MANUAL DE PROCEDIMIENTOS HEMATOLOGIacuteA Y COAGULACIOacuteN

CONTENIDO

Presentacioacuten7

Introduccioacuten9

SECCIOacuteN 1 GENERALIDADES11

11 Objetivo 11

12 Campo de aplicacioacuten 11

13 Responsabilidades11

14 Documentos de referencia12

SECCIOacuteN 2 MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD13

SECCIOacuteN 3 OBTENCIOacuteN DE MUESTRAS SANGUIacuteNEAS14

31 Objetivo14

32 Obtencioacuten de sangre venosa con jeringahellip14

33 Obtencioacuten de sangre venosa en tubos al vaciacuteo 16

34 Obtencioacuten de sangre de la vena yugular externa 18

35 Obtencioacuten de sangre capilar 19

SECCIOacuteN 4 ANTICOAGULANTES 22

41 Caracteriacutesticas baacutesicas de los anticoagulantes maacutes usados en hematologiacutea22

42 Anticoagulantes soacutelidoshellip22

43 Anticoagulantes liacutequidos 24

SECCIOacuteN 5 REALIZACIOacuteN Y TINCIOacuteN DEL FROTIS SANGUIacuteNEO 25

51 Meacutetodo de los dos portaobjetos 25

52 Coloraciones usadas 26

53 Tincioacuten con colorante de Wright27

SECCIOacuteN 6 HEMOGRAMA- HEMOGLOBINA- HEMATOCRITO 29

61 Recuento leucocitario 29

62 Recuento de gloacutebulos rojos 33

63 Determinacioacuten del volumen globular (Hto) 35

64 Dosaje de hemoglobina 38

65 Frotis de sangre perifeacuterica 40

66 Foacutermula leucocitaria 41

SECCIOacuteN 7 VELOCIDAD DE SEDIMENTACIOacuteN43

71 Meacutetodo de Westergren 43

72 Meacutetodo de Wintrobe 44

SECCIOacuteN 8 PERFIL DE HEMOSTASIA45

81 Principios generales 45

82 Mecanismo de coagulacioacuten 45

83 Exploracioacuten de la coagulacioacuten 46

84 Obtencioacuten del plasma 46

85 Tiempo de sangriacutea47

851 Meacutetodo de Ivy48

852 Meacutetodo de Duke49

86 Tiempo de coagulacioacuten de sangre total (TCST) 51

87 Tiempo de tromboplastina parcial activada (PTTK) 54

88 Tiempo de trombina 55

89 Tiempo de protrombina (Prueba de Quick) 56

SECCIOacuteN 9 RECUENTO DE RETICULOCITOS Y PLAQUETAS58

91 Recuento de reticulocitos 58

92 Recuento de plaquetas 60

SECCIOacuteN 10 LEUCOGRAMA63

101 Granulocitos63

102 Agranulocitos 65

103 Criterios para el desarrollo de un leucograma 67

SECCIOacuteN 11 ALTERACIONES ERITROCITARIAS79

Alteraciones en el tamantildeo 70

Alteraciones en la forma 71

Alteraciones de color72

Inclusiones anormales73

BIBLIOGRAFIacuteA79

ANEXO A Preparacioacuten de colorantes y soluciones maacutes

Usados en hematologiacutea81

ANEXO B Preparacioacuten de anticoagulantes 85

PRESENTACIOacuteN

Con el propoacutesito de uniformizar los procedimientos hematoloacutegicos que serealizan en los diversos laboratorios cliacutenicos el Instituto Nacional de Saludpone a disposicioacuten de la comunidad teacutecnico-cientiacutefica nacional el Manual deProcedimientos de Laboratorio en Teacutecnicas Baacutesicas de Hematologiacutea en elcual se incluyen todos los meacutetodos empleados en el campo hematoloacutegicobaacutesico De este modo se contribuye a mejorar la calidad de diagnoacutestico en loslaboratorios de los servicios de saludEl laboratorio de hematologiacutea cuenta con dos aacutereas baacutesicas Aacuterea deHematimetriacutea (hemograma VSE recuento de plaquetas etc) y Aacuterea deHemostasia Partiendo de esta estructura en este manual nos referiremos alas teacutecnicas baacutesicas empleadas en estas aacutereas partiendo de la toma de muestrahasta la realizacioacuten de las pruebas respectivasEs necesario enfatizar que para obtener resultados maacutes confiables es importantepero no imprescindible automatizar el laboratorio debido a que elloevitaraacute el posible error humano sobre todo en lo referente a recuentos celularesvalores de hemoglobina y constantes corpusculares ya que en estasvariables se trabaja con cantidades exactas de sangre hecho que es muydifiacutecil de lograr cuando se usan los meacutetodos manuales lo mismo sucede altratarse de las pruebas de hemostasiaEsperamos que este manual constituya una herramienta de consulta en laRed Nacional de Laboratorios de Salud ademaacutes de una guiacutea para el personalde laboratorio en general

INTRODUCCIOacuteN

El presente manual ha sido elaborado en forma simple didaacutectica y eminentementepraacutectica para que su contenido sea faacutecil de entender por el personalque labora en el laboratorio de hematologiacuteaSe divide en tres partes

1 En la primera parte se presentan los aspectos maacutes importantes de labioseguridad en el laboratorio

2 En la segunda parte se exponen las principales teacutecnicas baacutesicas del laboratoriode hematologiacutea

3 En la tercera parte se detallan las alteraciones maacutes frecuentes de la serieroja y de la serie blanca de un hemograma

El objetivo principal es protocolizar y estandarizar los procedimientoshematoloacutegicos que empiezan con la toma de muestra (siguiendo las pautasde control de calidad preanaliacutetica) hasta el procesamiento de eacutesta (fase analiacutetica)en la determinacioacuten correspondiente y por uacuteltimo en la emisioacuten de losresultados (fase postanaliacutetica) Debemos recalcar que cuando se realizanpruebas de hemostasia debe tenerse en consideracioacuten los cuidados comunesa toda prueba de laboratorio es decir las muestras deben obtenerse encondiciones apropiadas y rotularse debidamente Esperamos que el presentemanual sirva de guiacutea efectiva y que pueda ser enriquecido con nuevosaportes con la finalidad de alcanzar un trabajo de calidad

SECCIOacuteN 1

GENERALIDADES

11 OBJETIVO

Establecer y estandarizar los procedimientos baacutesicos de un examen dehemograma hemoglobina hematocrito recuento de plaquetas velocidad desedimentacioacuten y recuento de reticulocitos que sirvan de ayuda diagnoacutestica alcliacutenico

12 CAMPO DE APLICACIOacuteN

La aplicacioacuten de las teacutecnicas hematoloacutegicas nos sirve para estandarizar losprocedimientos a nivel nacional y para que sea de utilidad al personal teacutecnicoy profesional de los laboratorios cliacutenicos

13 RESPONSABILIDADES

131 El Centro Nacional de Laboratorios en Salud Puacuteblica a traveacutes de su

Direccioacuten Ejecutiva de Laboratorios de Referencia es responsable deautorizar la elaboracioacuten la revisioacuten y la actualizacioacuten del presente manualde acuerdo con los procedimientos aprobados por el Instituto Nacionalde Salud

132 Los directores de los establecimientos de salud son responsables deautorizar proporcionar los recursos necesarios y designar al personalresponsable para la aplicacioacuten de las disposiciones contenidas en elpresente manual

133 El personal de los establecimientos de salud es responsable de planificarlas acciones organizar controlar y capacitar al personal para cumplirlas disposiciones contenidas en el presente manual

134 Los jefes o responsables de los laboratorios deben asegurar el controlinterno de la calidad la idoneidad del personal equipos materialesreactivos e instalaciones

135 El personal meacutedico profesional y teacutecnico es responsable de seguir lasespecificaciones contenidas en el presente manual y aplicar los procedimientosespeciacuteficos indicados

14 DOCUMENTOS DE REFERENCIA

141 Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OrganizacioacutenPanamericana de la Salud Publicacioacuten cientiacutefica Nordm 439 Nordm 2 1983

142 Manual de normas de bioseguridad Instituto Nacional de Salud Serie deNormas Teacutecnicas Nordm 18 2ordf ed 1997

SECCIOacuteN 2

MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD

21 Para la obtencioacuten de muestras el personal involucrado en los diferentesprocesos para los exaacutemenes hematoloacutegicos debe aplicar las medidas debioseguridad establecidas en el Manual de Bioseguridad Serie de NormasTeacutecnicas Nordm 18

22 Se debe controlar sobre todo

221 Al personal que trabaja en el laboratorio de hematologiacutea

222 El proceso de coloracioacuten en el que se debe aplicar las medidas debioseguridad correspondientes al uso y manipulacioacuten de sustanciastoacutexicas o canceriacutegenas

223 Ver lo referente a medidas de proteccioacuten en caso de accidentes porinoculacioacuten

SECCIOacuteN 3

OBTENCIOacuteN DE MUESTRAS SANGUIacuteNEAS

31 OBJETIVO

Establecer y uniformizar criterios en el procedimiento de obtencioacuten de muestrassanguiacuteneas con un adecuado control de calidad ya que de ello dependeque el resultado del anaacutelisis de la muestra sea el correcto Se efectuaraacute enayunas o no dependiendo de la prueba a usar

32 OBTENCIOacuteN DE SANGRE VENOSA CON JERINGA

321 Materiales y equipos requeridos

3211 Algodoacuten

3212 Alcohol al 70

3213 Ligadura o torniquete de 25 a 30 cm de largo

3214 Jeringas de 5 mL

3215 Viales con anticoagulante EDTA

322 Obtencioacuten de la muestra

3221 Verificar que los elementos por utilizar esteacuten listos y que el pacientese sienta coacutemodo

3222 Aplicar el torniquete aproximadamente cuatro dedos por encima de laflexioacuten del codo o a 10 cm del codo sujetar con un medio nudo (Fig 1)

3223 Limpiar la zona con alcohol al 70 o alcohol yodado en un aacuterea de 2pulgadas (Fig 2)

3224 El paciente deberaacute abrir y cerrar la mano durante unos segundos ydespueacutes la mantendraacute cerrada esto ayudaraacute a visualizar las venassuperficiales (Fig 3)

3225 Se retira el estuche protector de la aguja y se coge la jeringa de talmanera que el bisel se encuentre hacia arriba (Fig 4)

3226 Se coloca la aguja en direccioacuten paralela a la vena se perfora la pielhaciendo avanzar la aguja 05-1 cm en el tejido subcutaacuteneo luego seperfora la vena (Fig 5)

3227 Se aspira la jeringa hasta el volumen requerido

3228 Retirar el torniquete e indicar al paciente que deje de hacer puntildeo Secoloca el algodoacuten seco encima de la puncioacuten y se retira la aguja (Fig 6)

3229 Retirar la aguja de la jeringa Verter la muestra lentamente por lasparedes del vial con anticoagulante No olvidar colocar una gota en lalaacutemina portaobjeto para realizar el frotis

32210 Agitar el vial en ciacuterculos sobre la mesa para homogeneizar la muestracon el anticoagulante

PUNTOS PARA LA EXTRACCIOacuteN DE SANGRE

(Toma de muestra)

Se obtiene de las venas de la fosa cubital

PROCEDIMIENTO

Fig 1 Fig 2 Fig 3

Fig 4 Fig 5

Fig 6 Fig 7

33 OBTENCIOacuteN DE SANGRE VENOSA EN TUBOS AL VACIacuteO

331 Materiales requeridos

3311 Algodoacuten

3312 Alcohol al 70

3313 Ligadura o torniquete de 25 a 30 cm de largo

3314 Tubos al vaciacuteo con anticoagulante EDTA (K3) EDTA (Na2) u otroanticoagulante

3315 Agujas con dispositivo para extraccioacuten de sangre al vaciacuteo

- Nordm 21 para adultos

- Nordm 22 para nintildeos y neonatos

De preferencia ambas de bisel corto para evitar la coagulacioacuten

332 Obtencioacuten de la muestra

3321 Repetir los pasos de 3221 a 3224

3322 Se retira el estuche protector de la aguja y eacuteste se enrosca al dispositivopara extraccioacuten de sangre al vaciacuteo

3323 Colocar la ligadura cuatro dedos por encima de la flexioacuten del codo o10 cm por encima de eacuteste y pedir al paciente que abra y cierre la manovarias veces para favorecer la dilatacioacuten de las venas

3324 Una vez escogida la vena desinfectarla con una pieza de algodoacutenembebido en etanol al 70

3325 Se coloca la aguja en direccioacuten paralela a la vena se perfora la pielhaciendo avanzar la aguja entre 05 cm y 1 cm en el tejido subcutaacuteneose inserta el tubo al vaciacuteo por la parte posterior y no preocuparse porla cantidad de sangre extraiacuteda ya que el mismo sonido del vaciacuteo avisaraacuteque la extraccioacuten terminoacute (Fig 8)

3326 Retirar la ligadura tirando del extremo doblado

3327 Colocar un pedazo de algodoacuten seco sobre la parte donde se encuentraoculta la aguja Sacar la aguja con un movimiento raacutepido y depositarlaen el recipiente de metal con desinfectante (Fig 9)

3328 Pedir al paciente que presione firmemente el algodoacuten durante 3 minutoscon el brazo extendido No se recomienda que se flexione el brazoa causa del riesgo que se forme un hematoma

3329 Mezclar por inmersioacuten suave la sangre con el anticoagulante contenidoen el tubo No agitar el contenido

Fig 8 Fig 9

333 Ventajas de una extraccioacuten de sangre venosa

3331 Pueden hacerse repetidos exaacutemenes con la misma muestra

3332 Parte de la muestra (plasma o suero) puede congelarse para referenciafutura

334 Desventajas de una extraccioacuten de sangre venosa

3341 La puncioacuten venosa por su largo procedimiento requiere mayor preparacioacuten que el meacutetodo capilar

3342 El meacutetodo es teacutecnicamente difiacutecil en nintildeos individuos obesos y pacientes en shock

3343 La hemoacutelisis debe ser evitada pues se puede obtener una disminucioacuten en el recuento de eritrocitos

3344 Debe evitarse prolongada estasis venosa producida por el torniquete pues produce hemoacutelisis y otros cambios que ponen la sangre en un estado inadecuado para el anaacutelisis de gases recuentos celulares determinacioacuten de pH sanguiacuteneo y algunas pruebas de coagulacioacuten

3345 La sangre anticoagulada si no es de obtencioacuten reciente no debe ser utilizada en extensiones de sangre pues algunos anticoagulantes producen cambios en las plaquetas que pueden causar aglutinaciones agregacioacuten plaquetaria y dificultan la identificacioacuten de leucocitos

3346 Puesto que algunos de los componentes de la sangre no son estables los recuentos de leucocitos y plaquetas e iacutendice de sedimentacioacuten deben realizarse antes de que pasen dos horas desde que se obtuvo la muestra

34 OBTENCIOacuteN DE SANGRE DE LA VENA YUGULAR EXTERNA

341 Materiales requeridos

3411 Algodoacuten

3412 Alcohol al 70

3413 Jeringas de 5 mL

3414 Viales con anticoagulante EDTA

342 Obtencioacuten de la muestra

3421 El paciente es cubierto por una saacutebana de manera que los brazospermanezcan inmovilizados a lo largo del cuerpo

3422 Al paciente se le coloca de cuacutebito dorsal sobre la mesa de examen ouna

camilla de manera que la cabeza cuelgue sobre el final de lamesa y el cuerpo sea

sujetado por un asistente

3423 Cuando el paciente grita la vena yugular externa se marca claramente

3424 Limpiar la zona en un aacuterea de 2 pulgadas con alcohol al 70 o

alcoholyodado

3425 Se repiten los pasos de 3225 a 3227 de la extraccioacuten de sangrevenosa

con jeringa

3426 Retirar la aguja de la vena y presionar suavemente con un algodoacutenseco

aproximadamente de 3 a 5 minutos Pedir al paciente que permanezcaechado diez

minutos

3427 Se repiten los pasos de 3229

3428 Se repiten los pasos de 32210

343 Ventajas

Constituye un buen meacutetodo para la obtencioacuten de sangre en pacientes conshock

con venas colapsadas

344 Desventajas

Por lo delicado en su procedimiento no se recomienda como rutina soacutelo encasos

en que no se pueda obtener la muestra por meacutetodos convencionales

35 OBTENCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR

Cuando la cantidad de sangre que se precisa es muy pequentildea o cuando

pordiferentes motivos no pueda practicarse una puncioacuten venosa debe recurrirse

a la puncioacuten capilar

351 Materiales requeridos

3512 Algodoacuten

3513 Alcohol al 70

3514 Lancetas desechables (Fig 10)

3515 Papel filtro Nordm 2

352 Procedimiento (Fig 11)

3521 La sangre capilar se obtiene de la cara lateral del dedo medio o anularen los adultos y del dedo gordo del pie o taloacuten en los nintildeos

3522 Desinfectar la zona con alcohol al 70 secar con algodoacuten esteacuteril

3523 Punzar la piel con una lanceta esteacuteril desechable (2 mm de profundidad)

3524 Usar gasa esteacuteril para desechar la primera gota y recoger las siguientesen tubos capilares Evitar comprimir la extremidad para obtenersangre porque se altera la composicioacuten sanguiacutenea

353 Ventajas

3531 Puede obtenerse con facilidad

3532 Es preferible cuando han de realizarse extensiones de sangre perifeacuterica

354 Desventajas

3541 Soacutelo se pueden obtener pequentildeas cantidades de sangre y los exaacutemenesde repeticioacuten requieren nuevas muestras

3542 La sangre en microtubos (capilares) frecuentemente se hemolizainterfiendo con la mayoriacutea de pruebas de laboratorio

3543 Los resultados obtenidos en pruebas con sangre capilar no puedenser comparados con los resultados de las pruebas con sangre venosa

3544 El dedo no soacutelo es delicado sino difiacutecil de desinfectar adecuadamenteen el tiempo disponible

3545 En pacientes con resistencia disminuida a la infeccioacuten (aquellos conleucemia agranulocitosis diabetes uremia y enfermedades con deficienciasinmunoloacutegicas) una muestra tomada del dedo es mucho maacutesprobable que conduzca a una infeccioacuten que otra tomada del brazo

3546 El recuento de eritrocitos y leucocitos asiacute como el recuento deplaquetas y reticulocitos no debe realizarse en sangre capilar debidoa la difiacutecil estandarizacioacuten del flujo sanguiacuteneo capilar

EXTRACCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR

Fig 10

Fig 11

SECCIOacuteN 4

ANTICOAGULANTES

Una vez extraiacuteda la sangre eacutesta puede conservarse coagulada o

mantenidaincoagulable mediante la adicioacuten de un anticoagulante

41 CARACTERIacuteSTICAS BAacuteSICAS DE LOS ANTICOAGULANTES MAacuteS

USADOSEN HEMATOLOGIacuteA

bull No alterar el tamantildeo de los hematiacutees

bull No producir hemoacutelisis

bull Evitar al maacuteximo la agregacioacuten plaquetaria

bull No alterar la morfologiacutea de los leucocitos

La sangre tratada con anticoagulante debe procesarse lo antes posible

inclusomantenida bajo refrigeracioacuten (4 ordmC) si no pasan de las 2 horas El

tiempomaacuteximo entre la extraccioacuten de la sangre y su procesamiento depende

delcoagulante de eleccioacuten y no debe ser maacutes de 4 horas a excepcioacuten

delanticoagulante EDTA (etilendiaminotetraceacutetico) que puede ser hasta 24

horas(en refrigeracioacuten a 4 ordmC)

Los anticoagulantes pueden emplearse en forma soacutelida o liacutequida Los

primerosestaacuten indicados para la determinacioacuten de los paraacutemetros

hematoloacutegicosya que no producen como los anticoagulantes liacutequidos dilucioacuten de

la sangre

42 ANTICOAGULANTES SOacuteLIDOS

421 EDTA

Es la sal disoacutedica o tripotaacutesica del aacutecido etilendiaminotetraceacutetico La saldisoacutedica

(Na2EDTA) es menos soluble que la sal tripotaacutesica (K3EDTA) Estoscompuestos

realizan su accioacuten a traveacutes de un efecto quelante sobre el calcioal fijarlo impiden

su activacioacuten y por ende la coagulacioacuten sanguiacutenea

4211 Ventajas

bull Respeta la morfologiacutea eritrocitaria (especialmente la sal tripotaacutesica) yleucocitaria de manera que permite una demora de dos horas en la realizacioacutendel frotis sanguiacuteneo despueacutes de la extraccioacuten sanguiacutenea

bull Asegura la conservacioacuten de los elementos formes sanguiacuteneos durante 24horas si la sangre se mantiene a 4 ordmC

bull Al inhibir la aglutinacioacuten de las plaquetas facilita su recuento o su expresioacutensemicuantitativa a partir del frotis

bull La concentracioacuten recomendada de EDTA es de 15 mgmL de sangre Unamayor cantidad de anticoagulante puede producir retraccioacuten celular condisminucioacuten del hematocrito y un aumento de la concentracioacuten media de lahemoglobina Un exceso de sangre con relacioacuten al anticoagulante produceformacioacuten de microagregados que pueden alterar los resultados El empleode tubos al vaciacuteo con una gota (50mL) de EDTA tripotaacutesica comercialpara 5 mL de sangre es de intereacutes praacutectico dado que es cien veces maacutessoluble facilitando la mezcla de sangre con anticoagulante

4212 Desventajas

Usado en exceso afecta a los eritrocitos y a los leucocitos a los cuales les produce encogimiento y cambios en su forma por ello debe cuidarse de agregar la cantidad correcta de sangre al anticoagulante

422 Anticoagulante de Wintrobe

Es una mezcla de oxalato de amonio y potasio Actuacutea por precipitacioacuten del calcio es faacutecil de preparar Se emplea en forma de polvo en proporcioacuten de 2 de oxalato de amonio por 1 de oxalato de potasio La cantidad recomendada es de 2 mg x mL de sangre Este anticoagulante no afecta el volumen globular medio y puede usarse para determinaciones de hemoglobina hematocrito y recuento globular pero para los extendidos queda limitada a los primeros minutos tampoco es uacutetil para el recuento plaquetario porque produce formacioacuten de agregados plaquetarios

423 Heparina

El nombre de heparina proviene del griego hepar que significa hiacutegado ya que fue aislado por primera vez de las ceacutelulas de este tejido Es un mucopolisacaacuterido aacutecido Presenta el

inconveniente de que si no se agita raacutepidamente con la sangre despueacutes de extraiacuteda

pueden formarse microcoaacutegulos aunque no altera el volumeneritrocitario ni la morfologiacutea de los leucocitos No es recomendablepara el frotis sanguiacuteneo porque produce un fondo azul en la laacutemina

La heparina de sodio o litio puede usarse en forma soacutelida o liacutequida en

proporcioacutende 01 - 02 mg de heparina por 1 mL de sangre

43 ANTICOAGULANTES LIacuteQUIDOS

431 Citrato trisoacutedico

Es de eleccioacuten para las pruebas de hemostasia y la velocidad de sedimentacioacuten

Actuacutea a traveacutes de la precipitacioacuten del calcio La concentracioacuten depende de

la prueba por realizar

bull Para pruebas de hemostasia se emplea en proporcioacuten de 1 9 (05 mL

deanticoagulante para 45 mL de sangre total)

bull Para la determinacioacuten de la VSG (Velocidad de Sedimentacioacuten Globular) es14

(05 mL de anticoagulante para 2 mL de sangre)

432 Oxalato soacutedico

Recomendado tambieacuten para las pruebas de hemostasia Se emplea en

proporcioacutende un volumen de anticoagulante para 4 vol de sangre

SECCIOacuteN 5

REALIZACIOacuteN Y TINCIOacuteN DEL FROTIS SANGUIacuteNEO

La praacutectica del frotis sanguiacuteneo tambieacuten llamado extendido es de gran importanciaen hematologiacutea ya que el diagnoacutestico de muchas enfermedadeshematoloacutegicas puede realizarse con soacutelo observar las caracteriacutesticasmorfoloacutegicas de las ceacutelulas sanguiacuteneas de manera que eacuteste no debe serexcesivamente grueso ni excesivamente fino Todas las laacuteminas por usarsobre todo nuevas deben ser limpiadas con algodoacuten y alcohol al 70 paraeliminar la grasa que viene adherida

51 MEacuteTODO DE LOS DOS PORTAOBJETOS

511 Materiales

- Alcohol al 70

- Algodoacuten

- Lanceta descartable

- Portaobjetos de vidrios limpios y desgrasados (25 x 75 mm)

512 Fundamento

Consiste en la extensioacuten de una gota de sangre sobre un portaobjeto (25 x 75)empleando el canto biselado de otro portaobjeto de igual dimensioacuten (Fig 12)

513 Procedimiento

5131 Una vez extraiacuteda la sangre con cualquiera de las metodologiacuteas secoloca una pequentildea gota de sangre (5mL) (aprox 3 mm de diaacutemetro)sobre un portaobjeto a 2 cm aproximadamente de uno de los extremos

5132 Colocar el canto de otro portaobjeto esmerilado sobre la superficiedel primer portaobjeto (en la que se encuentra la gota de sangre)formando un aacutengulo de 45ordm

5134 Deslizar suavemente y a velocidad moderada el portaobjeto sobre elotro en sentido longitudinal hasta que la gota de sangre quede bienextendida sobre la

superficie del primer portaobjeto El grosor delfrotis sanguiacuteneo puede variar seguacuten sea el aacutengulo que formen entresiacute ambos portaobjetos Asiacute si es superior a 45ordm la extensioacuten obtenidaseraacute gruesa y corta si es inferior a 45ordm seraacute larga y fina El secado delfrotis es a temperatura ambiente y en posicioacuten horizontal

Fig 12

1048729 Zona excesivamente gruesa Se halla en la regioacuten inmediata al punto departida de la extensioacuten (cabeza) En ella se aprecia siempre un aumento delinfocitos

1048729 Zona excesivamente fina Corresponde al final de la extensioacuten y termina enun aacuterea donde las ceacutelulas adoptan una posicioacuten acartonada (barbas) Enesta regioacuten existe un exceso de granulocitos y monocitos

1048729 Zona ideal Corresponde a la regioacuten intermedia del frotis y en ella existe unreparto equilibrado de ceacutelulas

52 COLORACIONES USADAS

Una vez seco el frotis se procede a la tincioacuten hematoloacutegica con el colorante deRomanowsky constituido por la mezcla de eosina y azul de metileno Dentrode eacutestas tenemos

521 Colorante de Giemsa

522 Colorante de May-Grunwald

523 Colorante de Wright

524 Colorante de Leishman

Preparacioacuten de colorantes (Anexo A)

1048729 Para el estudio de las ceacutelulas sanguiacuteneas utilizar el colorante 523 y 524

1048729 Para el estudio de hemoparaacutesitos utilizar el colorante 521

1048729 Utilizar el colorante 522 para casos especiales en que se desee observar

con mayor claridad y especificidad los graacutenulos de los neutrofilos

53 TINCIOacuteN CON COLORANTE DE WRIGHT

531 Fundamento

El colorante de Wright va a permitir suministrar un medio para estudiar lasangre y determinar las variaciones y anormalidades de estructura forma ytamantildeo de los eritrocitos su contenido de hemoglobina y sus propiedades decoloracioacuten La informacioacuten obtenida de un frotis de sangre perifeacuterica dependeen gran parte de la calidad del extendido y la coloracioacuten

532 Materiales

5321 Colorante de Wright (Anexo A)

5322 Frasco gotero

5323 Solucioacuten amortiguada tamponada (Anexo A)

533 Procedimiento

5331 Una vez obtenido el frotis sanguiacuteneo se le dejaraacute secar entre 15 y 20minutos

5332 Luego se coloca la preparacioacuten en un soporte y se cubre con el colorantede Wright dejaacutendolo por espacio de 5 minutos

5333 Posteriormente se antildeade solucioacuten amortiguada tamponada en partesiguales hasta obtener un brillo metaacutelico dejando 6 minutos adicionales

5334 Finalmente se lava con agua corriente y se deja secar

5335 Se coloca en el microscopio y con pequentildeo aumento se revisa lacalidad de la coloracioacuten la cantidad aproximada de gloacutebulos blancosy se escoge el sitio para iniciar el recuento Se coloca una gota deaceite de inmersioacuten y se enfoca a un aumento de 100xLa forma de los gloacutebulos rojos se examinaraacute detenidamente observandoademaacutes del color (cantidad de hemoglobina) presencia deplaquetas su agrupacioacuten y distribucioacuten

5336 Posteriormente se hace el recuento diferencial de gloacutebulos blancosen 100

ceacutelulas para lo cual se deberaacute conocer las diferencias entreneutroacutefilos eosinoacutefilos

linfocitos y monocitosUna extensioacuten de sangre bien tentildeida debe caracterizarse

por unabuena diferenciacioacuten de las estructuras subcelulares en los leucocitosuna

coloracioacuten rosada de los hematiacutees y la ausencia de precipitados

Los defectos maacutes frecuentes observados en la tincioacuten del frotis sanguiacuteneoson

Coloracioacuten excesivamente azul debido a

1048729 Frotis excesivamente grueso

1048729 Lavado insuficiente

1048729 Tincioacuten muy prolongada

1048729 Empleo de colorante excesivamente alcalino

Coloracioacuten con una tonalidad rosada

1048729 El colorante el tampoacuten o el agua de lavado tienen un pH demasiadoaacutecido

Presencia de precipitados

1048729 Obedecen a una accioacuten excesiva del colorante Esto se puede evitarcon la

filtracioacuten

SECCIOacuteN 6

HEMOGRAMA-HEMOGLOBINA-HEMATOCRITO

El hemograma de Shilling constituye uno de los exaacutemenes de laboratorio

maacutesusados en el campo de la hematologiacutea Comprende las siguientes pruebas

61 RECUENTO LEUCOCITARIO

Principio

La sangre anticoagulada se deposita en un liacutequido que permite evidenciar

losleucocitos mantenieacutendolos visibles mientras que los eritrocitos

sonhemolizados El recuento del nuacutemero de leucocitos o gloacutebulos blancos se

expresapor mm3 (miliacutemetro cuacutebico)

611 Equipos

- Microscopio

- Hemocitoacutemetro (Caacutemara de Neubauer)

Consta de los siguientes elementos

diams Una laacutemina portaobjeto gruesa en el centro se hallan dos

superficiescuadriculadas iguales separadas del resto de la laacutemina por surcos y

dosbarras transversales algo maacutes elevadas

diams Una laminilla cubreobjetos oacutepticamente plana que al colocarse sobrelas barras

elevadas de la laacutemina forma una caacutemara entre el cubreobjetosy la superficie

cuadriculadaLa altura entre el cubreobjetos y la laacutemina portaobjetos es de 01

mmCada cuadriacutecula mide 3 mm de lado y se divide en 9 cuadrados grandesCada

uno de los cuales mide 1 mm2 de superficie que se subdivide a suvez en 16

cuadrados medianos El cuadrado grande central se divide en25 cuadrados

pequentildeos y cada uno de ellos en 16 cuadraditos Cadacuadrado pequentildeo mide

02 mm de lado (004 mm2 de superficie) y cadacuadradito mide 005 mm de lado

(00025 mm2 de superficie)

612 Materiales y reactivos requeridos

6121 Pipeta de gloacutebulos blancos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0 a 100 mL)Presenta cerca del extremo superior una marca de 11 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla que funciona comomezcladora luego sigue el extremo maacutes largo de la pipeta (tallo) que estaacutedividida en 10 partes con 2 marcas 1 (parte final del bulbo) y 05 (a la mitaddel tallo) Se le acopla a su extremo superior 1 tubo de goma y una bombillapara aspirar

6122 Diluyente de gloacutebulos blancos Solucioacuten de Turk al 1

6123 Contador manual (Soacutelo si fuera necesario)

6124 Papel filtro

613 Procedimiento

6131 Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar deldedo se procede a aspirar la sangre con la pipeta de gloacutebulos blancoshasta la marca de 05 y a limpiar la punta con papel absorbente

6132 Introducir la pipeta en el tubo que contenga solucioacuten de Turk y absorberhasta la marca de 11 (no debe haber burbujas)

6133 Tapar ambos extremos y proceder a mezclar manualmente o en unrotador automaacutetico por 2 oacute 3 minutos

6134 Monte la laminilla de vidrio en la caacutemara para recuento que debe estarlimpia y seca

6135 Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocaruna gota pequentildea de esta solucioacuten en la caacutemara

6136 Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las ceacutelulas se sedimenten

6137 Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angularesCuando se usa la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002 mL) desangre total con anticoagulante o sangre capilar con anticoagulante yse diluye en un tubo que contenga 380 mL de solucioacuten de Turk (aquiacutetenemos una dilucioacuten 120)

LECTURA

Fig 13

La lectura se realiza en los campos 1 3 7 y 9 como estaacute indicado en la figuraAdemaacutes de los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes sedeben contar todos los leucocitos que se encuentren adheridos en la liacuteneahorizontal superior y vertical exterior o de lo contrario todos los leucocitosadheridos a la liacutenea horizontal inferior y vertical interior

614 Resultados

Nordm de leucocitos x mm3 = leucocitos contados en 4 camposdividealtura x dilucioacuten x aacuterea

Reemplazando = leucocitos contados en 4 camposdivide110 x 120 x 4=

Leucocitos contados en 4 camposdivide4200=

X1 divide4200= Nordm leucocitos contados x 50

615 Valores de referencia

5000 - 10 000 leucocitos mm3

616 Correccioacuten de valores para restar eritrocitos nucleados

Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el liacutequido de dilucioacuten por lo tantopueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con losleucocitos de tal manera que se debe emplear la siguiente foacutermula

Caacutelculo

La concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos (por litro) esNuacutemero de normoblatos contados x concentracioacuten o nuacutemero de leucocitos100 + Nordm de normoblastos contados

Ejemplo

Si se cuentan 50 normoblastos y la concentracioacuten del nuacutemero de leucocitos es16 x 109l la concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos seraacute

50 x16 = 53 x 109l

100 + 50

y la concentracioacuten de leucocitos corregida seraacute 16 - 53 = 107 x 109lEn unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitosse expresan por miliacutemetro cuacutebico En tales unidades el caacutelculo correspondienteal ejemplo que se ha dado seriacutea

50 x 16 000 = 5300 mm3

100 + 50

Recuento corregido de gloacutebulos blancos o leucocitos = 16 000 - 5300 = 10 700 mm3

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

62 RECUENTO DE GLOacuteBULOS ROJOS

Principio

La sangre se diluye en un liacutequido que nos permite observar claramente loshematiacutees luego esta dilucioacuten se coloca en una caacutemara de Neubauer con laayuda de una pipeta automaacutetica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopioa un objetivo de 40x para calcular el nuacutemero de gloacutebulos rojos por mm3

621 Equipos

- Microscopio

- Hemocitoacutemetro (caacutemara de Neubauer)

622 Materiales y reactivos requeridos

6221 Pipeta de gloacutebulos rojos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0-100 mL)

Presenta cerca del extremo superior una marca de 101 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla roja mezcladoraluego sigue el tallo (extremo maacutes largo) el cual estaacute dividido en 10 partescon 2 marcas 1 acabando el bulbo y 05 a la mitad del tallo Se requiereigual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar

6222 Diluyente de gloacutebulos rojos Cloruro de Sodio al 09 (ver anexo)

Diluyente de Hayem (ver anexo)

6223 Contador manual (soacutelo si fuera necesario)

6224 Papel filtro

623 Procedimiento

6231 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar

6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente

6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101

6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos

6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente

6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas

6237 Dejar en reposo por 3 minutos

6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)

6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos

LECTURA

Fig 14

624 Resultados

Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea

Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15

= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000

= hematiacutees contados x 10 000

625 Valores de referencia

(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)

Hombres 4 500 000 - 5 500 000

Mujeres 4 000 000 - 5 000 000

Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000

Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000

Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)

Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal

volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen

porcentaje o como valor decimal

Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre

total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)

631 Meacutetodo de Wintrobe

Materiales requeridos

- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm

- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia

- Tapoacuten de goma

Procedimiento

diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur

comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado

de no provocar espuma

diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten

diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos

Resultados (lectura)

Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos

Valores de referencia

Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

632 Meacutetodo de microhematocrito

Materiales requeridos

- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)

- Plastilina

Procedimiento

diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel

dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon

anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80

del capilar

diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina

diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma

diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm

Resultados (lectura)

La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio

Uso de la escala

diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero

diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la

columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical

diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos

Valores de referencia

Hombres 40 - 50

Mujeres 38 - 44

Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44

Lactantes (3 meses) 37 - 42

Recieacuten nacidos 50 - 58

La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)

64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA

Principio

La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre

641 Materiales y reactivos

6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro

6412 Pipetas

diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla

diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL

6413 Tubos de ensayo

6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten

Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia

CONTENIDO

Presentacioacuten7

Introduccioacuten9

SECCIOacuteN 1 GENERALIDADES11

11 Objetivo 11

12 Campo de aplicacioacuten 11

13 Responsabilidades11

14 Documentos de referencia12

SECCIOacuteN 2 MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD13

SECCIOacuteN 3 OBTENCIOacuteN DE MUESTRAS SANGUIacuteNEAS14

31 Objetivo14

32 Obtencioacuten de sangre venosa con jeringahellip14

33 Obtencioacuten de sangre venosa en tubos al vaciacuteo 16

34 Obtencioacuten de sangre de la vena yugular externa 18

35 Obtencioacuten de sangre capilar 19

SECCIOacuteN 4 ANTICOAGULANTES 22

41 Caracteriacutesticas baacutesicas de los anticoagulantes maacutes usados en hematologiacutea22

42 Anticoagulantes soacutelidoshellip22

43 Anticoagulantes liacutequidos 24

SECCIOacuteN 5 REALIZACIOacuteN Y TINCIOacuteN DEL FROTIS SANGUIacuteNEO 25

51 Meacutetodo de los dos portaobjetos 25

52 Coloraciones usadas 26

53 Tincioacuten con colorante de Wright27

SECCIOacuteN 6 HEMOGRAMA- HEMOGLOBINA- HEMATOCRITO 29

61 Recuento leucocitario 29

62 Recuento de gloacutebulos rojos 33

63 Determinacioacuten del volumen globular (Hto) 35

64 Dosaje de hemoglobina 38

65 Frotis de sangre perifeacuterica 40

66 Foacutermula leucocitaria 41

SECCIOacuteN 7 VELOCIDAD DE SEDIMENTACIOacuteN43

71 Meacutetodo de Westergren 43

72 Meacutetodo de Wintrobe 44

SECCIOacuteN 8 PERFIL DE HEMOSTASIA45

81 Principios generales 45

82 Mecanismo de coagulacioacuten 45

83 Exploracioacuten de la coagulacioacuten 46

84 Obtencioacuten del plasma 46

85 Tiempo de sangriacutea47

851 Meacutetodo de Ivy48

852 Meacutetodo de Duke49

86 Tiempo de coagulacioacuten de sangre total (TCST) 51

87 Tiempo de tromboplastina parcial activada (PTTK) 54

88 Tiempo de trombina 55

89 Tiempo de protrombina (Prueba de Quick) 56

SECCIOacuteN 9 RECUENTO DE RETICULOCITOS Y PLAQUETAS58

91 Recuento de reticulocitos 58

92 Recuento de plaquetas 60

SECCIOacuteN 10 LEUCOGRAMA63

101 Granulocitos63

102 Agranulocitos 65

103 Criterios para el desarrollo de un leucograma 67

SECCIOacuteN 11 ALTERACIONES ERITROCITARIAS79

Alteraciones en el tamantildeo 70

Alteraciones en la forma 71

Alteraciones de color72

Inclusiones anormales73

BIBLIOGRAFIacuteA79

ANEXO A Preparacioacuten de colorantes y soluciones maacutes

Usados en hematologiacutea81

ANEXO B Preparacioacuten de anticoagulantes 85

PRESENTACIOacuteN

Con el propoacutesito de uniformizar los procedimientos hematoloacutegicos que serealizan en los diversos laboratorios cliacutenicos el Instituto Nacional de Saludpone a disposicioacuten de la comunidad teacutecnico-cientiacutefica nacional el Manual deProcedimientos de Laboratorio en Teacutecnicas Baacutesicas de Hematologiacutea en elcual se incluyen todos los meacutetodos empleados en el campo hematoloacutegicobaacutesico De este modo se contribuye a mejorar la calidad de diagnoacutestico en loslaboratorios de los servicios de saludEl laboratorio de hematologiacutea cuenta con dos aacutereas baacutesicas Aacuterea deHematimetriacutea (hemograma VSE recuento de plaquetas etc) y Aacuterea deHemostasia Partiendo de esta estructura en este manual nos referiremos alas teacutecnicas baacutesicas empleadas en estas aacutereas partiendo de la toma de muestrahasta la realizacioacuten de las pruebas respectivasEs necesario enfatizar que para obtener resultados maacutes confiables es importantepero no imprescindible automatizar el laboratorio debido a que elloevitaraacute el posible error humano sobre todo en lo referente a recuentos celularesvalores de hemoglobina y constantes corpusculares ya que en estasvariables se trabaja con cantidades exactas de sangre hecho que es muydifiacutecil de lograr cuando se usan los meacutetodos manuales lo mismo sucede altratarse de las pruebas de hemostasiaEsperamos que este manual constituya una herramienta de consulta en laRed Nacional de Laboratorios de Salud ademaacutes de una guiacutea para el personalde laboratorio en general

INTRODUCCIOacuteN

El presente manual ha sido elaborado en forma simple didaacutectica y eminentementepraacutectica para que su contenido sea faacutecil de entender por el personalque labora en el laboratorio de hematologiacuteaSe divide en tres partes

1 En la primera parte se presentan los aspectos maacutes importantes de labioseguridad en el laboratorio

2 En la segunda parte se exponen las principales teacutecnicas baacutesicas del laboratoriode hematologiacutea

3 En la tercera parte se detallan las alteraciones maacutes frecuentes de la serieroja y de la serie blanca de un hemograma

El objetivo principal es protocolizar y estandarizar los procedimientoshematoloacutegicos que empiezan con la toma de muestra (siguiendo las pautasde control de calidad preanaliacutetica) hasta el procesamiento de eacutesta (fase analiacutetica)en la determinacioacuten correspondiente y por uacuteltimo en la emisioacuten de losresultados (fase postanaliacutetica) Debemos recalcar que cuando se realizanpruebas de hemostasia debe tenerse en consideracioacuten los cuidados comunesa toda prueba de laboratorio es decir las muestras deben obtenerse encondiciones apropiadas y rotularse debidamente Esperamos que el presentemanual sirva de guiacutea efectiva y que pueda ser enriquecido con nuevosaportes con la finalidad de alcanzar un trabajo de calidad

SECCIOacuteN 1

GENERALIDADES

11 OBJETIVO

Establecer y estandarizar los procedimientos baacutesicos de un examen dehemograma hemoglobina hematocrito recuento de plaquetas velocidad desedimentacioacuten y recuento de reticulocitos que sirvan de ayuda diagnoacutestica alcliacutenico

12 CAMPO DE APLICACIOacuteN

La aplicacioacuten de las teacutecnicas hematoloacutegicas nos sirve para estandarizar losprocedimientos a nivel nacional y para que sea de utilidad al personal teacutecnicoy profesional de los laboratorios cliacutenicos

13 RESPONSABILIDADES

131 El Centro Nacional de Laboratorios en Salud Puacuteblica a traveacutes de su

Direccioacuten Ejecutiva de Laboratorios de Referencia es responsable deautorizar la elaboracioacuten la revisioacuten y la actualizacioacuten del presente manualde acuerdo con los procedimientos aprobados por el Instituto Nacionalde Salud

132 Los directores de los establecimientos de salud son responsables deautorizar proporcionar los recursos necesarios y designar al personalresponsable para la aplicacioacuten de las disposiciones contenidas en elpresente manual

133 El personal de los establecimientos de salud es responsable de planificarlas acciones organizar controlar y capacitar al personal para cumplirlas disposiciones contenidas en el presente manual

134 Los jefes o responsables de los laboratorios deben asegurar el controlinterno de la calidad la idoneidad del personal equipos materialesreactivos e instalaciones

135 El personal meacutedico profesional y teacutecnico es responsable de seguir lasespecificaciones contenidas en el presente manual y aplicar los procedimientosespeciacuteficos indicados

14 DOCUMENTOS DE REFERENCIA

141 Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OrganizacioacutenPanamericana de la Salud Publicacioacuten cientiacutefica Nordm 439 Nordm 2 1983

142 Manual de normas de bioseguridad Instituto Nacional de Salud Serie deNormas Teacutecnicas Nordm 18 2ordf ed 1997

SECCIOacuteN 2

MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD

21 Para la obtencioacuten de muestras el personal involucrado en los diferentesprocesos para los exaacutemenes hematoloacutegicos debe aplicar las medidas debioseguridad establecidas en el Manual de Bioseguridad Serie de NormasTeacutecnicas Nordm 18

22 Se debe controlar sobre todo

221 Al personal que trabaja en el laboratorio de hematologiacutea

222 El proceso de coloracioacuten en el que se debe aplicar las medidas debioseguridad correspondientes al uso y manipulacioacuten de sustanciastoacutexicas o canceriacutegenas

223 Ver lo referente a medidas de proteccioacuten en caso de accidentes porinoculacioacuten

SECCIOacuteN 3

OBTENCIOacuteN DE MUESTRAS SANGUIacuteNEAS

31 OBJETIVO

Establecer y uniformizar criterios en el procedimiento de obtencioacuten de muestrassanguiacuteneas con un adecuado control de calidad ya que de ello dependeque el resultado del anaacutelisis de la muestra sea el correcto Se efectuaraacute enayunas o no dependiendo de la prueba a usar

32 OBTENCIOacuteN DE SANGRE VENOSA CON JERINGA

321 Materiales y equipos requeridos

3211 Algodoacuten

3212 Alcohol al 70

3213 Ligadura o torniquete de 25 a 30 cm de largo

3214 Jeringas de 5 mL

3215 Viales con anticoagulante EDTA

322 Obtencioacuten de la muestra

3221 Verificar que los elementos por utilizar esteacuten listos y que el pacientese sienta coacutemodo

3222 Aplicar el torniquete aproximadamente cuatro dedos por encima de laflexioacuten del codo o a 10 cm del codo sujetar con un medio nudo (Fig 1)

3223 Limpiar la zona con alcohol al 70 o alcohol yodado en un aacuterea de 2pulgadas (Fig 2)

3224 El paciente deberaacute abrir y cerrar la mano durante unos segundos ydespueacutes la mantendraacute cerrada esto ayudaraacute a visualizar las venassuperficiales (Fig 3)

3225 Se retira el estuche protector de la aguja y se coge la jeringa de talmanera que el bisel se encuentre hacia arriba (Fig 4)

3226 Se coloca la aguja en direccioacuten paralela a la vena se perfora la pielhaciendo avanzar la aguja 05-1 cm en el tejido subcutaacuteneo luego seperfora la vena (Fig 5)

3227 Se aspira la jeringa hasta el volumen requerido

3228 Retirar el torniquete e indicar al paciente que deje de hacer puntildeo Secoloca el algodoacuten seco encima de la puncioacuten y se retira la aguja (Fig 6)

3229 Retirar la aguja de la jeringa Verter la muestra lentamente por lasparedes del vial con anticoagulante No olvidar colocar una gota en lalaacutemina portaobjeto para realizar el frotis

32210 Agitar el vial en ciacuterculos sobre la mesa para homogeneizar la muestracon el anticoagulante

PUNTOS PARA LA EXTRACCIOacuteN DE SANGRE

(Toma de muestra)

Se obtiene de las venas de la fosa cubital

PROCEDIMIENTO

Fig 1 Fig 2 Fig 3

Fig 4 Fig 5

Fig 6 Fig 7

33 OBTENCIOacuteN DE SANGRE VENOSA EN TUBOS AL VACIacuteO

331 Materiales requeridos

3311 Algodoacuten

3312 Alcohol al 70

3313 Ligadura o torniquete de 25 a 30 cm de largo

3314 Tubos al vaciacuteo con anticoagulante EDTA (K3) EDTA (Na2) u otroanticoagulante

3315 Agujas con dispositivo para extraccioacuten de sangre al vaciacuteo

- Nordm 21 para adultos

- Nordm 22 para nintildeos y neonatos

De preferencia ambas de bisel corto para evitar la coagulacioacuten

332 Obtencioacuten de la muestra

3321 Repetir los pasos de 3221 a 3224

3322 Se retira el estuche protector de la aguja y eacuteste se enrosca al dispositivopara extraccioacuten de sangre al vaciacuteo

3323 Colocar la ligadura cuatro dedos por encima de la flexioacuten del codo o10 cm por encima de eacuteste y pedir al paciente que abra y cierre la manovarias veces para favorecer la dilatacioacuten de las venas

3324 Una vez escogida la vena desinfectarla con una pieza de algodoacutenembebido en etanol al 70

3325 Se coloca la aguja en direccioacuten paralela a la vena se perfora la pielhaciendo avanzar la aguja entre 05 cm y 1 cm en el tejido subcutaacuteneose inserta el tubo al vaciacuteo por la parte posterior y no preocuparse porla cantidad de sangre extraiacuteda ya que el mismo sonido del vaciacuteo avisaraacuteque la extraccioacuten terminoacute (Fig 8)

3326 Retirar la ligadura tirando del extremo doblado

3327 Colocar un pedazo de algodoacuten seco sobre la parte donde se encuentraoculta la aguja Sacar la aguja con un movimiento raacutepido y depositarlaen el recipiente de metal con desinfectante (Fig 9)

3328 Pedir al paciente que presione firmemente el algodoacuten durante 3 minutoscon el brazo extendido No se recomienda que se flexione el brazoa causa del riesgo que se forme un hematoma

3329 Mezclar por inmersioacuten suave la sangre con el anticoagulante contenidoen el tubo No agitar el contenido

Fig 8 Fig 9

333 Ventajas de una extraccioacuten de sangre venosa

3331 Pueden hacerse repetidos exaacutemenes con la misma muestra

3332 Parte de la muestra (plasma o suero) puede congelarse para referenciafutura

334 Desventajas de una extraccioacuten de sangre venosa

3341 La puncioacuten venosa por su largo procedimiento requiere mayor preparacioacuten que el meacutetodo capilar

3342 El meacutetodo es teacutecnicamente difiacutecil en nintildeos individuos obesos y pacientes en shock

3343 La hemoacutelisis debe ser evitada pues se puede obtener una disminucioacuten en el recuento de eritrocitos

3344 Debe evitarse prolongada estasis venosa producida por el torniquete pues produce hemoacutelisis y otros cambios que ponen la sangre en un estado inadecuado para el anaacutelisis de gases recuentos celulares determinacioacuten de pH sanguiacuteneo y algunas pruebas de coagulacioacuten

3345 La sangre anticoagulada si no es de obtencioacuten reciente no debe ser utilizada en extensiones de sangre pues algunos anticoagulantes producen cambios en las plaquetas que pueden causar aglutinaciones agregacioacuten plaquetaria y dificultan la identificacioacuten de leucocitos

3346 Puesto que algunos de los componentes de la sangre no son estables los recuentos de leucocitos y plaquetas e iacutendice de sedimentacioacuten deben realizarse antes de que pasen dos horas desde que se obtuvo la muestra

34 OBTENCIOacuteN DE SANGRE DE LA VENA YUGULAR EXTERNA

341 Materiales requeridos

3411 Algodoacuten

3412 Alcohol al 70

3413 Jeringas de 5 mL

3414 Viales con anticoagulante EDTA

342 Obtencioacuten de la muestra

3421 El paciente es cubierto por una saacutebana de manera que los brazospermanezcan inmovilizados a lo largo del cuerpo

3422 Al paciente se le coloca de cuacutebito dorsal sobre la mesa de examen ouna

camilla de manera que la cabeza cuelgue sobre el final de lamesa y el cuerpo sea

sujetado por un asistente

3423 Cuando el paciente grita la vena yugular externa se marca claramente

3424 Limpiar la zona en un aacuterea de 2 pulgadas con alcohol al 70 o

alcoholyodado

3425 Se repiten los pasos de 3225 a 3227 de la extraccioacuten de sangrevenosa

con jeringa

3426 Retirar la aguja de la vena y presionar suavemente con un algodoacutenseco

aproximadamente de 3 a 5 minutos Pedir al paciente que permanezcaechado diez

minutos

3427 Se repiten los pasos de 3229

3428 Se repiten los pasos de 32210

343 Ventajas

Constituye un buen meacutetodo para la obtencioacuten de sangre en pacientes conshock

con venas colapsadas

344 Desventajas

Por lo delicado en su procedimiento no se recomienda como rutina soacutelo encasos

en que no se pueda obtener la muestra por meacutetodos convencionales

35 OBTENCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR

Cuando la cantidad de sangre que se precisa es muy pequentildea o cuando

pordiferentes motivos no pueda practicarse una puncioacuten venosa debe recurrirse

a la puncioacuten capilar

351 Materiales requeridos

3512 Algodoacuten

3513 Alcohol al 70

3514 Lancetas desechables (Fig 10)

3515 Papel filtro Nordm 2

352 Procedimiento (Fig 11)

3521 La sangre capilar se obtiene de la cara lateral del dedo medio o anularen los adultos y del dedo gordo del pie o taloacuten en los nintildeos

3522 Desinfectar la zona con alcohol al 70 secar con algodoacuten esteacuteril

3523 Punzar la piel con una lanceta esteacuteril desechable (2 mm de profundidad)

3524 Usar gasa esteacuteril para desechar la primera gota y recoger las siguientesen tubos capilares Evitar comprimir la extremidad para obtenersangre porque se altera la composicioacuten sanguiacutenea

353 Ventajas

3531 Puede obtenerse con facilidad

3532 Es preferible cuando han de realizarse extensiones de sangre perifeacuterica

354 Desventajas

3541 Soacutelo se pueden obtener pequentildeas cantidades de sangre y los exaacutemenesde repeticioacuten requieren nuevas muestras

3542 La sangre en microtubos (capilares) frecuentemente se hemolizainterfiendo con la mayoriacutea de pruebas de laboratorio

3543 Los resultados obtenidos en pruebas con sangre capilar no puedenser comparados con los resultados de las pruebas con sangre venosa

3544 El dedo no soacutelo es delicado sino difiacutecil de desinfectar adecuadamenteen el tiempo disponible

3545 En pacientes con resistencia disminuida a la infeccioacuten (aquellos conleucemia agranulocitosis diabetes uremia y enfermedades con deficienciasinmunoloacutegicas) una muestra tomada del dedo es mucho maacutesprobable que conduzca a una infeccioacuten que otra tomada del brazo

3546 El recuento de eritrocitos y leucocitos asiacute como el recuento deplaquetas y reticulocitos no debe realizarse en sangre capilar debidoa la difiacutecil estandarizacioacuten del flujo sanguiacuteneo capilar

EXTRACCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR

Fig 10

Fig 11

SECCIOacuteN 4

ANTICOAGULANTES

Una vez extraiacuteda la sangre eacutesta puede conservarse coagulada o

mantenidaincoagulable mediante la adicioacuten de un anticoagulante

41 CARACTERIacuteSTICAS BAacuteSICAS DE LOS ANTICOAGULANTES MAacuteS

USADOSEN HEMATOLOGIacuteA

bull No alterar el tamantildeo de los hematiacutees

bull No producir hemoacutelisis

bull Evitar al maacuteximo la agregacioacuten plaquetaria

bull No alterar la morfologiacutea de los leucocitos

La sangre tratada con anticoagulante debe procesarse lo antes posible

inclusomantenida bajo refrigeracioacuten (4 ordmC) si no pasan de las 2 horas El

tiempomaacuteximo entre la extraccioacuten de la sangre y su procesamiento depende

delcoagulante de eleccioacuten y no debe ser maacutes de 4 horas a excepcioacuten

delanticoagulante EDTA (etilendiaminotetraceacutetico) que puede ser hasta 24

horas(en refrigeracioacuten a 4 ordmC)

Los anticoagulantes pueden emplearse en forma soacutelida o liacutequida Los

primerosestaacuten indicados para la determinacioacuten de los paraacutemetros

hematoloacutegicosya que no producen como los anticoagulantes liacutequidos dilucioacuten de

la sangre

42 ANTICOAGULANTES SOacuteLIDOS

421 EDTA

Es la sal disoacutedica o tripotaacutesica del aacutecido etilendiaminotetraceacutetico La saldisoacutedica

(Na2EDTA) es menos soluble que la sal tripotaacutesica (K3EDTA) Estoscompuestos

realizan su accioacuten a traveacutes de un efecto quelante sobre el calcioal fijarlo impiden

su activacioacuten y por ende la coagulacioacuten sanguiacutenea

4211 Ventajas

bull Respeta la morfologiacutea eritrocitaria (especialmente la sal tripotaacutesica) yleucocitaria de manera que permite una demora de dos horas en la realizacioacutendel frotis sanguiacuteneo despueacutes de la extraccioacuten sanguiacutenea

bull Asegura la conservacioacuten de los elementos formes sanguiacuteneos durante 24horas si la sangre se mantiene a 4 ordmC

bull Al inhibir la aglutinacioacuten de las plaquetas facilita su recuento o su expresioacutensemicuantitativa a partir del frotis

bull La concentracioacuten recomendada de EDTA es de 15 mgmL de sangre Unamayor cantidad de anticoagulante puede producir retraccioacuten celular condisminucioacuten del hematocrito y un aumento de la concentracioacuten media de lahemoglobina Un exceso de sangre con relacioacuten al anticoagulante produceformacioacuten de microagregados que pueden alterar los resultados El empleode tubos al vaciacuteo con una gota (50mL) de EDTA tripotaacutesica comercialpara 5 mL de sangre es de intereacutes praacutectico dado que es cien veces maacutessoluble facilitando la mezcla de sangre con anticoagulante

4212 Desventajas

Usado en exceso afecta a los eritrocitos y a los leucocitos a los cuales les produce encogimiento y cambios en su forma por ello debe cuidarse de agregar la cantidad correcta de sangre al anticoagulante

422 Anticoagulante de Wintrobe

Es una mezcla de oxalato de amonio y potasio Actuacutea por precipitacioacuten del calcio es faacutecil de preparar Se emplea en forma de polvo en proporcioacuten de 2 de oxalato de amonio por 1 de oxalato de potasio La cantidad recomendada es de 2 mg x mL de sangre Este anticoagulante no afecta el volumen globular medio y puede usarse para determinaciones de hemoglobina hematocrito y recuento globular pero para los extendidos queda limitada a los primeros minutos tampoco es uacutetil para el recuento plaquetario porque produce formacioacuten de agregados plaquetarios

423 Heparina

El nombre de heparina proviene del griego hepar que significa hiacutegado ya que fue aislado por primera vez de las ceacutelulas de este tejido Es un mucopolisacaacuterido aacutecido Presenta el

inconveniente de que si no se agita raacutepidamente con la sangre despueacutes de extraiacuteda

pueden formarse microcoaacutegulos aunque no altera el volumeneritrocitario ni la morfologiacutea de los leucocitos No es recomendablepara el frotis sanguiacuteneo porque produce un fondo azul en la laacutemina

La heparina de sodio o litio puede usarse en forma soacutelida o liacutequida en

proporcioacutende 01 - 02 mg de heparina por 1 mL de sangre

43 ANTICOAGULANTES LIacuteQUIDOS

431 Citrato trisoacutedico

Es de eleccioacuten para las pruebas de hemostasia y la velocidad de sedimentacioacuten

Actuacutea a traveacutes de la precipitacioacuten del calcio La concentracioacuten depende de

la prueba por realizar

bull Para pruebas de hemostasia se emplea en proporcioacuten de 1 9 (05 mL

deanticoagulante para 45 mL de sangre total)

bull Para la determinacioacuten de la VSG (Velocidad de Sedimentacioacuten Globular) es14

(05 mL de anticoagulante para 2 mL de sangre)

432 Oxalato soacutedico

Recomendado tambieacuten para las pruebas de hemostasia Se emplea en

proporcioacutende un volumen de anticoagulante para 4 vol de sangre

SECCIOacuteN 5

REALIZACIOacuteN Y TINCIOacuteN DEL FROTIS SANGUIacuteNEO

La praacutectica del frotis sanguiacuteneo tambieacuten llamado extendido es de gran importanciaen hematologiacutea ya que el diagnoacutestico de muchas enfermedadeshematoloacutegicas puede realizarse con soacutelo observar las caracteriacutesticasmorfoloacutegicas de las ceacutelulas sanguiacuteneas de manera que eacuteste no debe serexcesivamente grueso ni excesivamente fino Todas las laacuteminas por usarsobre todo nuevas deben ser limpiadas con algodoacuten y alcohol al 70 paraeliminar la grasa que viene adherida

51 MEacuteTODO DE LOS DOS PORTAOBJETOS

511 Materiales

- Alcohol al 70

- Algodoacuten

- Lanceta descartable

- Portaobjetos de vidrios limpios y desgrasados (25 x 75 mm)

512 Fundamento

Consiste en la extensioacuten de una gota de sangre sobre un portaobjeto (25 x 75)empleando el canto biselado de otro portaobjeto de igual dimensioacuten (Fig 12)

513 Procedimiento

5131 Una vez extraiacuteda la sangre con cualquiera de las metodologiacuteas secoloca una pequentildea gota de sangre (5mL) (aprox 3 mm de diaacutemetro)sobre un portaobjeto a 2 cm aproximadamente de uno de los extremos

5132 Colocar el canto de otro portaobjeto esmerilado sobre la superficiedel primer portaobjeto (en la que se encuentra la gota de sangre)formando un aacutengulo de 45ordm

5134 Deslizar suavemente y a velocidad moderada el portaobjeto sobre elotro en sentido longitudinal hasta que la gota de sangre quede bienextendida sobre la

superficie del primer portaobjeto El grosor delfrotis sanguiacuteneo puede variar seguacuten sea el aacutengulo que formen entresiacute ambos portaobjetos Asiacute si es superior a 45ordm la extensioacuten obtenidaseraacute gruesa y corta si es inferior a 45ordm seraacute larga y fina El secado delfrotis es a temperatura ambiente y en posicioacuten horizontal

Fig 12

1048729 Zona excesivamente gruesa Se halla en la regioacuten inmediata al punto departida de la extensioacuten (cabeza) En ella se aprecia siempre un aumento delinfocitos

1048729 Zona excesivamente fina Corresponde al final de la extensioacuten y termina enun aacuterea donde las ceacutelulas adoptan una posicioacuten acartonada (barbas) Enesta regioacuten existe un exceso de granulocitos y monocitos

1048729 Zona ideal Corresponde a la regioacuten intermedia del frotis y en ella existe unreparto equilibrado de ceacutelulas

52 COLORACIONES USADAS

Una vez seco el frotis se procede a la tincioacuten hematoloacutegica con el colorante deRomanowsky constituido por la mezcla de eosina y azul de metileno Dentrode eacutestas tenemos

