INDUCCION DE CALLO IN VITRO DE Daucus carota L. (ZANAHORIA)

Martens Lisbel,Novoa Lorena,Sanchez Pilar,Veja Christian. Asesor: Dr. Mauro Quiñones Taller de Biotecnología Vegetal. Facultad de Ciencias Biológicas

Universidad Ricardo Palma.

RESUMEN

Uno de los problemas en los cultivos de Daucus carota es que objeta mucho tiempo, inversión y áreas de cultivo, ocasionando consecuentemente la merma económica.Debido a esto, la demanda en la agricultura moderna ha llevado a la utilización de técnicas biotecnológicas que ayudan a evitar la susceptibilidad a las enfermedades y mejorar la productividad de las plantas, que resulta un método más eficiente, económico y rentable.

Una de estas técnicas es el cultivo a partir del callo. El callo es un tejido cicatril de división celular desdiferenciado y desorganizado, donde cada una de sus células es totipotente, es decir capaz de crecer, dividirse y dar lugar a una planta.En el presente trabajo se utilizó explantes de Daucus carota, sembrados en el medio MS (Murashigue – Skoog) como medio de cultivo nutricional para obtener crecimiento de tejido calloso.

INTRODUCCION Uno de los problemas en los cultivos de Daucus carota es que objeta mucho tiempo, inversión y áreas de cultivo, ocasionando consecuentemente la merma económica.Además presenta una susceptibilidad al ser afectada por diversas enfermedades, entre ellas la “podredumbre negra” causada por Stemphylium radicinum “hongo ascomiceto”, que causa oscurecimiento y muerte de las hojas y destrucción de la raíz; plagas como pulgón, gusanos grises, nematodos, etc.Debido a esto, la demanda en la agricultura moderna ha llevado a la utilización de técnicas biotecnológicas que ayudan a evitar la susceptibilidad a las enfermedades y mejorar la productividad de las plantas, que resulta un método más eficiente, económico y rentable. (OMS, 2005 y Sumpsi, J., 1982).

Una de estas técnicas es el cultivo a partir del callo. El callo es un proceso de desdiferenciación celular formado por la proliferación desordenada de células que da origen a una masa amorfa de tejido; es un proceso para obtener células germinativas de la planta seleccionada. (Quiñones, M., 2008); donde la respuesta embriogénica del callo depende del genotipo de planta. (Linz, 1984)En el presente trabajo se obtendrá tejido calloso en cultivo in Vitro de Daucus carota siguiendo el procedimiento descrito por Quiñones, M., 2008.

MATERIALES Y METODOS

Obtención de la plantaLa planta Daucus carota (Zanahoria) fue comprada en el supermercado wong, y trasladada al laboratorio de Biotecnología Vegetal de la Universidad Ricardo Palma en bolsa ziploc.

Preparación de medio de cultivoPara preparar el medio MS se separo una alicota y se agregaron los carbohidratos. Luego se enriqueció el medio con 2,4D (diclorofenoxiacético) y se midió el pH, el cual fue 5.5 – 6.5. Luego, se adiciono el gel rite y fue llevado al microondas para obtener el medio líquido. Se procedió a servir en tubos de ensayo y fueron sellados con papel aluminio. Por último se auto clavaron a 121C.

Esterilización del material biológicoLos explantes obtenidos del cambium de Daucus carota (Zanahoria) se colocaron en un beacker y fueron lavados con detergente, con ayuda de un cepillo y agua de caño. Luego se enjuago con agua destilada y seguidamente fueron sumergidos en alcohol 96% por 40 segundos. Los explantes fueron sumergidos en cloruro de mercurio (HgCl2

0.1%) por 10 minutos. Una vez transcurrido el tiempo indicado, el material biológico fue enjuagado en agua esterilizada 5 veces con un intervalo de 5 minutos por enjuague.

Tratamiento del explante e introducción en el medio de cultivoEn la cámara flujo laminar los explantes ya esterilizados se transfirieron a una placa Pietri estéril y se aíslo la parte nuclear del explante, se libero la yema con ayuda del bisturí y pinza de las células muertas que cubren el explante. Con ayuda de la pinza se introdujo el callo en forma aséptica en los tubos con medio de cultivo. Luego se sello el cuello del tubo con papel aluminio y se incubo a una temperatura de 27º C.

