos pirimidínicos, rompiendo la unión del fosfato al nucleótido adyacente

Sus productos son nucleótidos pirimidínicos 3’ fosfato y oligonucleótidos con terminal nucleotídico pirimidínico 3’ fosfato

5’pApGpGpCpCpApGpUpAp3’ > 5’pApGpGp + Cp + Cp + ApGpUp + Ap 3’

RIBONUCLEASA A DE PANCREAS DE BOVINO La RNAasa A es activa en ausencia de cofactores y

cationes divalentes; pero es inhibida por el inhibidor placentario de la RNAasa o por los complejos vanadil ribonucleósidos.

USOS Retiro de regiones no hibridizadas de RNA en los

híbridos DNA-RNA

RIBONUCLEASA T1 ( Aspergillus oryzae) CARACTERISTICAS

RNAasa T1 es una endorribonucleasa que ataca especificamente ataca los grupos 3’ fosfato de los nucleótidos de guanina y rompe el enlace 5’ fosfato al nucleótido adyacente.

Los productos finales son guanosina 3’ fosfato y oligonucleótidos con terminal en guanosina3’ fosfato.

5’pApGpGpCpUpGpApC 3’ > 5’pApGp + Gp + CpUpGp + ApC 3’

RIBONUCLEASA T1 ( Aspergillus oryzae) USOS:

Retiro de regiones de RNA de los híbridos DNA-RNA

DESOXIRRIBONUCLEASA I(DE PÁNCREAS DE BOVINO)

CARACTERISTICAS: DNAasa I es una endonucleasa que hidroliza DNA de

doble hebra o de hebra simple preferencialmente en los lugares adyacentes a nucleótidos pirimidínicos

En presencia de iones Mg la DNAasa I ataca cada cadena de DNA independientemente

En presencia de iones manganeso la DNAasa I ataca ambas cadenas de DNA a aproximadamente el mismo lugar dando fragmentos de DNA que son romos o que sobresalen solamente en uno o dos nucleótidos (Melgar E.y Goldthwait D.A. J. Biol. Chem 243:4409, 1968 )

DESOXIRRIBONUCLEASA I(DE PÁNCREAS DE BOVINO)

USOS: Introduciendo huecos al azar en el DNA de doble

hebra en preparaciones para “ nick translation”. Introduciendo un solo hueco en DNAs circulares en

preparaciones para mutaciones mediadas por bisulfito

Generando clones al azar para secuenciación en vectores del bacteriófago M13

Análisis de complejos proteína-DNA (DNAasa footprinting)

EXONUCLEASA III ( E. coli ) CARACTERISTICAS

La exonucleasa III cataliza el retiro de mononucleótidos 5’ del extremo 3’ terminal del DNA de doble hebra, no tiene actividad sobre DNAs de una hebra

Tiene como otras actividades añadidas una actividad endonucleasa específica para DNAs apurínicos y RNAasa H

5’ p----------------------------------OH 3’

3’OH------------------------------P 5’ ↓

EXONUCLEASA III(E. coli )

ACTIVIDAD:

5’ p----------------------------------OH 3’

3’OH------------------------------P 5’

↓

5’P---------------------OH 3’

3’OH--------------------P 5’

+ 5’pN OH