521 Colorante de Giemsa

522 Colorante de May-Grunwald

523 Colorante de Wright

524 Colorante de Leishman

Preparacioacuten de colorantes (Anexo A)

1048729 Para el estudio de las ceacutelulas sanguiacuteneas utilizar el colorante 523 y 524

1048729 Para el estudio de hemoparaacutesitos utilizar el colorante 521

1048729 Utilizar el colorante 522 para casos especiales en que se desee observar

con mayor claridad y especificidad los graacutenulos de los neutrofilos

53 TINCIOacuteN CON COLORANTE DE WRIGHT

531 Fundamento

El colorante de Wright va a permitir suministrar un medio para estudiar lasangre y determinar las variaciones y anormalidades de estructura forma ytamantildeo de los eritrocitos su contenido de hemoglobina y sus propiedades decoloracioacuten La informacioacuten obtenida de un frotis de sangre perifeacuterica dependeen gran parte de la calidad del extendido y la coloracioacuten

532 Materiales

5321 Colorante de Wright (Anexo A)

5322 Frasco gotero

5323 Solucioacuten amortiguada tamponada (Anexo A)

533 Procedimiento

5331 Una vez obtenido el frotis sanguiacuteneo se le dejaraacute secar entre 15 y 20minutos

5332 Luego se coloca la preparacioacuten en un soporte y se cubre con el colorantede Wright dejaacutendolo por espacio de 5 minutos

5333 Posteriormente se antildeade solucioacuten amortiguada tamponada en partesiguales hasta obtener un brillo metaacutelico dejando 6 minutos adicionales

5334 Finalmente se lava con agua corriente y se deja secar

5335 Se coloca en el microscopio y con pequentildeo aumento se revisa lacalidad de la coloracioacuten la cantidad aproximada de gloacutebulos blancosy se escoge el sitio para iniciar el recuento Se coloca una gota deaceite de inmersioacuten y se enfoca a un aumento de 100xLa forma de los gloacutebulos rojos se examinaraacute detenidamente observandoademaacutes del color (cantidad de hemoglobina) presencia deplaquetas su agrupacioacuten y distribucioacuten

5336 Posteriormente se hace el recuento diferencial de gloacutebulos blancosen 100

ceacutelulas para lo cual se deberaacute conocer las diferencias entreneutroacutefilos eosinoacutefilos

linfocitos y monocitosUna extensioacuten de sangre bien tentildeida debe caracterizarse

por unabuena diferenciacioacuten de las estructuras subcelulares en los leucocitosuna

coloracioacuten rosada de los hematiacutees y la ausencia de precipitados

Los defectos maacutes frecuentes observados en la tincioacuten del frotis sanguiacuteneoson

Coloracioacuten excesivamente azul debido a

1048729 Frotis excesivamente grueso

1048729 Lavado insuficiente

1048729 Tincioacuten muy prolongada

1048729 Empleo de colorante excesivamente alcalino

Coloracioacuten con una tonalidad rosada

1048729 El colorante el tampoacuten o el agua de lavado tienen un pH demasiadoaacutecido

Presencia de precipitados

1048729 Obedecen a una accioacuten excesiva del colorante Esto se puede evitarcon la

filtracioacuten

SECCIOacuteN 6

HEMOGRAMA-HEMOGLOBINA-HEMATOCRITO

El hemograma de Shilling constituye uno de los exaacutemenes de laboratorio

maacutesusados en el campo de la hematologiacutea Comprende las siguientes pruebas

61 RECUENTO LEUCOCITARIO

Principio

La sangre anticoagulada se deposita en un liacutequido que permite evidenciar

losleucocitos mantenieacutendolos visibles mientras que los eritrocitos

sonhemolizados El recuento del nuacutemero de leucocitos o gloacutebulos blancos se

expresapor mm3 (miliacutemetro cuacutebico)

611 Equipos

- Microscopio

- Hemocitoacutemetro (Caacutemara de Neubauer)

Consta de los siguientes elementos

diams Una laacutemina portaobjeto gruesa en el centro se hallan dos

superficiescuadriculadas iguales separadas del resto de la laacutemina por surcos y

dosbarras transversales algo maacutes elevadas

diams Una laminilla cubreobjetos oacutepticamente plana que al colocarse sobrelas barras

elevadas de la laacutemina forma una caacutemara entre el cubreobjetosy la superficie

cuadriculadaLa altura entre el cubreobjetos y la laacutemina portaobjetos es de 01

mmCada cuadriacutecula mide 3 mm de lado y se divide en 9 cuadrados grandesCada

uno de los cuales mide 1 mm2 de superficie que se subdivide a suvez en 16

cuadrados medianos El cuadrado grande central se divide en25 cuadrados

pequentildeos y cada uno de ellos en 16 cuadraditos Cadacuadrado pequentildeo mide

02 mm de lado (004 mm2 de superficie) y cadacuadradito mide 005 mm de lado

(00025 mm2 de superficie)

612 Materiales y reactivos requeridos

6121 Pipeta de gloacutebulos blancos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0 a 100 mL)Presenta cerca del extremo superior una marca de 11 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla que funciona comomezcladora luego sigue el extremo maacutes largo de la pipeta (tallo) que estaacutedividida en 10 partes con 2 marcas 1 (parte final del bulbo) y 05 (a la mitaddel tallo) Se le acopla a su extremo superior 1 tubo de goma y una bombillapara aspirar

6122 Diluyente de gloacutebulos blancos Solucioacuten de Turk al 1

6123 Contador manual (Soacutelo si fuera necesario)

6124 Papel filtro

613 Procedimiento

6131 Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar deldedo se procede a aspirar la sangre con la pipeta de gloacutebulos blancoshasta la marca de 05 y a limpiar la punta con papel absorbente

6132 Introducir la pipeta en el tubo que contenga solucioacuten de Turk y absorberhasta la marca de 11 (no debe haber burbujas)

6133 Tapar ambos extremos y proceder a mezclar manualmente o en unrotador automaacutetico por 2 oacute 3 minutos

6134 Monte la laminilla de vidrio en la caacutemara para recuento que debe estarlimpia y seca

6135 Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocaruna gota pequentildea de esta solucioacuten en la caacutemara

6136 Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las ceacutelulas se sedimenten

6137 Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angularesCuando se usa la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002 mL) desangre total con anticoagulante o sangre capilar con anticoagulante yse diluye en un tubo que contenga 380 mL de solucioacuten de Turk (aquiacutetenemos una dilucioacuten 120)

LECTURA

Fig 13

La lectura se realiza en los campos 1 3 7 y 9 como estaacute indicado en la figuraAdemaacutes de los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes sedeben contar todos los leucocitos que se encuentren adheridos en la liacuteneahorizontal superior y vertical exterior o de lo contrario todos los leucocitosadheridos a la liacutenea horizontal inferior y vertical interior

614 Resultados

Nordm de leucocitos x mm3 = leucocitos contados en 4 camposdividealtura x dilucioacuten x aacuterea

Reemplazando = leucocitos contados en 4 camposdivide110 x 120 x 4=

Leucocitos contados en 4 camposdivide4200=

X1 divide4200= Nordm leucocitos contados x 50

615 Valores de referencia

5000 - 10 000 leucocitos mm3

616 Correccioacuten de valores para restar eritrocitos nucleados

Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el liacutequido de dilucioacuten por lo tantopueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con losleucocitos de tal manera que se debe emplear la siguiente foacutermula

Caacutelculo

La concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos (por litro) esNuacutemero de normoblatos contados x concentracioacuten o nuacutemero de leucocitos100 + Nordm de normoblastos contados

Ejemplo

Si se cuentan 50 normoblastos y la concentracioacuten del nuacutemero de leucocitos es16 x 109l la concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos seraacute

50 x16 = 53 x 109l

100 + 50

y la concentracioacuten de leucocitos corregida seraacute 16 - 53 = 107 x 109lEn unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitosse expresan por miliacutemetro cuacutebico En tales unidades el caacutelculo correspondienteal ejemplo que se ha dado seriacutea

50 x 16 000 = 5300 mm3

100 + 50

Recuento corregido de gloacutebulos blancos o leucocitos = 16 000 - 5300 = 10 700 mm3

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

62 RECUENTO DE GLOacuteBULOS ROJOS

Principio

La sangre se diluye en un liacutequido que nos permite observar claramente loshematiacutees luego esta dilucioacuten se coloca en una caacutemara de Neubauer con laayuda de una pipeta automaacutetica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopioa un objetivo de 40x para calcular el nuacutemero de gloacutebulos rojos por mm3

621 Equipos

- Microscopio

- Hemocitoacutemetro (caacutemara de Neubauer)

622 Materiales y reactivos requeridos

6221 Pipeta de gloacutebulos rojos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0-100 mL)

Presenta cerca del extremo superior una marca de 101 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla roja mezcladoraluego sigue el tallo (extremo maacutes largo) el cual estaacute dividido en 10 partescon 2 marcas 1 acabando el bulbo y 05 a la mitad del tallo Se requiereigual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar

6222 Diluyente de gloacutebulos rojos Cloruro de Sodio al 09 (ver anexo)

Diluyente de Hayem (ver anexo)

6223 Contador manual (soacutelo si fuera necesario)

6224 Papel filtro

623 Procedimiento

6231 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar

6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente

6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101

6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos

6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente

6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas

6237 Dejar en reposo por 3 minutos

6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)

6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos

LECTURA

Fig 14

624 Resultados

Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea

Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15

= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000

= hematiacutees contados x 10 000

625 Valores de referencia

(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)

Hombres 4 500 000 - 5 500 000

Mujeres 4 000 000 - 5 000 000

Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000

Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000

Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)

Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal

volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen

porcentaje o como valor decimal

Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre

total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)

631 Meacutetodo de Wintrobe

Materiales requeridos

- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm

- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia

- Tapoacuten de goma

Procedimiento

diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur

comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado

de no provocar espuma

diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten

diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos

Resultados (lectura)

Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos

Valores de referencia

Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

632 Meacutetodo de microhematocrito

Materiales requeridos

- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)

- Plastilina

Procedimiento

diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel

dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon

anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80

del capilar

diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina

diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma

diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm

Resultados (lectura)

La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio

Uso de la escala

diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero

diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la

columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical

diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos

Valores de referencia

Hombres 40 - 50

Mujeres 38 - 44

Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44

Lactantes (3 meses) 37 - 42

Recieacuten nacidos 50 - 58

La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)

64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA

Principio

La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre

641 Materiales y reactivos

6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro

6412 Pipetas

diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla

diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL

6413 Tubos de ensayo

6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten

Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia

63 Determinacioacuten del volumen globular (Hto) 35

64 Dosaje de hemoglobina 38

65 Frotis de sangre perifeacuterica 40

66 Foacutermula leucocitaria 41

SECCIOacuteN 7 VELOCIDAD DE SEDIMENTACIOacuteN43

71 Meacutetodo de Westergren 43

72 Meacutetodo de Wintrobe 44

SECCIOacuteN 8 PERFIL DE HEMOSTASIA45

81 Principios generales 45

82 Mecanismo de coagulacioacuten 45

83 Exploracioacuten de la coagulacioacuten 46

84 Obtencioacuten del plasma 46

85 Tiempo de sangriacutea47

851 Meacutetodo de Ivy48

852 Meacutetodo de Duke49

86 Tiempo de coagulacioacuten de sangre total (TCST) 51

87 Tiempo de tromboplastina parcial activada (PTTK) 54

88 Tiempo de trombina 55

89 Tiempo de protrombina (Prueba de Quick) 56

SECCIOacuteN 9 RECUENTO DE RETICULOCITOS Y PLAQUETAS58

91 Recuento de reticulocitos 58

92 Recuento de plaquetas 60

SECCIOacuteN 10 LEUCOGRAMA63

101 Granulocitos63

102 Agranulocitos 65

103 Criterios para el desarrollo de un leucograma 67

SECCIOacuteN 11 ALTERACIONES ERITROCITARIAS79

Alteraciones en el tamantildeo 70

Alteraciones en la forma 71

Alteraciones de color72

Inclusiones anormales73

BIBLIOGRAFIacuteA79

ANEXO A Preparacioacuten de colorantes y soluciones maacutes

Usados en hematologiacutea81

ANEXO B Preparacioacuten de anticoagulantes 85

PRESENTACIOacuteN

Con el propoacutesito de uniformizar los procedimientos hematoloacutegicos que serealizan en los diversos laboratorios cliacutenicos el Instituto Nacional de Saludpone a disposicioacuten de la comunidad teacutecnico-cientiacutefica nacional el Manual deProcedimientos de Laboratorio en Teacutecnicas Baacutesicas de Hematologiacutea en elcual se incluyen todos los meacutetodos empleados en el campo hematoloacutegicobaacutesico De este modo se contribuye a mejorar la calidad de diagnoacutestico en loslaboratorios de los servicios de saludEl laboratorio de hematologiacutea cuenta con dos aacutereas baacutesicas Aacuterea deHematimetriacutea (hemograma VSE recuento de plaquetas etc) y Aacuterea deHemostasia Partiendo de esta estructura en este manual nos referiremos alas teacutecnicas baacutesicas empleadas en estas aacutereas partiendo de la toma de muestrahasta la realizacioacuten de las pruebas respectivasEs necesario enfatizar que para obtener resultados maacutes confiables es importantepero no imprescindible automatizar el laboratorio debido a que elloevitaraacute el posible error humano sobre todo en lo referente a recuentos celularesvalores de hemoglobina y constantes corpusculares ya que en estasvariables se trabaja con cantidades exactas de sangre hecho que es muydifiacutecil de lograr cuando se usan los meacutetodos manuales lo mismo sucede altratarse de las pruebas de hemostasiaEsperamos que este manual constituya una herramienta de consulta en laRed Nacional de Laboratorios de Salud ademaacutes de una guiacutea para el personalde laboratorio en general

INTRODUCCIOacuteN

El presente manual ha sido elaborado en forma simple didaacutectica y eminentementepraacutectica para que su contenido sea faacutecil de entender por el personalque labora en el laboratorio de hematologiacuteaSe divide en tres partes

1 En la primera parte se presentan los aspectos maacutes importantes de labioseguridad en el laboratorio

2 En la segunda parte se exponen las principales teacutecnicas baacutesicas del laboratoriode hematologiacutea

3 En la tercera parte se detallan las alteraciones maacutes frecuentes de la serieroja y de la serie blanca de un hemograma

El objetivo principal es protocolizar y estandarizar los procedimientoshematoloacutegicos que empiezan con la toma de muestra (siguiendo las pautasde control de calidad preanaliacutetica) hasta el procesamiento de eacutesta (fase analiacutetica)en la determinacioacuten correspondiente y por uacuteltimo en la emisioacuten de losresultados (fase postanaliacutetica) Debemos recalcar que cuando se realizanpruebas de hemostasia debe tenerse en consideracioacuten los cuidados comunesa toda prueba de laboratorio es decir las muestras deben obtenerse encondiciones apropiadas y rotularse debidamente Esperamos que el presentemanual sirva de guiacutea efectiva y que pueda ser enriquecido con nuevosaportes con la finalidad de alcanzar un trabajo de calidad

SECCIOacuteN 1

GENERALIDADES

11 OBJETIVO

Establecer y estandarizar los procedimientos baacutesicos de un examen dehemograma hemoglobina hematocrito recuento de plaquetas velocidad desedimentacioacuten y recuento de reticulocitos que sirvan de ayuda diagnoacutestica alcliacutenico

12 CAMPO DE APLICACIOacuteN

La aplicacioacuten de las teacutecnicas hematoloacutegicas nos sirve para estandarizar losprocedimientos a nivel nacional y para que sea de utilidad al personal teacutecnicoy profesional de los laboratorios cliacutenicos

13 RESPONSABILIDADES

131 El Centro Nacional de Laboratorios en Salud Puacuteblica a traveacutes de su

Direccioacuten Ejecutiva de Laboratorios de Referencia es responsable deautorizar la elaboracioacuten la revisioacuten y la actualizacioacuten del presente manualde acuerdo con los procedimientos aprobados por el Instituto Nacionalde Salud

132 Los directores de los establecimientos de salud son responsables deautorizar proporcionar los recursos necesarios y designar al personalresponsable para la aplicacioacuten de las disposiciones contenidas en elpresente manual

133 El personal de los establecimientos de salud es responsable de planificarlas acciones organizar controlar y capacitar al personal para cumplirlas disposiciones contenidas en el presente manual

134 Los jefes o responsables de los laboratorios deben asegurar el controlinterno de la calidad la idoneidad del personal equipos materialesreactivos e instalaciones

135 El personal meacutedico profesional y teacutecnico es responsable de seguir lasespecificaciones contenidas en el presente manual y aplicar los procedimientosespeciacuteficos indicados

14 DOCUMENTOS DE REFERENCIA

141 Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OrganizacioacutenPanamericana de la Salud Publicacioacuten cientiacutefica Nordm 439 Nordm 2 1983

142 Manual de normas de bioseguridad Instituto Nacional de Salud Serie deNormas Teacutecnicas Nordm 18 2ordf ed 1997

SECCIOacuteN 2

MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD

21 Para la obtencioacuten de muestras el personal involucrado en los diferentesprocesos para los exaacutemenes hematoloacutegicos debe aplicar las medidas debioseguridad establecidas en el Manual de Bioseguridad Serie de NormasTeacutecnicas Nordm 18

22 Se debe controlar sobre todo

221 Al personal que trabaja en el laboratorio de hematologiacutea

222 El proceso de coloracioacuten en el que se debe aplicar las medidas debioseguridad correspondientes al uso y manipulacioacuten de sustanciastoacutexicas o canceriacutegenas

223 Ver lo referente a medidas de proteccioacuten en caso de accidentes porinoculacioacuten

SECCIOacuteN 3

OBTENCIOacuteN DE MUESTRAS SANGUIacuteNEAS

31 OBJETIVO

Establecer y uniformizar criterios en el procedimiento de obtencioacuten de muestrassanguiacuteneas con un adecuado control de calidad ya que de ello dependeque el resultado del anaacutelisis de la muestra sea el correcto Se efectuaraacute enayunas o no dependiendo de la prueba a usar

32 OBTENCIOacuteN DE SANGRE VENOSA CON JERINGA

321 Materiales y equipos requeridos

3211 Algodoacuten

3212 Alcohol al 70

3213 Ligadura o torniquete de 25 a 30 cm de largo

3214 Jeringas de 5 mL

3215 Viales con anticoagulante EDTA

322 Obtencioacuten de la muestra

3221 Verificar que los elementos por utilizar esteacuten listos y que el pacientese sienta coacutemodo

3222 Aplicar el torniquete aproximadamente cuatro dedos por encima de laflexioacuten del codo o a 10 cm del codo sujetar con un medio nudo (Fig 1)

3223 Limpiar la zona con alcohol al 70 o alcohol yodado en un aacuterea de 2pulgadas (Fig 2)

3224 El paciente deberaacute abrir y cerrar la mano durante unos segundos ydespueacutes la mantendraacute cerrada esto ayudaraacute a visualizar las venassuperficiales (Fig 3)

3225 Se retira el estuche protector de la aguja y se coge la jeringa de talmanera que el bisel se encuentre hacia arriba (Fig 4)

3226 Se coloca la aguja en direccioacuten paralela a la vena se perfora la pielhaciendo avanzar la aguja 05-1 cm en el tejido subcutaacuteneo luego seperfora la vena (Fig 5)

3227 Se aspira la jeringa hasta el volumen requerido

3228 Retirar el torniquete e indicar al paciente que deje de hacer puntildeo Secoloca el algodoacuten seco encima de la puncioacuten y se retira la aguja (Fig 6)

3229 Retirar la aguja de la jeringa Verter la muestra lentamente por lasparedes del vial con anticoagulante No olvidar colocar una gota en lalaacutemina portaobjeto para realizar el frotis

32210 Agitar el vial en ciacuterculos sobre la mesa para homogeneizar la muestracon el anticoagulante

PUNTOS PARA LA EXTRACCIOacuteN DE SANGRE

(Toma de muestra)

Se obtiene de las venas de la fosa cubital

PROCEDIMIENTO

Fig 1 Fig 2 Fig 3

Fig 4 Fig 5

Fig 6 Fig 7

33 OBTENCIOacuteN DE SANGRE VENOSA EN TUBOS AL VACIacuteO

331 Materiales requeridos

3311 Algodoacuten

3312 Alcohol al 70

3313 Ligadura o torniquete de 25 a 30 cm de largo

3314 Tubos al vaciacuteo con anticoagulante EDTA (K3) EDTA (Na2) u otroanticoagulante

3315 Agujas con dispositivo para extraccioacuten de sangre al vaciacuteo

- Nordm 21 para adultos

- Nordm 22 para nintildeos y neonatos

De preferencia ambas de bisel corto para evitar la coagulacioacuten

332 Obtencioacuten de la muestra

3321 Repetir los pasos de 3221 a 3224

3322 Se retira el estuche protector de la aguja y eacuteste se enrosca al dispositivopara extraccioacuten de sangre al vaciacuteo

3323 Colocar la ligadura cuatro dedos por encima de la flexioacuten del codo o10 cm por encima de eacuteste y pedir al paciente que abra y cierre la manovarias veces para favorecer la dilatacioacuten de las venas

3324 Una vez escogida la vena desinfectarla con una pieza de algodoacutenembebido en etanol al 70

3325 Se coloca la aguja en direccioacuten paralela a la vena se perfora la pielhaciendo avanzar la aguja entre 05 cm y 1 cm en el tejido subcutaacuteneose inserta el tubo al vaciacuteo por la parte posterior y no preocuparse porla cantidad de sangre extraiacuteda ya que el mismo sonido del vaciacuteo avisaraacuteque la extraccioacuten terminoacute (Fig 8)

3326 Retirar la ligadura tirando del extremo doblado

3327 Colocar un pedazo de algodoacuten seco sobre la parte donde se encuentraoculta la aguja Sacar la aguja con un movimiento raacutepido y depositarlaen el recipiente de metal con desinfectante (Fig 9)

3328 Pedir al paciente que presione firmemente el algodoacuten durante 3 minutoscon el brazo extendido No se recomienda que se flexione el brazoa causa del riesgo que se forme un hematoma

3329 Mezclar por inmersioacuten suave la sangre con el anticoagulante contenidoen el tubo No agitar el contenido

Fig 8 Fig 9

333 Ventajas de una extraccioacuten de sangre venosa

3331 Pueden hacerse repetidos exaacutemenes con la misma muestra

3332 Parte de la muestra (plasma o suero) puede congelarse para referenciafutura

334 Desventajas de una extraccioacuten de sangre venosa

3341 La puncioacuten venosa por su largo procedimiento requiere mayor preparacioacuten que el meacutetodo capilar

3342 El meacutetodo es teacutecnicamente difiacutecil en nintildeos individuos obesos y pacientes en shock

3343 La hemoacutelisis debe ser evitada pues se puede obtener una disminucioacuten en el recuento de eritrocitos

3344 Debe evitarse prolongada estasis venosa producida por el torniquete pues produce hemoacutelisis y otros cambios que ponen la sangre en un estado inadecuado para el anaacutelisis de gases recuentos celulares determinacioacuten de pH sanguiacuteneo y algunas pruebas de coagulacioacuten

3345 La sangre anticoagulada si no es de obtencioacuten reciente no debe ser utilizada en extensiones de sangre pues algunos anticoagulantes producen cambios en las plaquetas que pueden causar aglutinaciones agregacioacuten plaquetaria y dificultan la identificacioacuten de leucocitos

3346 Puesto que algunos de los componentes de la sangre no son estables los recuentos de leucocitos y plaquetas e iacutendice de sedimentacioacuten deben realizarse antes de que pasen dos horas desde que se obtuvo la muestra

34 OBTENCIOacuteN DE SANGRE DE LA VENA YUGULAR EXTERNA

341 Materiales requeridos

3411 Algodoacuten

3412 Alcohol al 70

3413 Jeringas de 5 mL

3414 Viales con anticoagulante EDTA

342 Obtencioacuten de la muestra

3421 El paciente es cubierto por una saacutebana de manera que los brazospermanezcan inmovilizados a lo largo del cuerpo

3422 Al paciente se le coloca de cuacutebito dorsal sobre la mesa de examen ouna

camilla de manera que la cabeza cuelgue sobre el final de lamesa y el cuerpo sea

sujetado por un asistente

3423 Cuando el paciente grita la vena yugular externa se marca claramente

3424 Limpiar la zona en un aacuterea de 2 pulgadas con alcohol al 70 o

alcoholyodado

3425 Se repiten los pasos de 3225 a 3227 de la extraccioacuten de sangrevenosa

con jeringa

3426 Retirar la aguja de la vena y presionar suavemente con un algodoacutenseco

aproximadamente de 3 a 5 minutos Pedir al paciente que permanezcaechado diez

minutos

3427 Se repiten los pasos de 3229

3428 Se repiten los pasos de 32210

343 Ventajas

Constituye un buen meacutetodo para la obtencioacuten de sangre en pacientes conshock

con venas colapsadas

344 Desventajas

Por lo delicado en su procedimiento no se recomienda como rutina soacutelo encasos

en que no se pueda obtener la muestra por meacutetodos convencionales

35 OBTENCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR

Cuando la cantidad de sangre que se precisa es muy pequentildea o cuando

pordiferentes motivos no pueda practicarse una puncioacuten venosa debe recurrirse

a la puncioacuten capilar

351 Materiales requeridos

3512 Algodoacuten

3513 Alcohol al 70

3514 Lancetas desechables (Fig 10)

3515 Papel filtro Nordm 2

352 Procedimiento (Fig 11)

3521 La sangre capilar se obtiene de la cara lateral del dedo medio o anularen los adultos y del dedo gordo del pie o taloacuten en los nintildeos

3522 Desinfectar la zona con alcohol al 70 secar con algodoacuten esteacuteril

3523 Punzar la piel con una lanceta esteacuteril desechable (2 mm de profundidad)

3524 Usar gasa esteacuteril para desechar la primera gota y recoger las siguientesen tubos capilares Evitar comprimir la extremidad para obtenersangre porque se altera la composicioacuten sanguiacutenea

353 Ventajas

3531 Puede obtenerse con facilidad

3532 Es preferible cuando han de realizarse extensiones de sangre perifeacuterica

354 Desventajas

3541 Soacutelo se pueden obtener pequentildeas cantidades de sangre y los exaacutemenesde repeticioacuten requieren nuevas muestras

3542 La sangre en microtubos (capilares) frecuentemente se hemolizainterfiendo con la mayoriacutea de pruebas de laboratorio

3543 Los resultados obtenidos en pruebas con sangre capilar no puedenser comparados con los resultados de las pruebas con sangre venosa

3544 El dedo no soacutelo es delicado sino difiacutecil de desinfectar adecuadamenteen el tiempo disponible

3545 En pacientes con resistencia disminuida a la infeccioacuten (aquellos conleucemia agranulocitosis diabetes uremia y enfermedades con deficienciasinmunoloacutegicas) una muestra tomada del dedo es mucho maacutesprobable que conduzca a una infeccioacuten que otra tomada del brazo

3546 El recuento de eritrocitos y leucocitos asiacute como el recuento deplaquetas y reticulocitos no debe realizarse en sangre capilar debidoa la difiacutecil estandarizacioacuten del flujo sanguiacuteneo capilar

EXTRACCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR

Fig 10

Fig 11

SECCIOacuteN 4

ANTICOAGULANTES

Una vez extraiacuteda la sangre eacutesta puede conservarse coagulada o

mantenidaincoagulable mediante la adicioacuten de un anticoagulante

41 CARACTERIacuteSTICAS BAacuteSICAS DE LOS ANTICOAGULANTES MAacuteS

USADOSEN HEMATOLOGIacuteA

bull No alterar el tamantildeo de los hematiacutees

bull No producir hemoacutelisis

bull Evitar al maacuteximo la agregacioacuten plaquetaria

bull No alterar la morfologiacutea de los leucocitos

La sangre tratada con anticoagulante debe procesarse lo antes posible

inclusomantenida bajo refrigeracioacuten (4 ordmC) si no pasan de las 2 horas El

tiempomaacuteximo entre la extraccioacuten de la sangre y su procesamiento depende

delcoagulante de eleccioacuten y no debe ser maacutes de 4 horas a excepcioacuten

delanticoagulante EDTA (etilendiaminotetraceacutetico) que puede ser hasta 24

horas(en refrigeracioacuten a 4 ordmC)

Los anticoagulantes pueden emplearse en forma soacutelida o liacutequida Los

primerosestaacuten indicados para la determinacioacuten de los paraacutemetros

hematoloacutegicosya que no producen como los anticoagulantes liacutequidos dilucioacuten de

la sangre

42 ANTICOAGULANTES SOacuteLIDOS

421 EDTA

Es la sal disoacutedica o tripotaacutesica del aacutecido etilendiaminotetraceacutetico La saldisoacutedica

(Na2EDTA) es menos soluble que la sal tripotaacutesica (K3EDTA) Estoscompuestos

realizan su accioacuten a traveacutes de un efecto quelante sobre el calcioal fijarlo impiden

su activacioacuten y por ende la coagulacioacuten sanguiacutenea

4211 Ventajas

bull Respeta la morfologiacutea eritrocitaria (especialmente la sal tripotaacutesica) yleucocitaria de manera que permite una demora de dos horas en la realizacioacutendel frotis sanguiacuteneo despueacutes de la extraccioacuten sanguiacutenea

bull Asegura la conservacioacuten de los elementos formes sanguiacuteneos durante 24horas si la sangre se mantiene a 4 ordmC

bull Al inhibir la aglutinacioacuten de las plaquetas facilita su recuento o su expresioacutensemicuantitativa a partir del frotis

bull La concentracioacuten recomendada de EDTA es de 15 mgmL de sangre Unamayor cantidad de anticoagulante puede producir retraccioacuten celular condisminucioacuten del hematocrito y un aumento de la concentracioacuten media de lahemoglobina Un exceso de sangre con relacioacuten al anticoagulante produceformacioacuten de microagregados que pueden alterar los resultados El empleode tubos al vaciacuteo con una gota (50mL) de EDTA tripotaacutesica comercialpara 5 mL de sangre es de intereacutes praacutectico dado que es cien veces maacutessoluble facilitando la mezcla de sangre con anticoagulante

4212 Desventajas

Usado en exceso afecta a los eritrocitos y a los leucocitos a los cuales les produce encogimiento y cambios en su forma por ello debe cuidarse de agregar la cantidad correcta de sangre al anticoagulante

422 Anticoagulante de Wintrobe

Es una mezcla de oxalato de amonio y potasio Actuacutea por precipitacioacuten del calcio es faacutecil de preparar Se emplea en forma de polvo en proporcioacuten de 2 de oxalato de amonio por 1 de oxalato de potasio La cantidad recomendada es de 2 mg x mL de sangre Este anticoagulante no afecta el volumen globular medio y puede usarse para determinaciones de hemoglobina hematocrito y recuento globular pero para los extendidos queda limitada a los primeros minutos tampoco es uacutetil para el recuento plaquetario porque produce formacioacuten de agregados plaquetarios

423 Heparina

El nombre de heparina proviene del griego hepar que significa hiacutegado ya que fue aislado por primera vez de las ceacutelulas de este tejido Es un mucopolisacaacuterido aacutecido Presenta el

inconveniente de que si no se agita raacutepidamente con la sangre despueacutes de extraiacuteda

pueden formarse microcoaacutegulos aunque no altera el volumeneritrocitario ni la morfologiacutea de los leucocitos No es recomendablepara el frotis sanguiacuteneo porque produce un fondo azul en la laacutemina

La heparina de sodio o litio puede usarse en forma soacutelida o liacutequida en

proporcioacutende 01 - 02 mg de heparina por 1 mL de sangre

43 ANTICOAGULANTES LIacuteQUIDOS

431 Citrato trisoacutedico

Es de eleccioacuten para las pruebas de hemostasia y la velocidad de sedimentacioacuten

Actuacutea a traveacutes de la precipitacioacuten del calcio La concentracioacuten depende de

la prueba por realizar

bull Para pruebas de hemostasia se emplea en proporcioacuten de 1 9 (05 mL

deanticoagulante para 45 mL de sangre total)

bull Para la determinacioacuten de la VSG (Velocidad de Sedimentacioacuten Globular) es14

(05 mL de anticoagulante para 2 mL de sangre)

432 Oxalato soacutedico

Recomendado tambieacuten para las pruebas de hemostasia Se emplea en

proporcioacutende un volumen de anticoagulante para 4 vol de sangre

SECCIOacuteN 5

REALIZACIOacuteN Y TINCIOacuteN DEL FROTIS SANGUIacuteNEO

La praacutectica del frotis sanguiacuteneo tambieacuten llamado extendido es de gran importanciaen hematologiacutea ya que el diagnoacutestico de muchas enfermedadeshematoloacutegicas puede realizarse con soacutelo observar las caracteriacutesticasmorfoloacutegicas de las ceacutelulas sanguiacuteneas de manera que eacuteste no debe serexcesivamente grueso ni excesivamente fino Todas las laacuteminas por usarsobre todo nuevas deben ser limpiadas con algodoacuten y alcohol al 70 paraeliminar la grasa que viene adherida

51 MEacuteTODO DE LOS DOS PORTAOBJETOS

511 Materiales

- Alcohol al 70

- Algodoacuten

- Lanceta descartable

- Portaobjetos de vidrios limpios y desgrasados (25 x 75 mm)

512 Fundamento

Consiste en la extensioacuten de una gota de sangre sobre un portaobjeto (25 x 75)empleando el canto biselado de otro portaobjeto de igual dimensioacuten (Fig 12)

513 Procedimiento

5131 Una vez extraiacuteda la sangre con cualquiera de las metodologiacuteas secoloca una pequentildea gota de sangre (5mL) (aprox 3 mm de diaacutemetro)sobre un portaobjeto a 2 cm aproximadamente de uno de los extremos

5132 Colocar el canto de otro portaobjeto esmerilado sobre la superficiedel primer portaobjeto (en la que se encuentra la gota de sangre)formando un aacutengulo de 45ordm

5134 Deslizar suavemente y a velocidad moderada el portaobjeto sobre elotro en sentido longitudinal hasta que la gota de sangre quede bienextendida sobre la

superficie del primer portaobjeto El grosor delfrotis sanguiacuteneo puede variar seguacuten sea el aacutengulo que formen entresiacute ambos portaobjetos Asiacute si es superior a 45ordm la extensioacuten obtenidaseraacute gruesa y corta si es inferior a 45ordm seraacute larga y fina El secado delfrotis es a temperatura ambiente y en posicioacuten horizontal

Fig 12

1048729 Zona excesivamente gruesa Se halla en la regioacuten inmediata al punto departida de la extensioacuten (cabeza) En ella se aprecia siempre un aumento delinfocitos

1048729 Zona excesivamente fina Corresponde al final de la extensioacuten y termina enun aacuterea donde las ceacutelulas adoptan una posicioacuten acartonada (barbas) Enesta regioacuten existe un exceso de granulocitos y monocitos

1048729 Zona ideal Corresponde a la regioacuten intermedia del frotis y en ella existe unreparto equilibrado de ceacutelulas

52 COLORACIONES USADAS

Una vez seco el frotis se procede a la tincioacuten hematoloacutegica con el colorante deRomanowsky constituido por la mezcla de eosina y azul de metileno Dentrode eacutestas tenemos

521 Colorante de Giemsa

522 Colorante de May-Grunwald

523 Colorante de Wright

524 Colorante de Leishman

Preparacioacuten de colorantes (Anexo A)

1048729 Para el estudio de las ceacutelulas sanguiacuteneas utilizar el colorante 523 y 524

1048729 Para el estudio de hemoparaacutesitos utilizar el colorante 521

1048729 Utilizar el colorante 522 para casos especiales en que se desee observar

con mayor claridad y especificidad los graacutenulos de los neutrofilos

53 TINCIOacuteN CON COLORANTE DE WRIGHT

531 Fundamento

El colorante de Wright va a permitir suministrar un medio para estudiar lasangre y determinar las variaciones y anormalidades de estructura forma ytamantildeo de los eritrocitos su contenido de hemoglobina y sus propiedades decoloracioacuten La informacioacuten obtenida de un frotis de sangre perifeacuterica dependeen gran parte de la calidad del extendido y la coloracioacuten

532 Materiales

5321 Colorante de Wright (Anexo A)

5322 Frasco gotero

5323 Solucioacuten amortiguada tamponada (Anexo A)

533 Procedimiento

5331 Una vez obtenido el frotis sanguiacuteneo se le dejaraacute secar entre 15 y 20minutos

5332 Luego se coloca la preparacioacuten en un soporte y se cubre con el colorantede Wright dejaacutendolo por espacio de 5 minutos

5333 Posteriormente se antildeade solucioacuten amortiguada tamponada en partesiguales hasta obtener un brillo metaacutelico dejando 6 minutos adicionales

5334 Finalmente se lava con agua corriente y se deja secar

5335 Se coloca en el microscopio y con pequentildeo aumento se revisa lacalidad de la coloracioacuten la cantidad aproximada de gloacutebulos blancosy se escoge el sitio para iniciar el recuento Se coloca una gota deaceite de inmersioacuten y se enfoca a un aumento de 100xLa forma de los gloacutebulos rojos se examinaraacute detenidamente observandoademaacutes del color (cantidad de hemoglobina) presencia deplaquetas su agrupacioacuten y distribucioacuten

5336 Posteriormente se hace el recuento diferencial de gloacutebulos blancosen 100

ceacutelulas para lo cual se deberaacute conocer las diferencias entreneutroacutefilos eosinoacutefilos

linfocitos y monocitosUna extensioacuten de sangre bien tentildeida debe caracterizarse

por unabuena diferenciacioacuten de las estructuras subcelulares en los leucocitosuna

coloracioacuten rosada de los hematiacutees y la ausencia de precipitados

Los defectos maacutes frecuentes observados en la tincioacuten del frotis sanguiacuteneoson

Coloracioacuten excesivamente azul debido a

1048729 Frotis excesivamente grueso

1048729 Lavado insuficiente

1048729 Tincioacuten muy prolongada

1048729 Empleo de colorante excesivamente alcalino

Coloracioacuten con una tonalidad rosada

1048729 El colorante el tampoacuten o el agua de lavado tienen un pH demasiadoaacutecido

Presencia de precipitados

1048729 Obedecen a una accioacuten excesiva del colorante Esto se puede evitarcon la

filtracioacuten

SECCIOacuteN 6

HEMOGRAMA-HEMOGLOBINA-HEMATOCRITO

El hemograma de Shilling constituye uno de los exaacutemenes de laboratorio

maacutesusados en el campo de la hematologiacutea Comprende las siguientes pruebas

61 RECUENTO LEUCOCITARIO

Principio

La sangre anticoagulada se deposita en un liacutequido que permite evidenciar

losleucocitos mantenieacutendolos visibles mientras que los eritrocitos

sonhemolizados El recuento del nuacutemero de leucocitos o gloacutebulos blancos se

expresapor mm3 (miliacutemetro cuacutebico)

611 Equipos

- Microscopio

- Hemocitoacutemetro (Caacutemara de Neubauer)

Consta de los siguientes elementos

diams Una laacutemina portaobjeto gruesa en el centro se hallan dos

superficiescuadriculadas iguales separadas del resto de la laacutemina por surcos y

dosbarras transversales algo maacutes elevadas

diams Una laminilla cubreobjetos oacutepticamente plana que al colocarse sobrelas barras

elevadas de la laacutemina forma una caacutemara entre el cubreobjetosy la superficie

cuadriculadaLa altura entre el cubreobjetos y la laacutemina portaobjetos es de 01

mmCada cuadriacutecula mide 3 mm de lado y se divide en 9 cuadrados grandesCada

uno de los cuales mide 1 mm2 de superficie que se subdivide a suvez en 16

cuadrados medianos El cuadrado grande central se divide en25 cuadrados

pequentildeos y cada uno de ellos en 16 cuadraditos Cadacuadrado pequentildeo mide

02 mm de lado (004 mm2 de superficie) y cadacuadradito mide 005 mm de lado

(00025 mm2 de superficie)

612 Materiales y reactivos requeridos

6121 Pipeta de gloacutebulos blancos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0 a 100 mL)Presenta cerca del extremo superior una marca de 11 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla que funciona comomezcladora luego sigue el extremo maacutes largo de la pipeta (tallo) que estaacutedividida en 10 partes con 2 marcas 1 (parte final del bulbo) y 05 (a la mitaddel tallo) Se le acopla a su extremo superior 1 tubo de goma y una bombillapara aspirar

6122 Diluyente de gloacutebulos blancos Solucioacuten de Turk al 1

6123 Contador manual (Soacutelo si fuera necesario)

6124 Papel filtro

613 Procedimiento

6131 Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar deldedo se procede a aspirar la sangre con la pipeta de gloacutebulos blancoshasta la marca de 05 y a limpiar la punta con papel absorbente

6132 Introducir la pipeta en el tubo que contenga solucioacuten de Turk y absorberhasta la marca de 11 (no debe haber burbujas)

6133 Tapar ambos extremos y proceder a mezclar manualmente o en unrotador automaacutetico por 2 oacute 3 minutos

6134 Monte la laminilla de vidrio en la caacutemara para recuento que debe estarlimpia y seca

6135 Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocaruna gota pequentildea de esta solucioacuten en la caacutemara

6136 Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las ceacutelulas se sedimenten

6137 Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angularesCuando se usa la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002 mL) desangre total con anticoagulante o sangre capilar con anticoagulante yse diluye en un tubo que contenga 380 mL de solucioacuten de Turk (aquiacutetenemos una dilucioacuten 120)

LECTURA

Fig 13

La lectura se realiza en los campos 1 3 7 y 9 como estaacute indicado en la figuraAdemaacutes de los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes sedeben contar todos los leucocitos que se encuentren adheridos en la liacuteneahorizontal superior y vertical exterior o de lo contrario todos los leucocitosadheridos a la liacutenea horizontal inferior y vertical interior

614 Resultados

Nordm de leucocitos x mm3 = leucocitos contados en 4 camposdividealtura x dilucioacuten x aacuterea

Reemplazando = leucocitos contados en 4 camposdivide110 x 120 x 4=

Leucocitos contados en 4 camposdivide4200=

X1 divide4200= Nordm leucocitos contados x 50

615 Valores de referencia

5000 - 10 000 leucocitos mm3

616 Correccioacuten de valores para restar eritrocitos nucleados

Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el liacutequido de dilucioacuten por lo tantopueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con losleucocitos de tal manera que se debe emplear la siguiente foacutermula

Caacutelculo

La concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos (por litro) esNuacutemero de normoblatos contados x concentracioacuten o nuacutemero de leucocitos100 + Nordm de normoblastos contados

Ejemplo

Si se cuentan 50 normoblastos y la concentracioacuten del nuacutemero de leucocitos es16 x 109l la concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos seraacute

50 x16 = 53 x 109l

100 + 50

y la concentracioacuten de leucocitos corregida seraacute 16 - 53 = 107 x 109lEn unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitosse expresan por miliacutemetro cuacutebico En tales unidades el caacutelculo correspondienteal ejemplo que se ha dado seriacutea

50 x 16 000 = 5300 mm3

100 + 50

Recuento corregido de gloacutebulos blancos o leucocitos = 16 000 - 5300 = 10 700 mm3

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

62 RECUENTO DE GLOacuteBULOS ROJOS

Principio

La sangre se diluye en un liacutequido que nos permite observar claramente loshematiacutees luego esta dilucioacuten se coloca en una caacutemara de Neubauer con laayuda de una pipeta automaacutetica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopioa un objetivo de 40x para calcular el nuacutemero de gloacutebulos rojos por mm3

621 Equipos

- Microscopio

- Hemocitoacutemetro (caacutemara de Neubauer)

622 Materiales y reactivos requeridos

6221 Pipeta de gloacutebulos rojos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0-100 mL)

Presenta cerca del extremo superior una marca de 101 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla roja mezcladoraluego sigue el tallo (extremo maacutes largo) el cual estaacute dividido en 10 partescon 2 marcas 1 acabando el bulbo y 05 a la mitad del tallo Se requiereigual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar

6222 Diluyente de gloacutebulos rojos Cloruro de Sodio al 09 (ver anexo)

Diluyente de Hayem (ver anexo)

6223 Contador manual (soacutelo si fuera necesario)

6224 Papel filtro

623 Procedimiento

6231 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar

6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente

6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101

6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos

6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente

6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas

6237 Dejar en reposo por 3 minutos

6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)

6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos

LECTURA

Fig 14

624 Resultados

Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea

Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15

= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000

= hematiacutees contados x 10 000

625 Valores de referencia

(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)

Hombres 4 500 000 - 5 500 000

Mujeres 4 000 000 - 5 000 000

Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000

Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000

Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)

Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal

volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen

porcentaje o como valor decimal

Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre

total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)

631 Meacutetodo de Wintrobe

Materiales requeridos

- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm

- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia

- Tapoacuten de goma

Procedimiento

diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur

comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado

de no provocar espuma

diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten

diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos

Resultados (lectura)

Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos

Valores de referencia

Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

632 Meacutetodo de microhematocrito

Materiales requeridos

- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)

- Plastilina

Procedimiento

diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel

dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon

anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80

del capilar

diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina

diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma

diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm

Resultados (lectura)

La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio

Uso de la escala

diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero

diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la

columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical

diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos

Valores de referencia

Hombres 40 - 50

Mujeres 38 - 44

Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44

Lactantes (3 meses) 37 - 42

Recieacuten nacidos 50 - 58

La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)

64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA

Principio

La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre

641 Materiales y reactivos

6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro

6412 Pipetas

diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla

diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL

6413 Tubos de ensayo

6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten

Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia

Alteraciones en el tamantildeo 70

Alteraciones en la forma 71

Alteraciones de color72

Inclusiones anormales73

BIBLIOGRAFIacuteA79

ANEXO A Preparacioacuten de colorantes y soluciones maacutes

Usados en hematologiacutea81

ANEXO B Preparacioacuten de anticoagulantes 85

PRESENTACIOacuteN

Con el propoacutesito de uniformizar los procedimientos hematoloacutegicos que serealizan en los diversos laboratorios cliacutenicos el Instituto Nacional de Saludpone a disposicioacuten de la comunidad teacutecnico-cientiacutefica nacional el Manual deProcedimientos de Laboratorio en Teacutecnicas Baacutesicas de Hematologiacutea en elcual se incluyen todos los meacutetodos empleados en el campo hematoloacutegicobaacutesico De este modo se contribuye a mejorar la calidad de diagnoacutestico en loslaboratorios de los servicios de saludEl laboratorio de hematologiacutea cuenta con dos aacutereas baacutesicas Aacuterea deHematimetriacutea (hemograma VSE recuento de plaquetas etc) y Aacuterea deHemostasia Partiendo de esta estructura en este manual nos referiremos alas teacutecnicas baacutesicas empleadas en estas aacutereas partiendo de la toma de muestrahasta la realizacioacuten de las pruebas respectivasEs necesario enfatizar que para obtener resultados maacutes confiables es importantepero no imprescindible automatizar el laboratorio debido a que elloevitaraacute el posible error humano sobre todo en lo referente a recuentos celularesvalores de hemoglobina y constantes corpusculares ya que en estasvariables se trabaja con cantidades exactas de sangre hecho que es muydifiacutecil de lograr cuando se usan los meacutetodos manuales lo mismo sucede altratarse de las pruebas de hemostasiaEsperamos que este manual constituya una herramienta de consulta en laRed Nacional de Laboratorios de Salud ademaacutes de una guiacutea para el personalde laboratorio en general

INTRODUCCIOacuteN

El presente manual ha sido elaborado en forma simple didaacutectica y eminentementepraacutectica para que su contenido sea faacutecil de entender por el personalque labora en el laboratorio de hematologiacuteaSe divide en tres partes

1 En la primera parte se presentan los aspectos maacutes importantes de labioseguridad en el laboratorio

2 En la segunda parte se exponen las principales teacutecnicas baacutesicas del laboratoriode hematologiacutea

3 En la tercera parte se detallan las alteraciones maacutes frecuentes de la serieroja y de la serie blanca de un hemograma

El objetivo principal es protocolizar y estandarizar los procedimientoshematoloacutegicos que empiezan con la toma de muestra (siguiendo las pautasde control de calidad preanaliacutetica) hasta el procesamiento de eacutesta (fase analiacutetica)en la determinacioacuten correspondiente y por uacuteltimo en la emisioacuten de losresultados (fase postanaliacutetica) Debemos recalcar que cuando se realizanpruebas de hemostasia debe tenerse en consideracioacuten los cuidados comunesa toda prueba de laboratorio es decir las muestras deben obtenerse encondiciones apropiadas y rotularse debidamente Esperamos que el presentemanual sirva de guiacutea efectiva y que pueda ser enriquecido con nuevosaportes con la finalidad de alcanzar un trabajo de calidad

SECCIOacuteN 1

GENERALIDADES

11 OBJETIVO

Establecer y estandarizar los procedimientos baacutesicos de un examen dehemograma hemoglobina hematocrito recuento de plaquetas velocidad desedimentacioacuten y recuento de reticulocitos que sirvan de ayuda diagnoacutestica alcliacutenico

12 CAMPO DE APLICACIOacuteN

La aplicacioacuten de las teacutecnicas hematoloacutegicas nos sirve para estandarizar losprocedimientos a nivel nacional y para que sea de utilidad al personal teacutecnicoy profesional de los laboratorios cliacutenicos

13 RESPONSABILIDADES

131 El Centro Nacional de Laboratorios en Salud Puacuteblica a traveacutes de su

Direccioacuten Ejecutiva de Laboratorios de Referencia es responsable deautorizar la elaboracioacuten la revisioacuten y la actualizacioacuten del presente manualde acuerdo con los procedimientos aprobados por el Instituto Nacionalde Salud

132 Los directores de los establecimientos de salud son responsables deautorizar proporcionar los recursos necesarios y designar al personalresponsable para la aplicacioacuten de las disposiciones contenidas en elpresente manual

133 El personal de los establecimientos de salud es responsable de planificarlas acciones organizar controlar y capacitar al personal para cumplirlas disposiciones contenidas en el presente manual

134 Los jefes o responsables de los laboratorios deben asegurar el controlinterno de la calidad la idoneidad del personal equipos materialesreactivos e instalaciones

135 El personal meacutedico profesional y teacutecnico es responsable de seguir lasespecificaciones contenidas en el presente manual y aplicar los procedimientosespeciacuteficos indicados

14 DOCUMENTOS DE REFERENCIA

141 Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OrganizacioacutenPanamericana de la Salud Publicacioacuten cientiacutefica Nordm 439 Nordm 2 1983

142 Manual de normas de bioseguridad Instituto Nacional de Salud Serie deNormas Teacutecnicas Nordm 18 2ordf ed 1997

SECCIOacuteN 2

MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD

21 Para la obtencioacuten de muestras el personal involucrado en los diferentesprocesos para los exaacutemenes hematoloacutegicos debe aplicar las medidas debioseguridad establecidas en el Manual de Bioseguridad Serie de NormasTeacutecnicas Nordm 18

22 Se debe controlar sobre todo

221 Al personal que trabaja en el laboratorio de hematologiacutea

222 El proceso de coloracioacuten en el que se debe aplicar las medidas debioseguridad correspondientes al uso y manipulacioacuten de sustanciastoacutexicas o canceriacutegenas

223 Ver lo referente a medidas de proteccioacuten en caso de accidentes porinoculacioacuten

SECCIOacuteN 3

OBTENCIOacuteN DE MUESTRAS SANGUIacuteNEAS

31 OBJETIVO

Establecer y uniformizar criterios en el procedimiento de obtencioacuten de muestrassanguiacuteneas con un adecuado control de calidad ya que de ello dependeque el resultado del anaacutelisis de la muestra sea el correcto Se efectuaraacute enayunas o no dependiendo de la prueba a usar

32 OBTENCIOacuteN DE SANGRE VENOSA CON JERINGA

321 Materiales y equipos requeridos

3211 Algodoacuten

3212 Alcohol al 70

3213 Ligadura o torniquete de 25 a 30 cm de largo

3214 Jeringas de 5 mL

3215 Viales con anticoagulante EDTA

322 Obtencioacuten de la muestra

3221 Verificar que los elementos por utilizar esteacuten listos y que el pacientese sienta coacutemodo

3222 Aplicar el torniquete aproximadamente cuatro dedos por encima de laflexioacuten del codo o a 10 cm del codo sujetar con un medio nudo (Fig 1)

3223 Limpiar la zona con alcohol al 70 o alcohol yodado en un aacuterea de 2pulgadas (Fig 2)

3224 El paciente deberaacute abrir y cerrar la mano durante unos segundos ydespueacutes la mantendraacute cerrada esto ayudaraacute a visualizar las venassuperficiales (Fig 3)

3225 Se retira el estuche protector de la aguja y se coge la jeringa de talmanera que el bisel se encuentre hacia arriba (Fig 4)

3226 Se coloca la aguja en direccioacuten paralela a la vena se perfora la pielhaciendo avanzar la aguja 05-1 cm en el tejido subcutaacuteneo luego seperfora la vena (Fig 5)

3227 Se aspira la jeringa hasta el volumen requerido

3228 Retirar el torniquete e indicar al paciente que deje de hacer puntildeo Secoloca el algodoacuten seco encima de la puncioacuten y se retira la aguja (Fig 6)

3229 Retirar la aguja de la jeringa Verter la muestra lentamente por lasparedes del vial con anticoagulante No olvidar colocar una gota en lalaacutemina portaobjeto para realizar el frotis

32210 Agitar el vial en ciacuterculos sobre la mesa para homogeneizar la muestracon el anticoagulante

PUNTOS PARA LA EXTRACCIOacuteN DE SANGRE

(Toma de muestra)

Se obtiene de las venas de la fosa cubital

PROCEDIMIENTO

Fig 1 Fig 2 Fig 3

Fig 4 Fig 5

Fig 6 Fig 7

33 OBTENCIOacuteN DE SANGRE VENOSA EN TUBOS AL VACIacuteO

331 Materiales requeridos

3311 Algodoacuten

3312 Alcohol al 70

3313 Ligadura o torniquete de 25 a 30 cm de largo

3314 Tubos al vaciacuteo con anticoagulante EDTA (K3) EDTA (Na2) u otroanticoagulante

3315 Agujas con dispositivo para extraccioacuten de sangre al vaciacuteo

- Nordm 21 para adultos

- Nordm 22 para nintildeos y neonatos

De preferencia ambas de bisel corto para evitar la coagulacioacuten

332 Obtencioacuten de la muestra

3321 Repetir los pasos de 3221 a 3224

3322 Se retira el estuche protector de la aguja y eacuteste se enrosca al dispositivopara extraccioacuten de sangre al vaciacuteo

3323 Colocar la ligadura cuatro dedos por encima de la flexioacuten del codo o10 cm por encima de eacuteste y pedir al paciente que abra y cierre la manovarias veces para favorecer la dilatacioacuten de las venas

3324 Una vez escogida la vena desinfectarla con una pieza de algodoacutenembebido en etanol al 70

3325 Se coloca la aguja en direccioacuten paralela a la vena se perfora la pielhaciendo avanzar la aguja entre 05 cm y 1 cm en el tejido subcutaacuteneose inserta el tubo al vaciacuteo por la parte posterior y no preocuparse porla cantidad de sangre extraiacuteda ya que el mismo sonido del vaciacuteo avisaraacuteque la extraccioacuten terminoacute (Fig 8)

3326 Retirar la ligadura tirando del extremo doblado

3327 Colocar un pedazo de algodoacuten seco sobre la parte donde se encuentraoculta la aguja Sacar la aguja con un movimiento raacutepido y depositarlaen el recipiente de metal con desinfectante (Fig 9)

3328 Pedir al paciente que presione firmemente el algodoacuten durante 3 minutoscon el brazo extendido No se recomienda que se flexione el brazoa causa del riesgo que se forme un hematoma

3329 Mezclar por inmersioacuten suave la sangre con el anticoagulante contenidoen el tubo No agitar el contenido

Fig 8 Fig 9

333 Ventajas de una extraccioacuten de sangre venosa

3331 Pueden hacerse repetidos exaacutemenes con la misma muestra

3332 Parte de la muestra (plasma o suero) puede congelarse para referenciafutura

334 Desventajas de una extraccioacuten de sangre venosa

3341 La puncioacuten venosa por su largo procedimiento requiere mayor preparacioacuten que el meacutetodo capilar

3342 El meacutetodo es teacutecnicamente difiacutecil en nintildeos individuos obesos y pacientes en shock

3343 La hemoacutelisis debe ser evitada pues se puede obtener una disminucioacuten en el recuento de eritrocitos

3344 Debe evitarse prolongada estasis venosa producida por el torniquete pues produce hemoacutelisis y otros cambios que ponen la sangre en un estado inadecuado para el anaacutelisis de gases recuentos celulares determinacioacuten de pH sanguiacuteneo y algunas pruebas de coagulacioacuten

3345 La sangre anticoagulada si no es de obtencioacuten reciente no debe ser utilizada en extensiones de sangre pues algunos anticoagulantes producen cambios en las plaquetas que pueden causar aglutinaciones agregacioacuten plaquetaria y dificultan la identificacioacuten de leucocitos

3346 Puesto que algunos de los componentes de la sangre no son estables los recuentos de leucocitos y plaquetas e iacutendice de sedimentacioacuten deben realizarse antes de que pasen dos horas desde que se obtuvo la muestra

34 OBTENCIOacuteN DE SANGRE DE LA VENA YUGULAR EXTERNA

341 Materiales requeridos

3411 Algodoacuten

3412 Alcohol al 70

3413 Jeringas de 5 mL

3414 Viales con anticoagulante EDTA

342 Obtencioacuten de la muestra

3421 El paciente es cubierto por una saacutebana de manera que los brazospermanezcan inmovilizados a lo largo del cuerpo

3422 Al paciente se le coloca de cuacutebito dorsal sobre la mesa de examen ouna

camilla de manera que la cabeza cuelgue sobre el final de lamesa y el cuerpo sea

sujetado por un asistente

3423 Cuando el paciente grita la vena yugular externa se marca claramente

3424 Limpiar la zona en un aacuterea de 2 pulgadas con alcohol al 70 o

alcoholyodado

3425 Se repiten los pasos de 3225 a 3227 de la extraccioacuten de sangrevenosa

con jeringa

3426 Retirar la aguja de la vena y presionar suavemente con un algodoacutenseco

aproximadamente de 3 a 5 minutos Pedir al paciente que permanezcaechado diez

minutos

3427 Se repiten los pasos de 3229

3428 Se repiten los pasos de 32210

343 Ventajas

Constituye un buen meacutetodo para la obtencioacuten de sangre en pacientes conshock

con venas colapsadas

344 Desventajas

Por lo delicado en su procedimiento no se recomienda como rutina soacutelo encasos

en que no se pueda obtener la muestra por meacutetodos convencionales

35 OBTENCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR

Cuando la cantidad de sangre que se precisa es muy pequentildea o cuando

pordiferentes motivos no pueda practicarse una puncioacuten venosa debe recurrirse

a la puncioacuten capilar

351 Materiales requeridos

3512 Algodoacuten

3513 Alcohol al 70

3514 Lancetas desechables (Fig 10)

3515 Papel filtro Nordm 2

352 Procedimiento (Fig 11)

3521 La sangre capilar se obtiene de la cara lateral del dedo medio o anularen los adultos y del dedo gordo del pie o taloacuten en los nintildeos

3522 Desinfectar la zona con alcohol al 70 secar con algodoacuten esteacuteril

3523 Punzar la piel con una lanceta esteacuteril desechable (2 mm de profundidad)

3524 Usar gasa esteacuteril para desechar la primera gota y recoger las siguientesen tubos capilares Evitar comprimir la extremidad para obtenersangre porque se altera la composicioacuten sanguiacutenea

353 Ventajas

3531 Puede obtenerse con facilidad

3532 Es preferible cuando han de realizarse extensiones de sangre perifeacuterica

354 Desventajas

3541 Soacutelo se pueden obtener pequentildeas cantidades de sangre y los exaacutemenesde repeticioacuten requieren nuevas muestras

3542 La sangre en microtubos (capilares) frecuentemente se hemolizainterfiendo con la mayoriacutea de pruebas de laboratorio

3543 Los resultados obtenidos en pruebas con sangre capilar no puedenser comparados con los resultados de las pruebas con sangre venosa

3544 El dedo no soacutelo es delicado sino difiacutecil de desinfectar adecuadamenteen el tiempo disponible

3545 En pacientes con resistencia disminuida a la infeccioacuten (aquellos conleucemia agranulocitosis diabetes uremia y enfermedades con deficienciasinmunoloacutegicas) una muestra tomada del dedo es mucho maacutesprobable que conduzca a una infeccioacuten que otra tomada del brazo

3546 El recuento de eritrocitos y leucocitos asiacute como el recuento deplaquetas y reticulocitos no debe realizarse en sangre capilar debidoa la difiacutecil estandarizacioacuten del flujo sanguiacuteneo capilar

EXTRACCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR

Fig 10

Fig 11

SECCIOacuteN 4

ANTICOAGULANTES

Una vez extraiacuteda la sangre eacutesta puede conservarse coagulada o

mantenidaincoagulable mediante la adicioacuten de un anticoagulante

41 CARACTERIacuteSTICAS BAacuteSICAS DE LOS ANTICOAGULANTES MAacuteS

USADOSEN HEMATOLOGIacuteA

bull No alterar el tamantildeo de los hematiacutees

bull No producir hemoacutelisis

bull Evitar al maacuteximo la agregacioacuten plaquetaria

bull No alterar la morfologiacutea de los leucocitos

La sangre tratada con anticoagulante debe procesarse lo antes posible

inclusomantenida bajo refrigeracioacuten (4 ordmC) si no pasan de las 2 horas El

tiempomaacuteximo entre la extraccioacuten de la sangre y su procesamiento depende

delcoagulante de eleccioacuten y no debe ser maacutes de 4 horas a excepcioacuten

delanticoagulante EDTA (etilendiaminotetraceacutetico) que puede ser hasta 24

horas(en refrigeracioacuten a 4 ordmC)

Los anticoagulantes pueden emplearse en forma soacutelida o liacutequida Los

primerosestaacuten indicados para la determinacioacuten de los paraacutemetros

hematoloacutegicosya que no producen como los anticoagulantes liacutequidos dilucioacuten de

la sangre

42 ANTICOAGULANTES SOacuteLIDOS

421 EDTA

Es la sal disoacutedica o tripotaacutesica del aacutecido etilendiaminotetraceacutetico La saldisoacutedica