Monitoreo de la formación del calloEl monitoreo se llevo a cabo cada 7 días para evidenciar si hubo formación de tejido calloso. Con ayuda de una cámara digital se tomaron fotos.

RESULTADOS

Los explantes de Daucus carota fueron cultivados en un medio de cultivo MS enriquecido con 2,4D, se sembraron 8 tubos, observados en un periodo de cinco semanas. De los cuales 7 tubos evidenciaron contaminacion durante el transcurso de las cinco semanas(Fig.1), es decir el 88% de nuestras muestras fueron contaminadas. Solo un tubo presento desdiferenciacion y formacion de callo del explante de Daucus carota,en la segunda semana de cultivo, por lo tanto solo el 12% de nuestra muestra fue viable. Mostrando asi un alto indice de contaminacion de los explantes, probablemente microbiana o micotica o de fenolizacion.

Los explantes sembrados presentaban un color naranja en la primera semana, posteriormente fueron cambiando de color debido a la contaminacion, tanto del medio de cultivo enriquecido con 2,4D, como de los explantes, mostrando ciertos tubos una fenolizacion y por lo tanto un color oscuro del medio y del explante, lo cual afecto el desarrollo de la callogenesis.

Figure 1: Explante de Daucus carota con contaminacion (2da semana).

El unico tubo con desdiferenciacion, presento proceso de formación de callo en las dos terceras partes de su estructura no sumergida, sin tocar el medio de cultivo.(Fig.2)

La formación de tejido calloso despues de tres semanas de cultivo exhibio un crecimiento lento sobre la superficie del medio y el color fue cambiando de naranja a claro blanquecino, de consistencia seca y granulosa (Fig.3). De morfologia heterogenea, debido al crecimiento desorganizado del callo.

En la cuarta y quinta semana (Fig.4 y 5) se sigue evidenciando la totipotencialidad, y division constante del tejido calloso, en medio de cultivo MS enriquecido con 2,4D,in vitro. La auxina 2,4D tiene la capacidad para inducir procesos de diferenciación por lo que es necesaria para la formación del callo (Barba, 1987).

Los explantes estuvieron incubados en un cuarto climatizado con temperatura de 25Co. El proceso de desdiferenciacion se llevo a cabo en condiciones de oscuridad durante las cinco semanas de observacion.

Contaminación micótica

Figure 2: Dos semanas y se evidencia la desdiferenciacion del explante de D.carota en medio de cultivo MS.

Figure 3: 3ra. Semana, formacion de callo,del explante de Daucus carota en un medio de cultivo MS.

Figure 4: 4ta Semana, crecimiento en la formacion de callo de D.carota.

DISCUCION

Uno de los pasos importantes para la obtención del callo es la esterilización del explante, en la actualidad se ha generalizado el uso de etanol (70% v/v) y el hipoclorito de sodio de 1% al 3% contenidos en productos de uso domestico, con menor frecuencia hipoclorito de calcio y cloruro de mercurio, porque son compuestos altamente tóxicos y que no son fácilmente removibles del explante (Linz Re, Jarret RL.).

Se necesita la presencia de una auxina para la iniciación de un callo embriogénico, usualmente se emplea el 2,4-D, el cual brinda el estimulo de la iniciación de la embriogenesis somática en el callo. Sin embargo, la maduración de los embriones y la germinación no ocurren en la presencia de 2,4-D; En consecuencia hay que remover la auxina o usarla en concentraciones más bajas (Halperin 1964).

Es posible aumentar el potencial embriogénico de los callos de zanahoria exponiéndolos a niveles altos de sacarosa o de manitol; la sacarosa se utiliza en concentraciones de 2% y 3% hasta 12% demostrado por (Wheterell 1984).

CONCLUSIONES:

.Se obtuvo una muestra de tejido calloso aproximadamente entre la 4ta- 5ta semana de todas las muestras que se realizaron ya que el resto de los explantes presentaron una coloración más oscura a causa de la fenolizacion , otros presentando una despigmentación coloreando el medio MS, como también se vieron afectados por la contaminación por hongos ambientales .

.Para evitar la fenolizacion es requerida la utilización de antioxidantes en el medio, como el acido cítrico, acido ascórbico.

.Tener una asepsia adecuada para evitar el ingreso de hongos ambientales.

.Se sugiere determinar la concentración de sacarosa adecuada en el medio de cultivo para la inducción en menor tiempo.

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