(Na2EDTA) es menos soluble que la sal tripotaacutesica (K3EDTA) Estoscompuestos

realizan su accioacuten a traveacutes de un efecto quelante sobre el calcioal fijarlo impiden

su activacioacuten y por ende la coagulacioacuten sanguiacutenea

4211 Ventajas

bull Respeta la morfologiacutea eritrocitaria (especialmente la sal tripotaacutesica) yleucocitaria de manera que permite una demora de dos horas en la realizacioacutendel frotis sanguiacuteneo despueacutes de la extraccioacuten sanguiacutenea

bull Asegura la conservacioacuten de los elementos formes sanguiacuteneos durante 24horas si la sangre se mantiene a 4 ordmC

bull Al inhibir la aglutinacioacuten de las plaquetas facilita su recuento o su expresioacutensemicuantitativa a partir del frotis

bull La concentracioacuten recomendada de EDTA es de 15 mgmL de sangre Unamayor cantidad de anticoagulante puede producir retraccioacuten celular condisminucioacuten del hematocrito y un aumento de la concentracioacuten media de lahemoglobina Un exceso de sangre con relacioacuten al anticoagulante produceformacioacuten de microagregados que pueden alterar los resultados El empleode tubos al vaciacuteo con una gota (50mL) de EDTA tripotaacutesica comercialpara 5 mL de sangre es de intereacutes praacutectico dado que es cien veces maacutessoluble facilitando la mezcla de sangre con anticoagulante

4212 Desventajas

Usado en exceso afecta a los eritrocitos y a los leucocitos a los cuales les produce encogimiento y cambios en su forma por ello debe cuidarse de agregar la cantidad correcta de sangre al anticoagulante

422 Anticoagulante de Wintrobe

Es una mezcla de oxalato de amonio y potasio Actuacutea por precipitacioacuten del calcio es faacutecil de preparar Se emplea en forma de polvo en proporcioacuten de 2 de oxalato de amonio por 1 de oxalato de potasio La cantidad recomendada es de 2 mg x mL de sangre Este anticoagulante no afecta el volumen globular medio y puede usarse para determinaciones de hemoglobina hematocrito y recuento globular pero para los extendidos queda limitada a los primeros minutos tampoco es uacutetil para el recuento plaquetario porque produce formacioacuten de agregados plaquetarios

423 Heparina

El nombre de heparina proviene del griego hepar que significa hiacutegado ya que fue aislado por primera vez de las ceacutelulas de este tejido Es un mucopolisacaacuterido aacutecido Presenta el

inconveniente de que si no se agita raacutepidamente con la sangre despueacutes de extraiacuteda

pueden formarse microcoaacutegulos aunque no altera el volumeneritrocitario ni la morfologiacutea de los leucocitos No es recomendablepara el frotis sanguiacuteneo porque produce un fondo azul en la laacutemina

La heparina de sodio o litio puede usarse en forma soacutelida o liacutequida en

proporcioacutende 01 - 02 mg de heparina por 1 mL de sangre

43 ANTICOAGULANTES LIacuteQUIDOS

431 Citrato trisoacutedico

Es de eleccioacuten para las pruebas de hemostasia y la velocidad de sedimentacioacuten

Actuacutea a traveacutes de la precipitacioacuten del calcio La concentracioacuten depende de

la prueba por realizar

bull Para pruebas de hemostasia se emplea en proporcioacuten de 1 9 (05 mL

deanticoagulante para 45 mL de sangre total)

bull Para la determinacioacuten de la VSG (Velocidad de Sedimentacioacuten Globular) es14

(05 mL de anticoagulante para 2 mL de sangre)

432 Oxalato soacutedico

Recomendado tambieacuten para las pruebas de hemostasia Se emplea en

proporcioacutende un volumen de anticoagulante para 4 vol de sangre

SECCIOacuteN 5

REALIZACIOacuteN Y TINCIOacuteN DEL FROTIS SANGUIacuteNEO

La praacutectica del frotis sanguiacuteneo tambieacuten llamado extendido es de gran importanciaen hematologiacutea ya que el diagnoacutestico de muchas enfermedadeshematoloacutegicas puede realizarse con soacutelo observar las caracteriacutesticasmorfoloacutegicas de las ceacutelulas sanguiacuteneas de manera que eacuteste no debe serexcesivamente grueso ni excesivamente fino Todas las laacuteminas por usarsobre todo nuevas deben ser limpiadas con algodoacuten y alcohol al 70 paraeliminar la grasa que viene adherida

51 MEacuteTODO DE LOS DOS PORTAOBJETOS

511 Materiales

- Alcohol al 70

- Algodoacuten

- Lanceta descartable

- Portaobjetos de vidrios limpios y desgrasados (25 x 75 mm)

512 Fundamento

Consiste en la extensioacuten de una gota de sangre sobre un portaobjeto (25 x 75)empleando el canto biselado de otro portaobjeto de igual dimensioacuten (Fig 12)

513 Procedimiento

5131 Una vez extraiacuteda la sangre con cualquiera de las metodologiacuteas secoloca una pequentildea gota de sangre (5mL) (aprox 3 mm de diaacutemetro)sobre un portaobjeto a 2 cm aproximadamente de uno de los extremos

5132 Colocar el canto de otro portaobjeto esmerilado sobre la superficiedel primer portaobjeto (en la que se encuentra la gota de sangre)formando un aacutengulo de 45ordm

5134 Deslizar suavemente y a velocidad moderada el portaobjeto sobre elotro en sentido longitudinal hasta que la gota de sangre quede bienextendida sobre la

superficie del primer portaobjeto El grosor delfrotis sanguiacuteneo puede variar seguacuten sea el aacutengulo que formen entresiacute ambos portaobjetos Asiacute si es superior a 45ordm la extensioacuten obtenidaseraacute gruesa y corta si es inferior a 45ordm seraacute larga y fina El secado delfrotis es a temperatura ambiente y en posicioacuten horizontal

Fig 12

1048729 Zona excesivamente gruesa Se halla en la regioacuten inmediata al punto departida de la extensioacuten (cabeza) En ella se aprecia siempre un aumento delinfocitos

1048729 Zona excesivamente fina Corresponde al final de la extensioacuten y termina enun aacuterea donde las ceacutelulas adoptan una posicioacuten acartonada (barbas) Enesta regioacuten existe un exceso de granulocitos y monocitos

1048729 Zona ideal Corresponde a la regioacuten intermedia del frotis y en ella existe unreparto equilibrado de ceacutelulas

52 COLORACIONES USADAS

Una vez seco el frotis se procede a la tincioacuten hematoloacutegica con el colorante deRomanowsky constituido por la mezcla de eosina y azul de metileno Dentrode eacutestas tenemos

521 Colorante de Giemsa

522 Colorante de May-Grunwald

523 Colorante de Wright

524 Colorante de Leishman

Preparacioacuten de colorantes (Anexo A)

1048729 Para el estudio de las ceacutelulas sanguiacuteneas utilizar el colorante 523 y 524

1048729 Para el estudio de hemoparaacutesitos utilizar el colorante 521

1048729 Utilizar el colorante 522 para casos especiales en que se desee observar

con mayor claridad y especificidad los graacutenulos de los neutrofilos

53 TINCIOacuteN CON COLORANTE DE WRIGHT

531 Fundamento

El colorante de Wright va a permitir suministrar un medio para estudiar lasangre y determinar las variaciones y anormalidades de estructura forma ytamantildeo de los eritrocitos su contenido de hemoglobina y sus propiedades decoloracioacuten La informacioacuten obtenida de un frotis de sangre perifeacuterica dependeen gran parte de la calidad del extendido y la coloracioacuten

532 Materiales

5321 Colorante de Wright (Anexo A)

5322 Frasco gotero

5323 Solucioacuten amortiguada tamponada (Anexo A)

533 Procedimiento

5331 Una vez obtenido el frotis sanguiacuteneo se le dejaraacute secar entre 15 y 20minutos

5332 Luego se coloca la preparacioacuten en un soporte y se cubre con el colorantede Wright dejaacutendolo por espacio de 5 minutos

5333 Posteriormente se antildeade solucioacuten amortiguada tamponada en partesiguales hasta obtener un brillo metaacutelico dejando 6 minutos adicionales

5334 Finalmente se lava con agua corriente y se deja secar

5335 Se coloca en el microscopio y con pequentildeo aumento se revisa lacalidad de la coloracioacuten la cantidad aproximada de gloacutebulos blancosy se escoge el sitio para iniciar el recuento Se coloca una gota deaceite de inmersioacuten y se enfoca a un aumento de 100xLa forma de los gloacutebulos rojos se examinaraacute detenidamente observandoademaacutes del color (cantidad de hemoglobina) presencia deplaquetas su agrupacioacuten y distribucioacuten

5336 Posteriormente se hace el recuento diferencial de gloacutebulos blancosen 100

ceacutelulas para lo cual se deberaacute conocer las diferencias entreneutroacutefilos eosinoacutefilos

linfocitos y monocitosUna extensioacuten de sangre bien tentildeida debe caracterizarse

por unabuena diferenciacioacuten de las estructuras subcelulares en los leucocitosuna

coloracioacuten rosada de los hematiacutees y la ausencia de precipitados

Los defectos maacutes frecuentes observados en la tincioacuten del frotis sanguiacuteneoson

Coloracioacuten excesivamente azul debido a

1048729 Frotis excesivamente grueso

1048729 Lavado insuficiente

1048729 Tincioacuten muy prolongada

1048729 Empleo de colorante excesivamente alcalino

Coloracioacuten con una tonalidad rosada

1048729 El colorante el tampoacuten o el agua de lavado tienen un pH demasiadoaacutecido

Presencia de precipitados

1048729 Obedecen a una accioacuten excesiva del colorante Esto se puede evitarcon la

filtracioacuten

SECCIOacuteN 6

HEMOGRAMA-HEMOGLOBINA-HEMATOCRITO

El hemograma de Shilling constituye uno de los exaacutemenes de laboratorio

maacutesusados en el campo de la hematologiacutea Comprende las siguientes pruebas

61 RECUENTO LEUCOCITARIO

Principio

La sangre anticoagulada se deposita en un liacutequido que permite evidenciar

losleucocitos mantenieacutendolos visibles mientras que los eritrocitos

sonhemolizados El recuento del nuacutemero de leucocitos o gloacutebulos blancos se

expresapor mm3 (miliacutemetro cuacutebico)

611 Equipos

- Microscopio

- Hemocitoacutemetro (Caacutemara de Neubauer)

Consta de los siguientes elementos

diams Una laacutemina portaobjeto gruesa en el centro se hallan dos

superficiescuadriculadas iguales separadas del resto de la laacutemina por surcos y

dosbarras transversales algo maacutes elevadas

diams Una laminilla cubreobjetos oacutepticamente plana que al colocarse sobrelas barras

elevadas de la laacutemina forma una caacutemara entre el cubreobjetosy la superficie

cuadriculadaLa altura entre el cubreobjetos y la laacutemina portaobjetos es de 01

mmCada cuadriacutecula mide 3 mm de lado y se divide en 9 cuadrados grandesCada

uno de los cuales mide 1 mm2 de superficie que se subdivide a suvez en 16

cuadrados medianos El cuadrado grande central se divide en25 cuadrados

pequentildeos y cada uno de ellos en 16 cuadraditos Cadacuadrado pequentildeo mide

02 mm de lado (004 mm2 de superficie) y cadacuadradito mide 005 mm de lado

(00025 mm2 de superficie)

612 Materiales y reactivos requeridos

6121 Pipeta de gloacutebulos blancos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0 a 100 mL)Presenta cerca del extremo superior una marca de 11 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla que funciona comomezcladora luego sigue el extremo maacutes largo de la pipeta (tallo) que estaacutedividida en 10 partes con 2 marcas 1 (parte final del bulbo) y 05 (a la mitaddel tallo) Se le acopla a su extremo superior 1 tubo de goma y una bombillapara aspirar

6122 Diluyente de gloacutebulos blancos Solucioacuten de Turk al 1

6123 Contador manual (Soacutelo si fuera necesario)

6124 Papel filtro

613 Procedimiento

6131 Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar deldedo se procede a aspirar la sangre con la pipeta de gloacutebulos blancoshasta la marca de 05 y a limpiar la punta con papel absorbente

6132 Introducir la pipeta en el tubo que contenga solucioacuten de Turk y absorberhasta la marca de 11 (no debe haber burbujas)

6133 Tapar ambos extremos y proceder a mezclar manualmente o en unrotador automaacutetico por 2 oacute 3 minutos

6134 Monte la laminilla de vidrio en la caacutemara para recuento que debe estarlimpia y seca

6135 Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocaruna gota pequentildea de esta solucioacuten en la caacutemara

6136 Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las ceacutelulas se sedimenten

6137 Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angularesCuando se usa la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002 mL) desangre total con anticoagulante o sangre capilar con anticoagulante yse diluye en un tubo que contenga 380 mL de solucioacuten de Turk (aquiacutetenemos una dilucioacuten 120)

LECTURA

Fig 13

La lectura se realiza en los campos 1 3 7 y 9 como estaacute indicado en la figuraAdemaacutes de los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes sedeben contar todos los leucocitos que se encuentren adheridos en la liacuteneahorizontal superior y vertical exterior o de lo contrario todos los leucocitosadheridos a la liacutenea horizontal inferior y vertical interior

614 Resultados

Nordm de leucocitos x mm3 = leucocitos contados en 4 camposdividealtura x dilucioacuten x aacuterea

Reemplazando = leucocitos contados en 4 camposdivide110 x 120 x 4=

Leucocitos contados en 4 camposdivide4200=

X1 divide4200= Nordm leucocitos contados x 50

615 Valores de referencia

5000 - 10 000 leucocitos mm3

616 Correccioacuten de valores para restar eritrocitos nucleados

Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el liacutequido de dilucioacuten por lo tantopueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con losleucocitos de tal manera que se debe emplear la siguiente foacutermula

Caacutelculo

La concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos (por litro) esNuacutemero de normoblatos contados x concentracioacuten o nuacutemero de leucocitos100 + Nordm de normoblastos contados

Ejemplo

Si se cuentan 50 normoblastos y la concentracioacuten del nuacutemero de leucocitos es16 x 109l la concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos seraacute

50 x16 = 53 x 109l

100 + 50

y la concentracioacuten de leucocitos corregida seraacute 16 - 53 = 107 x 109lEn unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitosse expresan por miliacutemetro cuacutebico En tales unidades el caacutelculo correspondienteal ejemplo que se ha dado seriacutea

50 x 16 000 = 5300 mm3

100 + 50

Recuento corregido de gloacutebulos blancos o leucocitos = 16 000 - 5300 = 10 700 mm3

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

62 RECUENTO DE GLOacuteBULOS ROJOS

Principio

La sangre se diluye en un liacutequido que nos permite observar claramente loshematiacutees luego esta dilucioacuten se coloca en una caacutemara de Neubauer con laayuda de una pipeta automaacutetica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopioa un objetivo de 40x para calcular el nuacutemero de gloacutebulos rojos por mm3

621 Equipos

- Microscopio

- Hemocitoacutemetro (caacutemara de Neubauer)

622 Materiales y reactivos requeridos

6221 Pipeta de gloacutebulos rojos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0-100 mL)

Presenta cerca del extremo superior una marca de 101 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla roja mezcladoraluego sigue el tallo (extremo maacutes largo) el cual estaacute dividido en 10 partescon 2 marcas 1 acabando el bulbo y 05 a la mitad del tallo Se requiereigual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar

6222 Diluyente de gloacutebulos rojos Cloruro de Sodio al 09 (ver anexo)

Diluyente de Hayem (ver anexo)

6223 Contador manual (soacutelo si fuera necesario)

6224 Papel filtro

623 Procedimiento

6231 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar

6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente

6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101

6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos

6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente

6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas

6237 Dejar en reposo por 3 minutos

6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)

6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos

LECTURA

Fig 14

624 Resultados

Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea

Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15

= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000

= hematiacutees contados x 10 000

625 Valores de referencia

(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)

Hombres 4 500 000 - 5 500 000

Mujeres 4 000 000 - 5 000 000

Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000

Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000

Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)

Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal

volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen

porcentaje o como valor decimal

Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre

total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)

631 Meacutetodo de Wintrobe

Materiales requeridos

- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm

- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia

- Tapoacuten de goma

Procedimiento

diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur

comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado

de no provocar espuma

diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten

diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos

Resultados (lectura)

Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos

Valores de referencia

Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

632 Meacutetodo de microhematocrito

Materiales requeridos

- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)

- Plastilina

Procedimiento

diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel

dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon

anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80

del capilar

diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina

diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma

diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm

Resultados (lectura)

La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio

Uso de la escala

diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero

diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la

columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical

diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos

Valores de referencia

Hombres 40 - 50

Mujeres 38 - 44

Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44

Lactantes (3 meses) 37 - 42

Recieacuten nacidos 50 - 58

La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)

64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA

Principio

La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre

641 Materiales y reactivos

6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro

6412 Pipetas

diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla

diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL

6413 Tubos de ensayo

6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten

Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia

Con el propoacutesito de uniformizar los procedimientos hematoloacutegicos que serealizan en los diversos laboratorios cliacutenicos el Instituto Nacional de Saludpone a disposicioacuten de la comunidad teacutecnico-cientiacutefica nacional el Manual deProcedimientos de Laboratorio en Teacutecnicas Baacutesicas de Hematologiacutea en elcual se incluyen todos los meacutetodos empleados en el campo hematoloacutegicobaacutesico De este modo se contribuye a mejorar la calidad de diagnoacutestico en loslaboratorios de los servicios de saludEl laboratorio de hematologiacutea cuenta con dos aacutereas baacutesicas Aacuterea deHematimetriacutea (hemograma VSE recuento de plaquetas etc) y Aacuterea deHemostasia Partiendo de esta estructura en este manual nos referiremos alas teacutecnicas baacutesicas empleadas en estas aacutereas partiendo de la toma de muestrahasta la realizacioacuten de las pruebas respectivasEs necesario enfatizar que para obtener resultados maacutes confiables es importantepero no imprescindible automatizar el laboratorio debido a que elloevitaraacute el posible error humano sobre todo en lo referente a recuentos celularesvalores de hemoglobina y constantes corpusculares ya que en estasvariables se trabaja con cantidades exactas de sangre hecho que es muydifiacutecil de lograr cuando se usan los meacutetodos manuales lo mismo sucede altratarse de las pruebas de hemostasiaEsperamos que este manual constituya una herramienta de consulta en laRed Nacional de Laboratorios de Salud ademaacutes de una guiacutea para el personalde laboratorio en general

INTRODUCCIOacuteN

El presente manual ha sido elaborado en forma simple didaacutectica y eminentementepraacutectica para que su contenido sea faacutecil de entender por el personalque labora en el laboratorio de hematologiacuteaSe divide en tres partes

1 En la primera parte se presentan los aspectos maacutes importantes de labioseguridad en el laboratorio

2 En la segunda parte se exponen las principales teacutecnicas baacutesicas del laboratoriode hematologiacutea

3 En la tercera parte se detallan las alteraciones maacutes frecuentes de la serieroja y de la serie blanca de un hemograma

El objetivo principal es protocolizar y estandarizar los procedimientoshematoloacutegicos que empiezan con la toma de muestra (siguiendo las pautasde control de calidad preanaliacutetica) hasta el procesamiento de eacutesta (fase analiacutetica)en la determinacioacuten correspondiente y por uacuteltimo en la emisioacuten de losresultados (fase postanaliacutetica) Debemos recalcar que cuando se realizanpruebas de hemostasia debe tenerse en consideracioacuten los cuidados comunesa toda prueba de laboratorio es decir las muestras deben obtenerse encondiciones apropiadas y rotularse debidamente Esperamos que el presentemanual sirva de guiacutea efectiva y que pueda ser enriquecido con nuevosaportes con la finalidad de alcanzar un trabajo de calidad

SECCIOacuteN 1

GENERALIDADES

11 OBJETIVO

Establecer y estandarizar los procedimientos baacutesicos de un examen dehemograma hemoglobina hematocrito recuento de plaquetas velocidad desedimentacioacuten y recuento de reticulocitos que sirvan de ayuda diagnoacutestica alcliacutenico

12 CAMPO DE APLICACIOacuteN

La aplicacioacuten de las teacutecnicas hematoloacutegicas nos sirve para estandarizar losprocedimientos a nivel nacional y para que sea de utilidad al personal teacutecnicoy profesional de los laboratorios cliacutenicos

13 RESPONSABILIDADES

131 El Centro Nacional de Laboratorios en Salud Puacuteblica a traveacutes de su

Direccioacuten Ejecutiva de Laboratorios de Referencia es responsable deautorizar la elaboracioacuten la revisioacuten y la actualizacioacuten del presente manualde acuerdo con los procedimientos aprobados por el Instituto Nacionalde Salud

132 Los directores de los establecimientos de salud son responsables deautorizar proporcionar los recursos necesarios y designar al personalresponsable para la aplicacioacuten de las disposiciones contenidas en elpresente manual

133 El personal de los establecimientos de salud es responsable de planificarlas acciones organizar controlar y capacitar al personal para cumplirlas disposiciones contenidas en el presente manual

134 Los jefes o responsables de los laboratorios deben asegurar el controlinterno de la calidad la idoneidad del personal equipos materialesreactivos e instalaciones

135 El personal meacutedico profesional y teacutecnico es responsable de seguir lasespecificaciones contenidas en el presente manual y aplicar los procedimientosespeciacuteficos indicados

14 DOCUMENTOS DE REFERENCIA

141 Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OrganizacioacutenPanamericana de la Salud Publicacioacuten cientiacutefica Nordm 439 Nordm 2 1983

142 Manual de normas de bioseguridad Instituto Nacional de Salud Serie deNormas Teacutecnicas Nordm 18 2ordf ed 1997

SECCIOacuteN 2

MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD

21 Para la obtencioacuten de muestras el personal involucrado en los diferentesprocesos para los exaacutemenes hematoloacutegicos debe aplicar las medidas debioseguridad establecidas en el Manual de Bioseguridad Serie de NormasTeacutecnicas Nordm 18

22 Se debe controlar sobre todo

221 Al personal que trabaja en el laboratorio de hematologiacutea

222 El proceso de coloracioacuten en el que se debe aplicar las medidas debioseguridad correspondientes al uso y manipulacioacuten de sustanciastoacutexicas o canceriacutegenas

223 Ver lo referente a medidas de proteccioacuten en caso de accidentes porinoculacioacuten

SECCIOacuteN 3

OBTENCIOacuteN DE MUESTRAS SANGUIacuteNEAS

31 OBJETIVO

Establecer y uniformizar criterios en el procedimiento de obtencioacuten de muestrassanguiacuteneas con un adecuado control de calidad ya que de ello dependeque el resultado del anaacutelisis de la muestra sea el correcto Se efectuaraacute enayunas o no dependiendo de la prueba a usar

32 OBTENCIOacuteN DE SANGRE VENOSA CON JERINGA

321 Materiales y equipos requeridos

3211 Algodoacuten

3212 Alcohol al 70

3213 Ligadura o torniquete de 25 a 30 cm de largo

3214 Jeringas de 5 mL

3215 Viales con anticoagulante EDTA

322 Obtencioacuten de la muestra

3221 Verificar que los elementos por utilizar esteacuten listos y que el pacientese sienta coacutemodo

3222 Aplicar el torniquete aproximadamente cuatro dedos por encima de laflexioacuten del codo o a 10 cm del codo sujetar con un medio nudo (Fig 1)

3223 Limpiar la zona con alcohol al 70 o alcohol yodado en un aacuterea de 2pulgadas (Fig 2)

3224 El paciente deberaacute abrir y cerrar la mano durante unos segundos ydespueacutes la mantendraacute cerrada esto ayudaraacute a visualizar las venassuperficiales (Fig 3)

3225 Se retira el estuche protector de la aguja y se coge la jeringa de talmanera que el bisel se encuentre hacia arriba (Fig 4)

3226 Se coloca la aguja en direccioacuten paralela a la vena se perfora la pielhaciendo avanzar la aguja 05-1 cm en el tejido subcutaacuteneo luego seperfora la vena (Fig 5)

3227 Se aspira la jeringa hasta el volumen requerido

3228 Retirar el torniquete e indicar al paciente que deje de hacer puntildeo Secoloca el algodoacuten seco encima de la puncioacuten y se retira la aguja (Fig 6)

3229 Retirar la aguja de la jeringa Verter la muestra lentamente por lasparedes del vial con anticoagulante No olvidar colocar una gota en lalaacutemina portaobjeto para realizar el frotis

32210 Agitar el vial en ciacuterculos sobre la mesa para homogeneizar la muestracon el anticoagulante

PUNTOS PARA LA EXTRACCIOacuteN DE SANGRE

(Toma de muestra)

Se obtiene de las venas de la fosa cubital

PROCEDIMIENTO

Fig 1 Fig 2 Fig 3

Fig 4 Fig 5

Fig 6 Fig 7

33 OBTENCIOacuteN DE SANGRE VENOSA EN TUBOS AL VACIacuteO

331 Materiales requeridos

3311 Algodoacuten

3312 Alcohol al 70

3313 Ligadura o torniquete de 25 a 30 cm de largo

3314 Tubos al vaciacuteo con anticoagulante EDTA (K3) EDTA (Na2) u otroanticoagulante

3315 Agujas con dispositivo para extraccioacuten de sangre al vaciacuteo

- Nordm 21 para adultos

- Nordm 22 para nintildeos y neonatos

De preferencia ambas de bisel corto para evitar la coagulacioacuten

332 Obtencioacuten de la muestra

3321 Repetir los pasos de 3221 a 3224

3322 Se retira el estuche protector de la aguja y eacuteste se enrosca al dispositivopara extraccioacuten de sangre al vaciacuteo

3323 Colocar la ligadura cuatro dedos por encima de la flexioacuten del codo o10 cm por encima de eacuteste y pedir al paciente que abra y cierre la manovarias veces para favorecer la dilatacioacuten de las venas

3324 Una vez escogida la vena desinfectarla con una pieza de algodoacutenembebido en etanol al 70

3325 Se coloca la aguja en direccioacuten paralela a la vena se perfora la pielhaciendo avanzar la aguja entre 05 cm y 1 cm en el tejido subcutaacuteneose inserta el tubo al vaciacuteo por la parte posterior y no preocuparse porla cantidad de sangre extraiacuteda ya que el mismo sonido del vaciacuteo avisaraacuteque la extraccioacuten terminoacute (Fig 8)

3326 Retirar la ligadura tirando del extremo doblado

3327 Colocar un pedazo de algodoacuten seco sobre la parte donde se encuentraoculta la aguja Sacar la aguja con un movimiento raacutepido y depositarlaen el recipiente de metal con desinfectante (Fig 9)

3328 Pedir al paciente que presione firmemente el algodoacuten durante 3 minutoscon el brazo extendido No se recomienda que se flexione el brazoa causa del riesgo que se forme un hematoma

3329 Mezclar por inmersioacuten suave la sangre con el anticoagulante contenidoen el tubo No agitar el contenido

Fig 8 Fig 9

333 Ventajas de una extraccioacuten de sangre venosa

3331 Pueden hacerse repetidos exaacutemenes con la misma muestra

3332 Parte de la muestra (plasma o suero) puede congelarse para referenciafutura

334 Desventajas de una extraccioacuten de sangre venosa

3341 La puncioacuten venosa por su largo procedimiento requiere mayor preparacioacuten que el meacutetodo capilar

3342 El meacutetodo es teacutecnicamente difiacutecil en nintildeos individuos obesos y pacientes en shock

3343 La hemoacutelisis debe ser evitada pues se puede obtener una disminucioacuten en el recuento de eritrocitos

3344 Debe evitarse prolongada estasis venosa producida por el torniquete pues produce hemoacutelisis y otros cambios que ponen la sangre en un estado inadecuado para el anaacutelisis de gases recuentos celulares determinacioacuten de pH sanguiacuteneo y algunas pruebas de coagulacioacuten

3345 La sangre anticoagulada si no es de obtencioacuten reciente no debe ser utilizada en extensiones de sangre pues algunos anticoagulantes producen cambios en las plaquetas que pueden causar aglutinaciones agregacioacuten plaquetaria y dificultan la identificacioacuten de leucocitos

3346 Puesto que algunos de los componentes de la sangre no son estables los recuentos de leucocitos y plaquetas e iacutendice de sedimentacioacuten deben realizarse antes de que pasen dos horas desde que se obtuvo la muestra

34 OBTENCIOacuteN DE SANGRE DE LA VENA YUGULAR EXTERNA

341 Materiales requeridos

3411 Algodoacuten

3412 Alcohol al 70

3413 Jeringas de 5 mL

3414 Viales con anticoagulante EDTA

342 Obtencioacuten de la muestra

3421 El paciente es cubierto por una saacutebana de manera que los brazospermanezcan inmovilizados a lo largo del cuerpo

3422 Al paciente se le coloca de cuacutebito dorsal sobre la mesa de examen ouna

camilla de manera que la cabeza cuelgue sobre el final de lamesa y el cuerpo sea

sujetado por un asistente

3423 Cuando el paciente grita la vena yugular externa se marca claramente

3424 Limpiar la zona en un aacuterea de 2 pulgadas con alcohol al 70 o

alcoholyodado

3425 Se repiten los pasos de 3225 a 3227 de la extraccioacuten de sangrevenosa

con jeringa

3426 Retirar la aguja de la vena y presionar suavemente con un algodoacutenseco

aproximadamente de 3 a 5 minutos Pedir al paciente que permanezcaechado diez

minutos

3427 Se repiten los pasos de 3229

3428 Se repiten los pasos de 32210

343 Ventajas

Constituye un buen meacutetodo para la obtencioacuten de sangre en pacientes conshock

con venas colapsadas

344 Desventajas

Por lo delicado en su procedimiento no se recomienda como rutina soacutelo encasos

en que no se pueda obtener la muestra por meacutetodos convencionales

35 OBTENCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR

Cuando la cantidad de sangre que se precisa es muy pequentildea o cuando

pordiferentes motivos no pueda practicarse una puncioacuten venosa debe recurrirse

a la puncioacuten capilar

351 Materiales requeridos

3512 Algodoacuten

3513 Alcohol al 70

3514 Lancetas desechables (Fig 10)

3515 Papel filtro Nordm 2

352 Procedimiento (Fig 11)

3521 La sangre capilar se obtiene de la cara lateral del dedo medio o anularen los adultos y del dedo gordo del pie o taloacuten en los nintildeos

3522 Desinfectar la zona con alcohol al 70 secar con algodoacuten esteacuteril

3523 Punzar la piel con una lanceta esteacuteril desechable (2 mm de profundidad)

3524 Usar gasa esteacuteril para desechar la primera gota y recoger las siguientesen tubos capilares Evitar comprimir la extremidad para obtenersangre porque se altera la composicioacuten sanguiacutenea

353 Ventajas

3531 Puede obtenerse con facilidad

3532 Es preferible cuando han de realizarse extensiones de sangre perifeacuterica

354 Desventajas

3541 Soacutelo se pueden obtener pequentildeas cantidades de sangre y los exaacutemenesde repeticioacuten requieren nuevas muestras

3542 La sangre en microtubos (capilares) frecuentemente se hemolizainterfiendo con la mayoriacutea de pruebas de laboratorio

3543 Los resultados obtenidos en pruebas con sangre capilar no puedenser comparados con los resultados de las pruebas con sangre venosa

3544 El dedo no soacutelo es delicado sino difiacutecil de desinfectar adecuadamenteen el tiempo disponible

3545 En pacientes con resistencia disminuida a la infeccioacuten (aquellos conleucemia agranulocitosis diabetes uremia y enfermedades con deficienciasinmunoloacutegicas) una muestra tomada del dedo es mucho maacutesprobable que conduzca a una infeccioacuten que otra tomada del brazo

3546 El recuento de eritrocitos y leucocitos asiacute como el recuento deplaquetas y reticulocitos no debe realizarse en sangre capilar debidoa la difiacutecil estandarizacioacuten del flujo sanguiacuteneo capilar

EXTRACCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR

Fig 10

Fig 11

SECCIOacuteN 4

ANTICOAGULANTES

Una vez extraiacuteda la sangre eacutesta puede conservarse coagulada o

mantenidaincoagulable mediante la adicioacuten de un anticoagulante

41 CARACTERIacuteSTICAS BAacuteSICAS DE LOS ANTICOAGULANTES MAacuteS

USADOSEN HEMATOLOGIacuteA

bull No alterar el tamantildeo de los hematiacutees

bull No producir hemoacutelisis

bull Evitar al maacuteximo la agregacioacuten plaquetaria

bull No alterar la morfologiacutea de los leucocitos

La sangre tratada con anticoagulante debe procesarse lo antes posible

inclusomantenida bajo refrigeracioacuten (4 ordmC) si no pasan de las 2 horas El

tiempomaacuteximo entre la extraccioacuten de la sangre y su procesamiento depende

delcoagulante de eleccioacuten y no debe ser maacutes de 4 horas a excepcioacuten

delanticoagulante EDTA (etilendiaminotetraceacutetico) que puede ser hasta 24

horas(en refrigeracioacuten a 4 ordmC)

Los anticoagulantes pueden emplearse en forma soacutelida o liacutequida Los

primerosestaacuten indicados para la determinacioacuten de los paraacutemetros

hematoloacutegicosya que no producen como los anticoagulantes liacutequidos dilucioacuten de

la sangre

42 ANTICOAGULANTES SOacuteLIDOS

421 EDTA

Es la sal disoacutedica o tripotaacutesica del aacutecido etilendiaminotetraceacutetico La saldisoacutedica

(Na2EDTA) es menos soluble que la sal tripotaacutesica (K3EDTA) Estoscompuestos

realizan su accioacuten a traveacutes de un efecto quelante sobre el calcioal fijarlo impiden

su activacioacuten y por ende la coagulacioacuten sanguiacutenea

4211 Ventajas

bull Respeta la morfologiacutea eritrocitaria (especialmente la sal tripotaacutesica) yleucocitaria de manera que permite una demora de dos horas en la realizacioacutendel frotis sanguiacuteneo despueacutes de la extraccioacuten sanguiacutenea

bull Asegura la conservacioacuten de los elementos formes sanguiacuteneos durante 24horas si la sangre se mantiene a 4 ordmC

bull Al inhibir la aglutinacioacuten de las plaquetas facilita su recuento o su expresioacutensemicuantitativa a partir del frotis

bull La concentracioacuten recomendada de EDTA es de 15 mgmL de sangre Unamayor cantidad de anticoagulante puede producir retraccioacuten celular condisminucioacuten del hematocrito y un aumento de la concentracioacuten media de lahemoglobina Un exceso de sangre con relacioacuten al anticoagulante produceformacioacuten de microagregados que pueden alterar los resultados El empleode tubos al vaciacuteo con una gota (50mL) de EDTA tripotaacutesica comercialpara 5 mL de sangre es de intereacutes praacutectico dado que es cien veces maacutessoluble facilitando la mezcla de sangre con anticoagulante

4212 Desventajas

Usado en exceso afecta a los eritrocitos y a los leucocitos a los cuales les produce encogimiento y cambios en su forma por ello debe cuidarse de agregar la cantidad correcta de sangre al anticoagulante

422 Anticoagulante de Wintrobe

Es una mezcla de oxalato de amonio y potasio Actuacutea por precipitacioacuten del calcio es faacutecil de preparar Se emplea en forma de polvo en proporcioacuten de 2 de oxalato de amonio por 1 de oxalato de potasio La cantidad recomendada es de 2 mg x mL de sangre Este anticoagulante no afecta el volumen globular medio y puede usarse para determinaciones de hemoglobina hematocrito y recuento globular pero para los extendidos queda limitada a los primeros minutos tampoco es uacutetil para el recuento plaquetario porque produce formacioacuten de agregados plaquetarios

423 Heparina

El nombre de heparina proviene del griego hepar que significa hiacutegado ya que fue aislado por primera vez de las ceacutelulas de este tejido Es un mucopolisacaacuterido aacutecido Presenta el

inconveniente de que si no se agita raacutepidamente con la sangre despueacutes de extraiacuteda

pueden formarse microcoaacutegulos aunque no altera el volumeneritrocitario ni la morfologiacutea de los leucocitos No es recomendablepara el frotis sanguiacuteneo porque produce un fondo azul en la laacutemina

La heparina de sodio o litio puede usarse en forma soacutelida o liacutequida en

proporcioacutende 01 - 02 mg de heparina por 1 mL de sangre

43 ANTICOAGULANTES LIacuteQUIDOS

431 Citrato trisoacutedico

Es de eleccioacuten para las pruebas de hemostasia y la velocidad de sedimentacioacuten

Actuacutea a traveacutes de la precipitacioacuten del calcio La concentracioacuten depende de

la prueba por realizar

bull Para pruebas de hemostasia se emplea en proporcioacuten de 1 9 (05 mL

deanticoagulante para 45 mL de sangre total)

bull Para la determinacioacuten de la VSG (Velocidad de Sedimentacioacuten Globular) es14

(05 mL de anticoagulante para 2 mL de sangre)

432 Oxalato soacutedico

Recomendado tambieacuten para las pruebas de hemostasia Se emplea en

proporcioacutende un volumen de anticoagulante para 4 vol de sangre

SECCIOacuteN 5

REALIZACIOacuteN Y TINCIOacuteN DEL FROTIS SANGUIacuteNEO

La praacutectica del frotis sanguiacuteneo tambieacuten llamado extendido es de gran importanciaen hematologiacutea ya que el diagnoacutestico de muchas enfermedadeshematoloacutegicas puede realizarse con soacutelo observar las caracteriacutesticasmorfoloacutegicas de las ceacutelulas sanguiacuteneas de manera que eacuteste no debe serexcesivamente grueso ni excesivamente fino Todas las laacuteminas por usarsobre todo nuevas deben ser limpiadas con algodoacuten y alcohol al 70 paraeliminar la grasa que viene adherida

51 MEacuteTODO DE LOS DOS PORTAOBJETOS

511 Materiales

- Alcohol al 70

- Algodoacuten

- Lanceta descartable

- Portaobjetos de vidrios limpios y desgrasados (25 x 75 mm)

512 Fundamento

Consiste en la extensioacuten de una gota de sangre sobre un portaobjeto (25 x 75)empleando el canto biselado de otro portaobjeto de igual dimensioacuten (Fig 12)

513 Procedimiento

5131 Una vez extraiacuteda la sangre con cualquiera de las metodologiacuteas secoloca una pequentildea gota de sangre (5mL) (aprox 3 mm de diaacutemetro)sobre un portaobjeto a 2 cm aproximadamente de uno de los extremos

5132 Colocar el canto de otro portaobjeto esmerilado sobre la superficiedel primer portaobjeto (en la que se encuentra la gota de sangre)formando un aacutengulo de 45ordm

5134 Deslizar suavemente y a velocidad moderada el portaobjeto sobre elotro en sentido longitudinal hasta que la gota de sangre quede bienextendida sobre la

superficie del primer portaobjeto El grosor delfrotis sanguiacuteneo puede variar seguacuten sea el aacutengulo que formen entresiacute ambos portaobjetos Asiacute si es superior a 45ordm la extensioacuten obtenidaseraacute gruesa y corta si es inferior a 45ordm seraacute larga y fina El secado delfrotis es a temperatura ambiente y en posicioacuten horizontal

Fig 12

1048729 Zona excesivamente gruesa Se halla en la regioacuten inmediata al punto departida de la extensioacuten (cabeza) En ella se aprecia siempre un aumento delinfocitos

1048729 Zona excesivamente fina Corresponde al final de la extensioacuten y termina enun aacuterea donde las ceacutelulas adoptan una posicioacuten acartonada (barbas) Enesta regioacuten existe un exceso de granulocitos y monocitos

1048729 Zona ideal Corresponde a la regioacuten intermedia del frotis y en ella existe unreparto equilibrado de ceacutelulas

52 COLORACIONES USADAS

Una vez seco el frotis se procede a la tincioacuten hematoloacutegica con el colorante deRomanowsky constituido por la mezcla de eosina y azul de metileno Dentrode eacutestas tenemos

521 Colorante de Giemsa

522 Colorante de May-Grunwald

523 Colorante de Wright

524 Colorante de Leishman

Preparacioacuten de colorantes (Anexo A)

1048729 Para el estudio de las ceacutelulas sanguiacuteneas utilizar el colorante 523 y 524

1048729 Para el estudio de hemoparaacutesitos utilizar el colorante 521

1048729 Utilizar el colorante 522 para casos especiales en que se desee observar

con mayor claridad y especificidad los graacutenulos de los neutrofilos

53 TINCIOacuteN CON COLORANTE DE WRIGHT

531 Fundamento

El colorante de Wright va a permitir suministrar un medio para estudiar lasangre y determinar las variaciones y anormalidades de estructura forma ytamantildeo de los eritrocitos su contenido de hemoglobina y sus propiedades decoloracioacuten La informacioacuten obtenida de un frotis de sangre perifeacuterica dependeen gran parte de la calidad del extendido y la coloracioacuten

532 Materiales

5321 Colorante de Wright (Anexo A)

5322 Frasco gotero

5323 Solucioacuten amortiguada tamponada (Anexo A)

533 Procedimiento

5331 Una vez obtenido el frotis sanguiacuteneo se le dejaraacute secar entre 15 y 20minutos

5332 Luego se coloca la preparacioacuten en un soporte y se cubre con el colorantede Wright dejaacutendolo por espacio de 5 minutos

5333 Posteriormente se antildeade solucioacuten amortiguada tamponada en partesiguales hasta obtener un brillo metaacutelico dejando 6 minutos adicionales

5334 Finalmente se lava con agua corriente y se deja secar

5335 Se coloca en el microscopio y con pequentildeo aumento se revisa lacalidad de la coloracioacuten la cantidad aproximada de gloacutebulos blancosy se escoge el sitio para iniciar el recuento Se coloca una gota deaceite de inmersioacuten y se enfoca a un aumento de 100xLa forma de los gloacutebulos rojos se examinaraacute detenidamente observandoademaacutes del color (cantidad de hemoglobina) presencia deplaquetas su agrupacioacuten y distribucioacuten

5336 Posteriormente se hace el recuento diferencial de gloacutebulos blancosen 100

ceacutelulas para lo cual se deberaacute conocer las diferencias entreneutroacutefilos eosinoacutefilos

linfocitos y monocitosUna extensioacuten de sangre bien tentildeida debe caracterizarse

por unabuena diferenciacioacuten de las estructuras subcelulares en los leucocitosuna

coloracioacuten rosada de los hematiacutees y la ausencia de precipitados

Los defectos maacutes frecuentes observados en la tincioacuten del frotis sanguiacuteneoson

Coloracioacuten excesivamente azul debido a

1048729 Frotis excesivamente grueso

1048729 Lavado insuficiente

1048729 Tincioacuten muy prolongada

1048729 Empleo de colorante excesivamente alcalino

Coloracioacuten con una tonalidad rosada

1048729 El colorante el tampoacuten o el agua de lavado tienen un pH demasiadoaacutecido

Presencia de precipitados

1048729 Obedecen a una accioacuten excesiva del colorante Esto se puede evitarcon la

filtracioacuten

SECCIOacuteN 6

HEMOGRAMA-HEMOGLOBINA-HEMATOCRITO

El hemograma de Shilling constituye uno de los exaacutemenes de laboratorio

maacutesusados en el campo de la hematologiacutea Comprende las siguientes pruebas

61 RECUENTO LEUCOCITARIO

Principio

La sangre anticoagulada se deposita en un liacutequido que permite evidenciar

losleucocitos mantenieacutendolos visibles mientras que los eritrocitos

sonhemolizados El recuento del nuacutemero de leucocitos o gloacutebulos blancos se

expresapor mm3 (miliacutemetro cuacutebico)

611 Equipos

- Microscopio

- Hemocitoacutemetro (Caacutemara de Neubauer)

Consta de los siguientes elementos

diams Una laacutemina portaobjeto gruesa en el centro se hallan dos

superficiescuadriculadas iguales separadas del resto de la laacutemina por surcos y

dosbarras transversales algo maacutes elevadas

diams Una laminilla cubreobjetos oacutepticamente plana que al colocarse sobrelas barras

elevadas de la laacutemina forma una caacutemara entre el cubreobjetosy la superficie

cuadriculadaLa altura entre el cubreobjetos y la laacutemina portaobjetos es de 01

mmCada cuadriacutecula mide 3 mm de lado y se divide en 9 cuadrados grandesCada

uno de los cuales mide 1 mm2 de superficie que se subdivide a suvez en 16

cuadrados medianos El cuadrado grande central se divide en25 cuadrados

pequentildeos y cada uno de ellos en 16 cuadraditos Cadacuadrado pequentildeo mide

02 mm de lado (004 mm2 de superficie) y cadacuadradito mide 005 mm de lado

(00025 mm2 de superficie)

612 Materiales y reactivos requeridos

6121 Pipeta de gloacutebulos blancos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0 a 100 mL)Presenta cerca del extremo superior una marca de 11 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla que funciona comomezcladora luego sigue el extremo maacutes largo de la pipeta (tallo) que estaacutedividida en 10 partes con 2 marcas 1 (parte final del bulbo) y 05 (a la mitaddel tallo) Se le acopla a su extremo superior 1 tubo de goma y una bombillapara aspirar

6122 Diluyente de gloacutebulos blancos Solucioacuten de Turk al 1

6123 Contador manual (Soacutelo si fuera necesario)

6124 Papel filtro

613 Procedimiento

6131 Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar deldedo se procede a aspirar la sangre con la pipeta de gloacutebulos blancoshasta la marca de 05 y a limpiar la punta con papel absorbente

6132 Introducir la pipeta en el tubo que contenga solucioacuten de Turk y absorberhasta la marca de 11 (no debe haber burbujas)

6133 Tapar ambos extremos y proceder a mezclar manualmente o en unrotador automaacutetico por 2 oacute 3 minutos

6134 Monte la laminilla de vidrio en la caacutemara para recuento que debe estarlimpia y seca

6135 Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocaruna gota pequentildea de esta solucioacuten en la caacutemara

6136 Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las ceacutelulas se sedimenten

6137 Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angularesCuando se usa la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002 mL) desangre total con anticoagulante o sangre capilar con anticoagulante yse diluye en un tubo que contenga 380 mL de solucioacuten de Turk (aquiacutetenemos una dilucioacuten 120)

LECTURA

Fig 13

La lectura se realiza en los campos 1 3 7 y 9 como estaacute indicado en la figuraAdemaacutes de los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes sedeben contar todos los leucocitos que se encuentren adheridos en la liacuteneahorizontal superior y vertical exterior o de lo contrario todos los leucocitosadheridos a la liacutenea horizontal inferior y vertical interior

614 Resultados

Nordm de leucocitos x mm3 = leucocitos contados en 4 camposdividealtura x dilucioacuten x aacuterea

Reemplazando = leucocitos contados en 4 camposdivide110 x 120 x 4=

Leucocitos contados en 4 camposdivide4200=

X1 divide4200= Nordm leucocitos contados x 50

615 Valores de referencia

5000 - 10 000 leucocitos mm3

616 Correccioacuten de valores para restar eritrocitos nucleados

Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el liacutequido de dilucioacuten por lo tantopueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con losleucocitos de tal manera que se debe emplear la siguiente foacutermula

Caacutelculo

La concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos (por litro) esNuacutemero de normoblatos contados x concentracioacuten o nuacutemero de leucocitos100 + Nordm de normoblastos contados

Ejemplo

Si se cuentan 50 normoblastos y la concentracioacuten del nuacutemero de leucocitos es16 x 109l la concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos seraacute

50 x16 = 53 x 109l

100 + 50

y la concentracioacuten de leucocitos corregida seraacute 16 - 53 = 107 x 109lEn unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitosse expresan por miliacutemetro cuacutebico En tales unidades el caacutelculo correspondienteal ejemplo que se ha dado seriacutea

50 x 16 000 = 5300 mm3

100 + 50

Recuento corregido de gloacutebulos blancos o leucocitos = 16 000 - 5300 = 10 700 mm3

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

62 RECUENTO DE GLOacuteBULOS ROJOS

Principio

La sangre se diluye en un liacutequido que nos permite observar claramente loshematiacutees luego esta dilucioacuten se coloca en una caacutemara de Neubauer con laayuda de una pipeta automaacutetica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopioa un objetivo de 40x para calcular el nuacutemero de gloacutebulos rojos por mm3

621 Equipos

- Microscopio

- Hemocitoacutemetro (caacutemara de Neubauer)

622 Materiales y reactivos requeridos

6221 Pipeta de gloacutebulos rojos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0-100 mL)

Presenta cerca del extremo superior una marca de 101 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla roja mezcladoraluego sigue el tallo (extremo maacutes largo) el cual estaacute dividido en 10 partescon 2 marcas 1 acabando el bulbo y 05 a la mitad del tallo Se requiereigual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar

6222 Diluyente de gloacutebulos rojos Cloruro de Sodio al 09 (ver anexo)

Diluyente de Hayem (ver anexo)

6223 Contador manual (soacutelo si fuera necesario)

6224 Papel filtro

623 Procedimiento

6231 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar

6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente

6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101

6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos

6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente

6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas

6237 Dejar en reposo por 3 minutos

6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)

6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos

LECTURA

Fig 14

624 Resultados

Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea

Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15

= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000

= hematiacutees contados x 10 000

625 Valores de referencia

(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)

Hombres 4 500 000 - 5 500 000

Mujeres 4 000 000 - 5 000 000

Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000

Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000

Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)

Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal

volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen

porcentaje o como valor decimal

Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre

total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)

631 Meacutetodo de Wintrobe

Materiales requeridos

- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm

- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia

- Tapoacuten de goma

Procedimiento

diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur

comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado

de no provocar espuma

diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten

diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos

Resultados (lectura)

Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos

Valores de referencia

Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

632 Meacutetodo de microhematocrito

Materiales requeridos

- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)

- Plastilina

Procedimiento

diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel

dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon

anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80

del capilar

diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina

diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma

diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm

Resultados (lectura)

La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio

Uso de la escala

diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero

diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la

columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical

diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos

Valores de referencia

Hombres 40 - 50

Mujeres 38 - 44

Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44

Lactantes (3 meses) 37 - 42

Recieacuten nacidos 50 - 58

La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)

64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA

Principio

La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre

641 Materiales y reactivos

6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro

6412 Pipetas

diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla

diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL

6413 Tubos de ensayo

6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten

Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia

El presente manual ha sido elaborado en forma simple didaacutectica y eminentementepraacutectica para que su contenido sea faacutecil de entender por el personalque labora en el laboratorio de hematologiacuteaSe divide en tres partes

1 En la primera parte se presentan los aspectos maacutes importantes de labioseguridad en el laboratorio

2 En la segunda parte se exponen las principales teacutecnicas baacutesicas del laboratoriode hematologiacutea

3 En la tercera parte se detallan las alteraciones maacutes frecuentes de la serieroja y de la serie blanca de un hemograma

El objetivo principal es protocolizar y estandarizar los procedimientoshematoloacutegicos que empiezan con la toma de muestra (siguiendo las pautasde control de calidad preanaliacutetica) hasta el procesamiento de eacutesta (fase analiacutetica)en la determinacioacuten correspondiente y por uacuteltimo en la emisioacuten de losresultados (fase postanaliacutetica) Debemos recalcar que cuando se realizanpruebas de hemostasia debe tenerse en consideracioacuten los cuidados comunesa toda prueba de laboratorio es decir las muestras deben obtenerse encondiciones apropiadas y rotularse debidamente Esperamos que el presentemanual sirva de guiacutea efectiva y que pueda ser enriquecido con nuevosaportes con la finalidad de alcanzar un trabajo de calidad

SECCIOacuteN 1

GENERALIDADES

11 OBJETIVO

Establecer y estandarizar los procedimientos baacutesicos de un examen dehemograma hemoglobina hematocrito recuento de plaquetas velocidad desedimentacioacuten y recuento de reticulocitos que sirvan de ayuda diagnoacutestica alcliacutenico

12 CAMPO DE APLICACIOacuteN

La aplicacioacuten de las teacutecnicas hematoloacutegicas nos sirve para estandarizar losprocedimientos a nivel nacional y para que sea de utilidad al personal teacutecnicoy profesional de los laboratorios cliacutenicos

13 RESPONSABILIDADES

131 El Centro Nacional de Laboratorios en Salud Puacuteblica a traveacutes de su

Direccioacuten Ejecutiva de Laboratorios de Referencia es responsable deautorizar la elaboracioacuten la revisioacuten y la actualizacioacuten del presente manualde acuerdo con los procedimientos aprobados por el Instituto Nacionalde Salud

132 Los directores de los establecimientos de salud son responsables deautorizar proporcionar los recursos necesarios y designar al personalresponsable para la aplicacioacuten de las disposiciones contenidas en elpresente manual

133 El personal de los establecimientos de salud es responsable de planificarlas acciones organizar controlar y capacitar al personal para cumplirlas disposiciones contenidas en el presente manual

134 Los jefes o responsables de los laboratorios deben asegurar el controlinterno de la calidad la idoneidad del personal equipos materialesreactivos e instalaciones

135 El personal meacutedico profesional y teacutecnico es responsable de seguir lasespecificaciones contenidas en el presente manual y aplicar los procedimientosespeciacuteficos indicados

14 DOCUMENTOS DE REFERENCIA

141 Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OrganizacioacutenPanamericana de la Salud Publicacioacuten cientiacutefica Nordm 439 Nordm 2 1983

142 Manual de normas de bioseguridad Instituto Nacional de Salud Serie deNormas Teacutecnicas Nordm 18 2ordf ed 1997

SECCIOacuteN 2

MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD

21 Para la obtencioacuten de muestras el personal involucrado en los diferentesprocesos para los exaacutemenes hematoloacutegicos debe aplicar las medidas debioseguridad establecidas en el Manual de Bioseguridad Serie de NormasTeacutecnicas Nordm 18

22 Se debe controlar sobre todo

221 Al personal que trabaja en el laboratorio de hematologiacutea

222 El proceso de coloracioacuten en el que se debe aplicar las medidas debioseguridad correspondientes al uso y manipulacioacuten de sustanciastoacutexicas o canceriacutegenas

223 Ver lo referente a medidas de proteccioacuten en caso de accidentes porinoculacioacuten

SECCIOacuteN 3

OBTENCIOacuteN DE MUESTRAS SANGUIacuteNEAS

31 OBJETIVO

Establecer y uniformizar criterios en el procedimiento de obtencioacuten de muestrassanguiacuteneas con un adecuado control de calidad ya que de ello dependeque el resultado del anaacutelisis de la muestra sea el correcto Se efectuaraacute enayunas o no dependiendo de la prueba a usar

32 OBTENCIOacuteN DE SANGRE VENOSA CON JERINGA

321 Materiales y equipos requeridos

3211 Algodoacuten

3212 Alcohol al 70

3213 Ligadura o torniquete de 25 a 30 cm de largo

3214 Jeringas de 5 mL

3215 Viales con anticoagulante EDTA

322 Obtencioacuten de la muestra

3221 Verificar que los elementos por utilizar esteacuten listos y que el pacientese sienta coacutemodo

3222 Aplicar el torniquete aproximadamente cuatro dedos por encima de laflexioacuten del codo o a 10 cm del codo sujetar con un medio nudo (Fig 1)

3223 Limpiar la zona con alcohol al 70 o alcohol yodado en un aacuterea de 2pulgadas (Fig 2)

3224 El paciente deberaacute abrir y cerrar la mano durante unos segundos ydespueacutes la mantendraacute cerrada esto ayudaraacute a visualizar las venassuperficiales (Fig 3)

3225 Se retira el estuche protector de la aguja y se coge la jeringa de talmanera que el bisel se encuentre hacia arriba (Fig 4)

3226 Se coloca la aguja en direccioacuten paralela a la vena se perfora la pielhaciendo avanzar la aguja 05-1 cm en el tejido subcutaacuteneo luego seperfora la vena (Fig 5)

3227 Se aspira la jeringa hasta el volumen requerido

3228 Retirar el torniquete e indicar al paciente que deje de hacer puntildeo Secoloca el algodoacuten seco encima de la puncioacuten y se retira la aguja (Fig 6)

3229 Retirar la aguja de la jeringa Verter la muestra lentamente por lasparedes del vial con anticoagulante No olvidar colocar una gota en lalaacutemina portaobjeto para realizar el frotis

32210 Agitar el vial en ciacuterculos sobre la mesa para homogeneizar la muestracon el anticoagulante

PUNTOS PARA LA EXTRACCIOacuteN DE SANGRE

(Toma de muestra)

Se obtiene de las venas de la fosa cubital

PROCEDIMIENTO

Fig 1 Fig 2 Fig 3

Fig 4 Fig 5

Fig 6 Fig 7

33 OBTENCIOacuteN DE SANGRE VENOSA EN TUBOS AL VACIacuteO

331 Materiales requeridos

3311 Algodoacuten

3312 Alcohol al 70

3313 Ligadura o torniquete de 25 a 30 cm de largo

3314 Tubos al vaciacuteo con anticoagulante EDTA (K3) EDTA (Na2) u otroanticoagulante

3315 Agujas con dispositivo para extraccioacuten de sangre al vaciacuteo

- Nordm 21 para adultos

- Nordm 22 para nintildeos y neonatos

De preferencia ambas de bisel corto para evitar la coagulacioacuten

332 Obtencioacuten de la muestra

3321 Repetir los pasos de 3221 a 3224

3322 Se retira el estuche protector de la aguja y eacuteste se enrosca al dispositivopara extraccioacuten de sangre al vaciacuteo

3323 Colocar la ligadura cuatro dedos por encima de la flexioacuten del codo o10 cm por encima de eacuteste y pedir al paciente que abra y cierre la manovarias veces para favorecer la dilatacioacuten de las venas

3324 Una vez escogida la vena desinfectarla con una pieza de algodoacutenembebido en etanol al 70

3325 Se coloca la aguja en direccioacuten paralela a la vena se perfora la pielhaciendo avanzar la aguja entre 05 cm y 1 cm en el tejido subcutaacuteneose inserta el tubo al vaciacuteo por la parte posterior y no preocuparse porla cantidad de sangre extraiacuteda ya que el mismo sonido del vaciacuteo avisaraacuteque la extraccioacuten terminoacute (Fig 8)

3326 Retirar la ligadura tirando del extremo doblado

3327 Colocar un pedazo de algodoacuten seco sobre la parte donde se encuentraoculta la aguja Sacar la aguja con un movimiento raacutepido y depositarlaen el recipiente de metal con desinfectante (Fig 9)

3328 Pedir al paciente que presione firmemente el algodoacuten durante 3 minutoscon el brazo extendido No se recomienda que se flexione el brazoa causa del riesgo que se forme un hematoma

3329 Mezclar por inmersioacuten suave la sangre con el anticoagulante contenidoen el tubo No agitar el contenido

Fig 8 Fig 9

333 Ventajas de una extraccioacuten de sangre venosa

3331 Pueden hacerse repetidos exaacutemenes con la misma muestra

3332 Parte de la muestra (plasma o suero) puede congelarse para referenciafutura

334 Desventajas de una extraccioacuten de sangre venosa

3341 La puncioacuten venosa por su largo procedimiento requiere mayor preparacioacuten que el meacutetodo capilar

3342 El meacutetodo es teacutecnicamente difiacutecil en nintildeos individuos obesos y pacientes en shock

3343 La hemoacutelisis debe ser evitada pues se puede obtener una disminucioacuten en el recuento de eritrocitos

3344 Debe evitarse prolongada estasis venosa producida por el torniquete pues produce hemoacutelisis y otros cambios que ponen la sangre en un estado inadecuado para el anaacutelisis de gases recuentos celulares determinacioacuten de pH sanguiacuteneo y algunas pruebas de coagulacioacuten

3345 La sangre anticoagulada si no es de obtencioacuten reciente no debe ser utilizada en extensiones de sangre pues algunos anticoagulantes producen cambios en las plaquetas que pueden causar aglutinaciones agregacioacuten plaquetaria y dificultan la identificacioacuten de leucocitos

3346 Puesto que algunos de los componentes de la sangre no son estables los recuentos de leucocitos y plaquetas e iacutendice de sedimentacioacuten deben realizarse antes de que pasen dos horas desde que se obtuvo la muestra

34 OBTENCIOacuteN DE SANGRE DE LA VENA YUGULAR EXTERNA

341 Materiales requeridos

3411 Algodoacuten

3412 Alcohol al 70

3413 Jeringas de 5 mL

3414 Viales con anticoagulante EDTA

342 Obtencioacuten de la muestra

3421 El paciente es cubierto por una saacutebana de manera que los brazospermanezcan inmovilizados a lo largo del cuerpo

3422 Al paciente se le coloca de cuacutebito dorsal sobre la mesa de examen ouna

camilla de manera que la cabeza cuelgue sobre el final de lamesa y el cuerpo sea

sujetado por un asistente

3423 Cuando el paciente grita la vena yugular externa se marca claramente

3424 Limpiar la zona en un aacuterea de 2 pulgadas con alcohol al 70 o

alcoholyodado

3425 Se repiten los pasos de 3225 a 3227 de la extraccioacuten de sangrevenosa

con jeringa

3426 Retirar la aguja de la vena y presionar suavemente con un algodoacutenseco

aproximadamente de 3 a 5 minutos Pedir al paciente que permanezcaechado diez

minutos

3427 Se repiten los pasos de 3229

3428 Se repiten los pasos de 32210

343 Ventajas

Constituye un buen meacutetodo para la obtencioacuten de sangre en pacientes conshock

con venas colapsadas

344 Desventajas

Por lo delicado en su procedimiento no se recomienda como rutina soacutelo encasos

en que no se pueda obtener la muestra por meacutetodos convencionales

35 OBTENCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR

Cuando la cantidad de sangre que se precisa es muy pequentildea o cuando

pordiferentes motivos no pueda practicarse una puncioacuten venosa debe recurrirse

a la puncioacuten capilar

351 Materiales requeridos

3512 Algodoacuten

3513 Alcohol al 70

3514 Lancetas desechables (Fig 10)

3515 Papel filtro Nordm 2

352 Procedimiento (Fig 11)

3521 La sangre capilar se obtiene de la cara lateral del dedo medio o anularen los adultos y del dedo gordo del pie o taloacuten en los nintildeos

3522 Desinfectar la zona con alcohol al 70 secar con algodoacuten esteacuteril

3523 Punzar la piel con una lanceta esteacuteril desechable (2 mm de profundidad)

3524 Usar gasa esteacuteril para desechar la primera gota y recoger las siguientesen tubos capilares Evitar comprimir la extremidad para obtenersangre porque se altera la composicioacuten sanguiacutenea

353 Ventajas

3531 Puede obtenerse con facilidad

3532 Es preferible cuando han de realizarse extensiones de sangre perifeacuterica

354 Desventajas

3541 Soacutelo se pueden obtener pequentildeas cantidades de sangre y los exaacutemenesde repeticioacuten requieren nuevas muestras

3542 La sangre en microtubos (capilares) frecuentemente se hemolizainterfiendo con la mayoriacutea de pruebas de laboratorio

3543 Los resultados obtenidos en pruebas con sangre capilar no puedenser comparados con los resultados de las pruebas con sangre venosa

3544 El dedo no soacutelo es delicado sino difiacutecil de desinfectar adecuadamenteen el tiempo disponible

3545 En pacientes con resistencia disminuida a la infeccioacuten (aquellos conleucemia agranulocitosis diabetes uremia y enfermedades con deficienciasinmunoloacutegicas) una muestra tomada del dedo es mucho maacutesprobable que conduzca a una infeccioacuten que otra tomada del brazo

3546 El recuento de eritrocitos y leucocitos asiacute como el recuento deplaquetas y reticulocitos no debe realizarse en sangre capilar debidoa la difiacutecil estandarizacioacuten del flujo sanguiacuteneo capilar

EXTRACCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR

Fig 10

Fig 11

SECCIOacuteN 4

ANTICOAGULANTES

Una vez extraiacuteda la sangre eacutesta puede conservarse coagulada o

mantenidaincoagulable mediante la adicioacuten de un anticoagulante

41 CARACTERIacuteSTICAS BAacuteSICAS DE LOS ANTICOAGULANTES MAacuteS

USADOSEN HEMATOLOGIacuteA

bull No alterar el tamantildeo de los hematiacutees

bull No producir hemoacutelisis

bull Evitar al maacuteximo la agregacioacuten plaquetaria

bull No alterar la morfologiacutea de los leucocitos

La sangre tratada con anticoagulante debe procesarse lo antes posible

inclusomantenida bajo refrigeracioacuten (4 ordmC) si no pasan de las 2 horas El

tiempomaacuteximo entre la extraccioacuten de la sangre y su procesamiento depende

delcoagulante de eleccioacuten y no debe ser maacutes de 4 horas a excepcioacuten

delanticoagulante EDTA (etilendiaminotetraceacutetico) que puede ser hasta 24

horas(en refrigeracioacuten a 4 ordmC)

Los anticoagulantes pueden emplearse en forma soacutelida o liacutequida Los

primerosestaacuten indicados para la determinacioacuten de los paraacutemetros

hematoloacutegicosya que no producen como los anticoagulantes liacutequidos dilucioacuten de

la sangre

42 ANTICOAGULANTES SOacuteLIDOS

421 EDTA

Es la sal disoacutedica o tripotaacutesica del aacutecido etilendiaminotetraceacutetico La saldisoacutedica

(Na2EDTA) es menos soluble que la sal tripotaacutesica (K3EDTA) Estoscompuestos

realizan su accioacuten a traveacutes de un efecto quelante sobre el calcioal fijarlo impiden

su activacioacuten y por ende la coagulacioacuten sanguiacutenea

4211 Ventajas

bull Respeta la morfologiacutea eritrocitaria (especialmente la sal tripotaacutesica) yleucocitaria de manera que permite una demora de dos horas en la realizacioacutendel frotis sanguiacuteneo despueacutes de la extraccioacuten sanguiacutenea

bull Asegura la conservacioacuten de los elementos formes sanguiacuteneos durante 24horas si la sangre se mantiene a 4 ordmC

bull Al inhibir la aglutinacioacuten de las plaquetas facilita su recuento o su expresioacutensemicuantitativa a partir del frotis

bull La concentracioacuten recomendada de EDTA es de 15 mgmL de sangre Unamayor cantidad de anticoagulante puede producir retraccioacuten celular condisminucioacuten del hematocrito y un aumento de la concentracioacuten media de lahemoglobina Un exceso de sangre con relacioacuten al anticoagulante produceformacioacuten de microagregados que pueden alterar los resultados El empleode tubos al vaciacuteo con una gota (50mL) de EDTA tripotaacutesica comercialpara 5 mL de sangre es de intereacutes praacutectico dado que es cien veces maacutessoluble facilitando la mezcla de sangre con anticoagulante

4212 Desventajas

Usado en exceso afecta a los eritrocitos y a los leucocitos a los cuales les produce encogimiento y cambios en su forma por ello debe cuidarse de agregar la cantidad correcta de sangre al anticoagulante

422 Anticoagulante de Wintrobe

Es una mezcla de oxalato de amonio y potasio Actuacutea por precipitacioacuten del calcio es faacutecil de preparar Se emplea en forma de polvo en proporcioacuten de 2 de oxalato de amonio por 1 de oxalato de potasio La cantidad recomendada es de 2 mg x mL de sangre Este anticoagulante no afecta el volumen globular medio y puede usarse para determinaciones de hemoglobina hematocrito y recuento globular pero para los extendidos queda limitada a los primeros minutos tampoco es uacutetil para el recuento plaquetario porque produce formacioacuten de agregados plaquetarios

423 Heparina

El nombre de heparina proviene del griego hepar que significa hiacutegado ya que fue aislado por primera vez de las ceacutelulas de este tejido Es un mucopolisacaacuterido aacutecido Presenta el

inconveniente de que si no se agita raacutepidamente con la sangre despueacutes de extraiacuteda

pueden formarse microcoaacutegulos aunque no altera el volumeneritrocitario ni la morfologiacutea de los leucocitos No es recomendablepara el frotis sanguiacuteneo porque produce un fondo azul en la laacutemina

La heparina de sodio o litio puede usarse en forma soacutelida o liacutequida en

proporcioacutende 01 - 02 mg de heparina por 1 mL de sangre

43 ANTICOAGULANTES LIacuteQUIDOS

431 Citrato trisoacutedico

Es de eleccioacuten para las pruebas de hemostasia y la velocidad de sedimentacioacuten

Actuacutea a traveacutes de la precipitacioacuten del calcio La concentracioacuten depende de

la prueba por realizar

bull Para pruebas de hemostasia se emplea en proporcioacuten de 1 9 (05 mL

deanticoagulante para 45 mL de sangre total)

bull Para la determinacioacuten de la VSG (Velocidad de Sedimentacioacuten Globular) es14

(05 mL de anticoagulante para 2 mL de sangre)

432 Oxalato soacutedico

Recomendado tambieacuten para las pruebas de hemostasia Se emplea en

proporcioacutende un volumen de anticoagulante para 4 vol de sangre

SECCIOacuteN 5

REALIZACIOacuteN Y TINCIOacuteN DEL FROTIS SANGUIacuteNEO

La praacutectica del frotis sanguiacuteneo tambieacuten llamado extendido es de gran importanciaen hematologiacutea ya que el diagnoacutestico de muchas enfermedadeshematoloacutegicas puede realizarse con soacutelo observar las caracteriacutesticasmorfoloacutegicas de las ceacutelulas sanguiacuteneas de manera que eacuteste no debe serexcesivamente grueso ni excesivamente fino Todas las laacuteminas por usarsobre todo nuevas deben ser limpiadas con algodoacuten y alcohol al 70 paraeliminar la grasa que viene adherida

51 MEacuteTODO DE LOS DOS PORTAOBJETOS

511 Materiales

- Alcohol al 70

- Algodoacuten

- Lanceta descartable

- Portaobjetos de vidrios limpios y desgrasados (25 x 75 mm)

512 Fundamento

Consiste en la extensioacuten de una gota de sangre sobre un portaobjeto (25 x 75)empleando el canto biselado de otro portaobjeto de igual dimensioacuten (Fig 12)

513 Procedimiento

5131 Una vez extraiacuteda la sangre con cualquiera de las metodologiacuteas secoloca una pequentildea gota de sangre (5mL) (aprox 3 mm de diaacutemetro)sobre un portaobjeto a 2 cm aproximadamente de uno de los extremos

5132 Colocar el canto de otro portaobjeto esmerilado sobre la superficiedel primer portaobjeto (en la que se encuentra la gota de sangre)formando un aacutengulo de 45ordm

5134 Deslizar suavemente y a velocidad moderada el portaobjeto sobre elotro en sentido longitudinal hasta que la gota de sangre quede bienextendida sobre la

superficie del primer portaobjeto El grosor delfrotis sanguiacuteneo puede variar seguacuten sea el aacutengulo que formen entresiacute ambos portaobjetos Asiacute si es superior a 45ordm la extensioacuten obtenidaseraacute gruesa y corta si es inferior a 45ordm seraacute larga y fina El secado delfrotis es a temperatura ambiente y en posicioacuten horizontal

Fig 12

1048729 Zona excesivamente gruesa Se halla en la regioacuten inmediata al punto departida de la extensioacuten (cabeza) En ella se aprecia siempre un aumento delinfocitos

1048729 Zona excesivamente fina Corresponde al final de la extensioacuten y termina enun aacuterea donde las ceacutelulas adoptan una posicioacuten acartonada (barbas) Enesta regioacuten existe un exceso de granulocitos y monocitos

1048729 Zona ideal Corresponde a la regioacuten intermedia del frotis y en ella existe unreparto equilibrado de ceacutelulas

52 COLORACIONES USADAS

Una vez seco el frotis se procede a la tincioacuten hematoloacutegica con el colorante deRomanowsky constituido por la mezcla de eosina y azul de metileno Dentrode eacutestas tenemos

521 Colorante de Giemsa

522 Colorante de May-Grunwald

523 Colorante de Wright

524 Colorante de Leishman

Preparacioacuten de colorantes (Anexo A)

1048729 Para el estudio de las ceacutelulas sanguiacuteneas utilizar el colorante 523 y 524

1048729 Para el estudio de hemoparaacutesitos utilizar el colorante 521

1048729 Utilizar el colorante 522 para casos especiales en que se desee observar

con mayor claridad y especificidad los graacutenulos de los neutrofilos

53 TINCIOacuteN CON COLORANTE DE WRIGHT

531 Fundamento

El colorante de Wright va a permitir suministrar un medio para estudiar lasangre y determinar las variaciones y anormalidades de estructura forma ytamantildeo de los eritrocitos su contenido de hemoglobina y sus propiedades decoloracioacuten La informacioacuten obtenida de un frotis de sangre perifeacuterica dependeen gran parte de la calidad del extendido y la coloracioacuten

532 Materiales

5321 Colorante de Wright (Anexo A)

5322 Frasco gotero

5323 Solucioacuten amortiguada tamponada (Anexo A)

533 Procedimiento

5331 Una vez obtenido el frotis sanguiacuteneo se le dejaraacute secar entre 15 y 20minutos

5332 Luego se coloca la preparacioacuten en un soporte y se cubre con el colorantede Wright dejaacutendolo por espacio de 5 minutos

5333 Posteriormente se antildeade solucioacuten amortiguada tamponada en partesiguales hasta obtener un brillo metaacutelico dejando 6 minutos adicionales

5334 Finalmente se lava con agua corriente y se deja secar

5335 Se coloca en el microscopio y con pequentildeo aumento se revisa lacalidad de la coloracioacuten la cantidad aproximada de gloacutebulos blancosy se escoge el sitio para iniciar el recuento Se coloca una gota deaceite de inmersioacuten y se enfoca a un aumento de 100xLa forma de los gloacutebulos rojos se examinaraacute detenidamente observandoademaacutes del color (cantidad de hemoglobina) presencia deplaquetas su agrupacioacuten y distribucioacuten

5336 Posteriormente se hace el recuento diferencial de gloacutebulos blancosen 100

ceacutelulas para lo cual se deberaacute conocer las diferencias entreneutroacutefilos eosinoacutefilos

linfocitos y monocitosUna extensioacuten de sangre bien tentildeida debe caracterizarse

por unabuena diferenciacioacuten de las estructuras subcelulares en los leucocitosuna

coloracioacuten rosada de los hematiacutees y la ausencia de precipitados

Los defectos maacutes frecuentes observados en la tincioacuten del frotis sanguiacuteneoson

Coloracioacuten excesivamente azul debido a

1048729 Frotis excesivamente grueso

1048729 Lavado insuficiente

1048729 Tincioacuten muy prolongada

1048729 Empleo de colorante excesivamente alcalino

Coloracioacuten con una tonalidad rosada

1048729 El colorante el tampoacuten o el agua de lavado tienen un pH demasiadoaacutecido

Presencia de precipitados

1048729 Obedecen a una accioacuten excesiva del colorante Esto se puede evitarcon la

filtracioacuten

SECCIOacuteN 6

HEMOGRAMA-HEMOGLOBINA-HEMATOCRITO

El hemograma de Shilling constituye uno de los exaacutemenes de laboratorio

maacutesusados en el campo de la hematologiacutea Comprende las siguientes pruebas

61 RECUENTO LEUCOCITARIO

Principio

La sangre anticoagulada se deposita en un liacutequido que permite evidenciar

losleucocitos mantenieacutendolos visibles mientras que los eritrocitos

sonhemolizados El recuento del nuacutemero de leucocitos o gloacutebulos blancos se

expresapor mm3 (miliacutemetro cuacutebico)

611 Equipos

- Microscopio

- Hemocitoacutemetro (Caacutemara de Neubauer)

Consta de los siguientes elementos

diams Una laacutemina portaobjeto gruesa en el centro se hallan dos

superficiescuadriculadas iguales separadas del resto de la laacutemina por surcos y

dosbarras transversales algo maacutes elevadas

diams Una laminilla cubreobjetos oacutepticamente plana que al colocarse sobrelas barras

elevadas de la laacutemina forma una caacutemara entre el cubreobjetosy la superficie

cuadriculadaLa altura entre el cubreobjetos y la laacutemina portaobjetos es de 01

mmCada cuadriacutecula mide 3 mm de lado y se divide en 9 cuadrados grandesCada

uno de los cuales mide 1 mm2 de superficie que se subdivide a suvez en 16

cuadrados medianos El cuadrado grande central se divide en25 cuadrados

pequentildeos y cada uno de ellos en 16 cuadraditos Cadacuadrado pequentildeo mide

02 mm de lado (004 mm2 de superficie) y cadacuadradito mide 005 mm de lado

(00025 mm2 de superficie)

612 Materiales y reactivos requeridos

6121 Pipeta de gloacutebulos blancos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0 a 100 mL)Presenta cerca del extremo superior una marca de 11 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla que funciona comomezcladora luego sigue el extremo maacutes largo de la pipeta (tallo) que estaacutedividida en 10 partes con 2 marcas 1 (parte final del bulbo) y 05 (a la mitaddel tallo) Se le acopla a su extremo superior 1 tubo de goma y una bombillapara aspirar

6122 Diluyente de gloacutebulos blancos Solucioacuten de Turk al 1

6123 Contador manual (Soacutelo si fuera necesario)

6124 Papel filtro

613 Procedimiento

6131 Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar deldedo se procede a aspirar la sangre con la pipeta de gloacutebulos blancoshasta la marca de 05 y a limpiar la punta con papel absorbente

6132 Introducir la pipeta en el tubo que contenga solucioacuten de Turk y absorberhasta la marca de 11 (no debe haber burbujas)

6133 Tapar ambos extremos y proceder a mezclar manualmente o en unrotador automaacutetico por 2 oacute 3 minutos

6134 Monte la laminilla de vidrio en la caacutemara para recuento que debe estarlimpia y seca

6135 Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocaruna gota pequentildea de esta solucioacuten en la caacutemara

6136 Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las ceacutelulas se sedimenten

6137 Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angularesCuando se usa la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002 mL) desangre total con anticoagulante o sangre capilar con anticoagulante yse diluye en un tubo que contenga 380 mL de solucioacuten de Turk (aquiacutetenemos una dilucioacuten 120)

LECTURA

Fig 13

La lectura se realiza en los campos 1 3 7 y 9 como estaacute indicado en la figuraAdemaacutes de los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes sedeben contar todos los leucocitos que se encuentren adheridos en la liacuteneahorizontal superior y vertical exterior o de lo contrario todos los leucocitosadheridos a la liacutenea horizontal inferior y vertical interior

614 Resultados

Nordm de leucocitos x mm3 = leucocitos contados en 4 camposdividealtura x dilucioacuten x aacuterea

Reemplazando = leucocitos contados en 4 camposdivide110 x 120 x 4=

Leucocitos contados en 4 camposdivide4200=

X1 divide4200= Nordm leucocitos contados x 50

615 Valores de referencia

5000 - 10 000 leucocitos mm3

616 Correccioacuten de valores para restar eritrocitos nucleados

Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el liacutequido de dilucioacuten por lo tantopueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con losleucocitos de tal manera que se debe emplear la siguiente foacutermula

Caacutelculo

La concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos (por litro) esNuacutemero de normoblatos contados x concentracioacuten o nuacutemero de leucocitos100 + Nordm de normoblastos contados

Ejemplo

Si se cuentan 50 normoblastos y la concentracioacuten del nuacutemero de leucocitos es16 x 109l la concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos seraacute

50 x16 = 53 x 109l

100 + 50

y la concentracioacuten de leucocitos corregida seraacute 16 - 53 = 107 x 109lEn unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitosse expresan por miliacutemetro cuacutebico En tales unidades el caacutelculo correspondienteal ejemplo que se ha dado seriacutea

50 x 16 000 = 5300 mm3

100 + 50

Recuento corregido de gloacutebulos blancos o leucocitos = 16 000 - 5300 = 10 700 mm3

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

62 RECUENTO DE GLOacuteBULOS ROJOS

Principio

La sangre se diluye en un liacutequido que nos permite observar claramente loshematiacutees luego esta dilucioacuten se coloca en una caacutemara de Neubauer con laayuda de una pipeta automaacutetica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopioa un objetivo de 40x para calcular el nuacutemero de gloacutebulos rojos por mm3

621 Equipos

- Microscopio

- Hemocitoacutemetro (caacutemara de Neubauer)

622 Materiales y reactivos requeridos

6221 Pipeta de gloacutebulos rojos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0-100 mL)

Presenta cerca del extremo superior una marca de 101 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla roja mezcladoraluego sigue el tallo (extremo maacutes largo) el cual estaacute dividido en 10 partescon 2 marcas 1 acabando el bulbo y 05 a la mitad del tallo Se requiereigual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar

6222 Diluyente de gloacutebulos rojos Cloruro de Sodio al 09 (ver anexo)

Diluyente de Hayem (ver anexo)

6223 Contador manual (soacutelo si fuera necesario)

6224 Papel filtro

623 Procedimiento

6231 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar

6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente

6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101

6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos

6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente

6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas

6237 Dejar en reposo por 3 minutos

6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)

6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos

LECTURA

Fig 14

624 Resultados

Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea

Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15

= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000

= hematiacutees contados x 10 000

625 Valores de referencia

(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)

Hombres 4 500 000 - 5 500 000

Mujeres 4 000 000 - 5 000 000

Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000

Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000

Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)

Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal

volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen

porcentaje o como valor decimal

Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre

total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)

631 Meacutetodo de Wintrobe

Materiales requeridos

- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm

- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia

- Tapoacuten de goma

Procedimiento

diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur

comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado

de no provocar espuma

diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten

diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos

Resultados (lectura)

Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos

Valores de referencia

Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

632 Meacutetodo de microhematocrito

Materiales requeridos

- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)

- Plastilina

Procedimiento

diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel

dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon

anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80

del capilar

diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina

diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma

diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm

Resultados (lectura)

La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio

Uso de la escala

diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero

diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la

columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical

diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos

Valores de referencia

Hombres 40 - 50

Mujeres 38 - 44

Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44

Lactantes (3 meses) 37 - 42

Recieacuten nacidos 50 - 58

La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)

64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA

Principio

La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre

641 Materiales y reactivos

6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro

6412 Pipetas

diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla

diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL

6413 Tubos de ensayo

6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten

Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia

GENERALIDADES

11 OBJETIVO

Establecer y estandarizar los procedimientos baacutesicos de un examen dehemograma hemoglobina hematocrito recuento de plaquetas velocidad desedimentacioacuten y recuento de reticulocitos que sirvan de ayuda diagnoacutestica alcliacutenico

12 CAMPO DE APLICACIOacuteN

La aplicacioacuten de las teacutecnicas hematoloacutegicas nos sirve para estandarizar losprocedimientos a nivel nacional y para que sea de utilidad al personal teacutecnicoy profesional de los laboratorios cliacutenicos

13 RESPONSABILIDADES

131 El Centro Nacional de Laboratorios en Salud Puacuteblica a traveacutes de su

Direccioacuten Ejecutiva de Laboratorios de Referencia es responsable deautorizar la elaboracioacuten la revisioacuten y la actualizacioacuten del presente manualde acuerdo con los procedimientos aprobados por el Instituto Nacionalde Salud

132 Los directores de los establecimientos de salud son responsables deautorizar proporcionar los recursos necesarios y designar al personalresponsable para la aplicacioacuten de las disposiciones contenidas en elpresente manual

133 El personal de los establecimientos de salud es responsable de planificarlas acciones organizar controlar y capacitar al personal para cumplirlas disposiciones contenidas en el presente manual

134 Los jefes o responsables de los laboratorios deben asegurar el controlinterno de la calidad la idoneidad del personal equipos materialesreactivos e instalaciones

135 El personal meacutedico profesional y teacutecnico es responsable de seguir lasespecificaciones contenidas en el presente manual y aplicar los procedimientosespeciacuteficos indicados

14 DOCUMENTOS DE REFERENCIA

141 Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OrganizacioacutenPanamericana de la Salud Publicacioacuten cientiacutefica Nordm 439 Nordm 2 1983

142 Manual de normas de bioseguridad Instituto Nacional de Salud Serie deNormas Teacutecnicas Nordm 18 2ordf ed 1997

SECCIOacuteN 2

MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD

21 Para la obtencioacuten de muestras el personal involucrado en los diferentesprocesos para los exaacutemenes hematoloacutegicos debe aplicar las medidas debioseguridad establecidas en el Manual de Bioseguridad Serie de NormasTeacutecnicas Nordm 18

22 Se debe controlar sobre todo

221 Al personal que trabaja en el laboratorio de hematologiacutea

222 El proceso de coloracioacuten en el que se debe aplicar las medidas debioseguridad correspondientes al uso y manipulacioacuten de sustanciastoacutexicas o canceriacutegenas

223 Ver lo referente a medidas de proteccioacuten en caso de accidentes porinoculacioacuten

SECCIOacuteN 3

OBTENCIOacuteN DE MUESTRAS SANGUIacuteNEAS

31 OBJETIVO

Establecer y uniformizar criterios en el procedimiento de obtencioacuten de muestrassanguiacuteneas con un adecuado control de calidad ya que de ello dependeque el resultado del anaacutelisis de la muestra sea el correcto Se efectuaraacute enayunas o no dependiendo de la prueba a usar

32 OBTENCIOacuteN DE SANGRE VENOSA CON JERINGA

321 Materiales y equipos requeridos

3211 Algodoacuten

3212 Alcohol al 70

3213 Ligadura o torniquete de 25 a 30 cm de largo

3214 Jeringas de 5 mL

3215 Viales con anticoagulante EDTA

322 Obtencioacuten de la muestra

3221 Verificar que los elementos por utilizar esteacuten listos y que el pacientese sienta coacutemodo

3222 Aplicar el torniquete aproximadamente cuatro dedos por encima de laflexioacuten del codo o a 10 cm del codo sujetar con un medio nudo (Fig 1)

3223 Limpiar la zona con alcohol al 70 o alcohol yodado en un aacuterea de 2pulgadas (Fig 2)

3224 El paciente deberaacute abrir y cerrar la mano durante unos segundos ydespueacutes la mantendraacute cerrada esto ayudaraacute a visualizar las venassuperficiales (Fig 3)

3225 Se retira el estuche protector de la aguja y se coge la jeringa de talmanera que el bisel se encuentre hacia arriba (Fig 4)

3226 Se coloca la aguja en direccioacuten paralela a la vena se perfora la pielhaciendo avanzar la aguja 05-1 cm en el tejido subcutaacuteneo luego seperfora la vena (Fig 5)

3227 Se aspira la jeringa hasta el volumen requerido

3228 Retirar el torniquete e indicar al paciente que deje de hacer puntildeo Secoloca el algodoacuten seco encima de la puncioacuten y se retira la aguja (Fig 6)

3229 Retirar la aguja de la jeringa Verter la muestra lentamente por lasparedes del vial con anticoagulante No olvidar colocar una gota en lalaacutemina portaobjeto para realizar el frotis

32210 Agitar el vial en ciacuterculos sobre la mesa para homogeneizar la muestracon el anticoagulante

PUNTOS PARA LA EXTRACCIOacuteN DE SANGRE

(Toma de muestra)

Se obtiene de las venas de la fosa cubital

PROCEDIMIENTO

Fig 1 Fig 2 Fig 3

Fig 4 Fig 5

Fig 6 Fig 7

33 OBTENCIOacuteN DE SANGRE VENOSA EN TUBOS AL VACIacuteO

331 Materiales requeridos

3311 Algodoacuten

3312 Alcohol al 70

3313 Ligadura o torniquete de 25 a 30 cm de largo

3314 Tubos al vaciacuteo con anticoagulante EDTA (K3) EDTA (Na2) u otroanticoagulante

3315 Agujas con dispositivo para extraccioacuten de sangre al vaciacuteo

- Nordm 21 para adultos

- Nordm 22 para nintildeos y neonatos

De preferencia ambas de bisel corto para evitar la coagulacioacuten

332 Obtencioacuten de la muestra

3321 Repetir los pasos de 3221 a 3224

3322 Se retira el estuche protector de la aguja y eacuteste se enrosca al dispositivopara extraccioacuten de sangre al vaciacuteo

3323 Colocar la ligadura cuatro dedos por encima de la flexioacuten del codo o10 cm por encima de eacuteste y pedir al paciente que abra y cierre la manovarias veces para favorecer la dilatacioacuten de las venas

3324 Una vez escogida la vena desinfectarla con una pieza de algodoacutenembebido en etanol al 70

3325 Se coloca la aguja en direccioacuten paralela a la vena se perfora la pielhaciendo avanzar la aguja entre 05 cm y 1 cm en el tejido subcutaacuteneose inserta el tubo al vaciacuteo por la parte posterior y no preocuparse porla cantidad de sangre extraiacuteda ya que el mismo sonido del vaciacuteo avisaraacuteque la extraccioacuten terminoacute (Fig 8)

3326 Retirar la ligadura tirando del extremo doblado

3327 Colocar un pedazo de algodoacuten seco sobre la parte donde se encuentraoculta la aguja Sacar la aguja con un movimiento raacutepido y depositarlaen el recipiente de metal con desinfectante (Fig 9)

3328 Pedir al paciente que presione firmemente el algodoacuten durante 3 minutoscon el brazo extendido No se recomienda que se flexione el brazoa causa del riesgo que se forme un hematoma

3329 Mezclar por inmersioacuten suave la sangre con el anticoagulante contenidoen el tubo No agitar el contenido

Fig 8 Fig 9

333 Ventajas de una extraccioacuten de sangre venosa

3331 Pueden hacerse repetidos exaacutemenes con la misma muestra

3332 Parte de la muestra (plasma o suero) puede congelarse para referenciafutura

334 Desventajas de una extraccioacuten de sangre venosa

3341 La puncioacuten venosa por su largo procedimiento requiere mayor preparacioacuten que el meacutetodo capilar

3342 El meacutetodo es teacutecnicamente difiacutecil en nintildeos individuos obesos y pacientes en shock

3343 La hemoacutelisis debe ser evitada pues se puede obtener una disminucioacuten en el recuento de eritrocitos

3344 Debe evitarse prolongada estasis venosa producida por el torniquete pues produce hemoacutelisis y otros cambios que ponen la sangre en un estado inadecuado para el anaacutelisis de gases recuentos celulares determinacioacuten de pH sanguiacuteneo y algunas pruebas de coagulacioacuten

3345 La sangre anticoagulada si no es de obtencioacuten reciente no debe ser utilizada en extensiones de sangre pues algunos anticoagulantes producen cambios en las plaquetas que pueden causar aglutinaciones agregacioacuten plaquetaria y dificultan la identificacioacuten de leucocitos

3346 Puesto que algunos de los componentes de la sangre no son estables los recuentos de leucocitos y plaquetas e iacutendice de sedimentacioacuten deben realizarse antes de que pasen dos horas desde que se obtuvo la muestra

34 OBTENCIOacuteN DE SANGRE DE LA VENA YUGULAR EXTERNA

341 Materiales requeridos

3411 Algodoacuten

3412 Alcohol al 70

3413 Jeringas de 5 mL

3414 Viales con anticoagulante EDTA

342 Obtencioacuten de la muestra

3421 El paciente es cubierto por una saacutebana de manera que los brazospermanezcan inmovilizados a lo largo del cuerpo

3422 Al paciente se le coloca de cuacutebito dorsal sobre la mesa de examen ouna

camilla de manera que la cabeza cuelgue sobre el final de lamesa y el cuerpo sea

sujetado por un asistente

3423 Cuando el paciente grita la vena yugular externa se marca claramente

3424 Limpiar la zona en un aacuterea de 2 pulgadas con alcohol al 70 o

alcoholyodado

3425 Se repiten los pasos de 3225 a 3227 de la extraccioacuten de sangrevenosa

con jeringa

3426 Retirar la aguja de la vena y presionar suavemente con un algodoacutenseco

aproximadamente de 3 a 5 minutos Pedir al paciente que permanezcaechado diez

minutos

3427 Se repiten los pasos de 3229

3428 Se repiten los pasos de 32210

343 Ventajas

Constituye un buen meacutetodo para la obtencioacuten de sangre en pacientes conshock

con venas colapsadas

344 Desventajas

Por lo delicado en su procedimiento no se recomienda como rutina soacutelo encasos

en que no se pueda obtener la muestra por meacutetodos convencionales

35 OBTENCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR

Cuando la cantidad de sangre que se precisa es muy pequentildea o cuando

pordiferentes motivos no pueda practicarse una puncioacuten venosa debe recurrirse

a la puncioacuten capilar

351 Materiales requeridos

3512 Algodoacuten

3513 Alcohol al 70

3514 Lancetas desechables (Fig 10)

3515 Papel filtro Nordm 2

352 Procedimiento (Fig 11)

3521 La sangre capilar se obtiene de la cara lateral del dedo medio o anularen los adultos y del dedo gordo del pie o taloacuten en los nintildeos

3522 Desinfectar la zona con alcohol al 70 secar con algodoacuten esteacuteril

3523 Punzar la piel con una lanceta esteacuteril desechable (2 mm de profundidad)

3524 Usar gasa esteacuteril para desechar la primera gota y recoger las siguientesen tubos capilares Evitar comprimir la extremidad para obtenersangre porque se altera la composicioacuten sanguiacutenea

353 Ventajas

3531 Puede obtenerse con facilidad

3532 Es preferible cuando han de realizarse extensiones de sangre perifeacuterica

354 Desventajas

3541 Soacutelo se pueden obtener pequentildeas cantidades de sangre y los exaacutemenesde repeticioacuten requieren nuevas muestras

3542 La sangre en microtubos (capilares) frecuentemente se hemolizainterfiendo con la mayoriacutea de pruebas de laboratorio

3543 Los resultados obtenidos en pruebas con sangre capilar no puedenser comparados con los resultados de las pruebas con sangre venosa

3544 El dedo no soacutelo es delicado sino difiacutecil de desinfectar adecuadamenteen el tiempo disponible

3545 En pacientes con resistencia disminuida a la infeccioacuten (aquellos conleucemia agranulocitosis diabetes uremia y enfermedades con deficienciasinmunoloacutegicas) una muestra tomada del dedo es mucho maacutesprobable que conduzca a una infeccioacuten que otra tomada del brazo

3546 El recuento de eritrocitos y leucocitos asiacute como el recuento deplaquetas y reticulocitos no debe realizarse en sangre capilar debidoa la difiacutecil estandarizacioacuten del flujo sanguiacuteneo capilar

EXTRACCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR

Fig 10

Fig 11

SECCIOacuteN 4

ANTICOAGULANTES

Una vez extraiacuteda la sangre eacutesta puede conservarse coagulada o

mantenidaincoagulable mediante la adicioacuten de un anticoagulante

41 CARACTERIacuteSTICAS BAacuteSICAS DE LOS ANTICOAGULANTES MAacuteS

USADOSEN HEMATOLOGIacuteA

bull No alterar el tamantildeo de los hematiacutees

bull No producir hemoacutelisis

bull Evitar al maacuteximo la agregacioacuten plaquetaria

bull No alterar la morfologiacutea de los leucocitos

La sangre tratada con anticoagulante debe procesarse lo antes posible

inclusomantenida bajo refrigeracioacuten (4 ordmC) si no pasan de las 2 horas El

tiempomaacuteximo entre la extraccioacuten de la sangre y su procesamiento depende

delcoagulante de eleccioacuten y no debe ser maacutes de 4 horas a excepcioacuten

delanticoagulante EDTA (etilendiaminotetraceacutetico) que puede ser hasta 24

horas(en refrigeracioacuten a 4 ordmC)

Los anticoagulantes pueden emplearse en forma soacutelida o liacutequida Los

primerosestaacuten indicados para la determinacioacuten de los paraacutemetros

hematoloacutegicosya que no producen como los anticoagulantes liacutequidos dilucioacuten de

la sangre

42 ANTICOAGULANTES SOacuteLIDOS

421 EDTA

Es la sal disoacutedica o tripotaacutesica del aacutecido etilendiaminotetraceacutetico La saldisoacutedica

(Na2EDTA) es menos soluble que la sal tripotaacutesica (K3EDTA) Estoscompuestos

realizan su accioacuten a traveacutes de un efecto quelante sobre el calcioal fijarlo impiden

su activacioacuten y por ende la coagulacioacuten sanguiacutenea

4211 Ventajas

bull Respeta la morfologiacutea eritrocitaria (especialmente la sal tripotaacutesica) yleucocitaria de manera que permite una demora de dos horas en la realizacioacutendel frotis sanguiacuteneo despueacutes de la extraccioacuten sanguiacutenea

bull Asegura la conservacioacuten de los elementos formes sanguiacuteneos durante 24horas si la sangre se mantiene a 4 ordmC

bull Al inhibir la aglutinacioacuten de las plaquetas facilita su recuento o su expresioacutensemicuantitativa a partir del frotis

bull La concentracioacuten recomendada de EDTA es de 15 mgmL de sangre Unamayor cantidad de anticoagulante puede producir retraccioacuten celular condisminucioacuten del hematocrito y un aumento de la concentracioacuten media de lahemoglobina Un exceso de sangre con relacioacuten al anticoagulante produceformacioacuten de microagregados que pueden alterar los resultados El empleode tubos al vaciacuteo con una gota (50mL) de EDTA tripotaacutesica comercialpara 5 mL de sangre es de intereacutes praacutectico dado que es cien veces maacutessoluble facilitando la mezcla de sangre con anticoagulante

4212 Desventajas

Usado en exceso afecta a los eritrocitos y a los leucocitos a los cuales les produce encogimiento y cambios en su forma por ello debe cuidarse de agregar la cantidad correcta de sangre al anticoagulante

422 Anticoagulante de Wintrobe

Es una mezcla de oxalato de amonio y potasio Actuacutea por precipitacioacuten del calcio es faacutecil de preparar Se emplea en forma de polvo en proporcioacuten de 2 de oxalato de amonio por 1 de oxalato de potasio La cantidad recomendada es de 2 mg x mL de sangre Este anticoagulante no afecta el volumen globular medio y puede usarse para determinaciones de hemoglobina hematocrito y recuento globular pero para los extendidos queda limitada a los primeros minutos tampoco es uacutetil para el recuento plaquetario porque produce formacioacuten de agregados plaquetarios

423 Heparina

El nombre de heparina proviene del griego hepar que significa hiacutegado ya que fue aislado por primera vez de las ceacutelulas de este tejido Es un mucopolisacaacuterido aacutecido Presenta el

inconveniente de que si no se agita raacutepidamente con la sangre despueacutes de extraiacuteda

pueden formarse microcoaacutegulos aunque no altera el volumeneritrocitario ni la morfologiacutea de los leucocitos No es recomendablepara el frotis sanguiacuteneo porque produce un fondo azul en la laacutemina

La heparina de sodio o litio puede usarse en forma soacutelida o liacutequida en

proporcioacutende 01 - 02 mg de heparina por 1 mL de sangre

43 ANTICOAGULANTES LIacuteQUIDOS

431 Citrato trisoacutedico

Es de eleccioacuten para las pruebas de hemostasia y la velocidad de sedimentacioacuten

Actuacutea a traveacutes de la precipitacioacuten del calcio La concentracioacuten depende de

la prueba por realizar

bull Para pruebas de hemostasia se emplea en proporcioacuten de 1 9 (05 mL

deanticoagulante para 45 mL de sangre total)

bull Para la determinacioacuten de la VSG (Velocidad de Sedimentacioacuten Globular) es14

(05 mL de anticoagulante para 2 mL de sangre)

432 Oxalato soacutedico

Recomendado tambieacuten para las pruebas de hemostasia Se emplea en

proporcioacutende un volumen de anticoagulante para 4 vol de sangre

SECCIOacuteN 5

REALIZACIOacuteN Y TINCIOacuteN DEL FROTIS SANGUIacuteNEO

La praacutectica del frotis sanguiacuteneo tambieacuten llamado extendido es de gran importanciaen hematologiacutea ya que el diagnoacutestico de muchas enfermedadeshematoloacutegicas puede realizarse con soacutelo observar las caracteriacutesticasmorfoloacutegicas de las ceacutelulas sanguiacuteneas de manera que eacuteste no debe serexcesivamente grueso ni excesivamente fino Todas las laacuteminas por usarsobre todo nuevas deben ser limpiadas con algodoacuten y alcohol al 70 paraeliminar la grasa que viene adherida

51 MEacuteTODO DE LOS DOS PORTAOBJETOS

511 Materiales

- Alcohol al 70

- Algodoacuten

- Lanceta descartable

- Portaobjetos de vidrios limpios y desgrasados (25 x 75 mm)

512 Fundamento

Consiste en la extensioacuten de una gota de sangre sobre un portaobjeto (25 x 75)empleando el canto biselado de otro portaobjeto de igual dimensioacuten (Fig 12)

513 Procedimiento

5131 Una vez extraiacuteda la sangre con cualquiera de las metodologiacuteas secoloca una pequentildea gota de sangre (5mL) (aprox 3 mm de diaacutemetro)sobre un portaobjeto a 2 cm aproximadamente de uno de los extremos

5132 Colocar el canto de otro portaobjeto esmerilado sobre la superficiedel primer portaobjeto (en la que se encuentra la gota de sangre)formando un aacutengulo de 45ordm

5134 Deslizar suavemente y a velocidad moderada el portaobjeto sobre elotro en sentido longitudinal hasta que la gota de sangre quede bienextendida sobre la

superficie del primer portaobjeto El grosor delfrotis sanguiacuteneo puede variar seguacuten sea el aacutengulo que formen entresiacute ambos portaobjetos Asiacute si es superior a 45ordm la extensioacuten obtenidaseraacute gruesa y corta si es inferior a 45ordm seraacute larga y fina El secado delfrotis es a temperatura ambiente y en posicioacuten horizontal

Fig 12

1048729 Zona excesivamente gruesa Se halla en la regioacuten inmediata al punto departida de la extensioacuten (cabeza) En ella se aprecia siempre un aumento delinfocitos

1048729 Zona excesivamente fina Corresponde al final de la extensioacuten y termina enun aacuterea donde las ceacutelulas adoptan una posicioacuten acartonada (barbas) Enesta regioacuten existe un exceso de granulocitos y monocitos

1048729 Zona ideal Corresponde a la regioacuten intermedia del frotis y en ella existe unreparto equilibrado de ceacutelulas

52 COLORACIONES USADAS

Una vez seco el frotis se procede a la tincioacuten hematoloacutegica con el colorante deRomanowsky constituido por la mezcla de eosina y azul de metileno Dentrode eacutestas tenemos

521 Colorante de Giemsa

522 Colorante de May-Grunwald

523 Colorante de Wright

524 Colorante de Leishman

Preparacioacuten de colorantes (Anexo A)

1048729 Para el estudio de las ceacutelulas sanguiacuteneas utilizar el colorante 523 y 524

1048729 Para el estudio de hemoparaacutesitos utilizar el colorante 521

1048729 Utilizar el colorante 522 para casos especiales en que se desee observar

con mayor claridad y especificidad los graacutenulos de los neutrofilos

53 TINCIOacuteN CON COLORANTE DE WRIGHT

531 Fundamento

El colorante de Wright va a permitir suministrar un medio para estudiar lasangre y determinar las variaciones y anormalidades de estructura forma ytamantildeo de los eritrocitos su contenido de hemoglobina y sus propiedades decoloracioacuten La informacioacuten obtenida de un frotis de sangre perifeacuterica dependeen gran parte de la calidad del extendido y la coloracioacuten

532 Materiales

5321 Colorante de Wright (Anexo A)

5322 Frasco gotero

5323 Solucioacuten amortiguada tamponada (Anexo A)

533 Procedimiento

5331 Una vez obtenido el frotis sanguiacuteneo se le dejaraacute secar entre 15 y 20minutos

5332 Luego se coloca la preparacioacuten en un soporte y se cubre con el colorantede Wright dejaacutendolo por espacio de 5 minutos

5333 Posteriormente se antildeade solucioacuten amortiguada tamponada en partesiguales hasta obtener un brillo metaacutelico dejando 6 minutos adicionales

5334 Finalmente se lava con agua corriente y se deja secar

5335 Se coloca en el microscopio y con pequentildeo aumento se revisa lacalidad de la coloracioacuten la cantidad aproximada de gloacutebulos blancosy se escoge el sitio para iniciar el recuento Se coloca una gota deaceite de inmersioacuten y se enfoca a un aumento de 100xLa forma de los gloacutebulos rojos se examinaraacute detenidamente observandoademaacutes del color (cantidad de hemoglobina) presencia deplaquetas su agrupacioacuten y distribucioacuten

5336 Posteriormente se hace el recuento diferencial de gloacutebulos blancosen 100

ceacutelulas para lo cual se deberaacute conocer las diferencias entreneutroacutefilos eosinoacutefilos

linfocitos y monocitosUna extensioacuten de sangre bien tentildeida debe caracterizarse

por unabuena diferenciacioacuten de las estructuras subcelulares en los leucocitosuna

coloracioacuten rosada de los hematiacutees y la ausencia de precipitados

Los defectos maacutes frecuentes observados en la tincioacuten del frotis sanguiacuteneoson

Coloracioacuten excesivamente azul debido a

1048729 Frotis excesivamente grueso

1048729 Lavado insuficiente

1048729 Tincioacuten muy prolongada

1048729 Empleo de colorante excesivamente alcalino

Coloracioacuten con una tonalidad rosada

1048729 El colorante el tampoacuten o el agua de lavado tienen un pH demasiadoaacutecido

Presencia de precipitados

1048729 Obedecen a una accioacuten excesiva del colorante Esto se puede evitarcon la

filtracioacuten

SECCIOacuteN 6

HEMOGRAMA-HEMOGLOBINA-HEMATOCRITO

El hemograma de Shilling constituye uno de los exaacutemenes de laboratorio

maacutesusados en el campo de la hematologiacutea Comprende las siguientes pruebas

61 RECUENTO LEUCOCITARIO

Principio

La sangre anticoagulada se deposita en un liacutequido que permite evidenciar

losleucocitos mantenieacutendolos visibles mientras que los eritrocitos

sonhemolizados El recuento del nuacutemero de leucocitos o gloacutebulos blancos se

expresapor mm3 (miliacutemetro cuacutebico)

611 Equipos

- Microscopio

- Hemocitoacutemetro (Caacutemara de Neubauer)

Consta de los siguientes elementos

diams Una laacutemina portaobjeto gruesa en el centro se hallan dos

superficiescuadriculadas iguales separadas del resto de la laacutemina por surcos y

dosbarras transversales algo maacutes elevadas

diams Una laminilla cubreobjetos oacutepticamente plana que al colocarse sobrelas barras

elevadas de la laacutemina forma una caacutemara entre el cubreobjetosy la superficie

cuadriculadaLa altura entre el cubreobjetos y la laacutemina portaobjetos es de 01

mmCada cuadriacutecula mide 3 mm de lado y se divide en 9 cuadrados grandesCada

uno de los cuales mide 1 mm2 de superficie que se subdivide a suvez en 16

cuadrados medianos El cuadrado grande central se divide en25 cuadrados

pequentildeos y cada uno de ellos en 16 cuadraditos Cadacuadrado pequentildeo mide

02 mm de lado (004 mm2 de superficie) y cadacuadradito mide 005 mm de lado

(00025 mm2 de superficie)

612 Materiales y reactivos requeridos

6121 Pipeta de gloacutebulos blancos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0 a 100 mL)Presenta cerca del extremo superior una marca de 11 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla que funciona comomezcladora luego sigue el extremo maacutes largo de la pipeta (tallo) que estaacutedividida en 10 partes con 2 marcas 1 (parte final del bulbo) y 05 (a la mitaddel tallo) Se le acopla a su extremo superior 1 tubo de goma y una bombillapara aspirar

6122 Diluyente de gloacutebulos blancos Solucioacuten de Turk al 1

6123 Contador manual (Soacutelo si fuera necesario)

6124 Papel filtro

613 Procedimiento

6131 Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar deldedo se procede a aspirar la sangre con la pipeta de gloacutebulos blancoshasta la marca de 05 y a limpiar la punta con papel absorbente

6132 Introducir la pipeta en el tubo que contenga solucioacuten de Turk y absorberhasta la marca de 11 (no debe haber burbujas)

6133 Tapar ambos extremos y proceder a mezclar manualmente o en unrotador automaacutetico por 2 oacute 3 minutos

6134 Monte la laminilla de vidrio en la caacutemara para recuento que debe estarlimpia y seca

6135 Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocaruna gota pequentildea de esta solucioacuten en la caacutemara

6136 Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las ceacutelulas se sedimenten

6137 Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angularesCuando se usa la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002 mL) desangre total con anticoagulante o sangre capilar con anticoagulante yse diluye en un tubo que contenga 380 mL de solucioacuten de Turk (aquiacutetenemos una dilucioacuten 120)

LECTURA

Fig 13

La lectura se realiza en los campos 1 3 7 y 9 como estaacute indicado en la figuraAdemaacutes de los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes sedeben contar todos los leucocitos que se encuentren adheridos en la liacuteneahorizontal superior y vertical exterior o de lo contrario todos los leucocitosadheridos a la liacutenea horizontal inferior y vertical interior

614 Resultados

Nordm de leucocitos x mm3 = leucocitos contados en 4 camposdividealtura x dilucioacuten x aacuterea

Reemplazando = leucocitos contados en 4 camposdivide110 x 120 x 4=

Leucocitos contados en 4 camposdivide4200=

X1 divide4200= Nordm leucocitos contados x 50

615 Valores de referencia

5000 - 10 000 leucocitos mm3

616 Correccioacuten de valores para restar eritrocitos nucleados

Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el liacutequido de dilucioacuten por lo tantopueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con losleucocitos de tal manera que se debe emplear la siguiente foacutermula

Caacutelculo

La concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos (por litro) esNuacutemero de normoblatos contados x concentracioacuten o nuacutemero de leucocitos100 + Nordm de normoblastos contados

Ejemplo

Si se cuentan 50 normoblastos y la concentracioacuten del nuacutemero de leucocitos es16 x 109l la concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos seraacute

50 x16 = 53 x 109l

100 + 50

y la concentracioacuten de leucocitos corregida seraacute 16 - 53 = 107 x 109lEn unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitosse expresan por miliacutemetro cuacutebico En tales unidades el caacutelculo correspondienteal ejemplo que se ha dado seriacutea

50 x 16 000 = 5300 mm3

100 + 50

Recuento corregido de gloacutebulos blancos o leucocitos = 16 000 - 5300 = 10 700 mm3

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

62 RECUENTO DE GLOacuteBULOS ROJOS

Principio

La sangre se diluye en un liacutequido que nos permite observar claramente loshematiacutees luego esta dilucioacuten se coloca en una caacutemara de Neubauer con laayuda de una pipeta automaacutetica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopioa un objetivo de 40x para calcular el nuacutemero de gloacutebulos rojos por mm3

621 Equipos

- Microscopio

- Hemocitoacutemetro (caacutemara de Neubauer)

622 Materiales y reactivos requeridos

6221 Pipeta de gloacutebulos rojos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0-100 mL)

Presenta cerca del extremo superior una marca de 101 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla roja mezcladoraluego sigue el tallo (extremo maacutes largo) el cual estaacute dividido en 10 partescon 2 marcas 1 acabando el bulbo y 05 a la mitad del tallo Se requiereigual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar

6222 Diluyente de gloacutebulos rojos Cloruro de Sodio al 09 (ver anexo)

Diluyente de Hayem (ver anexo)

6223 Contador manual (soacutelo si fuera necesario)

6224 Papel filtro

623 Procedimiento

6231 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar

6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente

6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101

6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos

6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente

6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas

6237 Dejar en reposo por 3 minutos

6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)

6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos

LECTURA

Fig 14

624 Resultados

Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea

Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15

= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000

= hematiacutees contados x 10 000

625 Valores de referencia

(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)

Hombres 4 500 000 - 5 500 000

Mujeres 4 000 000 - 5 000 000

Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000

Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000

Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)

Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal

volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen

porcentaje o como valor decimal

Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre

total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)

631 Meacutetodo de Wintrobe

Materiales requeridos

- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm

- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia

- Tapoacuten de goma

Procedimiento

diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur

comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado

de no provocar espuma

diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten

diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos

Resultados (lectura)

Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos

Valores de referencia

Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

632 Meacutetodo de microhematocrito

Materiales requeridos

- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)

- Plastilina

Procedimiento

diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel

dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon

anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80

del capilar

diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina

diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma

diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm

Resultados (lectura)

La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio

Uso de la escala

diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero

diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la

columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical

diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos

Valores de referencia

Hombres 40 - 50

Mujeres 38 - 44

Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44

Lactantes (3 meses) 37 - 42

Recieacuten nacidos 50 - 58

La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)

64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA

Principio

La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre

641 Materiales y reactivos

6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro

6412 Pipetas

diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla

diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL

6413 Tubos de ensayo

6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten

Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia

141 Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OrganizacioacutenPanamericana de la Salud Publicacioacuten cientiacutefica Nordm 439 Nordm 2 1983

142 Manual de normas de bioseguridad Instituto Nacional de Salud Serie deNormas Teacutecnicas Nordm 18 2ordf ed 1997

SECCIOacuteN 2

MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD

21 Para la obtencioacuten de muestras el personal involucrado en los diferentesprocesos para los exaacutemenes hematoloacutegicos debe aplicar las medidas debioseguridad establecidas en el Manual de Bioseguridad Serie de NormasTeacutecnicas Nordm 18

22 Se debe controlar sobre todo

221 Al personal que trabaja en el laboratorio de hematologiacutea

222 El proceso de coloracioacuten en el que se debe aplicar las medidas debioseguridad correspondientes al uso y manipulacioacuten de sustanciastoacutexicas o canceriacutegenas

223 Ver lo referente a medidas de proteccioacuten en caso de accidentes porinoculacioacuten

SECCIOacuteN 3

OBTENCIOacuteN DE MUESTRAS SANGUIacuteNEAS

31 OBJETIVO

Establecer y uniformizar criterios en el procedimiento de obtencioacuten de muestrassanguiacuteneas con un adecuado control de calidad ya que de ello dependeque el resultado del anaacutelisis de la muestra sea el correcto Se efectuaraacute enayunas o no dependiendo de la prueba a usar

32 OBTENCIOacuteN DE SANGRE VENOSA CON JERINGA

321 Materiales y equipos requeridos

3211 Algodoacuten

3212 Alcohol al 70

3213 Ligadura o torniquete de 25 a 30 cm de largo

3214 Jeringas de 5 mL

3215 Viales con anticoagulante EDTA

322 Obtencioacuten de la muestra

3221 Verificar que los elementos por utilizar esteacuten listos y que el pacientese sienta coacutemodo

3222 Aplicar el torniquete aproximadamente cuatro dedos por encima de laflexioacuten del codo o a 10 cm del codo sujetar con un medio nudo (Fig 1)

3223 Limpiar la zona con alcohol al 70 o alcohol yodado en un aacuterea de 2pulgadas (Fig 2)

3224 El paciente deberaacute abrir y cerrar la mano durante unos segundos ydespueacutes la mantendraacute cerrada esto ayudaraacute a visualizar las venassuperficiales (Fig 3)

3225 Se retira el estuche protector de la aguja y se coge la jeringa de talmanera que el bisel se encuentre hacia arriba (Fig 4)

3226 Se coloca la aguja en direccioacuten paralela a la vena se perfora la pielhaciendo avanzar la aguja 05-1 cm en el tejido subcutaacuteneo luego seperfora la vena (Fig 5)

3227 Se aspira la jeringa hasta el volumen requerido

3228 Retirar el torniquete e indicar al paciente que deje de hacer puntildeo Secoloca el algodoacuten seco encima de la puncioacuten y se retira la aguja (Fig 6)

3229 Retirar la aguja de la jeringa Verter la muestra lentamente por lasparedes del vial con anticoagulante No olvidar colocar una gota en lalaacutemina portaobjeto para realizar el frotis

32210 Agitar el vial en ciacuterculos sobre la mesa para homogeneizar la muestracon el anticoagulante

PUNTOS PARA LA EXTRACCIOacuteN DE SANGRE

(Toma de muestra)

Se obtiene de las venas de la fosa cubital

PROCEDIMIENTO

Fig 1 Fig 2 Fig 3

Fig 4 Fig 5

Fig 6 Fig 7

33 OBTENCIOacuteN DE SANGRE VENOSA EN TUBOS AL VACIacuteO

331 Materiales requeridos

3311 Algodoacuten

3312 Alcohol al 70

3313 Ligadura o torniquete de 25 a 30 cm de largo

3314 Tubos al vaciacuteo con anticoagulante EDTA (K3) EDTA (Na2) u otroanticoagulante

3315 Agujas con dispositivo para extraccioacuten de sangre al vaciacuteo

- Nordm 21 para adultos

- Nordm 22 para nintildeos y neonatos

De preferencia ambas de bisel corto para evitar la coagulacioacuten

332 Obtencioacuten de la muestra

3321 Repetir los pasos de 3221 a 3224

3322 Se retira el estuche protector de la aguja y eacuteste se enrosca al dispositivopara extraccioacuten de sangre al vaciacuteo

3323 Colocar la ligadura cuatro dedos por encima de la flexioacuten del codo o10 cm por encima de eacuteste y pedir al paciente que abra y cierre la manovarias veces para favorecer la dilatacioacuten de las venas

3324 Una vez escogida la vena desinfectarla con una pieza de algodoacutenembebido en etanol al 70

3325 Se coloca la aguja en direccioacuten paralela a la vena se perfora la pielhaciendo avanzar la aguja entre 05 cm y 1 cm en el tejido subcutaacuteneose inserta el tubo al vaciacuteo por la parte posterior y no preocuparse porla cantidad de sangre extraiacuteda ya que el mismo sonido del vaciacuteo avisaraacuteque la extraccioacuten terminoacute (Fig 8)

3326 Retirar la ligadura tirando del extremo doblado

3327 Colocar un pedazo de algodoacuten seco sobre la parte donde se encuentraoculta la aguja Sacar la aguja con un movimiento raacutepido y depositarlaen el recipiente de metal con desinfectante (Fig 9)

3328 Pedir al paciente que presione firmemente el algodoacuten durante 3 minutoscon el brazo extendido No se recomienda que se flexione el brazoa causa del riesgo que se forme un hematoma

3329 Mezclar por inmersioacuten suave la sangre con el anticoagulante contenidoen el tubo No agitar el contenido

Fig 8 Fig 9

333 Ventajas de una extraccioacuten de sangre venosa

3331 Pueden hacerse repetidos exaacutemenes con la misma muestra

3332 Parte de la muestra (plasma o suero) puede congelarse para referenciafutura

334 Desventajas de una extraccioacuten de sangre venosa

3341 La puncioacuten venosa por su largo procedimiento requiere mayor preparacioacuten que el meacutetodo capilar

3342 El meacutetodo es teacutecnicamente difiacutecil en nintildeos individuos obesos y pacientes en shock

3343 La hemoacutelisis debe ser evitada pues se puede obtener una disminucioacuten en el recuento de eritrocitos

3344 Debe evitarse prolongada estasis venosa producida por el torniquete pues produce hemoacutelisis y otros cambios que ponen la sangre en un estado inadecuado para el anaacutelisis de gases recuentos celulares determinacioacuten de pH sanguiacuteneo y algunas pruebas de coagulacioacuten

3345 La sangre anticoagulada si no es de obtencioacuten reciente no debe ser utilizada en extensiones de sangre pues algunos anticoagulantes producen cambios en las plaquetas que pueden causar aglutinaciones agregacioacuten plaquetaria y dificultan la identificacioacuten de leucocitos

3346 Puesto que algunos de los componentes de la sangre no son estables los recuentos de leucocitos y plaquetas e iacutendice de sedimentacioacuten deben realizarse antes de que pasen dos horas desde que se obtuvo la muestra

34 OBTENCIOacuteN DE SANGRE DE LA VENA YUGULAR EXTERNA

341 Materiales requeridos

3411 Algodoacuten

3412 Alcohol al 70

3413 Jeringas de 5 mL

3414 Viales con anticoagulante EDTA

342 Obtencioacuten de la muestra

3421 El paciente es cubierto por una saacutebana de manera que los brazospermanezcan inmovilizados a lo largo del cuerpo

3422 Al paciente se le coloca de cuacutebito dorsal sobre la mesa de examen ouna

camilla de manera que la cabeza cuelgue sobre el final de lamesa y el cuerpo sea

sujetado por un asistente

3423 Cuando el paciente grita la vena yugular externa se marca claramente

3424 Limpiar la zona en un aacuterea de 2 pulgadas con alcohol al 70 o

alcoholyodado

3425 Se repiten los pasos de 3225 a 3227 de la extraccioacuten de sangrevenosa

con jeringa

3426 Retirar la aguja de la vena y presionar suavemente con un algodoacutenseco

aproximadamente de 3 a 5 minutos Pedir al paciente que permanezcaechado diez

minutos

3427 Se repiten los pasos de 3229

3428 Se repiten los pasos de 32210

343 Ventajas

Constituye un buen meacutetodo para la obtencioacuten de sangre en pacientes conshock

con venas colapsadas

344 Desventajas

Por lo delicado en su procedimiento no se recomienda como rutina soacutelo encasos

en que no se pueda obtener la muestra por meacutetodos convencionales

35 OBTENCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR

Cuando la cantidad de sangre que se precisa es muy pequentildea o cuando

pordiferentes motivos no pueda practicarse una puncioacuten venosa debe recurrirse

a la puncioacuten capilar

351 Materiales requeridos

3512 Algodoacuten

3513 Alcohol al 70

3514 Lancetas desechables (Fig 10)

3515 Papel filtro Nordm 2

352 Procedimiento (Fig 11)

3521 La sangre capilar se obtiene de la cara lateral del dedo medio o anularen los adultos y del dedo gordo del pie o taloacuten en los nintildeos

3522 Desinfectar la zona con alcohol al 70 secar con algodoacuten esteacuteril

3523 Punzar la piel con una lanceta esteacuteril desechable (2 mm de profundidad)

3524 Usar gasa esteacuteril para desechar la primera gota y recoger las siguientesen tubos capilares Evitar comprimir la extremidad para obtenersangre porque se altera la composicioacuten sanguiacutenea

353 Ventajas

3531 Puede obtenerse con facilidad

3532 Es preferible cuando han de realizarse extensiones de sangre perifeacuterica

354 Desventajas

3541 Soacutelo se pueden obtener pequentildeas cantidades de sangre y los exaacutemenesde repeticioacuten requieren nuevas muestras

3542 La sangre en microtubos (capilares) frecuentemente se hemolizainterfiendo con la mayoriacutea de pruebas de laboratorio

3543 Los resultados obtenidos en pruebas con sangre capilar no puedenser comparados con los resultados de las pruebas con sangre venosa

3544 El dedo no soacutelo es delicado sino difiacutecil de desinfectar adecuadamenteen el tiempo disponible

3545 En pacientes con resistencia disminuida a la infeccioacuten (aquellos conleucemia agranulocitosis diabetes uremia y enfermedades con deficienciasinmunoloacutegicas) una muestra tomada del dedo es mucho maacutesprobable que conduzca a una infeccioacuten que otra tomada del brazo

3546 El recuento de eritrocitos y leucocitos asiacute como el recuento deplaquetas y reticulocitos no debe realizarse en sangre capilar debidoa la difiacutecil estandarizacioacuten del flujo sanguiacuteneo capilar

EXTRACCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR

Fig 10

Fig 11

SECCIOacuteN 4

ANTICOAGULANTES

Una vez extraiacuteda la sangre eacutesta puede conservarse coagulada o

mantenidaincoagulable mediante la adicioacuten de un anticoagulante

41 CARACTERIacuteSTICAS BAacuteSICAS DE LOS ANTICOAGULANTES MAacuteS

USADOSEN HEMATOLOGIacuteA

bull No alterar el tamantildeo de los hematiacutees

bull No producir hemoacutelisis

bull Evitar al maacuteximo la agregacioacuten plaquetaria

bull No alterar la morfologiacutea de los leucocitos

La sangre tratada con anticoagulante debe procesarse lo antes posible

inclusomantenida bajo refrigeracioacuten (4 ordmC) si no pasan de las 2 horas El

tiempomaacuteximo entre la extraccioacuten de la sangre y su procesamiento depende

delcoagulante de eleccioacuten y no debe ser maacutes de 4 horas a excepcioacuten

delanticoagulante EDTA (etilendiaminotetraceacutetico) que puede ser hasta 24

horas(en refrigeracioacuten a 4 ordmC)

Los anticoagulantes pueden emplearse en forma soacutelida o liacutequida Los

primerosestaacuten indicados para la determinacioacuten de los paraacutemetros

hematoloacutegicosya que no producen como los anticoagulantes liacutequidos dilucioacuten de

la sangre

42 ANTICOAGULANTES SOacuteLIDOS

421 EDTA

Es la sal disoacutedica o tripotaacutesica del aacutecido etilendiaminotetraceacutetico La saldisoacutedica

(Na2EDTA) es menos soluble que la sal tripotaacutesica (K3EDTA) Estoscompuestos

realizan su accioacuten a traveacutes de un efecto quelante sobre el calcioal fijarlo impiden

su activacioacuten y por ende la coagulacioacuten sanguiacutenea

4211 Ventajas

bull Respeta la morfologiacutea eritrocitaria (especialmente la sal tripotaacutesica) yleucocitaria de manera que permite una demora de dos horas en la realizacioacutendel frotis sanguiacuteneo despueacutes de la extraccioacuten sanguiacutenea

bull Asegura la conservacioacuten de los elementos formes sanguiacuteneos durante 24horas si la sangre se mantiene a 4 ordmC

bull Al inhibir la aglutinacioacuten de las plaquetas facilita su recuento o su expresioacutensemicuantitativa a partir del frotis

bull La concentracioacuten recomendada de EDTA es de 15 mgmL de sangre Unamayor cantidad de anticoagulante puede producir retraccioacuten celular condisminucioacuten del hematocrito y un aumento de la concentracioacuten media de lahemoglobina Un exceso de sangre con relacioacuten al anticoagulante produceformacioacuten de microagregados que pueden alterar los resultados El empleode tubos al vaciacuteo con una gota (50mL) de EDTA tripotaacutesica comercialpara 5 mL de sangre es de intereacutes praacutectico dado que es cien veces maacutessoluble facilitando la mezcla de sangre con anticoagulante

4212 Desventajas

Usado en exceso afecta a los eritrocitos y a los leucocitos a los cuales les produce encogimiento y cambios en su forma por ello debe cuidarse de agregar la cantidad correcta de sangre al anticoagulante

422 Anticoagulante de Wintrobe

Es una mezcla de oxalato de amonio y potasio Actuacutea por precipitacioacuten del calcio es faacutecil de preparar Se emplea en forma de polvo en proporcioacuten de 2 de oxalato de amonio por 1 de oxalato de potasio La cantidad recomendada es de 2 mg x mL de sangre Este anticoagulante no afecta el volumen globular medio y puede usarse para determinaciones de hemoglobina hematocrito y recuento globular pero para los extendidos queda limitada a los primeros minutos tampoco es uacutetil para el recuento plaquetario porque produce formacioacuten de agregados plaquetarios

423 Heparina

El nombre de heparina proviene del griego hepar que significa hiacutegado ya que fue aislado por primera vez de las ceacutelulas de este tejido Es un mucopolisacaacuterido aacutecido Presenta el

inconveniente de que si no se agita raacutepidamente con la sangre despueacutes de extraiacuteda

pueden formarse microcoaacutegulos aunque no altera el volumeneritrocitario ni la morfologiacutea de los leucocitos No es recomendablepara el frotis sanguiacuteneo porque produce un fondo azul en la laacutemina

La heparina de sodio o litio puede usarse en forma soacutelida o liacutequida en

proporcioacutende 01 - 02 mg de heparina por 1 mL de sangre

43 ANTICOAGULANTES LIacuteQUIDOS

431 Citrato trisoacutedico

Es de eleccioacuten para las pruebas de hemostasia y la velocidad de sedimentacioacuten

Actuacutea a traveacutes de la precipitacioacuten del calcio La concentracioacuten depende de

la prueba por realizar

bull Para pruebas de hemostasia se emplea en proporcioacuten de 1 9 (05 mL

deanticoagulante para 45 mL de sangre total)

bull Para la determinacioacuten de la VSG (Velocidad de Sedimentacioacuten Globular) es14

(05 mL de anticoagulante para 2 mL de sangre)

432 Oxalato soacutedico

Recomendado tambieacuten para las pruebas de hemostasia Se emplea en

proporcioacutende un volumen de anticoagulante para 4 vol de sangre

SECCIOacuteN 5

REALIZACIOacuteN Y TINCIOacuteN DEL FROTIS SANGUIacuteNEO

La praacutectica del frotis sanguiacuteneo tambieacuten llamado extendido es de gran importanciaen hematologiacutea ya que el diagnoacutestico de muchas enfermedadeshematoloacutegicas puede realizarse con soacutelo observar las caracteriacutesticasmorfoloacutegicas de las ceacutelulas sanguiacuteneas de manera que eacuteste no debe serexcesivamente grueso ni excesivamente fino Todas las laacuteminas por usarsobre todo nuevas deben ser limpiadas con algodoacuten y alcohol al 70 paraeliminar la grasa que viene adherida

51 MEacuteTODO DE LOS DOS PORTAOBJETOS

511 Materiales

- Alcohol al 70

- Algodoacuten

- Lanceta descartable

- Portaobjetos de vidrios limpios y desgrasados (25 x 75 mm)

512 Fundamento

Consiste en la extensioacuten de una gota de sangre sobre un portaobjeto (25 x 75)empleando el canto biselado de otro portaobjeto de igual dimensioacuten (Fig 12)

513 Procedimiento

5131 Una vez extraiacuteda la sangre con cualquiera de las metodologiacuteas secoloca una pequentildea gota de sangre (5mL) (aprox 3 mm de diaacutemetro)sobre un portaobjeto a 2 cm aproximadamente de uno de los extremos

5132 Colocar el canto de otro portaobjeto esmerilado sobre la superficiedel primer portaobjeto (en la que se encuentra la gota de sangre)formando un aacutengulo de 45ordm

5134 Deslizar suavemente y a velocidad moderada el portaobjeto sobre elotro en sentido longitudinal hasta que la gota de sangre quede bienextendida sobre la

superficie del primer portaobjeto El grosor delfrotis sanguiacuteneo puede variar seguacuten sea el aacutengulo que formen entresiacute ambos portaobjetos Asiacute si es superior a 45ordm la extensioacuten obtenidaseraacute gruesa y corta si es inferior a 45ordm seraacute larga y fina El secado delfrotis es a temperatura ambiente y en posicioacuten horizontal

Fig 12

1048729 Zona excesivamente gruesa Se halla en la regioacuten inmediata al punto departida de la extensioacuten (cabeza) En ella se aprecia siempre un aumento delinfocitos

1048729 Zona excesivamente fina Corresponde al final de la extensioacuten y termina enun aacuterea donde las ceacutelulas adoptan una posicioacuten acartonada (barbas) Enesta regioacuten existe un exceso de granulocitos y monocitos

1048729 Zona ideal Corresponde a la regioacuten intermedia del frotis y en ella existe unreparto equilibrado de ceacutelulas

52 COLORACIONES USADAS

Una vez seco el frotis se procede a la tincioacuten hematoloacutegica con el colorante deRomanowsky constituido por la mezcla de eosina y azul de metileno Dentrode eacutestas tenemos

521 Colorante de Giemsa

522 Colorante de May-Grunwald

523 Colorante de Wright

524 Colorante de Leishman

Preparacioacuten de colorantes (Anexo A)

1048729 Para el estudio de las ceacutelulas sanguiacuteneas utilizar el colorante 523 y 524

1048729 Para el estudio de hemoparaacutesitos utilizar el colorante 521

1048729 Utilizar el colorante 522 para casos especiales en que se desee observar

con mayor claridad y especificidad los graacutenulos de los neutrofilos

53 TINCIOacuteN CON COLORANTE DE WRIGHT

531 Fundamento

El colorante de Wright va a permitir suministrar un medio para estudiar lasangre y determinar las variaciones y anormalidades de estructura forma ytamantildeo de los eritrocitos su contenido de hemoglobina y sus propiedades decoloracioacuten La informacioacuten obtenida de un frotis de sangre perifeacuterica dependeen gran parte de la calidad del extendido y la coloracioacuten

532 Materiales

5321 Colorante de Wright (Anexo A)

5322 Frasco gotero

5323 Solucioacuten amortiguada tamponada (Anexo A)

533 Procedimiento

5331 Una vez obtenido el frotis sanguiacuteneo se le dejaraacute secar entre 15 y 20minutos

5332 Luego se coloca la preparacioacuten en un soporte y se cubre con el colorantede Wright dejaacutendolo por espacio de 5 minutos

5333 Posteriormente se antildeade solucioacuten amortiguada tamponada en partesiguales hasta obtener un brillo metaacutelico dejando 6 minutos adicionales

5334 Finalmente se lava con agua corriente y se deja secar

5335 Se coloca en el microscopio y con pequentildeo aumento se revisa lacalidad de la coloracioacuten la cantidad aproximada de gloacutebulos blancosy se escoge el sitio para iniciar el recuento Se coloca una gota deaceite de inmersioacuten y se enfoca a un aumento de 100xLa forma de los gloacutebulos rojos se examinaraacute detenidamente observandoademaacutes del color (cantidad de hemoglobina) presencia deplaquetas su agrupacioacuten y distribucioacuten

5336 Posteriormente se hace el recuento diferencial de gloacutebulos blancosen 100

ceacutelulas para lo cual se deberaacute conocer las diferencias entreneutroacutefilos eosinoacutefilos

linfocitos y monocitosUna extensioacuten de sangre bien tentildeida debe caracterizarse

por unabuena diferenciacioacuten de las estructuras subcelulares en los leucocitosuna

coloracioacuten rosada de los hematiacutees y la ausencia de precipitados

Los defectos maacutes frecuentes observados en la tincioacuten del frotis sanguiacuteneoson

Coloracioacuten excesivamente azul debido a

1048729 Frotis excesivamente grueso

1048729 Lavado insuficiente

1048729 Tincioacuten muy prolongada

1048729 Empleo de colorante excesivamente alcalino

Coloracioacuten con una tonalidad rosada

1048729 El colorante el tampoacuten o el agua de lavado tienen un pH demasiadoaacutecido

Presencia de precipitados

1048729 Obedecen a una accioacuten excesiva del colorante Esto se puede evitarcon la

filtracioacuten

SECCIOacuteN 6

HEMOGRAMA-HEMOGLOBINA-HEMATOCRITO

El hemograma de Shilling constituye uno de los exaacutemenes de laboratorio

maacutesusados en el campo de la hematologiacutea Comprende las siguientes pruebas

61 RECUENTO LEUCOCITARIO

Principio

La sangre anticoagulada se deposita en un liacutequido que permite evidenciar

losleucocitos mantenieacutendolos visibles mientras que los eritrocitos

sonhemolizados El recuento del nuacutemero de leucocitos o gloacutebulos blancos se

expresapor mm3 (miliacutemetro cuacutebico)

611 Equipos

- Microscopio

- Hemocitoacutemetro (Caacutemara de Neubauer)

Consta de los siguientes elementos

diams Una laacutemina portaobjeto gruesa en el centro se hallan dos

superficiescuadriculadas iguales separadas del resto de la laacutemina por surcos y

dosbarras transversales algo maacutes elevadas

diams Una laminilla cubreobjetos oacutepticamente plana que al colocarse sobrelas barras

elevadas de la laacutemina forma una caacutemara entre el cubreobjetosy la superficie

cuadriculadaLa altura entre el cubreobjetos y la laacutemina portaobjetos es de 01

mmCada cuadriacutecula mide 3 mm de lado y se divide en 9 cuadrados grandesCada

uno de los cuales mide 1 mm2 de superficie que se subdivide a suvez en 16

cuadrados medianos El cuadrado grande central se divide en25 cuadrados

pequentildeos y cada uno de ellos en 16 cuadraditos Cadacuadrado pequentildeo mide

02 mm de lado (004 mm2 de superficie) y cadacuadradito mide 005 mm de lado

(00025 mm2 de superficie)

612 Materiales y reactivos requeridos

6121 Pipeta de gloacutebulos blancos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0 a 100 mL)Presenta cerca del extremo superior una marca de 11 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla que funciona comomezcladora luego sigue el extremo maacutes largo de la pipeta (tallo) que estaacutedividida en 10 partes con 2 marcas 1 (parte final del bulbo) y 05 (a la mitaddel tallo) Se le acopla a su extremo superior 1 tubo de goma y una bombillapara aspirar

6122 Diluyente de gloacutebulos blancos Solucioacuten de Turk al 1

6123 Contador manual (Soacutelo si fuera necesario)

6124 Papel filtro

613 Procedimiento

6131 Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar deldedo se procede a aspirar la sangre con la pipeta de gloacutebulos blancoshasta la marca de 05 y a limpiar la punta con papel absorbente

6132 Introducir la pipeta en el tubo que contenga solucioacuten de Turk y absorberhasta la marca de 11 (no debe haber burbujas)

6133 Tapar ambos extremos y proceder a mezclar manualmente o en unrotador automaacutetico por 2 oacute 3 minutos

6134 Monte la laminilla de vidrio en la caacutemara para recuento que debe estarlimpia y seca

6135 Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocaruna gota pequentildea de esta solucioacuten en la caacutemara

6136 Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las ceacutelulas se sedimenten

6137 Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angularesCuando se usa la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002 mL) desangre total con anticoagulante o sangre capilar con anticoagulante yse diluye en un tubo que contenga 380 mL de solucioacuten de Turk (aquiacutetenemos una dilucioacuten 120)

LECTURA

Fig 13

La lectura se realiza en los campos 1 3 7 y 9 como estaacute indicado en la figuraAdemaacutes de los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes sedeben contar todos los leucocitos que se encuentren adheridos en la liacuteneahorizontal superior y vertical exterior o de lo contrario todos los leucocitosadheridos a la liacutenea horizontal inferior y vertical interior

614 Resultados

Nordm de leucocitos x mm3 = leucocitos contados en 4 camposdividealtura x dilucioacuten x aacuterea

Reemplazando = leucocitos contados en 4 camposdivide110 x 120 x 4=

Leucocitos contados en 4 camposdivide4200=

X1 divide4200= Nordm leucocitos contados x 50

615 Valores de referencia

5000 - 10 000 leucocitos mm3

616 Correccioacuten de valores para restar eritrocitos nucleados

Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el liacutequido de dilucioacuten por lo tantopueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con losleucocitos de tal manera que se debe emplear la siguiente foacutermula

Caacutelculo

La concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos (por litro) esNuacutemero de normoblatos contados x concentracioacuten o nuacutemero de leucocitos100 + Nordm de normoblastos contados

Ejemplo

Si se cuentan 50 normoblastos y la concentracioacuten del nuacutemero de leucocitos es16 x 109l la concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos seraacute

50 x16 = 53 x 109l

100 + 50

y la concentracioacuten de leucocitos corregida seraacute 16 - 53 = 107 x 109lEn unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitosse expresan por miliacutemetro cuacutebico En tales unidades el caacutelculo correspondienteal ejemplo que se ha dado seriacutea

50 x 16 000 = 5300 mm3

100 + 50

Recuento corregido de gloacutebulos blancos o leucocitos = 16 000 - 5300 = 10 700 mm3

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

62 RECUENTO DE GLOacuteBULOS ROJOS

Principio

La sangre se diluye en un liacutequido que nos permite observar claramente loshematiacutees luego esta dilucioacuten se coloca en una caacutemara de Neubauer con laayuda de una pipeta automaacutetica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopioa un objetivo de 40x para calcular el nuacutemero de gloacutebulos rojos por mm3

621 Equipos

- Microscopio

- Hemocitoacutemetro (caacutemara de Neubauer)

622 Materiales y reactivos requeridos

6221 Pipeta de gloacutebulos rojos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0-100 mL)

Presenta cerca del extremo superior una marca de 101 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla roja mezcladoraluego sigue el tallo (extremo maacutes largo) el cual estaacute dividido en 10 partescon 2 marcas 1 acabando el bulbo y 05 a la mitad del tallo Se requiereigual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar

6222 Diluyente de gloacutebulos rojos Cloruro de Sodio al 09 (ver anexo)

Diluyente de Hayem (ver anexo)

6223 Contador manual (soacutelo si fuera necesario)

6224 Papel filtro

623 Procedimiento

6231 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar

6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente

6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101

6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos

6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente

6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas

6237 Dejar en reposo por 3 minutos

6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)

6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos

LECTURA

Fig 14

624 Resultados

Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea

Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15

= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000

= hematiacutees contados x 10 000

625 Valores de referencia

(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)

Hombres 4 500 000 - 5 500 000

Mujeres 4 000 000 - 5 000 000

Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000

Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000

Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)

Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal

volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen

porcentaje o como valor decimal

Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre

total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)

631 Meacutetodo de Wintrobe

Materiales requeridos

- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm

- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia

- Tapoacuten de goma

Procedimiento

diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur

comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado

de no provocar espuma

diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten

diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos

Resultados (lectura)

Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos

Valores de referencia

Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

632 Meacutetodo de microhematocrito

Materiales requeridos

- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)

- Plastilina

Procedimiento

diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel

dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon

anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80

del capilar

diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina

diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma

diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm

Resultados (lectura)

La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio

Uso de la escala

diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero

diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la

columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical

diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos

Valores de referencia

Hombres 40 - 50

Mujeres 38 - 44

Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44

Lactantes (3 meses) 37 - 42

Recieacuten nacidos 50 - 58

La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)

64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA

Principio

La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre

641 Materiales y reactivos

6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro

6412 Pipetas

diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla

diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL

6413 Tubos de ensayo

6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten

Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia

MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD

21 Para la obtencioacuten de muestras el personal involucrado en los diferentesprocesos para los exaacutemenes hematoloacutegicos debe aplicar las medidas debioseguridad establecidas en el Manual de Bioseguridad Serie de NormasTeacutecnicas Nordm 18

22 Se debe controlar sobre todo

221 Al personal que trabaja en el laboratorio de hematologiacutea

222 El proceso de coloracioacuten en el que se debe aplicar las medidas debioseguridad correspondientes al uso y manipulacioacuten de sustanciastoacutexicas o canceriacutegenas

223 Ver lo referente a medidas de proteccioacuten en caso de accidentes porinoculacioacuten

SECCIOacuteN 3

OBTENCIOacuteN DE MUESTRAS SANGUIacuteNEAS

31 OBJETIVO

Establecer y uniformizar criterios en el procedimiento de obtencioacuten de muestrassanguiacuteneas con un adecuado control de calidad ya que de ello dependeque el resultado del anaacutelisis de la muestra sea el correcto Se efectuaraacute enayunas o no dependiendo de la prueba a usar

32 OBTENCIOacuteN DE SANGRE VENOSA CON JERINGA

321 Materiales y equipos requeridos

3211 Algodoacuten

3212 Alcohol al 70

3213 Ligadura o torniquete de 25 a 30 cm de largo

3214 Jeringas de 5 mL

3215 Viales con anticoagulante EDTA

322 Obtencioacuten de la muestra

3221 Verificar que los elementos por utilizar esteacuten listos y que el pacientese sienta coacutemodo

3222 Aplicar el torniquete aproximadamente cuatro dedos por encima de laflexioacuten del codo o a 10 cm del codo sujetar con un medio nudo (Fig 1)

3223 Limpiar la zona con alcohol al 70 o alcohol yodado en un aacuterea de 2pulgadas (Fig 2)

3224 El paciente deberaacute abrir y cerrar la mano durante unos segundos ydespueacutes la mantendraacute cerrada esto ayudaraacute a visualizar las venassuperficiales (Fig 3)

3225 Se retira el estuche protector de la aguja y se coge la jeringa de talmanera que el bisel se encuentre hacia arriba (Fig 4)

3226 Se coloca la aguja en direccioacuten paralela a la vena se perfora la pielhaciendo avanzar la aguja 05-1 cm en el tejido subcutaacuteneo luego seperfora la vena (Fig 5)

3227 Se aspira la jeringa hasta el volumen requerido

3228 Retirar el torniquete e indicar al paciente que deje de hacer puntildeo Secoloca el algodoacuten seco encima de la puncioacuten y se retira la aguja (Fig 6)

3229 Retirar la aguja de la jeringa Verter la muestra lentamente por lasparedes del vial con anticoagulante No olvidar colocar una gota en lalaacutemina portaobjeto para realizar el frotis

32210 Agitar el vial en ciacuterculos sobre la mesa para homogeneizar la muestracon el anticoagulante

PUNTOS PARA LA EXTRACCIOacuteN DE SANGRE

(Toma de muestra)

Se obtiene de las venas de la fosa cubital

PROCEDIMIENTO

Fig 1 Fig 2 Fig 3

Fig 4 Fig 5

Fig 6 Fig 7

33 OBTENCIOacuteN DE SANGRE VENOSA EN TUBOS AL VACIacuteO

331 Materiales requeridos

3311 Algodoacuten

3312 Alcohol al 70

3313 Ligadura o torniquete de 25 a 30 cm de largo

3314 Tubos al vaciacuteo con anticoagulante EDTA (K3) EDTA (Na2) u otroanticoagulante

3315 Agujas con dispositivo para extraccioacuten de sangre al vaciacuteo

- Nordm 21 para adultos

- Nordm 22 para nintildeos y neonatos

De preferencia ambas de bisel corto para evitar la coagulacioacuten

332 Obtencioacuten de la muestra

3321 Repetir los pasos de 3221 a 3224

3322 Se retira el estuche protector de la aguja y eacuteste se enrosca al dispositivopara extraccioacuten de sangre al vaciacuteo

3323 Colocar la ligadura cuatro dedos por encima de la flexioacuten del codo o10 cm por encima de eacuteste y pedir al paciente que abra y cierre la manovarias veces para favorecer la dilatacioacuten de las venas

3324 Una vez escogida la vena desinfectarla con una pieza de algodoacutenembebido en etanol al 70

3325 Se coloca la aguja en direccioacuten paralela a la vena se perfora la pielhaciendo avanzar la aguja entre 05 cm y 1 cm en el tejido subcutaacuteneose inserta el tubo al vaciacuteo por la parte posterior y no preocuparse porla cantidad de sangre extraiacuteda ya que el mismo sonido del vaciacuteo avisaraacuteque la extraccioacuten terminoacute (Fig 8)

3326 Retirar la ligadura tirando del extremo doblado

3327 Colocar un pedazo de algodoacuten seco sobre la parte donde se encuentraoculta la aguja Sacar la aguja con un movimiento raacutepido y depositarlaen el recipiente de metal con desinfectante (Fig 9)

3328 Pedir al paciente que presione firmemente el algodoacuten durante 3 minutoscon el brazo extendido No se recomienda que se flexione el brazoa causa del riesgo que se forme un hematoma

3329 Mezclar por inmersioacuten suave la sangre con el anticoagulante contenidoen el tubo No agitar el contenido

Fig 8 Fig 9

333 Ventajas de una extraccioacuten de sangre venosa

3331 Pueden hacerse repetidos exaacutemenes con la misma muestra

3332 Parte de la muestra (plasma o suero) puede congelarse para referenciafutura

334 Desventajas de una extraccioacuten de sangre venosa

3341 La puncioacuten venosa por su largo procedimiento requiere mayor preparacioacuten que el meacutetodo capilar

3342 El meacutetodo es teacutecnicamente difiacutecil en nintildeos individuos obesos y pacientes en shock

3343 La hemoacutelisis debe ser evitada pues se puede obtener una disminucioacuten en el recuento de eritrocitos

3344 Debe evitarse prolongada estasis venosa producida por el torniquete pues produce hemoacutelisis y otros cambios que ponen la sangre en un estado inadecuado para el anaacutelisis de gases recuentos celulares determinacioacuten de pH sanguiacuteneo y algunas pruebas de coagulacioacuten

3345 La sangre anticoagulada si no es de obtencioacuten reciente no debe ser utilizada en extensiones de sangre pues algunos anticoagulantes producen cambios en las plaquetas que pueden causar aglutinaciones agregacioacuten plaquetaria y dificultan la identificacioacuten de leucocitos

3346 Puesto que algunos de los componentes de la sangre no son estables los recuentos de leucocitos y plaquetas e iacutendice de sedimentacioacuten deben realizarse antes de que pasen dos horas desde que se obtuvo la muestra

34 OBTENCIOacuteN DE SANGRE DE LA VENA YUGULAR EXTERNA

341 Materiales requeridos

3411 Algodoacuten

3412 Alcohol al 70

3413 Jeringas de 5 mL

3414 Viales con anticoagulante EDTA

342 Obtencioacuten de la muestra

3421 El paciente es cubierto por una saacutebana de manera que los brazospermanezcan inmovilizados a lo largo del cuerpo

3422 Al paciente se le coloca de cuacutebito dorsal sobre la mesa de examen ouna

camilla de manera que la cabeza cuelgue sobre el final de lamesa y el cuerpo sea

sujetado por un asistente

3423 Cuando el paciente grita la vena yugular externa se marca claramente

3424 Limpiar la zona en un aacuterea de 2 pulgadas con alcohol al 70 o

alcoholyodado

3425 Se repiten los pasos de 3225 a 3227 de la extraccioacuten de sangrevenosa

con jeringa

3426 Retirar la aguja de la vena y presionar suavemente con un algodoacutenseco

aproximadamente de 3 a 5 minutos Pedir al paciente que permanezcaechado diez

minutos

3427 Se repiten los pasos de 3229

3428 Se repiten los pasos de 32210

343 Ventajas

Constituye un buen meacutetodo para la obtencioacuten de sangre en pacientes conshock

con venas colapsadas

344 Desventajas

Por lo delicado en su procedimiento no se recomienda como rutina soacutelo encasos

en que no se pueda obtener la muestra por meacutetodos convencionales

35 OBTENCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR

Cuando la cantidad de sangre que se precisa es muy pequentildea o cuando

pordiferentes motivos no pueda practicarse una puncioacuten venosa debe recurrirse

a la puncioacuten capilar

351 Materiales requeridos

3512 Algodoacuten

3513 Alcohol al 70

3514 Lancetas desechables (Fig 10)

3515 Papel filtro Nordm 2

352 Procedimiento (Fig 11)

3521 La sangre capilar se obtiene de la cara lateral del dedo medio o anularen los adultos y del dedo gordo del pie o taloacuten en los nintildeos

3522 Desinfectar la zona con alcohol al 70 secar con algodoacuten esteacuteril

3523 Punzar la piel con una lanceta esteacuteril desechable (2 mm de profundidad)

3524 Usar gasa esteacuteril para desechar la primera gota y recoger las siguientesen tubos capilares Evitar comprimir la extremidad para obtenersangre porque se altera la composicioacuten sanguiacutenea

353 Ventajas

3531 Puede obtenerse con facilidad

3532 Es preferible cuando han de realizarse extensiones de sangre perifeacuterica

354 Desventajas

3541 Soacutelo se pueden obtener pequentildeas cantidades de sangre y los exaacutemenesde repeticioacuten requieren nuevas muestras

3542 La sangre en microtubos (capilares) frecuentemente se hemolizainterfiendo con la mayoriacutea de pruebas de laboratorio

3543 Los resultados obtenidos en pruebas con sangre capilar no puedenser comparados con los resultados de las pruebas con sangre venosa

3544 El dedo no soacutelo es delicado sino difiacutecil de desinfectar adecuadamenteen el tiempo disponible

3545 En pacientes con resistencia disminuida a la infeccioacuten (aquellos conleucemia agranulocitosis diabetes uremia y enfermedades con deficienciasinmunoloacutegicas) una muestra tomada del dedo es mucho maacutesprobable que conduzca a una infeccioacuten que otra tomada del brazo

3546 El recuento de eritrocitos y leucocitos asiacute como el recuento deplaquetas y reticulocitos no debe realizarse en sangre capilar debidoa la difiacutecil estandarizacioacuten del flujo sanguiacuteneo capilar

EXTRACCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR

Fig 10

Fig 11

SECCIOacuteN 4

ANTICOAGULANTES

Una vez extraiacuteda la sangre eacutesta puede conservarse coagulada o

mantenidaincoagulable mediante la adicioacuten de un anticoagulante

41 CARACTERIacuteSTICAS BAacuteSICAS DE LOS ANTICOAGULANTES MAacuteS

USADOSEN HEMATOLOGIacuteA

bull No alterar el tamantildeo de los hematiacutees

bull No producir hemoacutelisis

bull Evitar al maacuteximo la agregacioacuten plaquetaria

bull No alterar la morfologiacutea de los leucocitos

La sangre tratada con anticoagulante debe procesarse lo antes posible

inclusomantenida bajo refrigeracioacuten (4 ordmC) si no pasan de las 2 horas El

tiempomaacuteximo entre la extraccioacuten de la sangre y su procesamiento depende

delcoagulante de eleccioacuten y no debe ser maacutes de 4 horas a excepcioacuten

delanticoagulante EDTA (etilendiaminotetraceacutetico) que puede ser hasta 24

horas(en refrigeracioacuten a 4 ordmC)

Los anticoagulantes pueden emplearse en forma soacutelida o liacutequida Los

primerosestaacuten indicados para la determinacioacuten de los paraacutemetros

hematoloacutegicosya que no producen como los anticoagulantes liacutequidos dilucioacuten de

la sangre

42 ANTICOAGULANTES SOacuteLIDOS

421 EDTA

Es la sal disoacutedica o tripotaacutesica del aacutecido etilendiaminotetraceacutetico La saldisoacutedica

(Na2EDTA) es menos soluble que la sal tripotaacutesica (K3EDTA) Estoscompuestos

realizan su accioacuten a traveacutes de un efecto quelante sobre el calcioal fijarlo impiden

su activacioacuten y por ende la coagulacioacuten sanguiacutenea

4211 Ventajas

bull Respeta la morfologiacutea eritrocitaria (especialmente la sal tripotaacutesica) yleucocitaria de manera que permite una demora de dos horas en la realizacioacutendel frotis sanguiacuteneo despueacutes de la extraccioacuten sanguiacutenea

bull Asegura la conservacioacuten de los elementos formes sanguiacuteneos durante 24horas si la sangre se mantiene a 4 ordmC

bull Al inhibir la aglutinacioacuten de las plaquetas facilita su recuento o su expresioacutensemicuantitativa a partir del frotis

bull La concentracioacuten recomendada de EDTA es de 15 mgmL de sangre Unamayor cantidad de anticoagulante puede producir retraccioacuten celular condisminucioacuten del hematocrito y un aumento de la concentracioacuten media de lahemoglobina Un exceso de sangre con relacioacuten al anticoagulante produceformacioacuten de microagregados que pueden alterar los resultados El empleode tubos al vaciacuteo con una gota (50mL) de EDTA tripotaacutesica comercialpara 5 mL de sangre es de intereacutes praacutectico dado que es cien veces maacutessoluble facilitando la mezcla de sangre con anticoagulante

4212 Desventajas

Usado en exceso afecta a los eritrocitos y a los leucocitos a los cuales les produce encogimiento y cambios en su forma por ello debe cuidarse de agregar la cantidad correcta de sangre al anticoagulante

422 Anticoagulante de Wintrobe

Es una mezcla de oxalato de amonio y potasio Actuacutea por precipitacioacuten del calcio es faacutecil de preparar Se emplea en forma de polvo en proporcioacuten de 2 de oxalato de amonio por 1 de oxalato de potasio La cantidad recomendada es de 2 mg x mL de sangre Este anticoagulante no afecta el volumen globular medio y puede usarse para determinaciones de hemoglobina hematocrito y recuento globular pero para los extendidos queda limitada a los primeros minutos tampoco es uacutetil para el recuento plaquetario porque produce formacioacuten de agregados plaquetarios

423 Heparina

El nombre de heparina proviene del griego hepar que significa hiacutegado ya que fue aislado por primera vez de las ceacutelulas de este tejido Es un mucopolisacaacuterido aacutecido Presenta el

inconveniente de que si no se agita raacutepidamente con la sangre despueacutes de extraiacuteda

pueden formarse microcoaacutegulos aunque no altera el volumeneritrocitario ni la morfologiacutea de los leucocitos No es recomendablepara el frotis sanguiacuteneo porque produce un fondo azul en la laacutemina

La heparina de sodio o litio puede usarse en forma soacutelida o liacutequida en

proporcioacutende 01 - 02 mg de heparina por 1 mL de sangre

43 ANTICOAGULANTES LIacuteQUIDOS

431 Citrato trisoacutedico

Es de eleccioacuten para las pruebas de hemostasia y la velocidad de sedimentacioacuten

Actuacutea a traveacutes de la precipitacioacuten del calcio La concentracioacuten depende de

la prueba por realizar

bull Para pruebas de hemostasia se emplea en proporcioacuten de 1 9 (05 mL

deanticoagulante para 45 mL de sangre total)

bull Para la determinacioacuten de la VSG (Velocidad de Sedimentacioacuten Globular) es14

(05 mL de anticoagulante para 2 mL de sangre)

432 Oxalato soacutedico

Recomendado tambieacuten para las pruebas de hemostasia Se emplea en

proporcioacutende un volumen de anticoagulante para 4 vol de sangre

SECCIOacuteN 5

REALIZACIOacuteN Y TINCIOacuteN DEL FROTIS SANGUIacuteNEO

La praacutectica del frotis sanguiacuteneo tambieacuten llamado extendido es de gran importanciaen hematologiacutea ya que el diagnoacutestico de muchas enfermedadeshematoloacutegicas puede realizarse con soacutelo observar las caracteriacutesticasmorfoloacutegicas de las ceacutelulas sanguiacuteneas de manera que eacuteste no debe serexcesivamente grueso ni excesivamente fino Todas las laacuteminas por usarsobre todo nuevas deben ser limpiadas con algodoacuten y alcohol al 70 paraeliminar la grasa que viene adherida

51 MEacuteTODO DE LOS DOS PORTAOBJETOS

511 Materiales

- Alcohol al 70

- Algodoacuten

- Lanceta descartable

- Portaobjetos de vidrios limpios y desgrasados (25 x 75 mm)

512 Fundamento

Consiste en la extensioacuten de una gota de sangre sobre un portaobjeto (25 x 75)empleando el canto biselado de otro portaobjeto de igual dimensioacuten (Fig 12)

513 Procedimiento

5131 Una vez extraiacuteda la sangre con cualquiera de las metodologiacuteas secoloca una pequentildea gota de sangre (5mL) (aprox 3 mm de diaacutemetro)sobre un portaobjeto a 2 cm aproximadamente de uno de los extremos

5132 Colocar el canto de otro portaobjeto esmerilado sobre la superficiedel primer portaobjeto (en la que se encuentra la gota de sangre)formando un aacutengulo de 45ordm

5134 Deslizar suavemente y a velocidad moderada el portaobjeto sobre elotro en sentido longitudinal hasta que la gota de sangre quede bienextendida sobre la

superficie del primer portaobjeto El grosor delfrotis sanguiacuteneo puede variar seguacuten sea el aacutengulo que formen entresiacute ambos portaobjetos Asiacute si es superior a 45ordm la extensioacuten obtenidaseraacute gruesa y corta si es inferior a 45ordm seraacute larga y fina El secado delfrotis es a temperatura ambiente y en posicioacuten horizontal

Fig 12

1048729 Zona excesivamente gruesa Se halla en la regioacuten inmediata al punto departida de la extensioacuten (cabeza) En ella se aprecia siempre un aumento delinfocitos

1048729 Zona excesivamente fina Corresponde al final de la extensioacuten y termina enun aacuterea donde las ceacutelulas adoptan una posicioacuten acartonada (barbas) Enesta regioacuten existe un exceso de granulocitos y monocitos

1048729 Zona ideal Corresponde a la regioacuten intermedia del frotis y en ella existe unreparto equilibrado de ceacutelulas

52 COLORACIONES USADAS

Una vez seco el frotis se procede a la tincioacuten hematoloacutegica con el colorante deRomanowsky constituido por la mezcla de eosina y azul de metileno Dentrode eacutestas tenemos

521 Colorante de Giemsa

522 Colorante de May-Grunwald

523 Colorante de Wright

524 Colorante de Leishman

Preparacioacuten de colorantes (Anexo A)

1048729 Para el estudio de las ceacutelulas sanguiacuteneas utilizar el colorante 523 y 524

1048729 Para el estudio de hemoparaacutesitos utilizar el colorante 521

1048729 Utilizar el colorante 522 para casos especiales en que se desee observar

con mayor claridad y especificidad los graacutenulos de los neutrofilos

53 TINCIOacuteN CON COLORANTE DE WRIGHT

531 Fundamento

El colorante de Wright va a permitir suministrar un medio para estudiar lasangre y determinar las variaciones y anormalidades de estructura forma ytamantildeo de los eritrocitos su contenido de hemoglobina y sus propiedades decoloracioacuten La informacioacuten obtenida de un frotis de sangre perifeacuterica dependeen gran parte de la calidad del extendido y la coloracioacuten

532 Materiales

5321 Colorante de Wright (Anexo A)

5322 Frasco gotero

5323 Solucioacuten amortiguada tamponada (Anexo A)

533 Procedimiento

5331 Una vez obtenido el frotis sanguiacuteneo se le dejaraacute secar entre 15 y 20minutos

5332 Luego se coloca la preparacioacuten en un soporte y se cubre con el colorantede Wright dejaacutendolo por espacio de 5 minutos

5333 Posteriormente se antildeade solucioacuten amortiguada tamponada en partesiguales hasta obtener un brillo metaacutelico dejando 6 minutos adicionales

5334 Finalmente se lava con agua corriente y se deja secar

5335 Se coloca en el microscopio y con pequentildeo aumento se revisa lacalidad de la coloracioacuten la cantidad aproximada de gloacutebulos blancosy se escoge el sitio para iniciar el recuento Se coloca una gota deaceite de inmersioacuten y se enfoca a un aumento de 100xLa forma de los gloacutebulos rojos se examinaraacute detenidamente observandoademaacutes del color (cantidad de hemoglobina) presencia deplaquetas su agrupacioacuten y distribucioacuten

5336 Posteriormente se hace el recuento diferencial de gloacutebulos blancosen 100

ceacutelulas para lo cual se deberaacute conocer las diferencias entreneutroacutefilos eosinoacutefilos

linfocitos y monocitosUna extensioacuten de sangre bien tentildeida debe caracterizarse

por unabuena diferenciacioacuten de las estructuras subcelulares en los leucocitosuna

coloracioacuten rosada de los hematiacutees y la ausencia de precipitados

Los defectos maacutes frecuentes observados en la tincioacuten del frotis sanguiacuteneoson

Coloracioacuten excesivamente azul debido a

1048729 Frotis excesivamente grueso

1048729 Lavado insuficiente

1048729 Tincioacuten muy prolongada

1048729 Empleo de colorante excesivamente alcalino

Coloracioacuten con una tonalidad rosada

1048729 El colorante el tampoacuten o el agua de lavado tienen un pH demasiadoaacutecido

Presencia de precipitados

1048729 Obedecen a una accioacuten excesiva del colorante Esto se puede evitarcon la

filtracioacuten

SECCIOacuteN 6

HEMOGRAMA-HEMOGLOBINA-HEMATOCRITO

El hemograma de Shilling constituye uno de los exaacutemenes de laboratorio

maacutesusados en el campo de la hematologiacutea Comprende las siguientes pruebas

61 RECUENTO LEUCOCITARIO

Principio

La sangre anticoagulada se deposita en un liacutequido que permite evidenciar

losleucocitos mantenieacutendolos visibles mientras que los eritrocitos

sonhemolizados El recuento del nuacutemero de leucocitos o gloacutebulos blancos se

expresapor mm3 (miliacutemetro cuacutebico)

611 Equipos

- Microscopio

- Hemocitoacutemetro (Caacutemara de Neubauer)

Consta de los siguientes elementos

diams Una laacutemina portaobjeto gruesa en el centro se hallan dos

superficiescuadriculadas iguales separadas del resto de la laacutemina por surcos y

dosbarras transversales algo maacutes elevadas

diams Una laminilla cubreobjetos oacutepticamente plana que al colocarse sobrelas barras

elevadas de la laacutemina forma una caacutemara entre el cubreobjetosy la superficie

cuadriculadaLa altura entre el cubreobjetos y la laacutemina portaobjetos es de 01

mmCada cuadriacutecula mide 3 mm de lado y se divide en 9 cuadrados grandesCada

uno de los cuales mide 1 mm2 de superficie que se subdivide a suvez en 16

cuadrados medianos El cuadrado grande central se divide en25 cuadrados

pequentildeos y cada uno de ellos en 16 cuadraditos Cadacuadrado pequentildeo mide

02 mm de lado (004 mm2 de superficie) y cadacuadradito mide 005 mm de lado

(00025 mm2 de superficie)

612 Materiales y reactivos requeridos

6121 Pipeta de gloacutebulos blancos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0 a 100 mL)Presenta cerca del extremo superior una marca de 11 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla que funciona comomezcladora luego sigue el extremo maacutes largo de la pipeta (tallo) que estaacutedividida en 10 partes con 2 marcas 1 (parte final del bulbo) y 05 (a la mitaddel tallo) Se le acopla a su extremo superior 1 tubo de goma y una bombillapara aspirar

6122 Diluyente de gloacutebulos blancos Solucioacuten de Turk al 1

6123 Contador manual (Soacutelo si fuera necesario)

6124 Papel filtro

613 Procedimiento

6131 Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar deldedo se procede a aspirar la sangre con la pipeta de gloacutebulos blancoshasta la marca de 05 y a limpiar la punta con papel absorbente

6132 Introducir la pipeta en el tubo que contenga solucioacuten de Turk y absorberhasta la marca de 11 (no debe haber burbujas)

6133 Tapar ambos extremos y proceder a mezclar manualmente o en unrotador automaacutetico por 2 oacute 3 minutos

6134 Monte la laminilla de vidrio en la caacutemara para recuento que debe estarlimpia y seca

6135 Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocaruna gota pequentildea de esta solucioacuten en la caacutemara

6136 Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las ceacutelulas se sedimenten

6137 Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angularesCuando se usa la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002 mL) desangre total con anticoagulante o sangre capilar con anticoagulante yse diluye en un tubo que contenga 380 mL de solucioacuten de Turk (aquiacutetenemos una dilucioacuten 120)

LECTURA

Fig 13

La lectura se realiza en los campos 1 3 7 y 9 como estaacute indicado en la figuraAdemaacutes de los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes sedeben contar todos los leucocitos que se encuentren adheridos en la liacuteneahorizontal superior y vertical exterior o de lo contrario todos los leucocitosadheridos a la liacutenea horizontal inferior y vertical interior

614 Resultados

Nordm de leucocitos x mm3 = leucocitos contados en 4 camposdividealtura x dilucioacuten x aacuterea

Reemplazando = leucocitos contados en 4 camposdivide110 x 120 x 4=

Leucocitos contados en 4 camposdivide4200=

X1 divide4200= Nordm leucocitos contados x 50

615 Valores de referencia

5000 - 10 000 leucocitos mm3

616 Correccioacuten de valores para restar eritrocitos nucleados

Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el liacutequido de dilucioacuten por lo tantopueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con losleucocitos de tal manera que se debe emplear la siguiente foacutermula

Caacutelculo

La concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos (por litro) esNuacutemero de normoblatos contados x concentracioacuten o nuacutemero de leucocitos100 + Nordm de normoblastos contados

Ejemplo

Si se cuentan 50 normoblastos y la concentracioacuten del nuacutemero de leucocitos es16 x 109l la concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos seraacute

50 x16 = 53 x 109l

100 + 50

y la concentracioacuten de leucocitos corregida seraacute 16 - 53 = 107 x 109lEn unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitosse expresan por miliacutemetro cuacutebico En tales unidades el caacutelculo correspondienteal ejemplo que se ha dado seriacutea

50 x 16 000 = 5300 mm3

100 + 50

Recuento corregido de gloacutebulos blancos o leucocitos = 16 000 - 5300 = 10 700 mm3

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

62 RECUENTO DE GLOacuteBULOS ROJOS

Principio

La sangre se diluye en un liacutequido que nos permite observar claramente loshematiacutees luego esta dilucioacuten se coloca en una caacutemara de Neubauer con laayuda de una pipeta automaacutetica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopioa un objetivo de 40x para calcular el nuacutemero de gloacutebulos rojos por mm3

621 Equipos

- Microscopio

- Hemocitoacutemetro (caacutemara de Neubauer)

622 Materiales y reactivos requeridos

6221 Pipeta de gloacutebulos rojos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0-100 mL)

Presenta cerca del extremo superior una marca de 101 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla roja mezcladoraluego sigue el tallo (extremo maacutes largo) el cual estaacute dividido en 10 partescon 2 marcas 1 acabando el bulbo y 05 a la mitad del tallo Se requiereigual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar

6222 Diluyente de gloacutebulos rojos Cloruro de Sodio al 09 (ver anexo)

Diluyente de Hayem (ver anexo)

6223 Contador manual (soacutelo si fuera necesario)

6224 Papel filtro

623 Procedimiento

6231 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar

6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente

6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101

6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos

6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente

6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas

6237 Dejar en reposo por 3 minutos

6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)

6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos

LECTURA

Fig 14

624 Resultados

Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea

Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15

= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000

= hematiacutees contados x 10 000

625 Valores de referencia

(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)

Hombres 4 500 000 - 5 500 000

Mujeres 4 000 000 - 5 000 000

Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000

Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000

Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)

Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal

volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen

porcentaje o como valor decimal

Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre

total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)

631 Meacutetodo de Wintrobe

Materiales requeridos

- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm

- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia

- Tapoacuten de goma

Procedimiento

diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur

comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado

de no provocar espuma

diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten

diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos

Resultados (lectura)

Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos

Valores de referencia

Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

632 Meacutetodo de microhematocrito

Materiales requeridos

- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)

- Plastilina

Procedimiento

diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel

dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon

anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80

del capilar

diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina

diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma

diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm

Resultados (lectura)

La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio

Uso de la escala

diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero

diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la

columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical

diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos

Valores de referencia

Hombres 40 - 50

Mujeres 38 - 44

Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44

Lactantes (3 meses) 37 - 42

Recieacuten nacidos 50 - 58

La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)

64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA

Principio

La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre

641 Materiales y reactivos

6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro

6412 Pipetas

diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla

diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL

6413 Tubos de ensayo

6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten

Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia

OBTENCIOacuteN DE MUESTRAS SANGUIacuteNEAS

31 OBJETIVO

Establecer y uniformizar criterios en el procedimiento de obtencioacuten de muestrassanguiacuteneas con un adecuado control de calidad ya que de ello dependeque el resultado del anaacutelisis de la muestra sea el correcto Se efectuaraacute enayunas o no dependiendo de la prueba a usar

32 OBTENCIOacuteN DE SANGRE VENOSA CON JERINGA

321 Materiales y equipos requeridos

3211 Algodoacuten

3212 Alcohol al 70

3213 Ligadura o torniquete de 25 a 30 cm de largo

3214 Jeringas de 5 mL

3215 Viales con anticoagulante EDTA

322 Obtencioacuten de la muestra

3221 Verificar que los elementos por utilizar esteacuten listos y que el pacientese sienta coacutemodo

3222 Aplicar el torniquete aproximadamente cuatro dedos por encima de laflexioacuten del codo o a 10 cm del codo sujetar con un medio nudo (Fig 1)

3223 Limpiar la zona con alcohol al 70 o alcohol yodado en un aacuterea de 2pulgadas (Fig 2)

3224 El paciente deberaacute abrir y cerrar la mano durante unos segundos ydespueacutes la mantendraacute cerrada esto ayudaraacute a visualizar las venassuperficiales (Fig 3)

3225 Se retira el estuche protector de la aguja y se coge la jeringa de talmanera que el bisel se encuentre hacia arriba (Fig 4)

3226 Se coloca la aguja en direccioacuten paralela a la vena se perfora la pielhaciendo avanzar la aguja 05-1 cm en el tejido subcutaacuteneo luego seperfora la vena (Fig 5)

3227 Se aspira la jeringa hasta el volumen requerido

3228 Retirar el torniquete e indicar al paciente que deje de hacer puntildeo Secoloca el algodoacuten seco encima de la puncioacuten y se retira la aguja (Fig 6)

3229 Retirar la aguja de la jeringa Verter la muestra lentamente por lasparedes del vial con anticoagulante No olvidar colocar una gota en lalaacutemina portaobjeto para realizar el frotis

32210 Agitar el vial en ciacuterculos sobre la mesa para homogeneizar la muestracon el anticoagulante

PUNTOS PARA LA EXTRACCIOacuteN DE SANGRE

(Toma de muestra)

Se obtiene de las venas de la fosa cubital

PROCEDIMIENTO

Fig 1 Fig 2 Fig 3

Fig 4 Fig 5

Fig 6 Fig 7

33 OBTENCIOacuteN DE SANGRE VENOSA EN TUBOS AL VACIacuteO

331 Materiales requeridos

3311 Algodoacuten

3312 Alcohol al 70

3313 Ligadura o torniquete de 25 a 30 cm de largo

3314 Tubos al vaciacuteo con anticoagulante EDTA (K3) EDTA (Na2) u otroanticoagulante

3315 Agujas con dispositivo para extraccioacuten de sangre al vaciacuteo

- Nordm 21 para adultos

- Nordm 22 para nintildeos y neonatos

De preferencia ambas de bisel corto para evitar la coagulacioacuten

332 Obtencioacuten de la muestra

3321 Repetir los pasos de 3221 a 3224

3322 Se retira el estuche protector de la aguja y eacuteste se enrosca al dispositivopara extraccioacuten de sangre al vaciacuteo

3323 Colocar la ligadura cuatro dedos por encima de la flexioacuten del codo o10 cm por encima de eacuteste y pedir al paciente que abra y cierre la manovarias veces para favorecer la dilatacioacuten de las venas

3324 Una vez escogida la vena desinfectarla con una pieza de algodoacutenembebido en etanol al 70

3325 Se coloca la aguja en direccioacuten paralela a la vena se perfora la pielhaciendo avanzar la aguja entre 05 cm y 1 cm en el tejido subcutaacuteneose inserta el tubo al vaciacuteo por la parte posterior y no preocuparse porla cantidad de sangre extraiacuteda ya que el mismo sonido del vaciacuteo avisaraacuteque la extraccioacuten terminoacute (Fig 8)

3326 Retirar la ligadura tirando del extremo doblado

3327 Colocar un pedazo de algodoacuten seco sobre la parte donde se encuentraoculta la aguja Sacar la aguja con un movimiento raacutepido y depositarlaen el recipiente de metal con desinfectante (Fig 9)

3328 Pedir al paciente que presione firmemente el algodoacuten durante 3 minutoscon el brazo extendido No se recomienda que se flexione el brazoa causa del riesgo que se forme un hematoma

3329 Mezclar por inmersioacuten suave la sangre con el anticoagulante contenidoen el tubo No agitar el contenido

Fig 8 Fig 9

333 Ventajas de una extraccioacuten de sangre venosa

3331 Pueden hacerse repetidos exaacutemenes con la misma muestra

3332 Parte de la muestra (plasma o suero) puede congelarse para referenciafutura

334 Desventajas de una extraccioacuten de sangre venosa

3341 La puncioacuten venosa por su largo procedimiento requiere mayor preparacioacuten que el meacutetodo capilar

3342 El meacutetodo es teacutecnicamente difiacutecil en nintildeos individuos obesos y pacientes en shock

3343 La hemoacutelisis debe ser evitada pues se puede obtener una disminucioacuten en el recuento de eritrocitos

3344 Debe evitarse prolongada estasis venosa producida por el torniquete pues produce hemoacutelisis y otros cambios que ponen la sangre en un estado inadecuado para el anaacutelisis de gases recuentos celulares determinacioacuten de pH sanguiacuteneo y algunas pruebas de coagulacioacuten

3345 La sangre anticoagulada si no es de obtencioacuten reciente no debe ser utilizada en extensiones de sangre pues algunos anticoagulantes producen cambios en las plaquetas que pueden causar aglutinaciones agregacioacuten plaquetaria y dificultan la identificacioacuten de leucocitos

3346 Puesto que algunos de los componentes de la sangre no son estables los recuentos de leucocitos y plaquetas e iacutendice de sedimentacioacuten deben realizarse antes de que pasen dos horas desde que se obtuvo la muestra

34 OBTENCIOacuteN DE SANGRE DE LA VENA YUGULAR EXTERNA

341 Materiales requeridos

3411 Algodoacuten

3412 Alcohol al 70

3413 Jeringas de 5 mL

3414 Viales con anticoagulante EDTA

342 Obtencioacuten de la muestra

3421 El paciente es cubierto por una saacutebana de manera que los brazospermanezcan inmovilizados a lo largo del cuerpo

3422 Al paciente se le coloca de cuacutebito dorsal sobre la mesa de examen ouna

camilla de manera que la cabeza cuelgue sobre el final de lamesa y el cuerpo sea

sujetado por un asistente

3423 Cuando el paciente grita la vena yugular externa se marca claramente

3424 Limpiar la zona en un aacuterea de 2 pulgadas con alcohol al 70 o

alcoholyodado

3425 Se repiten los pasos de 3225 a 3227 de la extraccioacuten de sangrevenosa

con jeringa

3426 Retirar la aguja de la vena y presionar suavemente con un algodoacutenseco

aproximadamente de 3 a 5 minutos Pedir al paciente que permanezcaechado diez

minutos

3427 Se repiten los pasos de 3229

3428 Se repiten los pasos de 32210

343 Ventajas

Constituye un buen meacutetodo para la obtencioacuten de sangre en pacientes conshock

con venas colapsadas

344 Desventajas

Por lo delicado en su procedimiento no se recomienda como rutina soacutelo encasos

en que no se pueda obtener la muestra por meacutetodos convencionales

35 OBTENCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR

Cuando la cantidad de sangre que se precisa es muy pequentildea o cuando

pordiferentes motivos no pueda practicarse una puncioacuten venosa debe recurrirse

a la puncioacuten capilar

351 Materiales requeridos

3512 Algodoacuten

3513 Alcohol al 70

3514 Lancetas desechables (Fig 10)

3515 Papel filtro Nordm 2

352 Procedimiento (Fig 11)

3521 La sangre capilar se obtiene de la cara lateral del dedo medio o anularen los adultos y del dedo gordo del pie o taloacuten en los nintildeos

3522 Desinfectar la zona con alcohol al 70 secar con algodoacuten esteacuteril

3523 Punzar la piel con una lanceta esteacuteril desechable (2 mm de profundidad)

3524 Usar gasa esteacuteril para desechar la primera gota y recoger las siguientesen tubos capilares Evitar comprimir la extremidad para obtenersangre porque se altera la composicioacuten sanguiacutenea

353 Ventajas

3531 Puede obtenerse con facilidad

3532 Es preferible cuando han de realizarse extensiones de sangre perifeacuterica

354 Desventajas

3541 Soacutelo se pueden obtener pequentildeas cantidades de sangre y los exaacutemenesde repeticioacuten requieren nuevas muestras

3542 La sangre en microtubos (capilares) frecuentemente se hemolizainterfiendo con la mayoriacutea de pruebas de laboratorio

3543 Los resultados obtenidos en pruebas con sangre capilar no puedenser comparados con los resultados de las pruebas con sangre venosa

3544 El dedo no soacutelo es delicado sino difiacutecil de desinfectar adecuadamenteen el tiempo disponible

3545 En pacientes con resistencia disminuida a la infeccioacuten (aquellos conleucemia agranulocitosis diabetes uremia y enfermedades con deficienciasinmunoloacutegicas) una muestra tomada del dedo es mucho maacutesprobable que conduzca a una infeccioacuten que otra tomada del brazo

3546 El recuento de eritrocitos y leucocitos asiacute como el recuento deplaquetas y reticulocitos no debe realizarse en sangre capilar debidoa la difiacutecil estandarizacioacuten del flujo sanguiacuteneo capilar

EXTRACCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR

Fig 10

Fig 11

SECCIOacuteN 4

ANTICOAGULANTES

Una vez extraiacuteda la sangre eacutesta puede conservarse coagulada o

mantenidaincoagulable mediante la adicioacuten de un anticoagulante

41 CARACTERIacuteSTICAS BAacuteSICAS DE LOS ANTICOAGULANTES MAacuteS

USADOSEN HEMATOLOGIacuteA

bull No alterar el tamantildeo de los hematiacutees

bull No producir hemoacutelisis

bull Evitar al maacuteximo la agregacioacuten plaquetaria

bull No alterar la morfologiacutea de los leucocitos

La sangre tratada con anticoagulante debe procesarse lo antes posible

inclusomantenida bajo refrigeracioacuten (4 ordmC) si no pasan de las 2 horas El

tiempomaacuteximo entre la extraccioacuten de la sangre y su procesamiento depende

delcoagulante de eleccioacuten y no debe ser maacutes de 4 horas a excepcioacuten

delanticoagulante EDTA (etilendiaminotetraceacutetico) que puede ser hasta 24

horas(en refrigeracioacuten a 4 ordmC)

Los anticoagulantes pueden emplearse en forma soacutelida o liacutequida Los

primerosestaacuten indicados para la determinacioacuten de los paraacutemetros

hematoloacutegicosya que no producen como los anticoagulantes liacutequidos dilucioacuten de

la sangre

42 ANTICOAGULANTES SOacuteLIDOS

421 EDTA

Es la sal disoacutedica o tripotaacutesica del aacutecido etilendiaminotetraceacutetico La saldisoacutedica

(Na2EDTA) es menos soluble que la sal tripotaacutesica (K3EDTA) Estoscompuestos

realizan su accioacuten a traveacutes de un efecto quelante sobre el calcioal fijarlo impiden

su activacioacuten y por ende la coagulacioacuten sanguiacutenea

4211 Ventajas

bull Respeta la morfologiacutea eritrocitaria (especialmente la sal tripotaacutesica) yleucocitaria de manera que permite una demora de dos horas en la realizacioacutendel frotis sanguiacuteneo despueacutes de la extraccioacuten sanguiacutenea

bull Asegura la conservacioacuten de los elementos formes sanguiacuteneos durante 24horas si la sangre se mantiene a 4 ordmC

bull Al inhibir la aglutinacioacuten de las plaquetas facilita su recuento o su expresioacutensemicuantitativa a partir del frotis

bull La concentracioacuten recomendada de EDTA es de 15 mgmL de sangre Unamayor cantidad de anticoagulante puede producir retraccioacuten celular condisminucioacuten del hematocrito y un aumento de la concentracioacuten media de lahemoglobina Un exceso de sangre con relacioacuten al anticoagulante produceformacioacuten de microagregados que pueden alterar los resultados El empleode tubos al vaciacuteo con una gota (50mL) de EDTA tripotaacutesica comercialpara 5 mL de sangre es de intereacutes praacutectico dado que es cien veces maacutessoluble facilitando la mezcla de sangre con anticoagulante

4212 Desventajas

Usado en exceso afecta a los eritrocitos y a los leucocitos a los cuales les produce encogimiento y cambios en su forma por ello debe cuidarse de agregar la cantidad correcta de sangre al anticoagulante

422 Anticoagulante de Wintrobe

Es una mezcla de oxalato de amonio y potasio Actuacutea por precipitacioacuten del calcio es faacutecil de preparar Se emplea en forma de polvo en proporcioacuten de 2 de oxalato de amonio por 1 de oxalato de potasio La cantidad recomendada es de 2 mg x mL de sangre Este anticoagulante no afecta el volumen globular medio y puede usarse para determinaciones de hemoglobina hematocrito y recuento globular pero para los extendidos queda limitada a los primeros minutos tampoco es uacutetil para el recuento plaquetario porque produce formacioacuten de agregados plaquetarios

423 Heparina

El nombre de heparina proviene del griego hepar que significa hiacutegado ya que fue aislado por primera vez de las ceacutelulas de este tejido Es un mucopolisacaacuterido aacutecido Presenta el

inconveniente de que si no se agita raacutepidamente con la sangre despueacutes de extraiacuteda

pueden formarse microcoaacutegulos aunque no altera el volumeneritrocitario ni la morfologiacutea de los leucocitos No es recomendablepara el frotis sanguiacuteneo porque produce un fondo azul en la laacutemina

La heparina de sodio o litio puede usarse en forma soacutelida o liacutequida en

proporcioacutende 01 - 02 mg de heparina por 1 mL de sangre

43 ANTICOAGULANTES LIacuteQUIDOS

431 Citrato trisoacutedico

Es de eleccioacuten para las pruebas de hemostasia y la velocidad de sedimentacioacuten

Actuacutea a traveacutes de la precipitacioacuten del calcio La concentracioacuten depende de

la prueba por realizar

bull Para pruebas de hemostasia se emplea en proporcioacuten de 1 9 (05 mL

deanticoagulante para 45 mL de sangre total)

bull Para la determinacioacuten de la VSG (Velocidad de Sedimentacioacuten Globular) es14

(05 mL de anticoagulante para 2 mL de sangre)

432 Oxalato soacutedico

Recomendado tambieacuten para las pruebas de hemostasia Se emplea en

proporcioacutende un volumen de anticoagulante para 4 vol de sangre

SECCIOacuteN 5

REALIZACIOacuteN Y TINCIOacuteN DEL FROTIS SANGUIacuteNEO

La praacutectica del frotis sanguiacuteneo tambieacuten llamado extendido es de gran importanciaen hematologiacutea ya que el diagnoacutestico de muchas enfermedadeshematoloacutegicas puede realizarse con soacutelo observar las caracteriacutesticasmorfoloacutegicas de las ceacutelulas sanguiacuteneas de manera que eacuteste no debe serexcesivamente grueso ni excesivamente fino Todas las laacuteminas por usarsobre todo nuevas deben ser limpiadas con algodoacuten y alcohol al 70 paraeliminar la grasa que viene adherida

51 MEacuteTODO DE LOS DOS PORTAOBJETOS

511 Materiales

- Alcohol al 70

- Algodoacuten

- Lanceta descartable

- Portaobjetos de vidrios limpios y desgrasados (25 x 75 mm)

512 Fundamento

Consiste en la extensioacuten de una gota de sangre sobre un portaobjeto (25 x 75)empleando el canto biselado de otro portaobjeto de igual dimensioacuten (Fig 12)

513 Procedimiento

5131 Una vez extraiacuteda la sangre con cualquiera de las metodologiacuteas secoloca una pequentildea gota de sangre (5mL) (aprox 3 mm de diaacutemetro)sobre un portaobjeto a 2 cm aproximadamente de uno de los extremos

5132 Colocar el canto de otro portaobjeto esmerilado sobre la superficiedel primer portaobjeto (en la que se encuentra la gota de sangre)formando un aacutengulo de 45ordm

5134 Deslizar suavemente y a velocidad moderada el portaobjeto sobre elotro en sentido longitudinal hasta que la gota de sangre quede bienextendida sobre la

superficie del primer portaobjeto El grosor delfrotis sanguiacuteneo puede variar seguacuten sea el aacutengulo que formen entresiacute ambos portaobjetos Asiacute si es superior a 45ordm la extensioacuten obtenidaseraacute gruesa y corta si es inferior a 45ordm seraacute larga y fina El secado delfrotis es a temperatura ambiente y en posicioacuten horizontal

Fig 12

1048729 Zona excesivamente gruesa Se halla en la regioacuten inmediata al punto departida de la extensioacuten (cabeza) En ella se aprecia siempre un aumento delinfocitos

1048729 Zona excesivamente fina Corresponde al final de la extensioacuten y termina enun aacuterea donde las ceacutelulas adoptan una posicioacuten acartonada (barbas) Enesta regioacuten existe un exceso de granulocitos y monocitos

1048729 Zona ideal Corresponde a la regioacuten intermedia del frotis y en ella existe unreparto equilibrado de ceacutelulas

52 COLORACIONES USADAS

Una vez seco el frotis se procede a la tincioacuten hematoloacutegica con el colorante deRomanowsky constituido por la mezcla de eosina y azul de metileno Dentrode eacutestas tenemos

521 Colorante de Giemsa

522 Colorante de May-Grunwald

523 Colorante de Wright

524 Colorante de Leishman

Preparacioacuten de colorantes (Anexo A)

1048729 Para el estudio de las ceacutelulas sanguiacuteneas utilizar el colorante 523 y 524

1048729 Para el estudio de hemoparaacutesitos utilizar el colorante 521

1048729 Utilizar el colorante 522 para casos especiales en que se desee observar

con mayor claridad y especificidad los graacutenulos de los neutrofilos

53 TINCIOacuteN CON COLORANTE DE WRIGHT

531 Fundamento

El colorante de Wright va a permitir suministrar un medio para estudiar lasangre y determinar las variaciones y anormalidades de estructura forma ytamantildeo de los eritrocitos su contenido de hemoglobina y sus propiedades decoloracioacuten La informacioacuten obtenida de un frotis de sangre perifeacuterica dependeen gran parte de la calidad del extendido y la coloracioacuten

532 Materiales

5321 Colorante de Wright (Anexo A)

5322 Frasco gotero

5323 Solucioacuten amortiguada tamponada (Anexo A)

533 Procedimiento

5331 Una vez obtenido el frotis sanguiacuteneo se le dejaraacute secar entre 15 y 20minutos

5332 Luego se coloca la preparacioacuten en un soporte y se cubre con el colorantede Wright dejaacutendolo por espacio de 5 minutos

5333 Posteriormente se antildeade solucioacuten amortiguada tamponada en partesiguales hasta obtener un brillo metaacutelico dejando 6 minutos adicionales

5334 Finalmente se lava con agua corriente y se deja secar

5335 Se coloca en el microscopio y con pequentildeo aumento se revisa lacalidad de la coloracioacuten la cantidad aproximada de gloacutebulos blancosy se escoge el sitio para iniciar el recuento Se coloca una gota deaceite de inmersioacuten y se enfoca a un aumento de 100xLa forma de los gloacutebulos rojos se examinaraacute detenidamente observandoademaacutes del color (cantidad de hemoglobina) presencia deplaquetas su agrupacioacuten y distribucioacuten

5336 Posteriormente se hace el recuento diferencial de gloacutebulos blancosen 100

ceacutelulas para lo cual se deberaacute conocer las diferencias entreneutroacutefilos eosinoacutefilos

linfocitos y monocitosUna extensioacuten de sangre bien tentildeida debe caracterizarse

por unabuena diferenciacioacuten de las estructuras subcelulares en los leucocitosuna

coloracioacuten rosada de los hematiacutees y la ausencia de precipitados

Los defectos maacutes frecuentes observados en la tincioacuten del frotis sanguiacuteneoson

Coloracioacuten excesivamente azul debido a

1048729 Frotis excesivamente grueso

1048729 Lavado insuficiente

1048729 Tincioacuten muy prolongada

1048729 Empleo de colorante excesivamente alcalino

Coloracioacuten con una tonalidad rosada

1048729 El colorante el tampoacuten o el agua de lavado tienen un pH demasiadoaacutecido

Presencia de precipitados

1048729 Obedecen a una accioacuten excesiva del colorante Esto se puede evitarcon la

filtracioacuten

SECCIOacuteN 6

HEMOGRAMA-HEMOGLOBINA-HEMATOCRITO

El hemograma de Shilling constituye uno de los exaacutemenes de laboratorio

maacutesusados en el campo de la hematologiacutea Comprende las siguientes pruebas

61 RECUENTO LEUCOCITARIO

Principio

La sangre anticoagulada se deposita en un liacutequido que permite evidenciar

losleucocitos mantenieacutendolos visibles mientras que los eritrocitos

sonhemolizados El recuento del nuacutemero de leucocitos o gloacutebulos blancos se

expresapor mm3 (miliacutemetro cuacutebico)

611 Equipos

- Microscopio

- Hemocitoacutemetro (Caacutemara de Neubauer)

Consta de los siguientes elementos

diams Una laacutemina portaobjeto gruesa en el centro se hallan dos

superficiescuadriculadas iguales separadas del resto de la laacutemina por surcos y

dosbarras transversales algo maacutes elevadas

diams Una laminilla cubreobjetos oacutepticamente plana que al colocarse sobrelas barras

elevadas de la laacutemina forma una caacutemara entre el cubreobjetosy la superficie

cuadriculadaLa altura entre el cubreobjetos y la laacutemina portaobjetos es de 01

mmCada cuadriacutecula mide 3 mm de lado y se divide en 9 cuadrados grandesCada

uno de los cuales mide 1 mm2 de superficie que se subdivide a suvez en 16

cuadrados medianos El cuadrado grande central se divide en25 cuadrados

pequentildeos y cada uno de ellos en 16 cuadraditos Cadacuadrado pequentildeo mide

02 mm de lado (004 mm2 de superficie) y cadacuadradito mide 005 mm de lado

(00025 mm2 de superficie)

612 Materiales y reactivos requeridos

6121 Pipeta de gloacutebulos blancos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0 a 100 mL)Presenta cerca del extremo superior una marca de 11 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla que funciona comomezcladora luego sigue el extremo maacutes largo de la pipeta (tallo) que estaacutedividida en 10 partes con 2 marcas 1 (parte final del bulbo) y 05 (a la mitaddel tallo) Se le acopla a su extremo superior 1 tubo de goma y una bombillapara aspirar

6122 Diluyente de gloacutebulos blancos Solucioacuten de Turk al 1

6123 Contador manual (Soacutelo si fuera necesario)

6124 Papel filtro

613 Procedimiento

6131 Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar deldedo se procede a aspirar la sangre con la pipeta de gloacutebulos blancoshasta la marca de 05 y a limpiar la punta con papel absorbente

6132 Introducir la pipeta en el tubo que contenga solucioacuten de Turk y absorberhasta la marca de 11 (no debe haber burbujas)

6133 Tapar ambos extremos y proceder a mezclar manualmente o en unrotador automaacutetico por 2 oacute 3 minutos

6134 Monte la laminilla de vidrio en la caacutemara para recuento que debe estarlimpia y seca

6135 Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocaruna gota pequentildea de esta solucioacuten en la caacutemara

6136 Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las ceacutelulas se sedimenten

6137 Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angularesCuando se usa la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002 mL) desangre total con anticoagulante o sangre capilar con anticoagulante yse diluye en un tubo que contenga 380 mL de solucioacuten de Turk (aquiacutetenemos una dilucioacuten 120)

LECTURA

Fig 13

La lectura se realiza en los campos 1 3 7 y 9 como estaacute indicado en la figuraAdemaacutes de los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes sedeben contar todos los leucocitos que se encuentren adheridos en la liacuteneahorizontal superior y vertical exterior o de lo contrario todos los leucocitosadheridos a la liacutenea horizontal inferior y vertical interior

614 Resultados

Nordm de leucocitos x mm3 = leucocitos contados en 4 camposdividealtura x dilucioacuten x aacuterea

Reemplazando = leucocitos contados en 4 camposdivide110 x 120 x 4=

Leucocitos contados en 4 camposdivide4200=

X1 divide4200= Nordm leucocitos contados x 50

615 Valores de referencia

5000 - 10 000 leucocitos mm3

616 Correccioacuten de valores para restar eritrocitos nucleados

Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el liacutequido de dilucioacuten por lo tantopueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con losleucocitos de tal manera que se debe emplear la siguiente foacutermula

Caacutelculo

La concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos (por litro) esNuacutemero de normoblatos contados x concentracioacuten o nuacutemero de leucocitos100 + Nordm de normoblastos contados

Ejemplo

Si se cuentan 50 normoblastos y la concentracioacuten del nuacutemero de leucocitos es16 x 109l la concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos seraacute

50 x16 = 53 x 109l

100 + 50

y la concentracioacuten de leucocitos corregida seraacute 16 - 53 = 107 x 109lEn unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitosse expresan por miliacutemetro cuacutebico En tales unidades el caacutelculo correspondienteal ejemplo que se ha dado seriacutea

50 x 16 000 = 5300 mm3

100 + 50

Recuento corregido de gloacutebulos blancos o leucocitos = 16 000 - 5300 = 10 700 mm3

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

62 RECUENTO DE GLOacuteBULOS ROJOS

Principio

La sangre se diluye en un liacutequido que nos permite observar claramente loshematiacutees luego esta dilucioacuten se coloca en una caacutemara de Neubauer con laayuda de una pipeta automaacutetica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopioa un objetivo de 40x para calcular el nuacutemero de gloacutebulos rojos por mm3

621 Equipos

- Microscopio

- Hemocitoacutemetro (caacutemara de Neubauer)

622 Materiales y reactivos requeridos

6221 Pipeta de gloacutebulos rojos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0-100 mL)

Presenta cerca del extremo superior una marca de 101 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla roja mezcladoraluego sigue el tallo (extremo maacutes largo) el cual estaacute dividido en 10 partescon 2 marcas 1 acabando el bulbo y 05 a la mitad del tallo Se requiereigual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar

6222 Diluyente de gloacutebulos rojos Cloruro de Sodio al 09 (ver anexo)

Diluyente de Hayem (ver anexo)

6223 Contador manual (soacutelo si fuera necesario)

6224 Papel filtro

623 Procedimiento

6231 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar

6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente

6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101

6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos

6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente

6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas

6237 Dejar en reposo por 3 minutos

6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)

6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos

LECTURA

Fig 14

624 Resultados

Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea

Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15

= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000

= hematiacutees contados x 10 000

625 Valores de referencia

(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)

Hombres 4 500 000 - 5 500 000

Mujeres 4 000 000 - 5 000 000

Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000

Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000

Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)

Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal

volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen

porcentaje o como valor decimal

Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre

total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)

631 Meacutetodo de Wintrobe

Materiales requeridos

- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm

- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia

- Tapoacuten de goma

Procedimiento

diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur

comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado

de no provocar espuma

diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten

diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos

Resultados (lectura)

Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos

Valores de referencia

Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

632 Meacutetodo de microhematocrito

Materiales requeridos

- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)

- Plastilina

Procedimiento

diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel

dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon

anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80

del capilar

diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina

diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma

diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm

Resultados (lectura)

La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio

Uso de la escala

diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero

diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la

columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical

diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos

Valores de referencia

Hombres 40 - 50

Mujeres 38 - 44

Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44

Lactantes (3 meses) 37 - 42

Recieacuten nacidos 50 - 58

La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)

64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA

Principio

La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre

641 Materiales y reactivos

6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro

6412 Pipetas

diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla

diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL

6413 Tubos de ensayo

6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten

Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia

3228 Retirar el torniquete e indicar al paciente que deje de hacer puntildeo Secoloca el algodoacuten seco encima de la puncioacuten y se retira la aguja (Fig 6)

3229 Retirar la aguja de la jeringa Verter la muestra lentamente por lasparedes del vial con anticoagulante No olvidar colocar una gota en lalaacutemina portaobjeto para realizar el frotis

32210 Agitar el vial en ciacuterculos sobre la mesa para homogeneizar la muestracon el anticoagulante

PUNTOS PARA LA EXTRACCIOacuteN DE SANGRE

(Toma de muestra)

Se obtiene de las venas de la fosa cubital

PROCEDIMIENTO

Fig 1 Fig 2 Fig 3

Fig 4 Fig 5

Fig 6 Fig 7

33 OBTENCIOacuteN DE SANGRE VENOSA EN TUBOS AL VACIacuteO

331 Materiales requeridos

3311 Algodoacuten

3312 Alcohol al 70

3313 Ligadura o torniquete de 25 a 30 cm de largo

3314 Tubos al vaciacuteo con anticoagulante EDTA (K3) EDTA (Na2) u otroanticoagulante

3315 Agujas con dispositivo para extraccioacuten de sangre al vaciacuteo

- Nordm 21 para adultos

- Nordm 22 para nintildeos y neonatos

De preferencia ambas de bisel corto para evitar la coagulacioacuten

332 Obtencioacuten de la muestra

3321 Repetir los pasos de 3221 a 3224

3322 Se retira el estuche protector de la aguja y eacuteste se enrosca al dispositivopara extraccioacuten de sangre al vaciacuteo

3323 Colocar la ligadura cuatro dedos por encima de la flexioacuten del codo o10 cm por encima de eacuteste y pedir al paciente que abra y cierre la manovarias veces para favorecer la dilatacioacuten de las venas

3324 Una vez escogida la vena desinfectarla con una pieza de algodoacutenembebido en etanol al 70

3325 Se coloca la aguja en direccioacuten paralela a la vena se perfora la pielhaciendo avanzar la aguja entre 05 cm y 1 cm en el tejido subcutaacuteneose inserta el tubo al vaciacuteo por la parte posterior y no preocuparse porla cantidad de sangre extraiacuteda ya que el mismo sonido del vaciacuteo avisaraacuteque la extraccioacuten terminoacute (Fig 8)

3326 Retirar la ligadura tirando del extremo doblado

3327 Colocar un pedazo de algodoacuten seco sobre la parte donde se encuentraoculta la aguja Sacar la aguja con un movimiento raacutepido y depositarlaen el recipiente de metal con desinfectante (Fig 9)

3328 Pedir al paciente que presione firmemente el algodoacuten durante 3 minutoscon el brazo extendido No se recomienda que se flexione el brazoa causa del riesgo que se forme un hematoma

3329 Mezclar por inmersioacuten suave la sangre con el anticoagulante contenidoen el tubo No agitar el contenido

Fig 8 Fig 9

333 Ventajas de una extraccioacuten de sangre venosa

3331 Pueden hacerse repetidos exaacutemenes con la misma muestra

3332 Parte de la muestra (plasma o suero) puede congelarse para referenciafutura

334 Desventajas de una extraccioacuten de sangre venosa

3341 La puncioacuten venosa por su largo procedimiento requiere mayor preparacioacuten que el meacutetodo capilar

3342 El meacutetodo es teacutecnicamente difiacutecil en nintildeos individuos obesos y pacientes en shock

3343 La hemoacutelisis debe ser evitada pues se puede obtener una disminucioacuten en el recuento de eritrocitos

3344 Debe evitarse prolongada estasis venosa producida por el torniquete pues produce hemoacutelisis y otros cambios que ponen la sangre en un estado inadecuado para el anaacutelisis de gases recuentos celulares determinacioacuten de pH sanguiacuteneo y algunas pruebas de coagulacioacuten

3345 La sangre anticoagulada si no es de obtencioacuten reciente no debe ser utilizada en extensiones de sangre pues algunos anticoagulantes producen cambios en las plaquetas que pueden causar aglutinaciones agregacioacuten plaquetaria y dificultan la identificacioacuten de leucocitos

3346 Puesto que algunos de los componentes de la sangre no son estables los recuentos de leucocitos y plaquetas e iacutendice de sedimentacioacuten deben realizarse antes de que pasen dos horas desde que se obtuvo la muestra

34 OBTENCIOacuteN DE SANGRE DE LA VENA YUGULAR EXTERNA

341 Materiales requeridos

3411 Algodoacuten

3412 Alcohol al 70

3413 Jeringas de 5 mL

3414 Viales con anticoagulante EDTA

342 Obtencioacuten de la muestra

3421 El paciente es cubierto por una saacutebana de manera que los brazospermanezcan inmovilizados a lo largo del cuerpo

3422 Al paciente se le coloca de cuacutebito dorsal sobre la mesa de examen ouna

camilla de manera que la cabeza cuelgue sobre el final de lamesa y el cuerpo sea

sujetado por un asistente

3423 Cuando el paciente grita la vena yugular externa se marca claramente

3424 Limpiar la zona en un aacuterea de 2 pulgadas con alcohol al 70 o

alcoholyodado

3425 Se repiten los pasos de 3225 a 3227 de la extraccioacuten de sangrevenosa

con jeringa

3426 Retirar la aguja de la vena y presionar suavemente con un algodoacutenseco

aproximadamente de 3 a 5 minutos Pedir al paciente que permanezcaechado diez

minutos

3427 Se repiten los pasos de 3229

3428 Se repiten los pasos de 32210

343 Ventajas

Constituye un buen meacutetodo para la obtencioacuten de sangre en pacientes conshock

con venas colapsadas

344 Desventajas

Por lo delicado en su procedimiento no se recomienda como rutina soacutelo encasos

en que no se pueda obtener la muestra por meacutetodos convencionales

35 OBTENCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR

Cuando la cantidad de sangre que se precisa es muy pequentildea o cuando

pordiferentes motivos no pueda practicarse una puncioacuten venosa debe recurrirse

a la puncioacuten capilar

351 Materiales requeridos

3512 Algodoacuten

3513 Alcohol al 70

3514 Lancetas desechables (Fig 10)

3515 Papel filtro Nordm 2

352 Procedimiento (Fig 11)

3521 La sangre capilar se obtiene de la cara lateral del dedo medio o anularen los adultos y del dedo gordo del pie o taloacuten en los nintildeos

3522 Desinfectar la zona con alcohol al 70 secar con algodoacuten esteacuteril

3523 Punzar la piel con una lanceta esteacuteril desechable (2 mm de profundidad)

3524 Usar gasa esteacuteril para desechar la primera gota y recoger las siguientesen tubos capilares Evitar comprimir la extremidad para obtenersangre porque se altera la composicioacuten sanguiacutenea

353 Ventajas

3531 Puede obtenerse con facilidad

3532 Es preferible cuando han de realizarse extensiones de sangre perifeacuterica

354 Desventajas

3541 Soacutelo se pueden obtener pequentildeas cantidades de sangre y los exaacutemenesde repeticioacuten requieren nuevas muestras

3542 La sangre en microtubos (capilares) frecuentemente se hemolizainterfiendo con la mayoriacutea de pruebas de laboratorio

3543 Los resultados obtenidos en pruebas con sangre capilar no puedenser comparados con los resultados de las pruebas con sangre venosa

3544 El dedo no soacutelo es delicado sino difiacutecil de desinfectar adecuadamenteen el tiempo disponible

3545 En pacientes con resistencia disminuida a la infeccioacuten (aquellos conleucemia agranulocitosis diabetes uremia y enfermedades con deficienciasinmunoloacutegicas) una muestra tomada del dedo es mucho maacutesprobable que conduzca a una infeccioacuten que otra tomada del brazo

3546 El recuento de eritrocitos y leucocitos asiacute como el recuento deplaquetas y reticulocitos no debe realizarse en sangre capilar debidoa la difiacutecil estandarizacioacuten del flujo sanguiacuteneo capilar

EXTRACCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR

Fig 10

Fig 11

SECCIOacuteN 4

ANTICOAGULANTES

Una vez extraiacuteda la sangre eacutesta puede conservarse coagulada o

mantenidaincoagulable mediante la adicioacuten de un anticoagulante

41 CARACTERIacuteSTICAS BAacuteSICAS DE LOS ANTICOAGULANTES MAacuteS

USADOSEN HEMATOLOGIacuteA

bull No alterar el tamantildeo de los hematiacutees

bull No producir hemoacutelisis

bull Evitar al maacuteximo la agregacioacuten plaquetaria

bull No alterar la morfologiacutea de los leucocitos

La sangre tratada con anticoagulante debe procesarse lo antes posible

inclusomantenida bajo refrigeracioacuten (4 ordmC) si no pasan de las 2 horas El

tiempomaacuteximo entre la extraccioacuten de la sangre y su procesamiento depende

delcoagulante de eleccioacuten y no debe ser maacutes de 4 horas a excepcioacuten

delanticoagulante EDTA (etilendiaminotetraceacutetico) que puede ser hasta 24

horas(en refrigeracioacuten a 4 ordmC)

Los anticoagulantes pueden emplearse en forma soacutelida o liacutequida Los

primerosestaacuten indicados para la determinacioacuten de los paraacutemetros

hematoloacutegicosya que no producen como los anticoagulantes liacutequidos dilucioacuten de

la sangre

42 ANTICOAGULANTES SOacuteLIDOS

421 EDTA

Es la sal disoacutedica o tripotaacutesica del aacutecido etilendiaminotetraceacutetico La saldisoacutedica

(Na2EDTA) es menos soluble que la sal tripotaacutesica (K3EDTA) Estoscompuestos

realizan su accioacuten a traveacutes de un efecto quelante sobre el calcioal fijarlo impiden

su activacioacuten y por ende la coagulacioacuten sanguiacutenea

4211 Ventajas

bull Respeta la morfologiacutea eritrocitaria (especialmente la sal tripotaacutesica) yleucocitaria de manera que permite una demora de dos horas en la realizacioacutendel frotis sanguiacuteneo despueacutes de la extraccioacuten sanguiacutenea

bull Asegura la conservacioacuten de los elementos formes sanguiacuteneos durante 24horas si la sangre se mantiene a 4 ordmC

bull Al inhibir la aglutinacioacuten de las plaquetas facilita su recuento o su expresioacutensemicuantitativa a partir del frotis

bull La concentracioacuten recomendada de EDTA es de 15 mgmL de sangre Unamayor cantidad de anticoagulante puede producir retraccioacuten celular condisminucioacuten del hematocrito y un aumento de la concentracioacuten media de lahemoglobina Un exceso de sangre con relacioacuten al anticoagulante produceformacioacuten de microagregados que pueden alterar los resultados El empleode tubos al vaciacuteo con una gota (50mL) de EDTA tripotaacutesica comercialpara 5 mL de sangre es de intereacutes praacutectico dado que es cien veces maacutessoluble facilitando la mezcla de sangre con anticoagulante

4212 Desventajas

Usado en exceso afecta a los eritrocitos y a los leucocitos a los cuales les produce encogimiento y cambios en su forma por ello debe cuidarse de agregar la cantidad correcta de sangre al anticoagulante

422 Anticoagulante de Wintrobe

Es una mezcla de oxalato de amonio y potasio Actuacutea por precipitacioacuten del calcio es faacutecil de preparar Se emplea en forma de polvo en proporcioacuten de 2 de oxalato de amonio por 1 de oxalato de potasio La cantidad recomendada es de 2 mg x mL de sangre Este anticoagulante no afecta el volumen globular medio y puede usarse para determinaciones de hemoglobina hematocrito y recuento globular pero para los extendidos queda limitada a los primeros minutos tampoco es uacutetil para el recuento plaquetario porque produce formacioacuten de agregados plaquetarios

423 Heparina

El nombre de heparina proviene del griego hepar que significa hiacutegado ya que fue aislado por primera vez de las ceacutelulas de este tejido Es un mucopolisacaacuterido aacutecido Presenta el

inconveniente de que si no se agita raacutepidamente con la sangre despueacutes de extraiacuteda

pueden formarse microcoaacutegulos aunque no altera el volumeneritrocitario ni la morfologiacutea de los leucocitos No es recomendablepara el frotis sanguiacuteneo porque produce un fondo azul en la laacutemina

La heparina de sodio o litio puede usarse en forma soacutelida o liacutequida en

proporcioacutende 01 - 02 mg de heparina por 1 mL de sangre

43 ANTICOAGULANTES LIacuteQUIDOS

431 Citrato trisoacutedico

Es de eleccioacuten para las pruebas de hemostasia y la velocidad de sedimentacioacuten

Actuacutea a traveacutes de la precipitacioacuten del calcio La concentracioacuten depende de

la prueba por realizar

bull Para pruebas de hemostasia se emplea en proporcioacuten de 1 9 (05 mL

deanticoagulante para 45 mL de sangre total)

bull Para la determinacioacuten de la VSG (Velocidad de Sedimentacioacuten Globular) es14

(05 mL de anticoagulante para 2 mL de sangre)

432 Oxalato soacutedico

Recomendado tambieacuten para las pruebas de hemostasia Se emplea en

proporcioacutende un volumen de anticoagulante para 4 vol de sangre

SECCIOacuteN 5

REALIZACIOacuteN Y TINCIOacuteN DEL FROTIS SANGUIacuteNEO

La praacutectica del frotis sanguiacuteneo tambieacuten llamado extendido es de gran importanciaen hematologiacutea ya que el diagnoacutestico de muchas enfermedadeshematoloacutegicas puede realizarse con soacutelo observar las caracteriacutesticasmorfoloacutegicas de las ceacutelulas sanguiacuteneas de manera que eacuteste no debe serexcesivamente grueso ni excesivamente fino Todas las laacuteminas por usarsobre todo nuevas deben ser limpiadas con algodoacuten y alcohol al 70 paraeliminar la grasa que viene adherida

51 MEacuteTODO DE LOS DOS PORTAOBJETOS

511 Materiales

- Alcohol al 70

- Algodoacuten

- Lanceta descartable

- Portaobjetos de vidrios limpios y desgrasados (25 x 75 mm)

512 Fundamento

Consiste en la extensioacuten de una gota de sangre sobre un portaobjeto (25 x 75)empleando el canto biselado de otro portaobjeto de igual dimensioacuten (Fig 12)

513 Procedimiento

5131 Una vez extraiacuteda la sangre con cualquiera de las metodologiacuteas secoloca una pequentildea gota de sangre (5mL) (aprox 3 mm de diaacutemetro)sobre un portaobjeto a 2 cm aproximadamente de uno de los extremos

5132 Colocar el canto de otro portaobjeto esmerilado sobre la superficiedel primer portaobjeto (en la que se encuentra la gota de sangre)formando un aacutengulo de 45ordm

5134 Deslizar suavemente y a velocidad moderada el portaobjeto sobre elotro en sentido longitudinal hasta que la gota de sangre quede bienextendida sobre la

superficie del primer portaobjeto El grosor delfrotis sanguiacuteneo puede variar seguacuten sea el aacutengulo que formen entresiacute ambos portaobjetos Asiacute si es superior a 45ordm la extensioacuten obtenidaseraacute gruesa y corta si es inferior a 45ordm seraacute larga y fina El secado delfrotis es a temperatura ambiente y en posicioacuten horizontal

Fig 12

1048729 Zona excesivamente gruesa Se halla en la regioacuten inmediata al punto departida de la extensioacuten (cabeza) En ella se aprecia siempre un aumento delinfocitos

1048729 Zona excesivamente fina Corresponde al final de la extensioacuten y termina enun aacuterea donde las ceacutelulas adoptan una posicioacuten acartonada (barbas) Enesta regioacuten existe un exceso de granulocitos y monocitos

1048729 Zona ideal Corresponde a la regioacuten intermedia del frotis y en ella existe unreparto equilibrado de ceacutelulas

52 COLORACIONES USADAS

Una vez seco el frotis se procede a la tincioacuten hematoloacutegica con el colorante deRomanowsky constituido por la mezcla de eosina y azul de metileno Dentrode eacutestas tenemos

521 Colorante de Giemsa

522 Colorante de May-Grunwald

523 Colorante de Wright

524 Colorante de Leishman

Preparacioacuten de colorantes (Anexo A)

1048729 Para el estudio de las ceacutelulas sanguiacuteneas utilizar el colorante 523 y 524

1048729 Para el estudio de hemoparaacutesitos utilizar el colorante 521

1048729 Utilizar el colorante 522 para casos especiales en que se desee observar

con mayor claridad y especificidad los graacutenulos de los neutrofilos

53 TINCIOacuteN CON COLORANTE DE WRIGHT

531 Fundamento

El colorante de Wright va a permitir suministrar un medio para estudiar lasangre y determinar las variaciones y anormalidades de estructura forma ytamantildeo de los eritrocitos su contenido de hemoglobina y sus propiedades decoloracioacuten La informacioacuten obtenida de un frotis de sangre perifeacuterica dependeen gran parte de la calidad del extendido y la coloracioacuten

532 Materiales

5321 Colorante de Wright (Anexo A)

5322 Frasco gotero

5323 Solucioacuten amortiguada tamponada (Anexo A)

533 Procedimiento

5331 Una vez obtenido el frotis sanguiacuteneo se le dejaraacute secar entre 15 y 20minutos

5332 Luego se coloca la preparacioacuten en un soporte y se cubre con el colorantede Wright dejaacutendolo por espacio de 5 minutos

5333 Posteriormente se antildeade solucioacuten amortiguada tamponada en partesiguales hasta obtener un brillo metaacutelico dejando 6 minutos adicionales

5334 Finalmente se lava con agua corriente y se deja secar

5335 Se coloca en el microscopio y con pequentildeo aumento se revisa lacalidad de la coloracioacuten la cantidad aproximada de gloacutebulos blancosy se escoge el sitio para iniciar el recuento Se coloca una gota deaceite de inmersioacuten y se enfoca a un aumento de 100xLa forma de los gloacutebulos rojos se examinaraacute detenidamente observandoademaacutes del color (cantidad de hemoglobina) presencia deplaquetas su agrupacioacuten y distribucioacuten

5336 Posteriormente se hace el recuento diferencial de gloacutebulos blancosen 100

ceacutelulas para lo cual se deberaacute conocer las diferencias entreneutroacutefilos eosinoacutefilos

linfocitos y monocitosUna extensioacuten de sangre bien tentildeida debe caracterizarse

por unabuena diferenciacioacuten de las estructuras subcelulares en los leucocitosuna

coloracioacuten rosada de los hematiacutees y la ausencia de precipitados

Los defectos maacutes frecuentes observados en la tincioacuten del frotis sanguiacuteneoson

Coloracioacuten excesivamente azul debido a

1048729 Frotis excesivamente grueso

1048729 Lavado insuficiente

1048729 Tincioacuten muy prolongada

1048729 Empleo de colorante excesivamente alcalino

Coloracioacuten con una tonalidad rosada

1048729 El colorante el tampoacuten o el agua de lavado tienen un pH demasiadoaacutecido

Presencia de precipitados

1048729 Obedecen a una accioacuten excesiva del colorante Esto se puede evitarcon la

filtracioacuten

SECCIOacuteN 6

HEMOGRAMA-HEMOGLOBINA-HEMATOCRITO

El hemograma de Shilling constituye uno de los exaacutemenes de laboratorio

maacutesusados en el campo de la hematologiacutea Comprende las siguientes pruebas

61 RECUENTO LEUCOCITARIO

Principio

La sangre anticoagulada se deposita en un liacutequido que permite evidenciar

losleucocitos mantenieacutendolos visibles mientras que los eritrocitos

sonhemolizados El recuento del nuacutemero de leucocitos o gloacutebulos blancos se

expresapor mm3 (miliacutemetro cuacutebico)

611 Equipos

- Microscopio

- Hemocitoacutemetro (Caacutemara de Neubauer)

Consta de los siguientes elementos

diams Una laacutemina portaobjeto gruesa en el centro se hallan dos

superficiescuadriculadas iguales separadas del resto de la laacutemina por surcos y

dosbarras transversales algo maacutes elevadas

diams Una laminilla cubreobjetos oacutepticamente plana que al colocarse sobrelas barras

elevadas de la laacutemina forma una caacutemara entre el cubreobjetosy la superficie

cuadriculadaLa altura entre el cubreobjetos y la laacutemina portaobjetos es de 01

mmCada cuadriacutecula mide 3 mm de lado y se divide en 9 cuadrados grandesCada

uno de los cuales mide 1 mm2 de superficie que se subdivide a suvez en 16

cuadrados medianos El cuadrado grande central se divide en25 cuadrados

pequentildeos y cada uno de ellos en 16 cuadraditos Cadacuadrado pequentildeo mide

02 mm de lado (004 mm2 de superficie) y cadacuadradito mide 005 mm de lado

(00025 mm2 de superficie)

612 Materiales y reactivos requeridos

6121 Pipeta de gloacutebulos blancos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0 a 100 mL)Presenta cerca del extremo superior una marca de 11 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla que funciona comomezcladora luego sigue el extremo maacutes largo de la pipeta (tallo) que estaacutedividida en 10 partes con 2 marcas 1 (parte final del bulbo) y 05 (a la mitaddel tallo) Se le acopla a su extremo superior 1 tubo de goma y una bombillapara aspirar

6122 Diluyente de gloacutebulos blancos Solucioacuten de Turk al 1

6123 Contador manual (Soacutelo si fuera necesario)

6124 Papel filtro

613 Procedimiento

6131 Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar deldedo se procede a aspirar la sangre con la pipeta de gloacutebulos blancoshasta la marca de 05 y a limpiar la punta con papel absorbente

6132 Introducir la pipeta en el tubo que contenga solucioacuten de Turk y absorberhasta la marca de 11 (no debe haber burbujas)

6133 Tapar ambos extremos y proceder a mezclar manualmente o en unrotador automaacutetico por 2 oacute 3 minutos

6134 Monte la laminilla de vidrio en la caacutemara para recuento que debe estarlimpia y seca

6135 Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocaruna gota pequentildea de esta solucioacuten en la caacutemara

6136 Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las ceacutelulas se sedimenten

6137 Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angularesCuando se usa la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002 mL) desangre total con anticoagulante o sangre capilar con anticoagulante yse diluye en un tubo que contenga 380 mL de solucioacuten de Turk (aquiacutetenemos una dilucioacuten 120)

LECTURA

Fig 13

La lectura se realiza en los campos 1 3 7 y 9 como estaacute indicado en la figuraAdemaacutes de los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes sedeben contar todos los leucocitos que se encuentren adheridos en la liacuteneahorizontal superior y vertical exterior o de lo contrario todos los leucocitosadheridos a la liacutenea horizontal inferior y vertical interior

614 Resultados

Nordm de leucocitos x mm3 = leucocitos contados en 4 camposdividealtura x dilucioacuten x aacuterea

Reemplazando = leucocitos contados en 4 camposdivide110 x 120 x 4=

Leucocitos contados en 4 camposdivide4200=

X1 divide4200= Nordm leucocitos contados x 50

615 Valores de referencia

5000 - 10 000 leucocitos mm3

616 Correccioacuten de valores para restar eritrocitos nucleados

Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el liacutequido de dilucioacuten por lo tantopueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con losleucocitos de tal manera que se debe emplear la siguiente foacutermula

Caacutelculo

La concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos (por litro) esNuacutemero de normoblatos contados x concentracioacuten o nuacutemero de leucocitos100 + Nordm de normoblastos contados

Ejemplo

Si se cuentan 50 normoblastos y la concentracioacuten del nuacutemero de leucocitos es16 x 109l la concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos seraacute

50 x16 = 53 x 109l

100 + 50

y la concentracioacuten de leucocitos corregida seraacute 16 - 53 = 107 x 109lEn unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitosse expresan por miliacutemetro cuacutebico En tales unidades el caacutelculo correspondienteal ejemplo que se ha dado seriacutea

50 x 16 000 = 5300 mm3

100 + 50

Recuento corregido de gloacutebulos blancos o leucocitos = 16 000 - 5300 = 10 700 mm3

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

62 RECUENTO DE GLOacuteBULOS ROJOS

Principio

La sangre se diluye en un liacutequido que nos permite observar claramente loshematiacutees luego esta dilucioacuten se coloca en una caacutemara de Neubauer con laayuda de una pipeta automaacutetica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopioa un objetivo de 40x para calcular el nuacutemero de gloacutebulos rojos por mm3

621 Equipos

- Microscopio

- Hemocitoacutemetro (caacutemara de Neubauer)

622 Materiales y reactivos requeridos

6221 Pipeta de gloacutebulos rojos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0-100 mL)

Presenta cerca del extremo superior una marca de 101 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla roja mezcladoraluego sigue el tallo (extremo maacutes largo) el cual estaacute dividido en 10 partescon 2 marcas 1 acabando el bulbo y 05 a la mitad del tallo Se requiereigual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar

6222 Diluyente de gloacutebulos rojos Cloruro de Sodio al 09 (ver anexo)

Diluyente de Hayem (ver anexo)

6223 Contador manual (soacutelo si fuera necesario)

6224 Papel filtro

623 Procedimiento

6231 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar

6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente

6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101

6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos

6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente

6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas

6237 Dejar en reposo por 3 minutos

6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)

6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos

LECTURA

Fig 14

624 Resultados

Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea

Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15

= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000

= hematiacutees contados x 10 000

625 Valores de referencia

(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)

Hombres 4 500 000 - 5 500 000

Mujeres 4 000 000 - 5 000 000

Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000

Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000

Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)

Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal

volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen

porcentaje o como valor decimal

Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre

total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)

631 Meacutetodo de Wintrobe

Materiales requeridos

- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm

- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia

- Tapoacuten de goma

Procedimiento

diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur

comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado

de no provocar espuma

diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten

diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos

Resultados (lectura)

Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos

Valores de referencia

Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

632 Meacutetodo de microhematocrito

Materiales requeridos

- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)

- Plastilina

Procedimiento

diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel

dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon

anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80

del capilar

diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina

diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma

diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm

Resultados (lectura)

La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio

Uso de la escala

diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero

diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la

columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical

diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos

Valores de referencia

Hombres 40 - 50

Mujeres 38 - 44

Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44

Lactantes (3 meses) 37 - 42

Recieacuten nacidos 50 - 58

La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)

64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA

Principio

La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre

641 Materiales y reactivos

6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro

6412 Pipetas

diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla

diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL

6413 Tubos de ensayo

6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten

Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia

Fig 4 Fig 5

Fig 6 Fig 7

33 OBTENCIOacuteN DE SANGRE VENOSA EN TUBOS AL VACIacuteO

331 Materiales requeridos

3311 Algodoacuten

3312 Alcohol al 70

3313 Ligadura o torniquete de 25 a 30 cm de largo

3314 Tubos al vaciacuteo con anticoagulante EDTA (K3) EDTA (Na2) u otroanticoagulante

3315 Agujas con dispositivo para extraccioacuten de sangre al vaciacuteo

- Nordm 21 para adultos

- Nordm 22 para nintildeos y neonatos

De preferencia ambas de bisel corto para evitar la coagulacioacuten

332 Obtencioacuten de la muestra

3321 Repetir los pasos de 3221 a 3224

3322 Se retira el estuche protector de la aguja y eacuteste se enrosca al dispositivopara extraccioacuten de sangre al vaciacuteo

3323 Colocar la ligadura cuatro dedos por encima de la flexioacuten del codo o10 cm por encima de eacuteste y pedir al paciente que abra y cierre la manovarias veces para favorecer la dilatacioacuten de las venas

3324 Una vez escogida la vena desinfectarla con una pieza de algodoacutenembebido en etanol al 70

3325 Se coloca la aguja en direccioacuten paralela a la vena se perfora la pielhaciendo avanzar la aguja entre 05 cm y 1 cm en el tejido subcutaacuteneose inserta el tubo al vaciacuteo por la parte posterior y no preocuparse porla cantidad de sangre extraiacuteda ya que el mismo sonido del vaciacuteo avisaraacuteque la extraccioacuten terminoacute (Fig 8)

3326 Retirar la ligadura tirando del extremo doblado

3327 Colocar un pedazo de algodoacuten seco sobre la parte donde se encuentraoculta la aguja Sacar la aguja con un movimiento raacutepido y depositarlaen el recipiente de metal con desinfectante (Fig 9)

3328 Pedir al paciente que presione firmemente el algodoacuten durante 3 minutoscon el brazo extendido No se recomienda que se flexione el brazoa causa del riesgo que se forme un hematoma

3329 Mezclar por inmersioacuten suave la sangre con el anticoagulante contenidoen el tubo No agitar el contenido

Fig 8 Fig 9

333 Ventajas de una extraccioacuten de sangre venosa

3331 Pueden hacerse repetidos exaacutemenes con la misma muestra

3332 Parte de la muestra (plasma o suero) puede congelarse para referenciafutura

334 Desventajas de una extraccioacuten de sangre venosa

3341 La puncioacuten venosa por su largo procedimiento requiere mayor preparacioacuten que el meacutetodo capilar

3342 El meacutetodo es teacutecnicamente difiacutecil en nintildeos individuos obesos y pacientes en shock

3343 La hemoacutelisis debe ser evitada pues se puede obtener una disminucioacuten en el recuento de eritrocitos

3344 Debe evitarse prolongada estasis venosa producida por el torniquete pues produce hemoacutelisis y otros cambios que ponen la sangre en un estado inadecuado para el anaacutelisis de gases recuentos celulares determinacioacuten de pH sanguiacuteneo y algunas pruebas de coagulacioacuten

3345 La sangre anticoagulada si no es de obtencioacuten reciente no debe ser utilizada en extensiones de sangre pues algunos anticoagulantes producen cambios en las plaquetas que pueden causar aglutinaciones agregacioacuten plaquetaria y dificultan la identificacioacuten de leucocitos

3346 Puesto que algunos de los componentes de la sangre no son estables los recuentos de leucocitos y plaquetas e iacutendice de sedimentacioacuten deben realizarse antes de que pasen dos horas desde que se obtuvo la muestra

34 OBTENCIOacuteN DE SANGRE DE LA VENA YUGULAR EXTERNA

341 Materiales requeridos

3411 Algodoacuten

3412 Alcohol al 70

3413 Jeringas de 5 mL

3414 Viales con anticoagulante EDTA

342 Obtencioacuten de la muestra

3421 El paciente es cubierto por una saacutebana de manera que los brazospermanezcan inmovilizados a lo largo del cuerpo

3422 Al paciente se le coloca de cuacutebito dorsal sobre la mesa de examen ouna

camilla de manera que la cabeza cuelgue sobre el final de lamesa y el cuerpo sea

sujetado por un asistente

3423 Cuando el paciente grita la vena yugular externa se marca claramente

3424 Limpiar la zona en un aacuterea de 2 pulgadas con alcohol al 70 o

alcoholyodado

3425 Se repiten los pasos de 3225 a 3227 de la extraccioacuten de sangrevenosa

con jeringa

3426 Retirar la aguja de la vena y presionar suavemente con un algodoacutenseco

aproximadamente de 3 a 5 minutos Pedir al paciente que permanezcaechado diez

minutos

3427 Se repiten los pasos de 3229

3428 Se repiten los pasos de 32210

343 Ventajas

Constituye un buen meacutetodo para la obtencioacuten de sangre en pacientes conshock

con venas colapsadas

344 Desventajas

Por lo delicado en su procedimiento no se recomienda como rutina soacutelo encasos

en que no se pueda obtener la muestra por meacutetodos convencionales

35 OBTENCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR

Cuando la cantidad de sangre que se precisa es muy pequentildea o cuando

pordiferentes motivos no pueda practicarse una puncioacuten venosa debe recurrirse

a la puncioacuten capilar

351 Materiales requeridos

3512 Algodoacuten

3513 Alcohol al 70

3514 Lancetas desechables (Fig 10)

3515 Papel filtro Nordm 2

352 Procedimiento (Fig 11)

3521 La sangre capilar se obtiene de la cara lateral del dedo medio o anularen los adultos y del dedo gordo del pie o taloacuten en los nintildeos

3522 Desinfectar la zona con alcohol al 70 secar con algodoacuten esteacuteril

3523 Punzar la piel con una lanceta esteacuteril desechable (2 mm de profundidad)

3524 Usar gasa esteacuteril para desechar la primera gota y recoger las siguientesen tubos capilares Evitar comprimir la extremidad para obtenersangre porque se altera la composicioacuten sanguiacutenea

353 Ventajas

3531 Puede obtenerse con facilidad

3532 Es preferible cuando han de realizarse extensiones de sangre perifeacuterica

354 Desventajas

3541 Soacutelo se pueden obtener pequentildeas cantidades de sangre y los exaacutemenesde repeticioacuten requieren nuevas muestras

3542 La sangre en microtubos (capilares) frecuentemente se hemolizainterfiendo con la mayoriacutea de pruebas de laboratorio

3543 Los resultados obtenidos en pruebas con sangre capilar no puedenser comparados con los resultados de las pruebas con sangre venosa

3544 El dedo no soacutelo es delicado sino difiacutecil de desinfectar adecuadamenteen el tiempo disponible

3545 En pacientes con resistencia disminuida a la infeccioacuten (aquellos conleucemia agranulocitosis diabetes uremia y enfermedades con deficienciasinmunoloacutegicas) una muestra tomada del dedo es mucho maacutesprobable que conduzca a una infeccioacuten que otra tomada del brazo

3546 El recuento de eritrocitos y leucocitos asiacute como el recuento deplaquetas y reticulocitos no debe realizarse en sangre capilar debidoa la difiacutecil estandarizacioacuten del flujo sanguiacuteneo capilar

EXTRACCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR

Fig 10

Fig 11

SECCIOacuteN 4

ANTICOAGULANTES

Una vez extraiacuteda la sangre eacutesta puede conservarse coagulada o

mantenidaincoagulable mediante la adicioacuten de un anticoagulante

41 CARACTERIacuteSTICAS BAacuteSICAS DE LOS ANTICOAGULANTES MAacuteS

USADOSEN HEMATOLOGIacuteA

bull No alterar el tamantildeo de los hematiacutees

bull No producir hemoacutelisis

bull Evitar al maacuteximo la agregacioacuten plaquetaria

bull No alterar la morfologiacutea de los leucocitos

La sangre tratada con anticoagulante debe procesarse lo antes posible

inclusomantenida bajo refrigeracioacuten (4 ordmC) si no pasan de las 2 horas El

tiempomaacuteximo entre la extraccioacuten de la sangre y su procesamiento depende

delcoagulante de eleccioacuten y no debe ser maacutes de 4 horas a excepcioacuten

delanticoagulante EDTA (etilendiaminotetraceacutetico) que puede ser hasta 24

horas(en refrigeracioacuten a 4 ordmC)

Los anticoagulantes pueden emplearse en forma soacutelida o liacutequida Los

primerosestaacuten indicados para la determinacioacuten de los paraacutemetros

hematoloacutegicosya que no producen como los anticoagulantes liacutequidos dilucioacuten de

la sangre

42 ANTICOAGULANTES SOacuteLIDOS

421 EDTA

Es la sal disoacutedica o tripotaacutesica del aacutecido etilendiaminotetraceacutetico La saldisoacutedica

(Na2EDTA) es menos soluble que la sal tripotaacutesica (K3EDTA) Estoscompuestos

realizan su accioacuten a traveacutes de un efecto quelante sobre el calcioal fijarlo impiden

su activacioacuten y por ende la coagulacioacuten sanguiacutenea

4211 Ventajas

bull Respeta la morfologiacutea eritrocitaria (especialmente la sal tripotaacutesica) yleucocitaria de manera que permite una demora de dos horas en la realizacioacutendel frotis sanguiacuteneo despueacutes de la extraccioacuten sanguiacutenea

bull Asegura la conservacioacuten de los elementos formes sanguiacuteneos durante 24horas si la sangre se mantiene a 4 ordmC

bull Al inhibir la aglutinacioacuten de las plaquetas facilita su recuento o su expresioacutensemicuantitativa a partir del frotis

bull La concentracioacuten recomendada de EDTA es de 15 mgmL de sangre Unamayor cantidad de anticoagulante puede producir retraccioacuten celular condisminucioacuten del hematocrito y un aumento de la concentracioacuten media de lahemoglobina Un exceso de sangre con relacioacuten al anticoagulante produceformacioacuten de microagregados que pueden alterar los resultados El empleode tubos al vaciacuteo con una gota (50mL) de EDTA tripotaacutesica comercialpara 5 mL de sangre es de intereacutes praacutectico dado que es cien veces maacutessoluble facilitando la mezcla de sangre con anticoagulante

4212 Desventajas

Usado en exceso afecta a los eritrocitos y a los leucocitos a los cuales les produce encogimiento y cambios en su forma por ello debe cuidarse de agregar la cantidad correcta de sangre al anticoagulante

422 Anticoagulante de Wintrobe

Es una mezcla de oxalato de amonio y potasio Actuacutea por precipitacioacuten del calcio es faacutecil de preparar Se emplea en forma de polvo en proporcioacuten de 2 de oxalato de amonio por 1 de oxalato de potasio La cantidad recomendada es de 2 mg x mL de sangre Este anticoagulante no afecta el volumen globular medio y puede usarse para determinaciones de hemoglobina hematocrito y recuento globular pero para los extendidos queda limitada a los primeros minutos tampoco es uacutetil para el recuento plaquetario porque produce formacioacuten de agregados plaquetarios

423 Heparina

El nombre de heparina proviene del griego hepar que significa hiacutegado ya que fue aislado por primera vez de las ceacutelulas de este tejido Es un mucopolisacaacuterido aacutecido Presenta el

inconveniente de que si no se agita raacutepidamente con la sangre despueacutes de extraiacuteda

pueden formarse microcoaacutegulos aunque no altera el volumeneritrocitario ni la morfologiacutea de los leucocitos No es recomendablepara el frotis sanguiacuteneo porque produce un fondo azul en la laacutemina

La heparina de sodio o litio puede usarse en forma soacutelida o liacutequida en

proporcioacutende 01 - 02 mg de heparina por 1 mL de sangre

43 ANTICOAGULANTES LIacuteQUIDOS

431 Citrato trisoacutedico

Es de eleccioacuten para las pruebas de hemostasia y la velocidad de sedimentacioacuten

Actuacutea a traveacutes de la precipitacioacuten del calcio La concentracioacuten depende de

la prueba por realizar

bull Para pruebas de hemostasia se emplea en proporcioacuten de 1 9 (05 mL

deanticoagulante para 45 mL de sangre total)

bull Para la determinacioacuten de la VSG (Velocidad de Sedimentacioacuten Globular) es14

(05 mL de anticoagulante para 2 mL de sangre)

432 Oxalato soacutedico

Recomendado tambieacuten para las pruebas de hemostasia Se emplea en

proporcioacutende un volumen de anticoagulante para 4 vol de sangre

SECCIOacuteN 5

REALIZACIOacuteN Y TINCIOacuteN DEL FROTIS SANGUIacuteNEO

La praacutectica del frotis sanguiacuteneo tambieacuten llamado extendido es de gran importanciaen hematologiacutea ya que el diagnoacutestico de muchas enfermedadeshematoloacutegicas puede realizarse con soacutelo observar las caracteriacutesticasmorfoloacutegicas de las ceacutelulas sanguiacuteneas de manera que eacuteste no debe serexcesivamente grueso ni excesivamente fino Todas las laacuteminas por usarsobre todo nuevas deben ser limpiadas con algodoacuten y alcohol al 70 paraeliminar la grasa que viene adherida

51 MEacuteTODO DE LOS DOS PORTAOBJETOS

511 Materiales

- Alcohol al 70

- Algodoacuten

- Lanceta descartable

- Portaobjetos de vidrios limpios y desgrasados (25 x 75 mm)

512 Fundamento

Consiste en la extensioacuten de una gota de sangre sobre un portaobjeto (25 x 75)empleando el canto biselado de otro portaobjeto de igual dimensioacuten (Fig 12)

513 Procedimiento

5131 Una vez extraiacuteda la sangre con cualquiera de las metodologiacuteas secoloca una pequentildea gota de sangre (5mL) (aprox 3 mm de diaacutemetro)sobre un portaobjeto a 2 cm aproximadamente de uno de los extremos

5132 Colocar el canto de otro portaobjeto esmerilado sobre la superficiedel primer portaobjeto (en la que se encuentra la gota de sangre)formando un aacutengulo de 45ordm

5134 Deslizar suavemente y a velocidad moderada el portaobjeto sobre elotro en sentido longitudinal hasta que la gota de sangre quede bienextendida sobre la

superficie del primer portaobjeto El grosor delfrotis sanguiacuteneo puede variar seguacuten sea el aacutengulo que formen entresiacute ambos portaobjetos Asiacute si es superior a 45ordm la extensioacuten obtenidaseraacute gruesa y corta si es inferior a 45ordm seraacute larga y fina El secado delfrotis es a temperatura ambiente y en posicioacuten horizontal

Fig 12

1048729 Zona excesivamente gruesa Se halla en la regioacuten inmediata al punto departida de la extensioacuten (cabeza) En ella se aprecia siempre un aumento delinfocitos

1048729 Zona excesivamente fina Corresponde al final de la extensioacuten y termina enun aacuterea donde las ceacutelulas adoptan una posicioacuten acartonada (barbas) Enesta regioacuten existe un exceso de granulocitos y monocitos

1048729 Zona ideal Corresponde a la regioacuten intermedia del frotis y en ella existe unreparto equilibrado de ceacutelulas

52 COLORACIONES USADAS

Una vez seco el frotis se procede a la tincioacuten hematoloacutegica con el colorante deRomanowsky constituido por la mezcla de eosina y azul de metileno Dentrode eacutestas tenemos

521 Colorante de Giemsa

522 Colorante de May-Grunwald

523 Colorante de Wright

524 Colorante de Leishman

Preparacioacuten de colorantes (Anexo A)

1048729 Para el estudio de las ceacutelulas sanguiacuteneas utilizar el colorante 523 y 524

1048729 Para el estudio de hemoparaacutesitos utilizar el colorante 521

1048729 Utilizar el colorante 522 para casos especiales en que se desee observar

con mayor claridad y especificidad los graacutenulos de los neutrofilos

53 TINCIOacuteN CON COLORANTE DE WRIGHT

531 Fundamento

El colorante de Wright va a permitir suministrar un medio para estudiar lasangre y determinar las variaciones y anormalidades de estructura forma ytamantildeo de los eritrocitos su contenido de hemoglobina y sus propiedades decoloracioacuten La informacioacuten obtenida de un frotis de sangre perifeacuterica dependeen gran parte de la calidad del extendido y la coloracioacuten

532 Materiales

5321 Colorante de Wright (Anexo A)

5322 Frasco gotero

5323 Solucioacuten amortiguada tamponada (Anexo A)

533 Procedimiento

5331 Una vez obtenido el frotis sanguiacuteneo se le dejaraacute secar entre 15 y 20minutos

5332 Luego se coloca la preparacioacuten en un soporte y se cubre con el colorantede Wright dejaacutendolo por espacio de 5 minutos

5333 Posteriormente se antildeade solucioacuten amortiguada tamponada en partesiguales hasta obtener un brillo metaacutelico dejando 6 minutos adicionales

5334 Finalmente se lava con agua corriente y se deja secar

5335 Se coloca en el microscopio y con pequentildeo aumento se revisa lacalidad de la coloracioacuten la cantidad aproximada de gloacutebulos blancosy se escoge el sitio para iniciar el recuento Se coloca una gota deaceite de inmersioacuten y se enfoca a un aumento de 100xLa forma de los gloacutebulos rojos se examinaraacute detenidamente observandoademaacutes del color (cantidad de hemoglobina) presencia deplaquetas su agrupacioacuten y distribucioacuten

5336 Posteriormente se hace el recuento diferencial de gloacutebulos blancosen 100

ceacutelulas para lo cual se deberaacute conocer las diferencias entreneutroacutefilos eosinoacutefilos

linfocitos y monocitosUna extensioacuten de sangre bien tentildeida debe caracterizarse

por unabuena diferenciacioacuten de las estructuras subcelulares en los leucocitosuna

coloracioacuten rosada de los hematiacutees y la ausencia de precipitados

Los defectos maacutes frecuentes observados en la tincioacuten del frotis sanguiacuteneoson

Coloracioacuten excesivamente azul debido a

1048729 Frotis excesivamente grueso

1048729 Lavado insuficiente

1048729 Tincioacuten muy prolongada

1048729 Empleo de colorante excesivamente alcalino

Coloracioacuten con una tonalidad rosada

1048729 El colorante el tampoacuten o el agua de lavado tienen un pH demasiadoaacutecido

Presencia de precipitados

1048729 Obedecen a una accioacuten excesiva del colorante Esto se puede evitarcon la

filtracioacuten

SECCIOacuteN 6

HEMOGRAMA-HEMOGLOBINA-HEMATOCRITO

El hemograma de Shilling constituye uno de los exaacutemenes de laboratorio

maacutesusados en el campo de la hematologiacutea Comprende las siguientes pruebas

61 RECUENTO LEUCOCITARIO

Principio

La sangre anticoagulada se deposita en un liacutequido que permite evidenciar

losleucocitos mantenieacutendolos visibles mientras que los eritrocitos

sonhemolizados El recuento del nuacutemero de leucocitos o gloacutebulos blancos se

expresapor mm3 (miliacutemetro cuacutebico)

611 Equipos

- Microscopio

- Hemocitoacutemetro (Caacutemara de Neubauer)

Consta de los siguientes elementos

diams Una laacutemina portaobjeto gruesa en el centro se hallan dos

superficiescuadriculadas iguales separadas del resto de la laacutemina por surcos y

dosbarras transversales algo maacutes elevadas

diams Una laminilla cubreobjetos oacutepticamente plana que al colocarse sobrelas barras

elevadas de la laacutemina forma una caacutemara entre el cubreobjetosy la superficie

cuadriculadaLa altura entre el cubreobjetos y la laacutemina portaobjetos es de 01

mmCada cuadriacutecula mide 3 mm de lado y se divide en 9 cuadrados grandesCada

uno de los cuales mide 1 mm2 de superficie que se subdivide a suvez en 16

cuadrados medianos El cuadrado grande central se divide en25 cuadrados

pequentildeos y cada uno de ellos en 16 cuadraditos Cadacuadrado pequentildeo mide

02 mm de lado (004 mm2 de superficie) y cadacuadradito mide 005 mm de lado

(00025 mm2 de superficie)

612 Materiales y reactivos requeridos

6121 Pipeta de gloacutebulos blancos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0 a 100 mL)Presenta cerca del extremo superior una marca de 11 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla que funciona comomezcladora luego sigue el extremo maacutes largo de la pipeta (tallo) que estaacutedividida en 10 partes con 2 marcas 1 (parte final del bulbo) y 05 (a la mitaddel tallo) Se le acopla a su extremo superior 1 tubo de goma y una bombillapara aspirar

6122 Diluyente de gloacutebulos blancos Solucioacuten de Turk al 1

6123 Contador manual (Soacutelo si fuera necesario)

6124 Papel filtro

613 Procedimiento

6131 Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar deldedo se procede a aspirar la sangre con la pipeta de gloacutebulos blancoshasta la marca de 05 y a limpiar la punta con papel absorbente

6132 Introducir la pipeta en el tubo que contenga solucioacuten de Turk y absorberhasta la marca de 11 (no debe haber burbujas)

6133 Tapar ambos extremos y proceder a mezclar manualmente o en unrotador automaacutetico por 2 oacute 3 minutos

6134 Monte la laminilla de vidrio en la caacutemara para recuento que debe estarlimpia y seca

6135 Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocaruna gota pequentildea de esta solucioacuten en la caacutemara

6136 Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las ceacutelulas se sedimenten

6137 Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angularesCuando se usa la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002 mL) desangre total con anticoagulante o sangre capilar con anticoagulante yse diluye en un tubo que contenga 380 mL de solucioacuten de Turk (aquiacutetenemos una dilucioacuten 120)

LECTURA

Fig 13

La lectura se realiza en los campos 1 3 7 y 9 como estaacute indicado en la figuraAdemaacutes de los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes sedeben contar todos los leucocitos que se encuentren adheridos en la liacuteneahorizontal superior y vertical exterior o de lo contrario todos los leucocitosadheridos a la liacutenea horizontal inferior y vertical interior

614 Resultados

Nordm de leucocitos x mm3 = leucocitos contados en 4 camposdividealtura x dilucioacuten x aacuterea

Reemplazando = leucocitos contados en 4 camposdivide110 x 120 x 4=

Leucocitos contados en 4 camposdivide4200=

X1 divide4200= Nordm leucocitos contados x 50

615 Valores de referencia

5000 - 10 000 leucocitos mm3

616 Correccioacuten de valores para restar eritrocitos nucleados

Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el liacutequido de dilucioacuten por lo tantopueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con losleucocitos de tal manera que se debe emplear la siguiente foacutermula

Caacutelculo

La concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos (por litro) esNuacutemero de normoblatos contados x concentracioacuten o nuacutemero de leucocitos100 + Nordm de normoblastos contados

Ejemplo

Si se cuentan 50 normoblastos y la concentracioacuten del nuacutemero de leucocitos es16 x 109l la concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos seraacute

50 x16 = 53 x 109l

100 + 50

y la concentracioacuten de leucocitos corregida seraacute 16 - 53 = 107 x 109lEn unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitosse expresan por miliacutemetro cuacutebico En tales unidades el caacutelculo correspondienteal ejemplo que se ha dado seriacutea

50 x 16 000 = 5300 mm3

100 + 50

Recuento corregido de gloacutebulos blancos o leucocitos = 16 000 - 5300 = 10 700 mm3

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

62 RECUENTO DE GLOacuteBULOS ROJOS

Principio

La sangre se diluye en un liacutequido que nos permite observar claramente loshematiacutees luego esta dilucioacuten se coloca en una caacutemara de Neubauer con laayuda de una pipeta automaacutetica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopioa un objetivo de 40x para calcular el nuacutemero de gloacutebulos rojos por mm3

621 Equipos

- Microscopio

- Hemocitoacutemetro (caacutemara de Neubauer)

622 Materiales y reactivos requeridos

6221 Pipeta de gloacutebulos rojos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0-100 mL)

Presenta cerca del extremo superior una marca de 101 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla roja mezcladoraluego sigue el tallo (extremo maacutes largo) el cual estaacute dividido en 10 partescon 2 marcas 1 acabando el bulbo y 05 a la mitad del tallo Se requiereigual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar

6222 Diluyente de gloacutebulos rojos Cloruro de Sodio al 09 (ver anexo)

Diluyente de Hayem (ver anexo)

6223 Contador manual (soacutelo si fuera necesario)

6224 Papel filtro

623 Procedimiento

6231 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar

6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente

6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101

6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos

6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente

6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas

6237 Dejar en reposo por 3 minutos

6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)

6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos

LECTURA

Fig 14

624 Resultados

Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea

Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15

= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000

= hematiacutees contados x 10 000

625 Valores de referencia

(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)

Hombres 4 500 000 - 5 500 000

Mujeres 4 000 000 - 5 000 000

Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000

Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000

Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)

Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal

volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen

porcentaje o como valor decimal

Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre

total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)

631 Meacutetodo de Wintrobe

Materiales requeridos

- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm

- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia

- Tapoacuten de goma

Procedimiento

diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur

comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado

de no provocar espuma

diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten

diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos

Resultados (lectura)

Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos

Valores de referencia

Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

632 Meacutetodo de microhematocrito

Materiales requeridos

- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)

- Plastilina

Procedimiento

diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel

dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon

anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80

del capilar

diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina

diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma

diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm

Resultados (lectura)

La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio

Uso de la escala

diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero

diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la

columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical

diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos

Valores de referencia

Hombres 40 - 50

Mujeres 38 - 44

Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44

Lactantes (3 meses) 37 - 42

Recieacuten nacidos 50 - 58

La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)

64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA

Principio

La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre

641 Materiales y reactivos

6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro

6412 Pipetas

diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla

diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL

6413 Tubos de ensayo

6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten

Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia

3321 Repetir los pasos de 3221 a 3224

3322 Se retira el estuche protector de la aguja y eacuteste se enrosca al dispositivopara extraccioacuten de sangre al vaciacuteo

3323 Colocar la ligadura cuatro dedos por encima de la flexioacuten del codo o10 cm por encima de eacuteste y pedir al paciente que abra y cierre la manovarias veces para favorecer la dilatacioacuten de las venas

3324 Una vez escogida la vena desinfectarla con una pieza de algodoacutenembebido en etanol al 70

3325 Se coloca la aguja en direccioacuten paralela a la vena se perfora la pielhaciendo avanzar la aguja entre 05 cm y 1 cm en el tejido subcutaacuteneose inserta el tubo al vaciacuteo por la parte posterior y no preocuparse porla cantidad de sangre extraiacuteda ya que el mismo sonido del vaciacuteo avisaraacuteque la extraccioacuten terminoacute (Fig 8)

3326 Retirar la ligadura tirando del extremo doblado

3327 Colocar un pedazo de algodoacuten seco sobre la parte donde se encuentraoculta la aguja Sacar la aguja con un movimiento raacutepido y depositarlaen el recipiente de metal con desinfectante (Fig 9)

3328 Pedir al paciente que presione firmemente el algodoacuten durante 3 minutoscon el brazo extendido No se recomienda que se flexione el brazoa causa del riesgo que se forme un hematoma

3329 Mezclar por inmersioacuten suave la sangre con el anticoagulante contenidoen el tubo No agitar el contenido

Fig 8 Fig 9

333 Ventajas de una extraccioacuten de sangre venosa

3331 Pueden hacerse repetidos exaacutemenes con la misma muestra

3332 Parte de la muestra (plasma o suero) puede congelarse para referenciafutura

334 Desventajas de una extraccioacuten de sangre venosa

3341 La puncioacuten venosa por su largo procedimiento requiere mayor preparacioacuten que el meacutetodo capilar

3342 El meacutetodo es teacutecnicamente difiacutecil en nintildeos individuos obesos y pacientes en shock

3343 La hemoacutelisis debe ser evitada pues se puede obtener una disminucioacuten en el recuento de eritrocitos

3344 Debe evitarse prolongada estasis venosa producida por el torniquete pues produce hemoacutelisis y otros cambios que ponen la sangre en un estado inadecuado para el anaacutelisis de gases recuentos celulares determinacioacuten de pH sanguiacuteneo y algunas pruebas de coagulacioacuten

3345 La sangre anticoagulada si no es de obtencioacuten reciente no debe ser utilizada en extensiones de sangre pues algunos anticoagulantes producen cambios en las plaquetas que pueden causar aglutinaciones agregacioacuten plaquetaria y dificultan la identificacioacuten de leucocitos

3346 Puesto que algunos de los componentes de la sangre no son estables los recuentos de leucocitos y plaquetas e iacutendice de sedimentacioacuten deben realizarse antes de que pasen dos horas desde que se obtuvo la muestra

34 OBTENCIOacuteN DE SANGRE DE LA VENA YUGULAR EXTERNA

341 Materiales requeridos

3411 Algodoacuten

3412 Alcohol al 70

3413 Jeringas de 5 mL

3414 Viales con anticoagulante EDTA

342 Obtencioacuten de la muestra

3421 El paciente es cubierto por una saacutebana de manera que los brazospermanezcan inmovilizados a lo largo del cuerpo

3422 Al paciente se le coloca de cuacutebito dorsal sobre la mesa de examen ouna

camilla de manera que la cabeza cuelgue sobre el final de lamesa y el cuerpo sea

sujetado por un asistente

3423 Cuando el paciente grita la vena yugular externa se marca claramente

3424 Limpiar la zona en un aacuterea de 2 pulgadas con alcohol al 70 o

alcoholyodado

3425 Se repiten los pasos de 3225 a 3227 de la extraccioacuten de sangrevenosa

con jeringa

3426 Retirar la aguja de la vena y presionar suavemente con un algodoacutenseco

aproximadamente de 3 a 5 minutos Pedir al paciente que permanezcaechado diez

minutos

3427 Se repiten los pasos de 3229

3428 Se repiten los pasos de 32210

343 Ventajas

Constituye un buen meacutetodo para la obtencioacuten de sangre en pacientes conshock

con venas colapsadas

344 Desventajas

Por lo delicado en su procedimiento no se recomienda como rutina soacutelo encasos

en que no se pueda obtener la muestra por meacutetodos convencionales

35 OBTENCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR

Cuando la cantidad de sangre que se precisa es muy pequentildea o cuando

pordiferentes motivos no pueda practicarse una puncioacuten venosa debe recurrirse

a la puncioacuten capilar

351 Materiales requeridos

3512 Algodoacuten

3513 Alcohol al 70

3514 Lancetas desechables (Fig 10)

3515 Papel filtro Nordm 2

352 Procedimiento (Fig 11)

3521 La sangre capilar se obtiene de la cara lateral del dedo medio o anularen los adultos y del dedo gordo del pie o taloacuten en los nintildeos

3522 Desinfectar la zona con alcohol al 70 secar con algodoacuten esteacuteril

3523 Punzar la piel con una lanceta esteacuteril desechable (2 mm de profundidad)

3524 Usar gasa esteacuteril para desechar la primera gota y recoger las siguientesen tubos capilares Evitar comprimir la extremidad para obtenersangre porque se altera la composicioacuten sanguiacutenea

353 Ventajas

3531 Puede obtenerse con facilidad

3532 Es preferible cuando han de realizarse extensiones de sangre perifeacuterica

354 Desventajas

3541 Soacutelo se pueden obtener pequentildeas cantidades de sangre y los exaacutemenesde repeticioacuten requieren nuevas muestras

3542 La sangre en microtubos (capilares) frecuentemente se hemolizainterfiendo con la mayoriacutea de pruebas de laboratorio

3543 Los resultados obtenidos en pruebas con sangre capilar no puedenser comparados con los resultados de las pruebas con sangre venosa

3544 El dedo no soacutelo es delicado sino difiacutecil de desinfectar adecuadamenteen el tiempo disponible

3545 En pacientes con resistencia disminuida a la infeccioacuten (aquellos conleucemia agranulocitosis diabetes uremia y enfermedades con deficienciasinmunoloacutegicas) una muestra tomada del dedo es mucho maacutesprobable que conduzca a una infeccioacuten que otra tomada del brazo

3546 El recuento de eritrocitos y leucocitos asiacute como el recuento deplaquetas y reticulocitos no debe realizarse en sangre capilar debidoa la difiacutecil estandarizacioacuten del flujo sanguiacuteneo capilar

EXTRACCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR

Fig 10

Fig 11

SECCIOacuteN 4

ANTICOAGULANTES

Una vez extraiacuteda la sangre eacutesta puede conservarse coagulada o

mantenidaincoagulable mediante la adicioacuten de un anticoagulante

41 CARACTERIacuteSTICAS BAacuteSICAS DE LOS ANTICOAGULANTES MAacuteS

USADOSEN HEMATOLOGIacuteA

bull No alterar el tamantildeo de los hematiacutees

bull No producir hemoacutelisis

bull Evitar al maacuteximo la agregacioacuten plaquetaria

bull No alterar la morfologiacutea de los leucocitos

La sangre tratada con anticoagulante debe procesarse lo antes posible

inclusomantenida bajo refrigeracioacuten (4 ordmC) si no pasan de las 2 horas El

tiempomaacuteximo entre la extraccioacuten de la sangre y su procesamiento depende

delcoagulante de eleccioacuten y no debe ser maacutes de 4 horas a excepcioacuten

delanticoagulante EDTA (etilendiaminotetraceacutetico) que puede ser hasta 24

horas(en refrigeracioacuten a 4 ordmC)

Los anticoagulantes pueden emplearse en forma soacutelida o liacutequida Los

primerosestaacuten indicados para la determinacioacuten de los paraacutemetros

hematoloacutegicosya que no producen como los anticoagulantes liacutequidos dilucioacuten de

la sangre

42 ANTICOAGULANTES SOacuteLIDOS

421 EDTA

Es la sal disoacutedica o tripotaacutesica del aacutecido etilendiaminotetraceacutetico La saldisoacutedica

(Na2EDTA) es menos soluble que la sal tripotaacutesica (K3EDTA) Estoscompuestos

realizan su accioacuten a traveacutes de un efecto quelante sobre el calcioal fijarlo impiden

su activacioacuten y por ende la coagulacioacuten sanguiacutenea

4211 Ventajas

bull Respeta la morfologiacutea eritrocitaria (especialmente la sal tripotaacutesica) yleucocitaria de manera que permite una demora de dos horas en la realizacioacutendel frotis sanguiacuteneo despueacutes de la extraccioacuten sanguiacutenea

bull Asegura la conservacioacuten de los elementos formes sanguiacuteneos durante 24horas si la sangre se mantiene a 4 ordmC

bull Al inhibir la aglutinacioacuten de las plaquetas facilita su recuento o su expresioacutensemicuantitativa a partir del frotis

bull La concentracioacuten recomendada de EDTA es de 15 mgmL de sangre Unamayor cantidad de anticoagulante puede producir retraccioacuten celular condisminucioacuten del hematocrito y un aumento de la concentracioacuten media de lahemoglobina Un exceso de sangre con relacioacuten al anticoagulante produceformacioacuten de microagregados que pueden alterar los resultados El empleode tubos al vaciacuteo con una gota (50mL) de EDTA tripotaacutesica comercialpara 5 mL de sangre es de intereacutes praacutectico dado que es cien veces maacutessoluble facilitando la mezcla de sangre con anticoagulante

4212 Desventajas

Usado en exceso afecta a los eritrocitos y a los leucocitos a los cuales les produce encogimiento y cambios en su forma por ello debe cuidarse de agregar la cantidad correcta de sangre al anticoagulante

422 Anticoagulante de Wintrobe

Es una mezcla de oxalato de amonio y potasio Actuacutea por precipitacioacuten del calcio es faacutecil de preparar Se emplea en forma de polvo en proporcioacuten de 2 de oxalato de amonio por 1 de oxalato de potasio La cantidad recomendada es de 2 mg x mL de sangre Este anticoagulante no afecta el volumen globular medio y puede usarse para determinaciones de hemoglobina hematocrito y recuento globular pero para los extendidos queda limitada a los primeros minutos tampoco es uacutetil para el recuento plaquetario porque produce formacioacuten de agregados plaquetarios

423 Heparina

El nombre de heparina proviene del griego hepar que significa hiacutegado ya que fue aislado por primera vez de las ceacutelulas de este tejido Es un mucopolisacaacuterido aacutecido Presenta el

inconveniente de que si no se agita raacutepidamente con la sangre despueacutes de extraiacuteda

pueden formarse microcoaacutegulos aunque no altera el volumeneritrocitario ni la morfologiacutea de los leucocitos No es recomendablepara el frotis sanguiacuteneo porque produce un fondo azul en la laacutemina

La heparina de sodio o litio puede usarse en forma soacutelida o liacutequida en

proporcioacutende 01 - 02 mg de heparina por 1 mL de sangre

43 ANTICOAGULANTES LIacuteQUIDOS

431 Citrato trisoacutedico

Es de eleccioacuten para las pruebas de hemostasia y la velocidad de sedimentacioacuten

Actuacutea a traveacutes de la precipitacioacuten del calcio La concentracioacuten depende de

la prueba por realizar

bull Para pruebas de hemostasia se emplea en proporcioacuten de 1 9 (05 mL

deanticoagulante para 45 mL de sangre total)

bull Para la determinacioacuten de la VSG (Velocidad de Sedimentacioacuten Globular) es14

(05 mL de anticoagulante para 2 mL de sangre)

432 Oxalato soacutedico

Recomendado tambieacuten para las pruebas de hemostasia Se emplea en

proporcioacutende un volumen de anticoagulante para 4 vol de sangre

SECCIOacuteN 5

REALIZACIOacuteN Y TINCIOacuteN DEL FROTIS SANGUIacuteNEO

La praacutectica del frotis sanguiacuteneo tambieacuten llamado extendido es de gran importanciaen hematologiacutea ya que el diagnoacutestico de muchas enfermedadeshematoloacutegicas puede realizarse con soacutelo observar las caracteriacutesticasmorfoloacutegicas de las ceacutelulas sanguiacuteneas de manera que eacuteste no debe serexcesivamente grueso ni excesivamente fino Todas las laacuteminas por usarsobre todo nuevas deben ser limpiadas con algodoacuten y alcohol al 70 paraeliminar la grasa que viene adherida

51 MEacuteTODO DE LOS DOS PORTAOBJETOS

511 Materiales

- Alcohol al 70

- Algodoacuten

- Lanceta descartable

- Portaobjetos de vidrios limpios y desgrasados (25 x 75 mm)

512 Fundamento

Consiste en la extensioacuten de una gota de sangre sobre un portaobjeto (25 x 75)empleando el canto biselado de otro portaobjeto de igual dimensioacuten (Fig 12)

513 Procedimiento

5131 Una vez extraiacuteda la sangre con cualquiera de las metodologiacuteas secoloca una pequentildea gota de sangre (5mL) (aprox 3 mm de diaacutemetro)sobre un portaobjeto a 2 cm aproximadamente de uno de los extremos

5132 Colocar el canto de otro portaobjeto esmerilado sobre la superficiedel primer portaobjeto (en la que se encuentra la gota de sangre)formando un aacutengulo de 45ordm

5134 Deslizar suavemente y a velocidad moderada el portaobjeto sobre elotro en sentido longitudinal hasta que la gota de sangre quede bienextendida sobre la

superficie del primer portaobjeto El grosor delfrotis sanguiacuteneo puede variar seguacuten sea el aacutengulo que formen entresiacute ambos portaobjetos Asiacute si es superior a 45ordm la extensioacuten obtenidaseraacute gruesa y corta si es inferior a 45ordm seraacute larga y fina El secado delfrotis es a temperatura ambiente y en posicioacuten horizontal

Fig 12

1048729 Zona excesivamente gruesa Se halla en la regioacuten inmediata al punto departida de la extensioacuten (cabeza) En ella se aprecia siempre un aumento delinfocitos

1048729 Zona excesivamente fina Corresponde al final de la extensioacuten y termina enun aacuterea donde las ceacutelulas adoptan una posicioacuten acartonada (barbas) Enesta regioacuten existe un exceso de granulocitos y monocitos

1048729 Zona ideal Corresponde a la regioacuten intermedia del frotis y en ella existe unreparto equilibrado de ceacutelulas

52 COLORACIONES USADAS

Una vez seco el frotis se procede a la tincioacuten hematoloacutegica con el colorante deRomanowsky constituido por la mezcla de eosina y azul de metileno Dentrode eacutestas tenemos

521 Colorante de Giemsa

522 Colorante de May-Grunwald

523 Colorante de Wright

524 Colorante de Leishman

Preparacioacuten de colorantes (Anexo A)

1048729 Para el estudio de las ceacutelulas sanguiacuteneas utilizar el colorante 523 y 524

1048729 Para el estudio de hemoparaacutesitos utilizar el colorante 521

1048729 Utilizar el colorante 522 para casos especiales en que se desee observar

con mayor claridad y especificidad los graacutenulos de los neutrofilos

53 TINCIOacuteN CON COLORANTE DE WRIGHT

531 Fundamento

El colorante de Wright va a permitir suministrar un medio para estudiar lasangre y determinar las variaciones y anormalidades de estructura forma ytamantildeo de los eritrocitos su contenido de hemoglobina y sus propiedades decoloracioacuten La informacioacuten obtenida de un frotis de sangre perifeacuterica dependeen gran parte de la calidad del extendido y la coloracioacuten

532 Materiales

5321 Colorante de Wright (Anexo A)

5322 Frasco gotero

5323 Solucioacuten amortiguada tamponada (Anexo A)

533 Procedimiento

5331 Una vez obtenido el frotis sanguiacuteneo se le dejaraacute secar entre 15 y 20minutos

5332 Luego se coloca la preparacioacuten en un soporte y se cubre con el colorantede Wright dejaacutendolo por espacio de 5 minutos

5333 Posteriormente se antildeade solucioacuten amortiguada tamponada en partesiguales hasta obtener un brillo metaacutelico dejando 6 minutos adicionales

5334 Finalmente se lava con agua corriente y se deja secar

5335 Se coloca en el microscopio y con pequentildeo aumento se revisa lacalidad de la coloracioacuten la cantidad aproximada de gloacutebulos blancosy se escoge el sitio para iniciar el recuento Se coloca una gota deaceite de inmersioacuten y se enfoca a un aumento de 100xLa forma de los gloacutebulos rojos se examinaraacute detenidamente observandoademaacutes del color (cantidad de hemoglobina) presencia deplaquetas su agrupacioacuten y distribucioacuten

5336 Posteriormente se hace el recuento diferencial de gloacutebulos blancosen 100

ceacutelulas para lo cual se deberaacute conocer las diferencias entreneutroacutefilos eosinoacutefilos

linfocitos y monocitosUna extensioacuten de sangre bien tentildeida debe caracterizarse

por unabuena diferenciacioacuten de las estructuras subcelulares en los leucocitosuna

coloracioacuten rosada de los hematiacutees y la ausencia de precipitados

Los defectos maacutes frecuentes observados en la tincioacuten del frotis sanguiacuteneoson

Coloracioacuten excesivamente azul debido a

1048729 Frotis excesivamente grueso

1048729 Lavado insuficiente

1048729 Tincioacuten muy prolongada

1048729 Empleo de colorante excesivamente alcalino

Coloracioacuten con una tonalidad rosada

1048729 El colorante el tampoacuten o el agua de lavado tienen un pH demasiadoaacutecido

Presencia de precipitados

1048729 Obedecen a una accioacuten excesiva del colorante Esto se puede evitarcon la

filtracioacuten

SECCIOacuteN 6

HEMOGRAMA-HEMOGLOBINA-HEMATOCRITO

El hemograma de Shilling constituye uno de los exaacutemenes de laboratorio

maacutesusados en el campo de la hematologiacutea Comprende las siguientes pruebas

61 RECUENTO LEUCOCITARIO

Principio

La sangre anticoagulada se deposita en un liacutequido que permite evidenciar

losleucocitos mantenieacutendolos visibles mientras que los eritrocitos

sonhemolizados El recuento del nuacutemero de leucocitos o gloacutebulos blancos se

expresapor mm3 (miliacutemetro cuacutebico)

611 Equipos

- Microscopio

- Hemocitoacutemetro (Caacutemara de Neubauer)

Consta de los siguientes elementos

diams Una laacutemina portaobjeto gruesa en el centro se hallan dos

superficiescuadriculadas iguales separadas del resto de la laacutemina por surcos y

dosbarras transversales algo maacutes elevadas

diams Una laminilla cubreobjetos oacutepticamente plana que al colocarse sobrelas barras

elevadas de la laacutemina forma una caacutemara entre el cubreobjetosy la superficie

cuadriculadaLa altura entre el cubreobjetos y la laacutemina portaobjetos es de 01

mmCada cuadriacutecula mide 3 mm de lado y se divide en 9 cuadrados grandesCada

uno de los cuales mide 1 mm2 de superficie que se subdivide a suvez en 16

cuadrados medianos El cuadrado grande central se divide en25 cuadrados

pequentildeos y cada uno de ellos en 16 cuadraditos Cadacuadrado pequentildeo mide

02 mm de lado (004 mm2 de superficie) y cadacuadradito mide 005 mm de lado

(00025 mm2 de superficie)

612 Materiales y reactivos requeridos

6121 Pipeta de gloacutebulos blancos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0 a 100 mL)Presenta cerca del extremo superior una marca de 11 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla que funciona comomezcladora luego sigue el extremo maacutes largo de la pipeta (tallo) que estaacutedividida en 10 partes con 2 marcas 1 (parte final del bulbo) y 05 (a la mitaddel tallo) Se le acopla a su extremo superior 1 tubo de goma y una bombillapara aspirar

6122 Diluyente de gloacutebulos blancos Solucioacuten de Turk al 1

6123 Contador manual (Soacutelo si fuera necesario)

6124 Papel filtro

613 Procedimiento

6131 Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar deldedo se procede a aspirar la sangre con la pipeta de gloacutebulos blancoshasta la marca de 05 y a limpiar la punta con papel absorbente

6132 Introducir la pipeta en el tubo que contenga solucioacuten de Turk y absorberhasta la marca de 11 (no debe haber burbujas)

6133 Tapar ambos extremos y proceder a mezclar manualmente o en unrotador automaacutetico por 2 oacute 3 minutos

6134 Monte la laminilla de vidrio en la caacutemara para recuento que debe estarlimpia y seca

6135 Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocaruna gota pequentildea de esta solucioacuten en la caacutemara

6136 Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las ceacutelulas se sedimenten

6137 Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angularesCuando se usa la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002 mL) desangre total con anticoagulante o sangre capilar con anticoagulante yse diluye en un tubo que contenga 380 mL de solucioacuten de Turk (aquiacutetenemos una dilucioacuten 120)

LECTURA

Fig 13

La lectura se realiza en los campos 1 3 7 y 9 como estaacute indicado en la figuraAdemaacutes de los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes sedeben contar todos los leucocitos que se encuentren adheridos en la liacuteneahorizontal superior y vertical exterior o de lo contrario todos los leucocitosadheridos a la liacutenea horizontal inferior y vertical interior

614 Resultados

Nordm de leucocitos x mm3 = leucocitos contados en 4 camposdividealtura x dilucioacuten x aacuterea

Reemplazando = leucocitos contados en 4 camposdivide110 x 120 x 4=

Leucocitos contados en 4 camposdivide4200=

X1 divide4200= Nordm leucocitos contados x 50

615 Valores de referencia

5000 - 10 000 leucocitos mm3

616 Correccioacuten de valores para restar eritrocitos nucleados

Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el liacutequido de dilucioacuten por lo tantopueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con losleucocitos de tal manera que se debe emplear la siguiente foacutermula

Caacutelculo

La concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos (por litro) esNuacutemero de normoblatos contados x concentracioacuten o nuacutemero de leucocitos100 + Nordm de normoblastos contados

Ejemplo

Si se cuentan 50 normoblastos y la concentracioacuten del nuacutemero de leucocitos es16 x 109l la concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos seraacute

50 x16 = 53 x 109l

100 + 50

y la concentracioacuten de leucocitos corregida seraacute 16 - 53 = 107 x 109lEn unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitosse expresan por miliacutemetro cuacutebico En tales unidades el caacutelculo correspondienteal ejemplo que se ha dado seriacutea

50 x 16 000 = 5300 mm3

100 + 50

Recuento corregido de gloacutebulos blancos o leucocitos = 16 000 - 5300 = 10 700 mm3

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

62 RECUENTO DE GLOacuteBULOS ROJOS

Principio

La sangre se diluye en un liacutequido que nos permite observar claramente loshematiacutees luego esta dilucioacuten se coloca en una caacutemara de Neubauer con laayuda de una pipeta automaacutetica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopioa un objetivo de 40x para calcular el nuacutemero de gloacutebulos rojos por mm3

621 Equipos

- Microscopio

- Hemocitoacutemetro (caacutemara de Neubauer)

622 Materiales y reactivos requeridos

6221 Pipeta de gloacutebulos rojos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0-100 mL)

Presenta cerca del extremo superior una marca de 101 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla roja mezcladoraluego sigue el tallo (extremo maacutes largo) el cual estaacute dividido en 10 partescon 2 marcas 1 acabando el bulbo y 05 a la mitad del tallo Se requiereigual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar

6222 Diluyente de gloacutebulos rojos Cloruro de Sodio al 09 (ver anexo)

Diluyente de Hayem (ver anexo)

6223 Contador manual (soacutelo si fuera necesario)

6224 Papel filtro

623 Procedimiento

6231 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar

6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente

6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101

6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos

6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente

6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas

6237 Dejar en reposo por 3 minutos

6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)

6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos

LECTURA

Fig 14

624 Resultados

Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea

Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15

= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000

= hematiacutees contados x 10 000

625 Valores de referencia

(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)

Hombres 4 500 000 - 5 500 000

Mujeres 4 000 000 - 5 000 000

Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000

Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000

Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)

Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal

volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen

porcentaje o como valor decimal

Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre

total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)

631 Meacutetodo de Wintrobe

Materiales requeridos

- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm

- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia

- Tapoacuten de goma

Procedimiento

diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur

comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado

de no provocar espuma

diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten

diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos

Resultados (lectura)

Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos

Valores de referencia

Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

632 Meacutetodo de microhematocrito

Materiales requeridos

- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)

- Plastilina

Procedimiento

diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel

dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon

anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80

del capilar

diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina

diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma

diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm

Resultados (lectura)

La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio

Uso de la escala

diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero

diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la

columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical

diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos

Valores de referencia

Hombres 40 - 50

Mujeres 38 - 44

Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44

Lactantes (3 meses) 37 - 42

Recieacuten nacidos 50 - 58

La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)

64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA

Principio

La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre

641 Materiales y reactivos

6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro

6412 Pipetas

diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla

diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL

6413 Tubos de ensayo

6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten

Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia

3331 Pueden hacerse repetidos exaacutemenes con la misma muestra

3332 Parte de la muestra (plasma o suero) puede congelarse para referenciafutura

334 Desventajas de una extraccioacuten de sangre venosa

3341 La puncioacuten venosa por su largo procedimiento requiere mayor preparacioacuten que el meacutetodo capilar

3342 El meacutetodo es teacutecnicamente difiacutecil en nintildeos individuos obesos y pacientes en shock

3343 La hemoacutelisis debe ser evitada pues se puede obtener una disminucioacuten en el recuento de eritrocitos

3344 Debe evitarse prolongada estasis venosa producida por el torniquete pues produce hemoacutelisis y otros cambios que ponen la sangre en un estado inadecuado para el anaacutelisis de gases recuentos celulares determinacioacuten de pH sanguiacuteneo y algunas pruebas de coagulacioacuten

3345 La sangre anticoagulada si no es de obtencioacuten reciente no debe ser utilizada en extensiones de sangre pues algunos anticoagulantes producen cambios en las plaquetas que pueden causar aglutinaciones agregacioacuten plaquetaria y dificultan la identificacioacuten de leucocitos

3346 Puesto que algunos de los componentes de la sangre no son estables los recuentos de leucocitos y plaquetas e iacutendice de sedimentacioacuten deben realizarse antes de que pasen dos horas desde que se obtuvo la muestra

34 OBTENCIOacuteN DE SANGRE DE LA VENA YUGULAR EXTERNA

341 Materiales requeridos

3411 Algodoacuten

3412 Alcohol al 70

3413 Jeringas de 5 mL

3414 Viales con anticoagulante EDTA

342 Obtencioacuten de la muestra

3421 El paciente es cubierto por una saacutebana de manera que los brazospermanezcan inmovilizados a lo largo del cuerpo

3422 Al paciente se le coloca de cuacutebito dorsal sobre la mesa de examen ouna

camilla de manera que la cabeza cuelgue sobre el final de lamesa y el cuerpo sea

sujetado por un asistente

3423 Cuando el paciente grita la vena yugular externa se marca claramente

3424 Limpiar la zona en un aacuterea de 2 pulgadas con alcohol al 70 o

alcoholyodado

3425 Se repiten los pasos de 3225 a 3227 de la extraccioacuten de sangrevenosa

con jeringa

3426 Retirar la aguja de la vena y presionar suavemente con un algodoacutenseco

aproximadamente de 3 a 5 minutos Pedir al paciente que permanezcaechado diez

minutos

3427 Se repiten los pasos de 3229

3428 Se repiten los pasos de 32210

343 Ventajas

Constituye un buen meacutetodo para la obtencioacuten de sangre en pacientes conshock

con venas colapsadas

344 Desventajas

Por lo delicado en su procedimiento no se recomienda como rutina soacutelo encasos

en que no se pueda obtener la muestra por meacutetodos convencionales

35 OBTENCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR

Cuando la cantidad de sangre que se precisa es muy pequentildea o cuando

pordiferentes motivos no pueda practicarse una puncioacuten venosa debe recurrirse

a la puncioacuten capilar

351 Materiales requeridos

3512 Algodoacuten

3513 Alcohol al 70

3514 Lancetas desechables (Fig 10)

3515 Papel filtro Nordm 2

352 Procedimiento (Fig 11)

3521 La sangre capilar se obtiene de la cara lateral del dedo medio o anularen los adultos y del dedo gordo del pie o taloacuten en los nintildeos

3522 Desinfectar la zona con alcohol al 70 secar con algodoacuten esteacuteril

3523 Punzar la piel con una lanceta esteacuteril desechable (2 mm de profundidad)

3524 Usar gasa esteacuteril para desechar la primera gota y recoger las siguientesen tubos capilares Evitar comprimir la extremidad para obtenersangre porque se altera la composicioacuten sanguiacutenea

353 Ventajas

3531 Puede obtenerse con facilidad

3532 Es preferible cuando han de realizarse extensiones de sangre perifeacuterica

354 Desventajas

3541 Soacutelo se pueden obtener pequentildeas cantidades de sangre y los exaacutemenesde repeticioacuten requieren nuevas muestras

3542 La sangre en microtubos (capilares) frecuentemente se hemolizainterfiendo con la mayoriacutea de pruebas de laboratorio

3543 Los resultados obtenidos en pruebas con sangre capilar no puedenser comparados con los resultados de las pruebas con sangre venosa

3544 El dedo no soacutelo es delicado sino difiacutecil de desinfectar adecuadamenteen el tiempo disponible

3545 En pacientes con resistencia disminuida a la infeccioacuten (aquellos conleucemia agranulocitosis diabetes uremia y enfermedades con deficienciasinmunoloacutegicas) una muestra tomada del dedo es mucho maacutesprobable que conduzca a una infeccioacuten que otra tomada del brazo

3546 El recuento de eritrocitos y leucocitos asiacute como el recuento deplaquetas y reticulocitos no debe realizarse en sangre capilar debidoa la difiacutecil estandarizacioacuten del flujo sanguiacuteneo capilar

EXTRACCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR

Fig 10

Fig 11

SECCIOacuteN 4

ANTICOAGULANTES

Una vez extraiacuteda la sangre eacutesta puede conservarse coagulada o

mantenidaincoagulable mediante la adicioacuten de un anticoagulante

41 CARACTERIacuteSTICAS BAacuteSICAS DE LOS ANTICOAGULANTES MAacuteS

USADOSEN HEMATOLOGIacuteA

bull No alterar el tamantildeo de los hematiacutees

bull No producir hemoacutelisis

bull Evitar al maacuteximo la agregacioacuten plaquetaria

bull No alterar la morfologiacutea de los leucocitos

La sangre tratada con anticoagulante debe procesarse lo antes posible

inclusomantenida bajo refrigeracioacuten (4 ordmC) si no pasan de las 2 horas El

tiempomaacuteximo entre la extraccioacuten de la sangre y su procesamiento depende

delcoagulante de eleccioacuten y no debe ser maacutes de 4 horas a excepcioacuten

delanticoagulante EDTA (etilendiaminotetraceacutetico) que puede ser hasta 24

horas(en refrigeracioacuten a 4 ordmC)

Los anticoagulantes pueden emplearse en forma soacutelida o liacutequida Los

primerosestaacuten indicados para la determinacioacuten de los paraacutemetros

hematoloacutegicosya que no producen como los anticoagulantes liacutequidos dilucioacuten de

la sangre

42 ANTICOAGULANTES SOacuteLIDOS

421 EDTA

Es la sal disoacutedica o tripotaacutesica del aacutecido etilendiaminotetraceacutetico La saldisoacutedica

(Na2EDTA) es menos soluble que la sal tripotaacutesica (K3EDTA) Estoscompuestos

realizan su accioacuten a traveacutes de un efecto quelante sobre el calcioal fijarlo impiden

su activacioacuten y por ende la coagulacioacuten sanguiacutenea

4211 Ventajas

bull Respeta la morfologiacutea eritrocitaria (especialmente la sal tripotaacutesica) yleucocitaria de manera que permite una demora de dos horas en la realizacioacutendel frotis sanguiacuteneo despueacutes de la extraccioacuten sanguiacutenea

bull Asegura la conservacioacuten de los elementos formes sanguiacuteneos durante 24horas si la sangre se mantiene a 4 ordmC

bull Al inhibir la aglutinacioacuten de las plaquetas facilita su recuento o su expresioacutensemicuantitativa a partir del frotis

bull La concentracioacuten recomendada de EDTA es de 15 mgmL de sangre Unamayor cantidad de anticoagulante puede producir retraccioacuten celular condisminucioacuten del hematocrito y un aumento de la concentracioacuten media de lahemoglobina Un exceso de sangre con relacioacuten al anticoagulante produceformacioacuten de microagregados que pueden alterar los resultados El empleode tubos al vaciacuteo con una gota (50mL) de EDTA tripotaacutesica comercialpara 5 mL de sangre es de intereacutes praacutectico dado que es cien veces maacutessoluble facilitando la mezcla de sangre con anticoagulante

4212 Desventajas

Usado en exceso afecta a los eritrocitos y a los leucocitos a los cuales les produce encogimiento y cambios en su forma por ello debe cuidarse de agregar la cantidad correcta de sangre al anticoagulante

422 Anticoagulante de Wintrobe

Es una mezcla de oxalato de amonio y potasio Actuacutea por precipitacioacuten del calcio es faacutecil de preparar Se emplea en forma de polvo en proporcioacuten de 2 de oxalato de amonio por 1 de oxalato de potasio La cantidad recomendada es de 2 mg x mL de sangre Este anticoagulante no afecta el volumen globular medio y puede usarse para determinaciones de hemoglobina hematocrito y recuento globular pero para los extendidos queda limitada a los primeros minutos tampoco es uacutetil para el recuento plaquetario porque produce formacioacuten de agregados plaquetarios

423 Heparina

El nombre de heparina proviene del griego hepar que significa hiacutegado ya que fue aislado por primera vez de las ceacutelulas de este tejido Es un mucopolisacaacuterido aacutecido Presenta el

inconveniente de que si no se agita raacutepidamente con la sangre despueacutes de extraiacuteda

pueden formarse microcoaacutegulos aunque no altera el volumeneritrocitario ni la morfologiacutea de los leucocitos No es recomendablepara el frotis sanguiacuteneo porque produce un fondo azul en la laacutemina

La heparina de sodio o litio puede usarse en forma soacutelida o liacutequida en

proporcioacutende 01 - 02 mg de heparina por 1 mL de sangre

43 ANTICOAGULANTES LIacuteQUIDOS

431 Citrato trisoacutedico

Es de eleccioacuten para las pruebas de hemostasia y la velocidad de sedimentacioacuten

Actuacutea a traveacutes de la precipitacioacuten del calcio La concentracioacuten depende de

la prueba por realizar

bull Para pruebas de hemostasia se emplea en proporcioacuten de 1 9 (05 mL

deanticoagulante para 45 mL de sangre total)

bull Para la determinacioacuten de la VSG (Velocidad de Sedimentacioacuten Globular) es14

(05 mL de anticoagulante para 2 mL de sangre)

432 Oxalato soacutedico

Recomendado tambieacuten para las pruebas de hemostasia Se emplea en

proporcioacutende un volumen de anticoagulante para 4 vol de sangre

SECCIOacuteN 5

REALIZACIOacuteN Y TINCIOacuteN DEL FROTIS SANGUIacuteNEO

La praacutectica del frotis sanguiacuteneo tambieacuten llamado extendido es de gran importanciaen hematologiacutea ya que el diagnoacutestico de muchas enfermedadeshematoloacutegicas puede realizarse con soacutelo observar las caracteriacutesticasmorfoloacutegicas de las ceacutelulas sanguiacuteneas de manera que eacuteste no debe serexcesivamente grueso ni excesivamente fino Todas las laacuteminas por usarsobre todo nuevas deben ser limpiadas con algodoacuten y alcohol al 70 paraeliminar la grasa que viene adherida

51 MEacuteTODO DE LOS DOS PORTAOBJETOS

511 Materiales

- Alcohol al 70

- Algodoacuten

- Lanceta descartable

- Portaobjetos de vidrios limpios y desgrasados (25 x 75 mm)

512 Fundamento

Consiste en la extensioacuten de una gota de sangre sobre un portaobjeto (25 x 75)empleando el canto biselado de otro portaobjeto de igual dimensioacuten (Fig 12)

513 Procedimiento

5131 Una vez extraiacuteda la sangre con cualquiera de las metodologiacuteas secoloca una pequentildea gota de sangre (5mL) (aprox 3 mm de diaacutemetro)sobre un portaobjeto a 2 cm aproximadamente de uno de los extremos

5132 Colocar el canto de otro portaobjeto esmerilado sobre la superficiedel primer portaobjeto (en la que se encuentra la gota de sangre)formando un aacutengulo de 45ordm

5134 Deslizar suavemente y a velocidad moderada el portaobjeto sobre elotro en sentido longitudinal hasta que la gota de sangre quede bienextendida sobre la

superficie del primer portaobjeto El grosor delfrotis sanguiacuteneo puede variar seguacuten sea el aacutengulo que formen entresiacute ambos portaobjetos Asiacute si es superior a 45ordm la extensioacuten obtenidaseraacute gruesa y corta si es inferior a 45ordm seraacute larga y fina El secado delfrotis es a temperatura ambiente y en posicioacuten horizontal

Fig 12

1048729 Zona excesivamente gruesa Se halla en la regioacuten inmediata al punto departida de la extensioacuten (cabeza) En ella se aprecia siempre un aumento delinfocitos

1048729 Zona excesivamente fina Corresponde al final de la extensioacuten y termina enun aacuterea donde las ceacutelulas adoptan una posicioacuten acartonada (barbas) Enesta regioacuten existe un exceso de granulocitos y monocitos

1048729 Zona ideal Corresponde a la regioacuten intermedia del frotis y en ella existe unreparto equilibrado de ceacutelulas

52 COLORACIONES USADAS

Una vez seco el frotis se procede a la tincioacuten hematoloacutegica con el colorante deRomanowsky constituido por la mezcla de eosina y azul de metileno Dentrode eacutestas tenemos

521 Colorante de Giemsa

522 Colorante de May-Grunwald

523 Colorante de Wright

524 Colorante de Leishman

Preparacioacuten de colorantes (Anexo A)

1048729 Para el estudio de las ceacutelulas sanguiacuteneas utilizar el colorante 523 y 524

1048729 Para el estudio de hemoparaacutesitos utilizar el colorante 521

1048729 Utilizar el colorante 522 para casos especiales en que se desee observar

con mayor claridad y especificidad los graacutenulos de los neutrofilos

53 TINCIOacuteN CON COLORANTE DE WRIGHT

531 Fundamento

El colorante de Wright va a permitir suministrar un medio para estudiar lasangre y determinar las variaciones y anormalidades de estructura forma ytamantildeo de los eritrocitos su contenido de hemoglobina y sus propiedades decoloracioacuten La informacioacuten obtenida de un frotis de sangre perifeacuterica dependeen gran parte de la calidad del extendido y la coloracioacuten

532 Materiales

5321 Colorante de Wright (Anexo A)

5322 Frasco gotero

5323 Solucioacuten amortiguada tamponada (Anexo A)

533 Procedimiento

5331 Una vez obtenido el frotis sanguiacuteneo se le dejaraacute secar entre 15 y 20minutos

5332 Luego se coloca la preparacioacuten en un soporte y se cubre con el colorantede Wright dejaacutendolo por espacio de 5 minutos

5333 Posteriormente se antildeade solucioacuten amortiguada tamponada en partesiguales hasta obtener un brillo metaacutelico dejando 6 minutos adicionales

5334 Finalmente se lava con agua corriente y se deja secar

5335 Se coloca en el microscopio y con pequentildeo aumento se revisa lacalidad de la coloracioacuten la cantidad aproximada de gloacutebulos blancosy se escoge el sitio para iniciar el recuento Se coloca una gota deaceite de inmersioacuten y se enfoca a un aumento de 100xLa forma de los gloacutebulos rojos se examinaraacute detenidamente observandoademaacutes del color (cantidad de hemoglobina) presencia deplaquetas su agrupacioacuten y distribucioacuten

5336 Posteriormente se hace el recuento diferencial de gloacutebulos blancosen 100

ceacutelulas para lo cual se deberaacute conocer las diferencias entreneutroacutefilos eosinoacutefilos

linfocitos y monocitosUna extensioacuten de sangre bien tentildeida debe caracterizarse

por unabuena diferenciacioacuten de las estructuras subcelulares en los leucocitosuna

coloracioacuten rosada de los hematiacutees y la ausencia de precipitados

Los defectos maacutes frecuentes observados en la tincioacuten del frotis sanguiacuteneoson

Coloracioacuten excesivamente azul debido a

1048729 Frotis excesivamente grueso

1048729 Lavado insuficiente

1048729 Tincioacuten muy prolongada

1048729 Empleo de colorante excesivamente alcalino

Coloracioacuten con una tonalidad rosada

1048729 El colorante el tampoacuten o el agua de lavado tienen un pH demasiadoaacutecido

Presencia de precipitados

1048729 Obedecen a una accioacuten excesiva del colorante Esto se puede evitarcon la

filtracioacuten

SECCIOacuteN 6

HEMOGRAMA-HEMOGLOBINA-HEMATOCRITO

El hemograma de Shilling constituye uno de los exaacutemenes de laboratorio

maacutesusados en el campo de la hematologiacutea Comprende las siguientes pruebas

61 RECUENTO LEUCOCITARIO

Principio

La sangre anticoagulada se deposita en un liacutequido que permite evidenciar

losleucocitos mantenieacutendolos visibles mientras que los eritrocitos

sonhemolizados El recuento del nuacutemero de leucocitos o gloacutebulos blancos se

expresapor mm3 (miliacutemetro cuacutebico)

611 Equipos

- Microscopio

- Hemocitoacutemetro (Caacutemara de Neubauer)

Consta de los siguientes elementos

diams Una laacutemina portaobjeto gruesa en el centro se hallan dos

superficiescuadriculadas iguales separadas del resto de la laacutemina por surcos y

dosbarras transversales algo maacutes elevadas

diams Una laminilla cubreobjetos oacutepticamente plana que al colocarse sobrelas barras

elevadas de la laacutemina forma una caacutemara entre el cubreobjetosy la superficie

cuadriculadaLa altura entre el cubreobjetos y la laacutemina portaobjetos es de 01

mmCada cuadriacutecula mide 3 mm de lado y se divide en 9 cuadrados grandesCada

uno de los cuales mide 1 mm2 de superficie que se subdivide a suvez en 16

cuadrados medianos El cuadrado grande central se divide en25 cuadrados

pequentildeos y cada uno de ellos en 16 cuadraditos Cadacuadrado pequentildeo mide

02 mm de lado (004 mm2 de superficie) y cadacuadradito mide 005 mm de lado

(00025 mm2 de superficie)

612 Materiales y reactivos requeridos

6121 Pipeta de gloacutebulos blancos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0 a 100 mL)Presenta cerca del extremo superior una marca de 11 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla que funciona comomezcladora luego sigue el extremo maacutes largo de la pipeta (tallo) que estaacutedividida en 10 partes con 2 marcas 1 (parte final del bulbo) y 05 (a la mitaddel tallo) Se le acopla a su extremo superior 1 tubo de goma y una bombillapara aspirar

6122 Diluyente de gloacutebulos blancos Solucioacuten de Turk al 1

6123 Contador manual (Soacutelo si fuera necesario)

6124 Papel filtro

613 Procedimiento

6131 Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar deldedo se procede a aspirar la sangre con la pipeta de gloacutebulos blancoshasta la marca de 05 y a limpiar la punta con papel absorbente

6132 Introducir la pipeta en el tubo que contenga solucioacuten de Turk y absorberhasta la marca de 11 (no debe haber burbujas)

6133 Tapar ambos extremos y proceder a mezclar manualmente o en unrotador automaacutetico por 2 oacute 3 minutos

6134 Monte la laminilla de vidrio en la caacutemara para recuento que debe estarlimpia y seca

6135 Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocaruna gota pequentildea de esta solucioacuten en la caacutemara

6136 Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las ceacutelulas se sedimenten

6137 Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angularesCuando se usa la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002 mL) desangre total con anticoagulante o sangre capilar con anticoagulante yse diluye en un tubo que contenga 380 mL de solucioacuten de Turk (aquiacutetenemos una dilucioacuten 120)

LECTURA

Fig 13

La lectura se realiza en los campos 1 3 7 y 9 como estaacute indicado en la figuraAdemaacutes de los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes sedeben contar todos los leucocitos que se encuentren adheridos en la liacuteneahorizontal superior y vertical exterior o de lo contrario todos los leucocitosadheridos a la liacutenea horizontal inferior y vertical interior

614 Resultados

Nordm de leucocitos x mm3 = leucocitos contados en 4 camposdividealtura x dilucioacuten x aacuterea

Reemplazando = leucocitos contados en 4 camposdivide110 x 120 x 4=

Leucocitos contados en 4 camposdivide4200=

X1 divide4200= Nordm leucocitos contados x 50

615 Valores de referencia

5000 - 10 000 leucocitos mm3

616 Correccioacuten de valores para restar eritrocitos nucleados

Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el liacutequido de dilucioacuten por lo tantopueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con losleucocitos de tal manera que se debe emplear la siguiente foacutermula

Caacutelculo

La concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos (por litro) esNuacutemero de normoblatos contados x concentracioacuten o nuacutemero de leucocitos100 + Nordm de normoblastos contados

Ejemplo

Si se cuentan 50 normoblastos y la concentracioacuten del nuacutemero de leucocitos es16 x 109l la concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos seraacute

50 x16 = 53 x 109l

100 + 50

y la concentracioacuten de leucocitos corregida seraacute 16 - 53 = 107 x 109lEn unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitosse expresan por miliacutemetro cuacutebico En tales unidades el caacutelculo correspondienteal ejemplo que se ha dado seriacutea

50 x 16 000 = 5300 mm3

100 + 50

Recuento corregido de gloacutebulos blancos o leucocitos = 16 000 - 5300 = 10 700 mm3

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

62 RECUENTO DE GLOacuteBULOS ROJOS

Principio

La sangre se diluye en un liacutequido que nos permite observar claramente loshematiacutees luego esta dilucioacuten se coloca en una caacutemara de Neubauer con laayuda de una pipeta automaacutetica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopioa un objetivo de 40x para calcular el nuacutemero de gloacutebulos rojos por mm3

621 Equipos

- Microscopio

- Hemocitoacutemetro (caacutemara de Neubauer)

622 Materiales y reactivos requeridos

6221 Pipeta de gloacutebulos rojos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0-100 mL)

Presenta cerca del extremo superior una marca de 101 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla roja mezcladoraluego sigue el tallo (extremo maacutes largo) el cual estaacute dividido en 10 partescon 2 marcas 1 acabando el bulbo y 05 a la mitad del tallo Se requiereigual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar

6222 Diluyente de gloacutebulos rojos Cloruro de Sodio al 09 (ver anexo)

Diluyente de Hayem (ver anexo)

6223 Contador manual (soacutelo si fuera necesario)

6224 Papel filtro

623 Procedimiento

6231 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar

6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente

6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101

6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos

6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente

6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas

6237 Dejar en reposo por 3 minutos

6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)

6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos

LECTURA

Fig 14

624 Resultados

Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea

Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15

= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000

= hematiacutees contados x 10 000

625 Valores de referencia

(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)

Hombres 4 500 000 - 5 500 000

Mujeres 4 000 000 - 5 000 000

Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000

Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000

Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)

Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal

volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen

porcentaje o como valor decimal

Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre

total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)

631 Meacutetodo de Wintrobe

Materiales requeridos

- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm

- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia

- Tapoacuten de goma

Procedimiento

diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur

comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado

de no provocar espuma

diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten

diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos

Resultados (lectura)

Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos

Valores de referencia

Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

632 Meacutetodo de microhematocrito

Materiales requeridos

- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)

- Plastilina

Procedimiento

diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel

dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon

anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80

del capilar

diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina

diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma

diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm

Resultados (lectura)

La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio

Uso de la escala

diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero

diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la

columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical

diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos

Valores de referencia

Hombres 40 - 50

Mujeres 38 - 44

Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44

Lactantes (3 meses) 37 - 42

Recieacuten nacidos 50 - 58

La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)

64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA

Principio

La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre

641 Materiales y reactivos

6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro

6412 Pipetas

diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla

diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL

6413 Tubos de ensayo

6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten

Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia

3422 Al paciente se le coloca de cuacutebito dorsal sobre la mesa de examen ouna

camilla de manera que la cabeza cuelgue sobre el final de lamesa y el cuerpo sea

sujetado por un asistente

3423 Cuando el paciente grita la vena yugular externa se marca claramente

3424 Limpiar la zona en un aacuterea de 2 pulgadas con alcohol al 70 o

alcoholyodado

3425 Se repiten los pasos de 3225 a 3227 de la extraccioacuten de sangrevenosa

con jeringa

3426 Retirar la aguja de la vena y presionar suavemente con un algodoacutenseco

aproximadamente de 3 a 5 minutos Pedir al paciente que permanezcaechado diez

minutos

3427 Se repiten los pasos de 3229

3428 Se repiten los pasos de 32210

343 Ventajas

Constituye un buen meacutetodo para la obtencioacuten de sangre en pacientes conshock

con venas colapsadas

344 Desventajas

Por lo delicado en su procedimiento no se recomienda como rutina soacutelo encasos

en que no se pueda obtener la muestra por meacutetodos convencionales

35 OBTENCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR

Cuando la cantidad de sangre que se precisa es muy pequentildea o cuando

pordiferentes motivos no pueda practicarse una puncioacuten venosa debe recurrirse

a la puncioacuten capilar

351 Materiales requeridos

3512 Algodoacuten

3513 Alcohol al 70

3514 Lancetas desechables (Fig 10)

3515 Papel filtro Nordm 2

352 Procedimiento (Fig 11)

3521 La sangre capilar se obtiene de la cara lateral del dedo medio o anularen los adultos y del dedo gordo del pie o taloacuten en los nintildeos

3522 Desinfectar la zona con alcohol al 70 secar con algodoacuten esteacuteril

3523 Punzar la piel con una lanceta esteacuteril desechable (2 mm de profundidad)

3524 Usar gasa esteacuteril para desechar la primera gota y recoger las siguientesen tubos capilares Evitar comprimir la extremidad para obtenersangre porque se altera la composicioacuten sanguiacutenea

353 Ventajas

3531 Puede obtenerse con facilidad

3532 Es preferible cuando han de realizarse extensiones de sangre perifeacuterica

354 Desventajas

3541 Soacutelo se pueden obtener pequentildeas cantidades de sangre y los exaacutemenesde repeticioacuten requieren nuevas muestras

3542 La sangre en microtubos (capilares) frecuentemente se hemolizainterfiendo con la mayoriacutea de pruebas de laboratorio

3543 Los resultados obtenidos en pruebas con sangre capilar no puedenser comparados con los resultados de las pruebas con sangre venosa

3544 El dedo no soacutelo es delicado sino difiacutecil de desinfectar adecuadamenteen el tiempo disponible

3545 En pacientes con resistencia disminuida a la infeccioacuten (aquellos conleucemia agranulocitosis diabetes uremia y enfermedades con deficienciasinmunoloacutegicas) una muestra tomada del dedo es mucho maacutesprobable que conduzca a una infeccioacuten que otra tomada del brazo

3546 El recuento de eritrocitos y leucocitos asiacute como el recuento deplaquetas y reticulocitos no debe realizarse en sangre capilar debidoa la difiacutecil estandarizacioacuten del flujo sanguiacuteneo capilar

EXTRACCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR

Fig 10

Fig 11

SECCIOacuteN 4

ANTICOAGULANTES

Una vez extraiacuteda la sangre eacutesta puede conservarse coagulada o

mantenidaincoagulable mediante la adicioacuten de un anticoagulante

41 CARACTERIacuteSTICAS BAacuteSICAS DE LOS ANTICOAGULANTES MAacuteS

USADOSEN HEMATOLOGIacuteA

bull No alterar el tamantildeo de los hematiacutees

bull No producir hemoacutelisis

bull Evitar al maacuteximo la agregacioacuten plaquetaria

bull No alterar la morfologiacutea de los leucocitos

La sangre tratada con anticoagulante debe procesarse lo antes posible

inclusomantenida bajo refrigeracioacuten (4 ordmC) si no pasan de las 2 horas El

tiempomaacuteximo entre la extraccioacuten de la sangre y su procesamiento depende

delcoagulante de eleccioacuten y no debe ser maacutes de 4 horas a excepcioacuten

delanticoagulante EDTA (etilendiaminotetraceacutetico) que puede ser hasta 24

horas(en refrigeracioacuten a 4 ordmC)

Los anticoagulantes pueden emplearse en forma soacutelida o liacutequida Los

primerosestaacuten indicados para la determinacioacuten de los paraacutemetros

hematoloacutegicosya que no producen como los anticoagulantes liacutequidos dilucioacuten de

la sangre

42 ANTICOAGULANTES SOacuteLIDOS

421 EDTA

Es la sal disoacutedica o tripotaacutesica del aacutecido etilendiaminotetraceacutetico La saldisoacutedica

(Na2EDTA) es menos soluble que la sal tripotaacutesica (K3EDTA) Estoscompuestos

realizan su accioacuten a traveacutes de un efecto quelante sobre el calcioal fijarlo impiden

su activacioacuten y por ende la coagulacioacuten sanguiacutenea

4211 Ventajas

bull Respeta la morfologiacutea eritrocitaria (especialmente la sal tripotaacutesica) yleucocitaria de manera que permite una demora de dos horas en la realizacioacutendel frotis sanguiacuteneo despueacutes de la extraccioacuten sanguiacutenea

bull Asegura la conservacioacuten de los elementos formes sanguiacuteneos durante 24horas si la sangre se mantiene a 4 ordmC

bull Al inhibir la aglutinacioacuten de las plaquetas facilita su recuento o su expresioacutensemicuantitativa a partir del frotis

bull La concentracioacuten recomendada de EDTA es de 15 mgmL de sangre Unamayor cantidad de anticoagulante puede producir retraccioacuten celular condisminucioacuten del hematocrito y un aumento de la concentracioacuten media de lahemoglobina Un exceso de sangre con relacioacuten al anticoagulante produceformacioacuten de microagregados que pueden alterar los resultados El empleode tubos al vaciacuteo con una gota (50mL) de EDTA tripotaacutesica comercialpara 5 mL de sangre es de intereacutes praacutectico dado que es cien veces maacutessoluble facilitando la mezcla de sangre con anticoagulante

4212 Desventajas

Usado en exceso afecta a los eritrocitos y a los leucocitos a los cuales les produce encogimiento y cambios en su forma por ello debe cuidarse de agregar la cantidad correcta de sangre al anticoagulante

422 Anticoagulante de Wintrobe

Es una mezcla de oxalato de amonio y potasio Actuacutea por precipitacioacuten del calcio es faacutecil de preparar Se emplea en forma de polvo en proporcioacuten de 2 de oxalato de amonio por 1 de oxalato de potasio La cantidad recomendada es de 2 mg x mL de sangre Este anticoagulante no afecta el volumen globular medio y puede usarse para determinaciones de hemoglobina hematocrito y recuento globular pero para los extendidos queda limitada a los primeros minutos tampoco es uacutetil para el recuento plaquetario porque produce formacioacuten de agregados plaquetarios

423 Heparina

El nombre de heparina proviene del griego hepar que significa hiacutegado ya que fue aislado por primera vez de las ceacutelulas de este tejido Es un mucopolisacaacuterido aacutecido Presenta el

inconveniente de que si no se agita raacutepidamente con la sangre despueacutes de extraiacuteda

pueden formarse microcoaacutegulos aunque no altera el volumeneritrocitario ni la morfologiacutea de los leucocitos No es recomendablepara el frotis sanguiacuteneo porque produce un fondo azul en la laacutemina

La heparina de sodio o litio puede usarse en forma soacutelida o liacutequida en

proporcioacutende 01 - 02 mg de heparina por 1 mL de sangre

43 ANTICOAGULANTES LIacuteQUIDOS

431 Citrato trisoacutedico

Es de eleccioacuten para las pruebas de hemostasia y la velocidad de sedimentacioacuten

Actuacutea a traveacutes de la precipitacioacuten del calcio La concentracioacuten depende de

la prueba por realizar

bull Para pruebas de hemostasia se emplea en proporcioacuten de 1 9 (05 mL

deanticoagulante para 45 mL de sangre total)

bull Para la determinacioacuten de la VSG (Velocidad de Sedimentacioacuten Globular) es14

(05 mL de anticoagulante para 2 mL de sangre)

432 Oxalato soacutedico

Recomendado tambieacuten para las pruebas de hemostasia Se emplea en

proporcioacutende un volumen de anticoagulante para 4 vol de sangre

SECCIOacuteN 5

REALIZACIOacuteN Y TINCIOacuteN DEL FROTIS SANGUIacuteNEO

La praacutectica del frotis sanguiacuteneo tambieacuten llamado extendido es de gran importanciaen hematologiacutea ya que el diagnoacutestico de muchas enfermedadeshematoloacutegicas puede realizarse con soacutelo observar las caracteriacutesticasmorfoloacutegicas de las ceacutelulas sanguiacuteneas de manera que eacuteste no debe serexcesivamente grueso ni excesivamente fino Todas las laacuteminas por usarsobre todo nuevas deben ser limpiadas con algodoacuten y alcohol al 70 paraeliminar la grasa que viene adherida

51 MEacuteTODO DE LOS DOS PORTAOBJETOS

511 Materiales

- Alcohol al 70

- Algodoacuten

- Lanceta descartable

- Portaobjetos de vidrios limpios y desgrasados (25 x 75 mm)

512 Fundamento

Consiste en la extensioacuten de una gota de sangre sobre un portaobjeto (25 x 75)empleando el canto biselado de otro portaobjeto de igual dimensioacuten (Fig 12)

513 Procedimiento

5131 Una vez extraiacuteda la sangre con cualquiera de las metodologiacuteas secoloca una pequentildea gota de sangre (5mL) (aprox 3 mm de diaacutemetro)sobre un portaobjeto a 2 cm aproximadamente de uno de los extremos

5132 Colocar el canto de otro portaobjeto esmerilado sobre la superficiedel primer portaobjeto (en la que se encuentra la gota de sangre)formando un aacutengulo de 45ordm

5134 Deslizar suavemente y a velocidad moderada el portaobjeto sobre elotro en sentido longitudinal hasta que la gota de sangre quede bienextendida sobre la

superficie del primer portaobjeto El grosor delfrotis sanguiacuteneo puede variar seguacuten sea el aacutengulo que formen entresiacute ambos portaobjetos Asiacute si es superior a 45ordm la extensioacuten obtenidaseraacute gruesa y corta si es inferior a 45ordm seraacute larga y fina El secado delfrotis es a temperatura ambiente y en posicioacuten horizontal

Fig 12

1048729 Zona excesivamente gruesa Se halla en la regioacuten inmediata al punto departida de la extensioacuten (cabeza) En ella se aprecia siempre un aumento delinfocitos

1048729 Zona excesivamente fina Corresponde al final de la extensioacuten y termina enun aacuterea donde las ceacutelulas adoptan una posicioacuten acartonada (barbas) Enesta regioacuten existe un exceso de granulocitos y monocitos

1048729 Zona ideal Corresponde a la regioacuten intermedia del frotis y en ella existe unreparto equilibrado de ceacutelulas

52 COLORACIONES USADAS

Una vez seco el frotis se procede a la tincioacuten hematoloacutegica con el colorante deRomanowsky constituido por la mezcla de eosina y azul de metileno Dentrode eacutestas tenemos

521 Colorante de Giemsa

522 Colorante de May-Grunwald

523 Colorante de Wright

524 Colorante de Leishman

Preparacioacuten de colorantes (Anexo A)

1048729 Para el estudio de las ceacutelulas sanguiacuteneas utilizar el colorante 523 y 524

1048729 Para el estudio de hemoparaacutesitos utilizar el colorante 521

1048729 Utilizar el colorante 522 para casos especiales en que se desee observar

con mayor claridad y especificidad los graacutenulos de los neutrofilos

53 TINCIOacuteN CON COLORANTE DE WRIGHT

531 Fundamento

El colorante de Wright va a permitir suministrar un medio para estudiar lasangre y determinar las variaciones y anormalidades de estructura forma ytamantildeo de los eritrocitos su contenido de hemoglobina y sus propiedades decoloracioacuten La informacioacuten obtenida de un frotis de sangre perifeacuterica dependeen gran parte de la calidad del extendido y la coloracioacuten

532 Materiales

5321 Colorante de Wright (Anexo A)

5322 Frasco gotero

5323 Solucioacuten amortiguada tamponada (Anexo A)

533 Procedimiento

5331 Una vez obtenido el frotis sanguiacuteneo se le dejaraacute secar entre 15 y 20minutos

5332 Luego se coloca la preparacioacuten en un soporte y se cubre con el colorantede Wright dejaacutendolo por espacio de 5 minutos

5333 Posteriormente se antildeade solucioacuten amortiguada tamponada en partesiguales hasta obtener un brillo metaacutelico dejando 6 minutos adicionales

5334 Finalmente se lava con agua corriente y se deja secar

5335 Se coloca en el microscopio y con pequentildeo aumento se revisa lacalidad de la coloracioacuten la cantidad aproximada de gloacutebulos blancosy se escoge el sitio para iniciar el recuento Se coloca una gota deaceite de inmersioacuten y se enfoca a un aumento de 100xLa forma de los gloacutebulos rojos se examinaraacute detenidamente observandoademaacutes del color (cantidad de hemoglobina) presencia deplaquetas su agrupacioacuten y distribucioacuten

5336 Posteriormente se hace el recuento diferencial de gloacutebulos blancosen 100

ceacutelulas para lo cual se deberaacute conocer las diferencias entreneutroacutefilos eosinoacutefilos

linfocitos y monocitosUna extensioacuten de sangre bien tentildeida debe caracterizarse

por unabuena diferenciacioacuten de las estructuras subcelulares en los leucocitosuna

coloracioacuten rosada de los hematiacutees y la ausencia de precipitados

Los defectos maacutes frecuentes observados en la tincioacuten del frotis sanguiacuteneoson

Coloracioacuten excesivamente azul debido a

1048729 Frotis excesivamente grueso

1048729 Lavado insuficiente

1048729 Tincioacuten muy prolongada

1048729 Empleo de colorante excesivamente alcalino

Coloracioacuten con una tonalidad rosada

1048729 El colorante el tampoacuten o el agua de lavado tienen un pH demasiadoaacutecido

Presencia de precipitados

1048729 Obedecen a una accioacuten excesiva del colorante Esto se puede evitarcon la

filtracioacuten

SECCIOacuteN 6

HEMOGRAMA-HEMOGLOBINA-HEMATOCRITO

El hemograma de Shilling constituye uno de los exaacutemenes de laboratorio

maacutesusados en el campo de la hematologiacutea Comprende las siguientes pruebas

61 RECUENTO LEUCOCITARIO

Principio

La sangre anticoagulada se deposita en un liacutequido que permite evidenciar

losleucocitos mantenieacutendolos visibles mientras que los eritrocitos

sonhemolizados El recuento del nuacutemero de leucocitos o gloacutebulos blancos se

expresapor mm3 (miliacutemetro cuacutebico)

611 Equipos

- Microscopio

- Hemocitoacutemetro (Caacutemara de Neubauer)

Consta de los siguientes elementos

diams Una laacutemina portaobjeto gruesa en el centro se hallan dos

superficiescuadriculadas iguales separadas del resto de la laacutemina por surcos y

dosbarras transversales algo maacutes elevadas

diams Una laminilla cubreobjetos oacutepticamente plana que al colocarse sobrelas barras

elevadas de la laacutemina forma una caacutemara entre el cubreobjetosy la superficie

cuadriculadaLa altura entre el cubreobjetos y la laacutemina portaobjetos es de 01

mmCada cuadriacutecula mide 3 mm de lado y se divide en 9 cuadrados grandesCada

uno de los cuales mide 1 mm2 de superficie que se subdivide a suvez en 16

cuadrados medianos El cuadrado grande central se divide en25 cuadrados

pequentildeos y cada uno de ellos en 16 cuadraditos Cadacuadrado pequentildeo mide

02 mm de lado (004 mm2 de superficie) y cadacuadradito mide 005 mm de lado

(00025 mm2 de superficie)

612 Materiales y reactivos requeridos

6121 Pipeta de gloacutebulos blancos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0 a 100 mL)Presenta cerca del extremo superior una marca de 11 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla que funciona comomezcladora luego sigue el extremo maacutes largo de la pipeta (tallo) que estaacutedividida en 10 partes con 2 marcas 1 (parte final del bulbo) y 05 (a la mitaddel tallo) Se le acopla a su extremo superior 1 tubo de goma y una bombillapara aspirar

6122 Diluyente de gloacutebulos blancos Solucioacuten de Turk al 1

6123 Contador manual (Soacutelo si fuera necesario)

6124 Papel filtro

613 Procedimiento

6131 Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar deldedo se procede a aspirar la sangre con la pipeta de gloacutebulos blancoshasta la marca de 05 y a limpiar la punta con papel absorbente

6132 Introducir la pipeta en el tubo que contenga solucioacuten de Turk y absorberhasta la marca de 11 (no debe haber burbujas)

6133 Tapar ambos extremos y proceder a mezclar manualmente o en unrotador automaacutetico por 2 oacute 3 minutos

6134 Monte la laminilla de vidrio en la caacutemara para recuento que debe estarlimpia y seca

6135 Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocaruna gota pequentildea de esta solucioacuten en la caacutemara

6136 Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las ceacutelulas se sedimenten

6137 Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angularesCuando se usa la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002 mL) desangre total con anticoagulante o sangre capilar con anticoagulante yse diluye en un tubo que contenga 380 mL de solucioacuten de Turk (aquiacutetenemos una dilucioacuten 120)

LECTURA

Fig 13

La lectura se realiza en los campos 1 3 7 y 9 como estaacute indicado en la figuraAdemaacutes de los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes sedeben contar todos los leucocitos que se encuentren adheridos en la liacuteneahorizontal superior y vertical exterior o de lo contrario todos los leucocitosadheridos a la liacutenea horizontal inferior y vertical interior

614 Resultados

Nordm de leucocitos x mm3 = leucocitos contados en 4 camposdividealtura x dilucioacuten x aacuterea

Reemplazando = leucocitos contados en 4 camposdivide110 x 120 x 4=

Leucocitos contados en 4 camposdivide4200=

X1 divide4200= Nordm leucocitos contados x 50

615 Valores de referencia

5000 - 10 000 leucocitos mm3

616 Correccioacuten de valores para restar eritrocitos nucleados

Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el liacutequido de dilucioacuten por lo tantopueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con losleucocitos de tal manera que se debe emplear la siguiente foacutermula

Caacutelculo

La concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos (por litro) esNuacutemero de normoblatos contados x concentracioacuten o nuacutemero de leucocitos100 + Nordm de normoblastos contados

Ejemplo

Si se cuentan 50 normoblastos y la concentracioacuten del nuacutemero de leucocitos es16 x 109l la concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos seraacute

50 x16 = 53 x 109l

100 + 50

y la concentracioacuten de leucocitos corregida seraacute 16 - 53 = 107 x 109lEn unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitosse expresan por miliacutemetro cuacutebico En tales unidades el caacutelculo correspondienteal ejemplo que se ha dado seriacutea

50 x 16 000 = 5300 mm3

100 + 50

Recuento corregido de gloacutebulos blancos o leucocitos = 16 000 - 5300 = 10 700 mm3

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

62 RECUENTO DE GLOacuteBULOS ROJOS

Principio

La sangre se diluye en un liacutequido que nos permite observar claramente loshematiacutees luego esta dilucioacuten se coloca en una caacutemara de Neubauer con laayuda de una pipeta automaacutetica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopioa un objetivo de 40x para calcular el nuacutemero de gloacutebulos rojos por mm3

621 Equipos

- Microscopio

- Hemocitoacutemetro (caacutemara de Neubauer)

622 Materiales y reactivos requeridos

6221 Pipeta de gloacutebulos rojos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0-100 mL)

Presenta cerca del extremo superior una marca de 101 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla roja mezcladoraluego sigue el tallo (extremo maacutes largo) el cual estaacute dividido en 10 partescon 2 marcas 1 acabando el bulbo y 05 a la mitad del tallo Se requiereigual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar

6222 Diluyente de gloacutebulos rojos Cloruro de Sodio al 09 (ver anexo)

Diluyente de Hayem (ver anexo)

6223 Contador manual (soacutelo si fuera necesario)

6224 Papel filtro

623 Procedimiento

6231 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar

6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente

6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101

6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos

6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente

6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas

6237 Dejar en reposo por 3 minutos

6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)

6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos

LECTURA

Fig 14

624 Resultados

Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea

Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15

= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000

= hematiacutees contados x 10 000

625 Valores de referencia

(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)

Hombres 4 500 000 - 5 500 000

Mujeres 4 000 000 - 5 000 000

Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000

Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000

Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)

Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal

volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen

porcentaje o como valor decimal

Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre

total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)

631 Meacutetodo de Wintrobe

Materiales requeridos

- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm

- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia

- Tapoacuten de goma

Procedimiento

diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur

comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado

de no provocar espuma

diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten

diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos

Resultados (lectura)

Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos

Valores de referencia

Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

632 Meacutetodo de microhematocrito

Materiales requeridos

- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)

- Plastilina

Procedimiento

diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel

dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon

anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80

del capilar

diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina

diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma

diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm

Resultados (lectura)

La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio

Uso de la escala

diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero

diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la

columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical

diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos

Valores de referencia

Hombres 40 - 50

Mujeres 38 - 44

Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44

Lactantes (3 meses) 37 - 42

Recieacuten nacidos 50 - 58

La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)

64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA

Principio

La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre

641 Materiales y reactivos

6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro

6412 Pipetas

diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla

diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL

6413 Tubos de ensayo

6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten

Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia

3515 Papel filtro Nordm 2

352 Procedimiento (Fig 11)

3521 La sangre capilar se obtiene de la cara lateral del dedo medio o anularen los adultos y del dedo gordo del pie o taloacuten en los nintildeos

3522 Desinfectar la zona con alcohol al 70 secar con algodoacuten esteacuteril

3523 Punzar la piel con una lanceta esteacuteril desechable (2 mm de profundidad)

3524 Usar gasa esteacuteril para desechar la primera gota y recoger las siguientesen tubos capilares Evitar comprimir la extremidad para obtenersangre porque se altera la composicioacuten sanguiacutenea

353 Ventajas

3531 Puede obtenerse con facilidad

3532 Es preferible cuando han de realizarse extensiones de sangre perifeacuterica

354 Desventajas

3541 Soacutelo se pueden obtener pequentildeas cantidades de sangre y los exaacutemenesde repeticioacuten requieren nuevas muestras

3542 La sangre en microtubos (capilares) frecuentemente se hemolizainterfiendo con la mayoriacutea de pruebas de laboratorio

3543 Los resultados obtenidos en pruebas con sangre capilar no puedenser comparados con los resultados de las pruebas con sangre venosa

3544 El dedo no soacutelo es delicado sino difiacutecil de desinfectar adecuadamenteen el tiempo disponible

3545 En pacientes con resistencia disminuida a la infeccioacuten (aquellos conleucemia agranulocitosis diabetes uremia y enfermedades con deficienciasinmunoloacutegicas) una muestra tomada del dedo es mucho maacutesprobable que conduzca a una infeccioacuten que otra tomada del brazo

3546 El recuento de eritrocitos y leucocitos asiacute como el recuento deplaquetas y reticulocitos no debe realizarse en sangre capilar debidoa la difiacutecil estandarizacioacuten del flujo sanguiacuteneo capilar

EXTRACCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR

Fig 10

Fig 11

SECCIOacuteN 4

ANTICOAGULANTES

Una vez extraiacuteda la sangre eacutesta puede conservarse coagulada o

mantenidaincoagulable mediante la adicioacuten de un anticoagulante

41 CARACTERIacuteSTICAS BAacuteSICAS DE LOS ANTICOAGULANTES MAacuteS

USADOSEN HEMATOLOGIacuteA

bull No alterar el tamantildeo de los hematiacutees

bull No producir hemoacutelisis

bull Evitar al maacuteximo la agregacioacuten plaquetaria

bull No alterar la morfologiacutea de los leucocitos

La sangre tratada con anticoagulante debe procesarse lo antes posible

inclusomantenida bajo refrigeracioacuten (4 ordmC) si no pasan de las 2 horas El

tiempomaacuteximo entre la extraccioacuten de la sangre y su procesamiento depende

delcoagulante de eleccioacuten y no debe ser maacutes de 4 horas a excepcioacuten

delanticoagulante EDTA (etilendiaminotetraceacutetico) que puede ser hasta 24

horas(en refrigeracioacuten a 4 ordmC)

Los anticoagulantes pueden emplearse en forma soacutelida o liacutequida Los

primerosestaacuten indicados para la determinacioacuten de los paraacutemetros

hematoloacutegicosya que no producen como los anticoagulantes liacutequidos dilucioacuten de

la sangre

42 ANTICOAGULANTES SOacuteLIDOS

421 EDTA

Es la sal disoacutedica o tripotaacutesica del aacutecido etilendiaminotetraceacutetico La saldisoacutedica

(Na2EDTA) es menos soluble que la sal tripotaacutesica (K3EDTA) Estoscompuestos

realizan su accioacuten a traveacutes de un efecto quelante sobre el calcioal fijarlo impiden

su activacioacuten y por ende la coagulacioacuten sanguiacutenea

4211 Ventajas

bull Respeta la morfologiacutea eritrocitaria (especialmente la sal tripotaacutesica) yleucocitaria de manera que permite una demora de dos horas en la realizacioacutendel frotis sanguiacuteneo despueacutes de la extraccioacuten sanguiacutenea

bull Asegura la conservacioacuten de los elementos formes sanguiacuteneos durante 24horas si la sangre se mantiene a 4 ordmC

bull Al inhibir la aglutinacioacuten de las plaquetas facilita su recuento o su expresioacutensemicuantitativa a partir del frotis

bull La concentracioacuten recomendada de EDTA es de 15 mgmL de sangre Unamayor cantidad de anticoagulante puede producir retraccioacuten celular condisminucioacuten del hematocrito y un aumento de la concentracioacuten media de lahemoglobina Un exceso de sangre con relacioacuten al anticoagulante produceformacioacuten de microagregados que pueden alterar los resultados El empleode tubos al vaciacuteo con una gota (50mL) de EDTA tripotaacutesica comercialpara 5 mL de sangre es de intereacutes praacutectico dado que es cien veces maacutessoluble facilitando la mezcla de sangre con anticoagulante

4212 Desventajas

Usado en exceso afecta a los eritrocitos y a los leucocitos a los cuales les produce encogimiento y cambios en su forma por ello debe cuidarse de agregar la cantidad correcta de sangre al anticoagulante

422 Anticoagulante de Wintrobe

Es una mezcla de oxalato de amonio y potasio Actuacutea por precipitacioacuten del calcio es faacutecil de preparar Se emplea en forma de polvo en proporcioacuten de 2 de oxalato de amonio por 1 de oxalato de potasio La cantidad recomendada es de 2 mg x mL de sangre Este anticoagulante no afecta el volumen globular medio y puede usarse para determinaciones de hemoglobina hematocrito y recuento globular pero para los extendidos queda limitada a los primeros minutos tampoco es uacutetil para el recuento plaquetario porque produce formacioacuten de agregados plaquetarios

423 Heparina

El nombre de heparina proviene del griego hepar que significa hiacutegado ya que fue aislado por primera vez de las ceacutelulas de este tejido Es un mucopolisacaacuterido aacutecido Presenta el

inconveniente de que si no se agita raacutepidamente con la sangre despueacutes de extraiacuteda

pueden formarse microcoaacutegulos aunque no altera el volumeneritrocitario ni la morfologiacutea de los leucocitos No es recomendablepara el frotis sanguiacuteneo porque produce un fondo azul en la laacutemina

La heparina de sodio o litio puede usarse en forma soacutelida o liacutequida en

proporcioacutende 01 - 02 mg de heparina por 1 mL de sangre

43 ANTICOAGULANTES LIacuteQUIDOS

431 Citrato trisoacutedico

Es de eleccioacuten para las pruebas de hemostasia y la velocidad de sedimentacioacuten

Actuacutea a traveacutes de la precipitacioacuten del calcio La concentracioacuten depende de

la prueba por realizar

bull Para pruebas de hemostasia se emplea en proporcioacuten de 1 9 (05 mL

deanticoagulante para 45 mL de sangre total)

bull Para la determinacioacuten de la VSG (Velocidad de Sedimentacioacuten Globular) es14

(05 mL de anticoagulante para 2 mL de sangre)

432 Oxalato soacutedico

Recomendado tambieacuten para las pruebas de hemostasia Se emplea en

proporcioacutende un volumen de anticoagulante para 4 vol de sangre

SECCIOacuteN 5

REALIZACIOacuteN Y TINCIOacuteN DEL FROTIS SANGUIacuteNEO

La praacutectica del frotis sanguiacuteneo tambieacuten llamado extendido es de gran importanciaen hematologiacutea ya que el diagnoacutestico de muchas enfermedadeshematoloacutegicas puede realizarse con soacutelo observar las caracteriacutesticasmorfoloacutegicas de las ceacutelulas sanguiacuteneas de manera que eacuteste no debe serexcesivamente grueso ni excesivamente fino Todas las laacuteminas por usarsobre todo nuevas deben ser limpiadas con algodoacuten y alcohol al 70 paraeliminar la grasa que viene adherida

51 MEacuteTODO DE LOS DOS PORTAOBJETOS

511 Materiales

- Alcohol al 70

- Algodoacuten

- Lanceta descartable

- Portaobjetos de vidrios limpios y desgrasados (25 x 75 mm)

512 Fundamento

Consiste en la extensioacuten de una gota de sangre sobre un portaobjeto (25 x 75)empleando el canto biselado de otro portaobjeto de igual dimensioacuten (Fig 12)

513 Procedimiento

5131 Una vez extraiacuteda la sangre con cualquiera de las metodologiacuteas secoloca una pequentildea gota de sangre (5mL) (aprox 3 mm de diaacutemetro)sobre un portaobjeto a 2 cm aproximadamente de uno de los extremos

5132 Colocar el canto de otro portaobjeto esmerilado sobre la superficiedel primer portaobjeto (en la que se encuentra la gota de sangre)formando un aacutengulo de 45ordm

5134 Deslizar suavemente y a velocidad moderada el portaobjeto sobre elotro en sentido longitudinal hasta que la gota de sangre quede bienextendida sobre la

superficie del primer portaobjeto El grosor delfrotis sanguiacuteneo puede variar seguacuten sea el aacutengulo que formen entresiacute ambos portaobjetos Asiacute si es superior a 45ordm la extensioacuten obtenidaseraacute gruesa y corta si es inferior a 45ordm seraacute larga y fina El secado delfrotis es a temperatura ambiente y en posicioacuten horizontal

Fig 12

1048729 Zona excesivamente gruesa Se halla en la regioacuten inmediata al punto departida de la extensioacuten (cabeza) En ella se aprecia siempre un aumento delinfocitos

1048729 Zona excesivamente fina Corresponde al final de la extensioacuten y termina enun aacuterea donde las ceacutelulas adoptan una posicioacuten acartonada (barbas) Enesta regioacuten existe un exceso de granulocitos y monocitos

1048729 Zona ideal Corresponde a la regioacuten intermedia del frotis y en ella existe unreparto equilibrado de ceacutelulas

52 COLORACIONES USADAS

Una vez seco el frotis se procede a la tincioacuten hematoloacutegica con el colorante deRomanowsky constituido por la mezcla de eosina y azul de metileno Dentrode eacutestas tenemos

521 Colorante de Giemsa

522 Colorante de May-Grunwald

523 Colorante de Wright

524 Colorante de Leishman

Preparacioacuten de colorantes (Anexo A)

1048729 Para el estudio de las ceacutelulas sanguiacuteneas utilizar el colorante 523 y 524

1048729 Para el estudio de hemoparaacutesitos utilizar el colorante 521

1048729 Utilizar el colorante 522 para casos especiales en que se desee observar

con mayor claridad y especificidad los graacutenulos de los neutrofilos

53 TINCIOacuteN CON COLORANTE DE WRIGHT

531 Fundamento

El colorante de Wright va a permitir suministrar un medio para estudiar lasangre y determinar las variaciones y anormalidades de estructura forma ytamantildeo de los eritrocitos su contenido de hemoglobina y sus propiedades decoloracioacuten La informacioacuten obtenida de un frotis de sangre perifeacuterica dependeen gran parte de la calidad del extendido y la coloracioacuten

532 Materiales

5321 Colorante de Wright (Anexo A)

5322 Frasco gotero

5323 Solucioacuten amortiguada tamponada (Anexo A)

533 Procedimiento

5331 Una vez obtenido el frotis sanguiacuteneo se le dejaraacute secar entre 15 y 20minutos

5332 Luego se coloca la preparacioacuten en un soporte y se cubre con el colorantede Wright dejaacutendolo por espacio de 5 minutos

5333 Posteriormente se antildeade solucioacuten amortiguada tamponada en partesiguales hasta obtener un brillo metaacutelico dejando 6 minutos adicionales

5334 Finalmente se lava con agua corriente y se deja secar

5335 Se coloca en el microscopio y con pequentildeo aumento se revisa lacalidad de la coloracioacuten la cantidad aproximada de gloacutebulos blancosy se escoge el sitio para iniciar el recuento Se coloca una gota deaceite de inmersioacuten y se enfoca a un aumento de 100xLa forma de los gloacutebulos rojos se examinaraacute detenidamente observandoademaacutes del color (cantidad de hemoglobina) presencia deplaquetas su agrupacioacuten y distribucioacuten

5336 Posteriormente se hace el recuento diferencial de gloacutebulos blancosen 100

ceacutelulas para lo cual se deberaacute conocer las diferencias entreneutroacutefilos eosinoacutefilos

linfocitos y monocitosUna extensioacuten de sangre bien tentildeida debe caracterizarse

por unabuena diferenciacioacuten de las estructuras subcelulares en los leucocitosuna

coloracioacuten rosada de los hematiacutees y la ausencia de precipitados

Los defectos maacutes frecuentes observados en la tincioacuten del frotis sanguiacuteneoson

Coloracioacuten excesivamente azul debido a

1048729 Frotis excesivamente grueso

1048729 Lavado insuficiente

1048729 Tincioacuten muy prolongada

1048729 Empleo de colorante excesivamente alcalino

Coloracioacuten con una tonalidad rosada

1048729 El colorante el tampoacuten o el agua de lavado tienen un pH demasiadoaacutecido

Presencia de precipitados

1048729 Obedecen a una accioacuten excesiva del colorante Esto se puede evitarcon la

filtracioacuten

SECCIOacuteN 6

HEMOGRAMA-HEMOGLOBINA-HEMATOCRITO

El hemograma de Shilling constituye uno de los exaacutemenes de laboratorio

maacutesusados en el campo de la hematologiacutea Comprende las siguientes pruebas

61 RECUENTO LEUCOCITARIO

Principio

La sangre anticoagulada se deposita en un liacutequido que permite evidenciar

losleucocitos mantenieacutendolos visibles mientras que los eritrocitos

sonhemolizados El recuento del nuacutemero de leucocitos o gloacutebulos blancos se

expresapor mm3 (miliacutemetro cuacutebico)

611 Equipos

- Microscopio

- Hemocitoacutemetro (Caacutemara de Neubauer)

Consta de los siguientes elementos

diams Una laacutemina portaobjeto gruesa en el centro se hallan dos

superficiescuadriculadas iguales separadas del resto de la laacutemina por surcos y

dosbarras transversales algo maacutes elevadas

diams Una laminilla cubreobjetos oacutepticamente plana que al colocarse sobrelas barras

elevadas de la laacutemina forma una caacutemara entre el cubreobjetosy la superficie

cuadriculadaLa altura entre el cubreobjetos y la laacutemina portaobjetos es de 01

mmCada cuadriacutecula mide 3 mm de lado y se divide en 9 cuadrados grandesCada

uno de los cuales mide 1 mm2 de superficie que se subdivide a suvez en 16

cuadrados medianos El cuadrado grande central se divide en25 cuadrados

pequentildeos y cada uno de ellos en 16 cuadraditos Cadacuadrado pequentildeo mide

02 mm de lado (004 mm2 de superficie) y cadacuadradito mide 005 mm de lado

(00025 mm2 de superficie)

612 Materiales y reactivos requeridos

6121 Pipeta de gloacutebulos blancos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0 a 100 mL)Presenta cerca del extremo superior una marca de 11 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla que funciona comomezcladora luego sigue el extremo maacutes largo de la pipeta (tallo) que estaacutedividida en 10 partes con 2 marcas 1 (parte final del bulbo) y 05 (a la mitaddel tallo) Se le acopla a su extremo superior 1 tubo de goma y una bombillapara aspirar

6122 Diluyente de gloacutebulos blancos Solucioacuten de Turk al 1

6123 Contador manual (Soacutelo si fuera necesario)

6124 Papel filtro

613 Procedimiento

6131 Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar deldedo se procede a aspirar la sangre con la pipeta de gloacutebulos blancoshasta la marca de 05 y a limpiar la punta con papel absorbente

6132 Introducir la pipeta en el tubo que contenga solucioacuten de Turk y absorberhasta la marca de 11 (no debe haber burbujas)

6133 Tapar ambos extremos y proceder a mezclar manualmente o en unrotador automaacutetico por 2 oacute 3 minutos

6134 Monte la laminilla de vidrio en la caacutemara para recuento que debe estarlimpia y seca

6135 Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocaruna gota pequentildea de esta solucioacuten en la caacutemara

6136 Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las ceacutelulas se sedimenten

6137 Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angularesCuando se usa la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002 mL) desangre total con anticoagulante o sangre capilar con anticoagulante yse diluye en un tubo que contenga 380 mL de solucioacuten de Turk (aquiacutetenemos una dilucioacuten 120)

LECTURA

Fig 13

La lectura se realiza en los campos 1 3 7 y 9 como estaacute indicado en la figuraAdemaacutes de los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes sedeben contar todos los leucocitos que se encuentren adheridos en la liacuteneahorizontal superior y vertical exterior o de lo contrario todos los leucocitosadheridos a la liacutenea horizontal inferior y vertical interior

614 Resultados

Nordm de leucocitos x mm3 = leucocitos contados en 4 camposdividealtura x dilucioacuten x aacuterea

Reemplazando = leucocitos contados en 4 camposdivide110 x 120 x 4=

Leucocitos contados en 4 camposdivide4200=

X1 divide4200= Nordm leucocitos contados x 50

615 Valores de referencia

5000 - 10 000 leucocitos mm3

616 Correccioacuten de valores para restar eritrocitos nucleados

Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el liacutequido de dilucioacuten por lo tantopueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con losleucocitos de tal manera que se debe emplear la siguiente foacutermula

Caacutelculo

La concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos (por litro) esNuacutemero de normoblatos contados x concentracioacuten o nuacutemero de leucocitos100 + Nordm de normoblastos contados

Ejemplo

Si se cuentan 50 normoblastos y la concentracioacuten del nuacutemero de leucocitos es16 x 109l la concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos seraacute

50 x16 = 53 x 109l

100 + 50

y la concentracioacuten de leucocitos corregida seraacute 16 - 53 = 107 x 109lEn unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitosse expresan por miliacutemetro cuacutebico En tales unidades el caacutelculo correspondienteal ejemplo que se ha dado seriacutea

50 x 16 000 = 5300 mm3

100 + 50

Recuento corregido de gloacutebulos blancos o leucocitos = 16 000 - 5300 = 10 700 mm3

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

62 RECUENTO DE GLOacuteBULOS ROJOS

Principio

La sangre se diluye en un liacutequido que nos permite observar claramente loshematiacutees luego esta dilucioacuten se coloca en una caacutemara de Neubauer con laayuda de una pipeta automaacutetica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopioa un objetivo de 40x para calcular el nuacutemero de gloacutebulos rojos por mm3

621 Equipos

- Microscopio

- Hemocitoacutemetro (caacutemara de Neubauer)

622 Materiales y reactivos requeridos

6221 Pipeta de gloacutebulos rojos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0-100 mL)

Presenta cerca del extremo superior una marca de 101 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla roja mezcladoraluego sigue el tallo (extremo maacutes largo) el cual estaacute dividido en 10 partescon 2 marcas 1 acabando el bulbo y 05 a la mitad del tallo Se requiereigual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar

6222 Diluyente de gloacutebulos rojos Cloruro de Sodio al 09 (ver anexo)

Diluyente de Hayem (ver anexo)

6223 Contador manual (soacutelo si fuera necesario)

6224 Papel filtro

623 Procedimiento

6231 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar

6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente

6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101

6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos

6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente

6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas

6237 Dejar en reposo por 3 minutos

6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)

6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos

LECTURA

Fig 14

624 Resultados

Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea

Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15

= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000

= hematiacutees contados x 10 000

625 Valores de referencia

(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)

Hombres 4 500 000 - 5 500 000

Mujeres 4 000 000 - 5 000 000

Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000

Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000

Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)

Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal

volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen

porcentaje o como valor decimal

Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre

total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)

631 Meacutetodo de Wintrobe

Materiales requeridos

- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm

- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia

- Tapoacuten de goma

Procedimiento

diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur

comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado

de no provocar espuma

diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten

diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos

Resultados (lectura)

Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos

Valores de referencia

Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

632 Meacutetodo de microhematocrito

Materiales requeridos

- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)

- Plastilina

Procedimiento

diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel

dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon

anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80

del capilar

diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina

diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma

diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm

Resultados (lectura)

La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio

Uso de la escala

diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero

diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la

columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical

diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos

Valores de referencia

Hombres 40 - 50

Mujeres 38 - 44

Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44

Lactantes (3 meses) 37 - 42

Recieacuten nacidos 50 - 58

La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)

64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA

Principio

La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre

641 Materiales y reactivos

6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro

6412 Pipetas

diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla

diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL

6413 Tubos de ensayo

6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten

Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia

EXTRACCIOacuteN DE SANGRE CAPILAR

Fig 10

Fig 11

SECCIOacuteN 4

ANTICOAGULANTES

Una vez extraiacuteda la sangre eacutesta puede conservarse coagulada o

mantenidaincoagulable mediante la adicioacuten de un anticoagulante

41 CARACTERIacuteSTICAS BAacuteSICAS DE LOS ANTICOAGULANTES MAacuteS

USADOSEN HEMATOLOGIacuteA

bull No alterar el tamantildeo de los hematiacutees

bull No producir hemoacutelisis

bull Evitar al maacuteximo la agregacioacuten plaquetaria

bull No alterar la morfologiacutea de los leucocitos

La sangre tratada con anticoagulante debe procesarse lo antes posible

inclusomantenida bajo refrigeracioacuten (4 ordmC) si no pasan de las 2 horas El

tiempomaacuteximo entre la extraccioacuten de la sangre y su procesamiento depende

delcoagulante de eleccioacuten y no debe ser maacutes de 4 horas a excepcioacuten

delanticoagulante EDTA (etilendiaminotetraceacutetico) que puede ser hasta 24

horas(en refrigeracioacuten a 4 ordmC)

Los anticoagulantes pueden emplearse en forma soacutelida o liacutequida Los

primerosestaacuten indicados para la determinacioacuten de los paraacutemetros

hematoloacutegicosya que no producen como los anticoagulantes liacutequidos dilucioacuten de

la sangre

42 ANTICOAGULANTES SOacuteLIDOS

421 EDTA

Es la sal disoacutedica o tripotaacutesica del aacutecido etilendiaminotetraceacutetico La saldisoacutedica

(Na2EDTA) es menos soluble que la sal tripotaacutesica (K3EDTA) Estoscompuestos

realizan su accioacuten a traveacutes de un efecto quelante sobre el calcioal fijarlo impiden

su activacioacuten y por ende la coagulacioacuten sanguiacutenea

4211 Ventajas

bull Respeta la morfologiacutea eritrocitaria (especialmente la sal tripotaacutesica) yleucocitaria de manera que permite una demora de dos horas en la realizacioacutendel frotis sanguiacuteneo despueacutes de la extraccioacuten sanguiacutenea

bull Asegura la conservacioacuten de los elementos formes sanguiacuteneos durante 24horas si la sangre se mantiene a 4 ordmC

bull Al inhibir la aglutinacioacuten de las plaquetas facilita su recuento o su expresioacutensemicuantitativa a partir del frotis

bull La concentracioacuten recomendada de EDTA es de 15 mgmL de sangre Unamayor cantidad de anticoagulante puede producir retraccioacuten celular condisminucioacuten del hematocrito y un aumento de la concentracioacuten media de lahemoglobina Un exceso de sangre con relacioacuten al anticoagulante produceformacioacuten de microagregados que pueden alterar los resultados El empleode tubos al vaciacuteo con una gota (50mL) de EDTA tripotaacutesica comercialpara 5 mL de sangre es de intereacutes praacutectico dado que es cien veces maacutessoluble facilitando la mezcla de sangre con anticoagulante

4212 Desventajas

Usado en exceso afecta a los eritrocitos y a los leucocitos a los cuales les produce encogimiento y cambios en su forma por ello debe cuidarse de agregar la cantidad correcta de sangre al anticoagulante

422 Anticoagulante de Wintrobe

Es una mezcla de oxalato de amonio y potasio Actuacutea por precipitacioacuten del calcio es faacutecil de preparar Se emplea en forma de polvo en proporcioacuten de 2 de oxalato de amonio por 1 de oxalato de potasio La cantidad recomendada es de 2 mg x mL de sangre Este anticoagulante no afecta el volumen globular medio y puede usarse para determinaciones de hemoglobina hematocrito y recuento globular pero para los extendidos queda limitada a los primeros minutos tampoco es uacutetil para el recuento plaquetario porque produce formacioacuten de agregados plaquetarios

423 Heparina

El nombre de heparina proviene del griego hepar que significa hiacutegado ya que fue aislado por primera vez de las ceacutelulas de este tejido Es un mucopolisacaacuterido aacutecido Presenta el

inconveniente de que si no se agita raacutepidamente con la sangre despueacutes de extraiacuteda

pueden formarse microcoaacutegulos aunque no altera el volumeneritrocitario ni la morfologiacutea de los leucocitos No es recomendablepara el frotis sanguiacuteneo porque produce un fondo azul en la laacutemina

La heparina de sodio o litio puede usarse en forma soacutelida o liacutequida en

proporcioacutende 01 - 02 mg de heparina por 1 mL de sangre

43 ANTICOAGULANTES LIacuteQUIDOS

431 Citrato trisoacutedico

Es de eleccioacuten para las pruebas de hemostasia y la velocidad de sedimentacioacuten

Actuacutea a traveacutes de la precipitacioacuten del calcio La concentracioacuten depende de

la prueba por realizar

bull Para pruebas de hemostasia se emplea en proporcioacuten de 1 9 (05 mL

deanticoagulante para 45 mL de sangre total)

bull Para la determinacioacuten de la VSG (Velocidad de Sedimentacioacuten Globular) es14

(05 mL de anticoagulante para 2 mL de sangre)

432 Oxalato soacutedico

Recomendado tambieacuten para las pruebas de hemostasia Se emplea en

proporcioacutende un volumen de anticoagulante para 4 vol de sangre

SECCIOacuteN 5

REALIZACIOacuteN Y TINCIOacuteN DEL FROTIS SANGUIacuteNEO

La praacutectica del frotis sanguiacuteneo tambieacuten llamado extendido es de gran importanciaen hematologiacutea ya que el diagnoacutestico de muchas enfermedadeshematoloacutegicas puede realizarse con soacutelo observar las caracteriacutesticasmorfoloacutegicas de las ceacutelulas sanguiacuteneas de manera que eacuteste no debe serexcesivamente grueso ni excesivamente fino Todas las laacuteminas por usarsobre todo nuevas deben ser limpiadas con algodoacuten y alcohol al 70 paraeliminar la grasa que viene adherida

51 MEacuteTODO DE LOS DOS PORTAOBJETOS

511 Materiales

- Alcohol al 70

- Algodoacuten

- Lanceta descartable

- Portaobjetos de vidrios limpios y desgrasados (25 x 75 mm)

512 Fundamento

Consiste en la extensioacuten de una gota de sangre sobre un portaobjeto (25 x 75)empleando el canto biselado de otro portaobjeto de igual dimensioacuten (Fig 12)

513 Procedimiento

5131 Una vez extraiacuteda la sangre con cualquiera de las metodologiacuteas secoloca una pequentildea gota de sangre (5mL) (aprox 3 mm de diaacutemetro)sobre un portaobjeto a 2 cm aproximadamente de uno de los extremos

5132 Colocar el canto de otro portaobjeto esmerilado sobre la superficiedel primer portaobjeto (en la que se encuentra la gota de sangre)formando un aacutengulo de 45ordm

5134 Deslizar suavemente y a velocidad moderada el portaobjeto sobre elotro en sentido longitudinal hasta que la gota de sangre quede bienextendida sobre la

superficie del primer portaobjeto El grosor delfrotis sanguiacuteneo puede variar seguacuten sea el aacutengulo que formen entresiacute ambos portaobjetos Asiacute si es superior a 45ordm la extensioacuten obtenidaseraacute gruesa y corta si es inferior a 45ordm seraacute larga y fina El secado delfrotis es a temperatura ambiente y en posicioacuten horizontal

Fig 12

1048729 Zona excesivamente gruesa Se halla en la regioacuten inmediata al punto departida de la extensioacuten (cabeza) En ella se aprecia siempre un aumento delinfocitos

1048729 Zona excesivamente fina Corresponde al final de la extensioacuten y termina enun aacuterea donde las ceacutelulas adoptan una posicioacuten acartonada (barbas) Enesta regioacuten existe un exceso de granulocitos y monocitos

1048729 Zona ideal Corresponde a la regioacuten intermedia del frotis y en ella existe unreparto equilibrado de ceacutelulas

52 COLORACIONES USADAS

Una vez seco el frotis se procede a la tincioacuten hematoloacutegica con el colorante deRomanowsky constituido por la mezcla de eosina y azul de metileno Dentrode eacutestas tenemos

521 Colorante de Giemsa

522 Colorante de May-Grunwald

523 Colorante de Wright

524 Colorante de Leishman

Preparacioacuten de colorantes (Anexo A)

1048729 Para el estudio de las ceacutelulas sanguiacuteneas utilizar el colorante 523 y 524

1048729 Para el estudio de hemoparaacutesitos utilizar el colorante 521

1048729 Utilizar el colorante 522 para casos especiales en que se desee observar

con mayor claridad y especificidad los graacutenulos de los neutrofilos

53 TINCIOacuteN CON COLORANTE DE WRIGHT

531 Fundamento

El colorante de Wright va a permitir suministrar un medio para estudiar lasangre y determinar las variaciones y anormalidades de estructura forma ytamantildeo de los eritrocitos su contenido de hemoglobina y sus propiedades decoloracioacuten La informacioacuten obtenida de un frotis de sangre perifeacuterica dependeen gran parte de la calidad del extendido y la coloracioacuten

532 Materiales

5321 Colorante de Wright (Anexo A)

5322 Frasco gotero

5323 Solucioacuten amortiguada tamponada (Anexo A)

533 Procedimiento

5331 Una vez obtenido el frotis sanguiacuteneo se le dejaraacute secar entre 15 y 20minutos

5332 Luego se coloca la preparacioacuten en un soporte y se cubre con el colorantede Wright dejaacutendolo por espacio de 5 minutos

5333 Posteriormente se antildeade solucioacuten amortiguada tamponada en partesiguales hasta obtener un brillo metaacutelico dejando 6 minutos adicionales

5334 Finalmente se lava con agua corriente y se deja secar

5335 Se coloca en el microscopio y con pequentildeo aumento se revisa lacalidad de la coloracioacuten la cantidad aproximada de gloacutebulos blancosy se escoge el sitio para iniciar el recuento Se coloca una gota deaceite de inmersioacuten y se enfoca a un aumento de 100xLa forma de los gloacutebulos rojos se examinaraacute detenidamente observandoademaacutes del color (cantidad de hemoglobina) presencia deplaquetas su agrupacioacuten y distribucioacuten

5336 Posteriormente se hace el recuento diferencial de gloacutebulos blancosen 100

ceacutelulas para lo cual se deberaacute conocer las diferencias entreneutroacutefilos eosinoacutefilos

linfocitos y monocitosUna extensioacuten de sangre bien tentildeida debe caracterizarse

por unabuena diferenciacioacuten de las estructuras subcelulares en los leucocitosuna

coloracioacuten rosada de los hematiacutees y la ausencia de precipitados

Los defectos maacutes frecuentes observados en la tincioacuten del frotis sanguiacuteneoson

Coloracioacuten excesivamente azul debido a

1048729 Frotis excesivamente grueso

1048729 Lavado insuficiente

1048729 Tincioacuten muy prolongada

1048729 Empleo de colorante excesivamente alcalino

Coloracioacuten con una tonalidad rosada

1048729 El colorante el tampoacuten o el agua de lavado tienen un pH demasiadoaacutecido

Presencia de precipitados

1048729 Obedecen a una accioacuten excesiva del colorante Esto se puede evitarcon la

filtracioacuten

SECCIOacuteN 6

HEMOGRAMA-HEMOGLOBINA-HEMATOCRITO

El hemograma de Shilling constituye uno de los exaacutemenes de laboratorio

maacutesusados en el campo de la hematologiacutea Comprende las siguientes pruebas

61 RECUENTO LEUCOCITARIO

Principio

La sangre anticoagulada se deposita en un liacutequido que permite evidenciar

losleucocitos mantenieacutendolos visibles mientras que los eritrocitos

sonhemolizados El recuento del nuacutemero de leucocitos o gloacutebulos blancos se

expresapor mm3 (miliacutemetro cuacutebico)

611 Equipos

- Microscopio

- Hemocitoacutemetro (Caacutemara de Neubauer)

Consta de los siguientes elementos

diams Una laacutemina portaobjeto gruesa en el centro se hallan dos

superficiescuadriculadas iguales separadas del resto de la laacutemina por surcos y

dosbarras transversales algo maacutes elevadas

diams Una laminilla cubreobjetos oacutepticamente plana que al colocarse sobrelas barras

elevadas de la laacutemina forma una caacutemara entre el cubreobjetosy la superficie

cuadriculadaLa altura entre el cubreobjetos y la laacutemina portaobjetos es de 01

mmCada cuadriacutecula mide 3 mm de lado y se divide en 9 cuadrados grandesCada

uno de los cuales mide 1 mm2 de superficie que se subdivide a suvez en 16

cuadrados medianos El cuadrado grande central se divide en25 cuadrados

pequentildeos y cada uno de ellos en 16 cuadraditos Cadacuadrado pequentildeo mide

02 mm de lado (004 mm2 de superficie) y cadacuadradito mide 005 mm de lado

(00025 mm2 de superficie)

612 Materiales y reactivos requeridos

6121 Pipeta de gloacutebulos blancos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0 a 100 mL)Presenta cerca del extremo superior una marca de 11 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla que funciona comomezcladora luego sigue el extremo maacutes largo de la pipeta (tallo) que estaacutedividida en 10 partes con 2 marcas 1 (parte final del bulbo) y 05 (a la mitaddel tallo) Se le acopla a su extremo superior 1 tubo de goma y una bombillapara aspirar

6122 Diluyente de gloacutebulos blancos Solucioacuten de Turk al 1

6123 Contador manual (Soacutelo si fuera necesario)

6124 Papel filtro

613 Procedimiento

6131 Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar deldedo se procede a aspirar la sangre con la pipeta de gloacutebulos blancoshasta la marca de 05 y a limpiar la punta con papel absorbente

6132 Introducir la pipeta en el tubo que contenga solucioacuten de Turk y absorberhasta la marca de 11 (no debe haber burbujas)

6133 Tapar ambos extremos y proceder a mezclar manualmente o en unrotador automaacutetico por 2 oacute 3 minutos

6134 Monte la laminilla de vidrio en la caacutemara para recuento que debe estarlimpia y seca

6135 Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocaruna gota pequentildea de esta solucioacuten en la caacutemara

6136 Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las ceacutelulas se sedimenten

6137 Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angularesCuando se usa la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002 mL) desangre total con anticoagulante o sangre capilar con anticoagulante yse diluye en un tubo que contenga 380 mL de solucioacuten de Turk (aquiacutetenemos una dilucioacuten 120)

LECTURA

Fig 13

La lectura se realiza en los campos 1 3 7 y 9 como estaacute indicado en la figuraAdemaacutes de los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes sedeben contar todos los leucocitos que se encuentren adheridos en la liacuteneahorizontal superior y vertical exterior o de lo contrario todos los leucocitosadheridos a la liacutenea horizontal inferior y vertical interior

614 Resultados

Nordm de leucocitos x mm3 = leucocitos contados en 4 camposdividealtura x dilucioacuten x aacuterea

Reemplazando = leucocitos contados en 4 camposdivide110 x 120 x 4=

Leucocitos contados en 4 camposdivide4200=

X1 divide4200= Nordm leucocitos contados x 50

615 Valores de referencia

5000 - 10 000 leucocitos mm3

616 Correccioacuten de valores para restar eritrocitos nucleados

Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el liacutequido de dilucioacuten por lo tantopueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con losleucocitos de tal manera que se debe emplear la siguiente foacutermula

Caacutelculo

La concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos (por litro) esNuacutemero de normoblatos contados x concentracioacuten o nuacutemero de leucocitos100 + Nordm de normoblastos contados

Ejemplo

Si se cuentan 50 normoblastos y la concentracioacuten del nuacutemero de leucocitos es16 x 109l la concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos seraacute

50 x16 = 53 x 109l

100 + 50

y la concentracioacuten de leucocitos corregida seraacute 16 - 53 = 107 x 109lEn unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitosse expresan por miliacutemetro cuacutebico En tales unidades el caacutelculo correspondienteal ejemplo que se ha dado seriacutea

50 x 16 000 = 5300 mm3

100 + 50

Recuento corregido de gloacutebulos blancos o leucocitos = 16 000 - 5300 = 10 700 mm3

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

62 RECUENTO DE GLOacuteBULOS ROJOS

Principio

La sangre se diluye en un liacutequido que nos permite observar claramente loshematiacutees luego esta dilucioacuten se coloca en una caacutemara de Neubauer con laayuda de una pipeta automaacutetica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopioa un objetivo de 40x para calcular el nuacutemero de gloacutebulos rojos por mm3

621 Equipos

- Microscopio

- Hemocitoacutemetro (caacutemara de Neubauer)

622 Materiales y reactivos requeridos

6221 Pipeta de gloacutebulos rojos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0-100 mL)

Presenta cerca del extremo superior una marca de 101 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla roja mezcladoraluego sigue el tallo (extremo maacutes largo) el cual estaacute dividido en 10 partescon 2 marcas 1 acabando el bulbo y 05 a la mitad del tallo Se requiereigual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar

6222 Diluyente de gloacutebulos rojos Cloruro de Sodio al 09 (ver anexo)

Diluyente de Hayem (ver anexo)

6223 Contador manual (soacutelo si fuera necesario)

6224 Papel filtro

623 Procedimiento

6231 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar

6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente

6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101

6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos

6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente

6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas

6237 Dejar en reposo por 3 minutos

6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)

6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos

LECTURA

Fig 14

624 Resultados

Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea

Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15

= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000

= hematiacutees contados x 10 000

625 Valores de referencia

(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)

Hombres 4 500 000 - 5 500 000

Mujeres 4 000 000 - 5 000 000

Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000

Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000

Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)

Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal

volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen

porcentaje o como valor decimal

Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre

total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)

631 Meacutetodo de Wintrobe

Materiales requeridos

- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm

- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia

- Tapoacuten de goma

Procedimiento

diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur

comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado

de no provocar espuma

diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten

diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos

Resultados (lectura)

Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos

Valores de referencia

Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

632 Meacutetodo de microhematocrito

Materiales requeridos

- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)

- Plastilina

Procedimiento

diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel

dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon

anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80

del capilar

diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina

diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma

diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm

Resultados (lectura)

La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio

Uso de la escala

diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero

diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la

columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical

diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos

Valores de referencia

Hombres 40 - 50

Mujeres 38 - 44

Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44

Lactantes (3 meses) 37 - 42

Recieacuten nacidos 50 - 58

La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)

64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA

Principio

La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre

641 Materiales y reactivos

6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro

6412 Pipetas

diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla

diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL

6413 Tubos de ensayo

6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten

Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia

SECCIOacuteN 4

ANTICOAGULANTES

Una vez extraiacuteda la sangre eacutesta puede conservarse coagulada o

mantenidaincoagulable mediante la adicioacuten de un anticoagulante

41 CARACTERIacuteSTICAS BAacuteSICAS DE LOS ANTICOAGULANTES MAacuteS

USADOSEN HEMATOLOGIacuteA

bull No alterar el tamantildeo de los hematiacutees

bull No producir hemoacutelisis

bull Evitar al maacuteximo la agregacioacuten plaquetaria

bull No alterar la morfologiacutea de los leucocitos

La sangre tratada con anticoagulante debe procesarse lo antes posible

inclusomantenida bajo refrigeracioacuten (4 ordmC) si no pasan de las 2 horas El

tiempomaacuteximo entre la extraccioacuten de la sangre y su procesamiento depende

delcoagulante de eleccioacuten y no debe ser maacutes de 4 horas a excepcioacuten

delanticoagulante EDTA (etilendiaminotetraceacutetico) que puede ser hasta 24

horas(en refrigeracioacuten a 4 ordmC)

Los anticoagulantes pueden emplearse en forma soacutelida o liacutequida Los

primerosestaacuten indicados para la determinacioacuten de los paraacutemetros

hematoloacutegicosya que no producen como los anticoagulantes liacutequidos dilucioacuten de

la sangre

42 ANTICOAGULANTES SOacuteLIDOS

421 EDTA

Es la sal disoacutedica o tripotaacutesica del aacutecido etilendiaminotetraceacutetico La saldisoacutedica

(Na2EDTA) es menos soluble que la sal tripotaacutesica (K3EDTA) Estoscompuestos

realizan su accioacuten a traveacutes de un efecto quelante sobre el calcioal fijarlo impiden

su activacioacuten y por ende la coagulacioacuten sanguiacutenea

4211 Ventajas

bull Respeta la morfologiacutea eritrocitaria (especialmente la sal tripotaacutesica) yleucocitaria de manera que permite una demora de dos horas en la realizacioacutendel frotis sanguiacuteneo despueacutes de la extraccioacuten sanguiacutenea

bull Asegura la conservacioacuten de los elementos formes sanguiacuteneos durante 24horas si la sangre se mantiene a 4 ordmC

bull Al inhibir la aglutinacioacuten de las plaquetas facilita su recuento o su expresioacutensemicuantitativa a partir del frotis

bull La concentracioacuten recomendada de EDTA es de 15 mgmL de sangre Unamayor cantidad de anticoagulante puede producir retraccioacuten celular condisminucioacuten del hematocrito y un aumento de la concentracioacuten media de lahemoglobina Un exceso de sangre con relacioacuten al anticoagulante produceformacioacuten de microagregados que pueden alterar los resultados El empleode tubos al vaciacuteo con una gota (50mL) de EDTA tripotaacutesica comercialpara 5 mL de sangre es de intereacutes praacutectico dado que es cien veces maacutessoluble facilitando la mezcla de sangre con anticoagulante

4212 Desventajas

Usado en exceso afecta a los eritrocitos y a los leucocitos a los cuales les produce encogimiento y cambios en su forma por ello debe cuidarse de agregar la cantidad correcta de sangre al anticoagulante

422 Anticoagulante de Wintrobe

Es una mezcla de oxalato de amonio y potasio Actuacutea por precipitacioacuten del calcio es faacutecil de preparar Se emplea en forma de polvo en proporcioacuten de 2 de oxalato de amonio por 1 de oxalato de potasio La cantidad recomendada es de 2 mg x mL de sangre Este anticoagulante no afecta el volumen globular medio y puede usarse para determinaciones de hemoglobina hematocrito y recuento globular pero para los extendidos queda limitada a los primeros minutos tampoco es uacutetil para el recuento plaquetario porque produce formacioacuten de agregados plaquetarios

423 Heparina

El nombre de heparina proviene del griego hepar que significa hiacutegado ya que fue aislado por primera vez de las ceacutelulas de este tejido Es un mucopolisacaacuterido aacutecido Presenta el

inconveniente de que si no se agita raacutepidamente con la sangre despueacutes de extraiacuteda

pueden formarse microcoaacutegulos aunque no altera el volumeneritrocitario ni la morfologiacutea de los leucocitos No es recomendablepara el frotis sanguiacuteneo porque produce un fondo azul en la laacutemina

La heparina de sodio o litio puede usarse en forma soacutelida o liacutequida en

proporcioacutende 01 - 02 mg de heparina por 1 mL de sangre

43 ANTICOAGULANTES LIacuteQUIDOS

431 Citrato trisoacutedico

Es de eleccioacuten para las pruebas de hemostasia y la velocidad de sedimentacioacuten

Actuacutea a traveacutes de la precipitacioacuten del calcio La concentracioacuten depende de

la prueba por realizar

bull Para pruebas de hemostasia se emplea en proporcioacuten de 1 9 (05 mL

deanticoagulante para 45 mL de sangre total)

bull Para la determinacioacuten de la VSG (Velocidad de Sedimentacioacuten Globular) es14

(05 mL de anticoagulante para 2 mL de sangre)

432 Oxalato soacutedico

Recomendado tambieacuten para las pruebas de hemostasia Se emplea en

proporcioacutende un volumen de anticoagulante para 4 vol de sangre

SECCIOacuteN 5

REALIZACIOacuteN Y TINCIOacuteN DEL FROTIS SANGUIacuteNEO

La praacutectica del frotis sanguiacuteneo tambieacuten llamado extendido es de gran importanciaen hematologiacutea ya que el diagnoacutestico de muchas enfermedadeshematoloacutegicas puede realizarse con soacutelo observar las caracteriacutesticasmorfoloacutegicas de las ceacutelulas sanguiacuteneas de manera que eacuteste no debe serexcesivamente grueso ni excesivamente fino Todas las laacuteminas por usarsobre todo nuevas deben ser limpiadas con algodoacuten y alcohol al 70 paraeliminar la grasa que viene adherida

51 MEacuteTODO DE LOS DOS PORTAOBJETOS

511 Materiales

- Alcohol al 70

- Algodoacuten

- Lanceta descartable

- Portaobjetos de vidrios limpios y desgrasados (25 x 75 mm)

512 Fundamento

Consiste en la extensioacuten de una gota de sangre sobre un portaobjeto (25 x 75)empleando el canto biselado de otro portaobjeto de igual dimensioacuten (Fig 12)

513 Procedimiento

5131 Una vez extraiacuteda la sangre con cualquiera de las metodologiacuteas secoloca una pequentildea gota de sangre (5mL) (aprox 3 mm de diaacutemetro)sobre un portaobjeto a 2 cm aproximadamente de uno de los extremos

5132 Colocar el canto de otro portaobjeto esmerilado sobre la superficiedel primer portaobjeto (en la que se encuentra la gota de sangre)formando un aacutengulo de 45ordm

5134 Deslizar suavemente y a velocidad moderada el portaobjeto sobre elotro en sentido longitudinal hasta que la gota de sangre quede bienextendida sobre la

superficie del primer portaobjeto El grosor delfrotis sanguiacuteneo puede variar seguacuten sea el aacutengulo que formen entresiacute ambos portaobjetos Asiacute si es superior a 45ordm la extensioacuten obtenidaseraacute gruesa y corta si es inferior a 45ordm seraacute larga y fina El secado delfrotis es a temperatura ambiente y en posicioacuten horizontal

Fig 12

1048729 Zona excesivamente gruesa Se halla en la regioacuten inmediata al punto departida de la extensioacuten (cabeza) En ella se aprecia siempre un aumento delinfocitos

1048729 Zona excesivamente fina Corresponde al final de la extensioacuten y termina enun aacuterea donde las ceacutelulas adoptan una posicioacuten acartonada (barbas) Enesta regioacuten existe un exceso de granulocitos y monocitos

1048729 Zona ideal Corresponde a la regioacuten intermedia del frotis y en ella existe unreparto equilibrado de ceacutelulas

52 COLORACIONES USADAS

Una vez seco el frotis se procede a la tincioacuten hematoloacutegica con el colorante deRomanowsky constituido por la mezcla de eosina y azul de metileno Dentrode eacutestas tenemos

521 Colorante de Giemsa

522 Colorante de May-Grunwald

523 Colorante de Wright

524 Colorante de Leishman

Preparacioacuten de colorantes (Anexo A)

1048729 Para el estudio de las ceacutelulas sanguiacuteneas utilizar el colorante 523 y 524

1048729 Para el estudio de hemoparaacutesitos utilizar el colorante 521

1048729 Utilizar el colorante 522 para casos especiales en que se desee observar

con mayor claridad y especificidad los graacutenulos de los neutrofilos

53 TINCIOacuteN CON COLORANTE DE WRIGHT

531 Fundamento

El colorante de Wright va a permitir suministrar un medio para estudiar lasangre y determinar las variaciones y anormalidades de estructura forma ytamantildeo de los eritrocitos su contenido de hemoglobina y sus propiedades decoloracioacuten La informacioacuten obtenida de un frotis de sangre perifeacuterica dependeen gran parte de la calidad del extendido y la coloracioacuten

532 Materiales

5321 Colorante de Wright (Anexo A)

5322 Frasco gotero

5323 Solucioacuten amortiguada tamponada (Anexo A)

533 Procedimiento

5331 Una vez obtenido el frotis sanguiacuteneo se le dejaraacute secar entre 15 y 20minutos

5332 Luego se coloca la preparacioacuten en un soporte y se cubre con el colorantede Wright dejaacutendolo por espacio de 5 minutos

5333 Posteriormente se antildeade solucioacuten amortiguada tamponada en partesiguales hasta obtener un brillo metaacutelico dejando 6 minutos adicionales

5334 Finalmente se lava con agua corriente y se deja secar

5335 Se coloca en el microscopio y con pequentildeo aumento se revisa lacalidad de la coloracioacuten la cantidad aproximada de gloacutebulos blancosy se escoge el sitio para iniciar el recuento Se coloca una gota deaceite de inmersioacuten y se enfoca a un aumento de 100xLa forma de los gloacutebulos rojos se examinaraacute detenidamente observandoademaacutes del color (cantidad de hemoglobina) presencia deplaquetas su agrupacioacuten y distribucioacuten

5336 Posteriormente se hace el recuento diferencial de gloacutebulos blancosen 100

ceacutelulas para lo cual se deberaacute conocer las diferencias entreneutroacutefilos eosinoacutefilos

linfocitos y monocitosUna extensioacuten de sangre bien tentildeida debe caracterizarse

por unabuena diferenciacioacuten de las estructuras subcelulares en los leucocitosuna

coloracioacuten rosada de los hematiacutees y la ausencia de precipitados

Los defectos maacutes frecuentes observados en la tincioacuten del frotis sanguiacuteneoson

Coloracioacuten excesivamente azul debido a

1048729 Frotis excesivamente grueso

1048729 Lavado insuficiente

1048729 Tincioacuten muy prolongada

1048729 Empleo de colorante excesivamente alcalino

Coloracioacuten con una tonalidad rosada

1048729 El colorante el tampoacuten o el agua de lavado tienen un pH demasiadoaacutecido

Presencia de precipitados

1048729 Obedecen a una accioacuten excesiva del colorante Esto se puede evitarcon la

filtracioacuten

SECCIOacuteN 6

HEMOGRAMA-HEMOGLOBINA-HEMATOCRITO

El hemograma de Shilling constituye uno de los exaacutemenes de laboratorio

maacutesusados en el campo de la hematologiacutea Comprende las siguientes pruebas

61 RECUENTO LEUCOCITARIO

Principio

La sangre anticoagulada se deposita en un liacutequido que permite evidenciar

losleucocitos mantenieacutendolos visibles mientras que los eritrocitos

sonhemolizados El recuento del nuacutemero de leucocitos o gloacutebulos blancos se

expresapor mm3 (miliacutemetro cuacutebico)

611 Equipos

- Microscopio

- Hemocitoacutemetro (Caacutemara de Neubauer)

Consta de los siguientes elementos

diams Una laacutemina portaobjeto gruesa en el centro se hallan dos

superficiescuadriculadas iguales separadas del resto de la laacutemina por surcos y

dosbarras transversales algo maacutes elevadas

diams Una laminilla cubreobjetos oacutepticamente plana que al colocarse sobrelas barras

elevadas de la laacutemina forma una caacutemara entre el cubreobjetosy la superficie

cuadriculadaLa altura entre el cubreobjetos y la laacutemina portaobjetos es de 01

mmCada cuadriacutecula mide 3 mm de lado y se divide en 9 cuadrados grandesCada

uno de los cuales mide 1 mm2 de superficie que se subdivide a suvez en 16

cuadrados medianos El cuadrado grande central se divide en25 cuadrados

pequentildeos y cada uno de ellos en 16 cuadraditos Cadacuadrado pequentildeo mide

02 mm de lado (004 mm2 de superficie) y cadacuadradito mide 005 mm de lado

(00025 mm2 de superficie)

612 Materiales y reactivos requeridos

6121 Pipeta de gloacutebulos blancos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0 a 100 mL)Presenta cerca del extremo superior una marca de 11 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla que funciona comomezcladora luego sigue el extremo maacutes largo de la pipeta (tallo) que estaacutedividida en 10 partes con 2 marcas 1 (parte final del bulbo) y 05 (a la mitaddel tallo) Se le acopla a su extremo superior 1 tubo de goma y una bombillapara aspirar

6122 Diluyente de gloacutebulos blancos Solucioacuten de Turk al 1

6123 Contador manual (Soacutelo si fuera necesario)

6124 Papel filtro

613 Procedimiento

6131 Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar deldedo se procede a aspirar la sangre con la pipeta de gloacutebulos blancoshasta la marca de 05 y a limpiar la punta con papel absorbente

6132 Introducir la pipeta en el tubo que contenga solucioacuten de Turk y absorberhasta la marca de 11 (no debe haber burbujas)

6133 Tapar ambos extremos y proceder a mezclar manualmente o en unrotador automaacutetico por 2 oacute 3 minutos

6134 Monte la laminilla de vidrio en la caacutemara para recuento que debe estarlimpia y seca

6135 Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocaruna gota pequentildea de esta solucioacuten en la caacutemara

6136 Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las ceacutelulas se sedimenten

6137 Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angularesCuando se usa la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002 mL) desangre total con anticoagulante o sangre capilar con anticoagulante yse diluye en un tubo que contenga 380 mL de solucioacuten de Turk (aquiacutetenemos una dilucioacuten 120)

LECTURA

Fig 13

La lectura se realiza en los campos 1 3 7 y 9 como estaacute indicado en la figuraAdemaacutes de los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes sedeben contar todos los leucocitos que se encuentren adheridos en la liacuteneahorizontal superior y vertical exterior o de lo contrario todos los leucocitosadheridos a la liacutenea horizontal inferior y vertical interior

614 Resultados

Nordm de leucocitos x mm3 = leucocitos contados en 4 camposdividealtura x dilucioacuten x aacuterea

Reemplazando = leucocitos contados en 4 camposdivide110 x 120 x 4=

Leucocitos contados en 4 camposdivide4200=

X1 divide4200= Nordm leucocitos contados x 50

615 Valores de referencia

5000 - 10 000 leucocitos mm3

616 Correccioacuten de valores para restar eritrocitos nucleados

Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el liacutequido de dilucioacuten por lo tantopueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con losleucocitos de tal manera que se debe emplear la siguiente foacutermula

Caacutelculo

La concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos (por litro) esNuacutemero de normoblatos contados x concentracioacuten o nuacutemero de leucocitos100 + Nordm de normoblastos contados

Ejemplo

Si se cuentan 50 normoblastos y la concentracioacuten del nuacutemero de leucocitos es16 x 109l la concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos seraacute

50 x16 = 53 x 109l

100 + 50

y la concentracioacuten de leucocitos corregida seraacute 16 - 53 = 107 x 109lEn unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitosse expresan por miliacutemetro cuacutebico En tales unidades el caacutelculo correspondienteal ejemplo que se ha dado seriacutea

50 x 16 000 = 5300 mm3

100 + 50

Recuento corregido de gloacutebulos blancos o leucocitos = 16 000 - 5300 = 10 700 mm3

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

62 RECUENTO DE GLOacuteBULOS ROJOS

Principio

La sangre se diluye en un liacutequido que nos permite observar claramente loshematiacutees luego esta dilucioacuten se coloca en una caacutemara de Neubauer con laayuda de una pipeta automaacutetica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopioa un objetivo de 40x para calcular el nuacutemero de gloacutebulos rojos por mm3

621 Equipos

- Microscopio

- Hemocitoacutemetro (caacutemara de Neubauer)

622 Materiales y reactivos requeridos

6221 Pipeta de gloacutebulos rojos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0-100 mL)

Presenta cerca del extremo superior una marca de 101 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla roja mezcladoraluego sigue el tallo (extremo maacutes largo) el cual estaacute dividido en 10 partescon 2 marcas 1 acabando el bulbo y 05 a la mitad del tallo Se requiereigual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar

6222 Diluyente de gloacutebulos rojos Cloruro de Sodio al 09 (ver anexo)

Diluyente de Hayem (ver anexo)

6223 Contador manual (soacutelo si fuera necesario)

6224 Papel filtro

623 Procedimiento

6231 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar

6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente

6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101

6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos

6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente

6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas

6237 Dejar en reposo por 3 minutos

6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)

6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos

LECTURA

Fig 14

624 Resultados

Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea

Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15

= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000

= hematiacutees contados x 10 000

625 Valores de referencia

(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)

Hombres 4 500 000 - 5 500 000

Mujeres 4 000 000 - 5 000 000

Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000

Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000

Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)

Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal

volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen

porcentaje o como valor decimal

Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre

total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)

631 Meacutetodo de Wintrobe

Materiales requeridos

- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm

- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia

- Tapoacuten de goma

Procedimiento

diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur

comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado

de no provocar espuma

diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten

diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos

Resultados (lectura)

Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos

Valores de referencia

Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

632 Meacutetodo de microhematocrito

Materiales requeridos

- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)

- Plastilina

Procedimiento

diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel

dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon

anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80

del capilar

diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina

diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma

diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm

Resultados (lectura)

La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio

Uso de la escala

diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero

diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la

columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical

diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos

Valores de referencia

Hombres 40 - 50

Mujeres 38 - 44

Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44

Lactantes (3 meses) 37 - 42

Recieacuten nacidos 50 - 58

La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)

64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA

Principio

La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre

641 Materiales y reactivos

6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro

6412 Pipetas

diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla

diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL

6413 Tubos de ensayo

6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten

Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia

realizan su accioacuten a traveacutes de un efecto quelante sobre el calcioal fijarlo impiden

su activacioacuten y por ende la coagulacioacuten sanguiacutenea

4211 Ventajas

bull Respeta la morfologiacutea eritrocitaria (especialmente la sal tripotaacutesica) yleucocitaria de manera que permite una demora de dos horas en la realizacioacutendel frotis sanguiacuteneo despueacutes de la extraccioacuten sanguiacutenea

bull Asegura la conservacioacuten de los elementos formes sanguiacuteneos durante 24horas si la sangre se mantiene a 4 ordmC

bull Al inhibir la aglutinacioacuten de las plaquetas facilita su recuento o su expresioacutensemicuantitativa a partir del frotis

bull La concentracioacuten recomendada de EDTA es de 15 mgmL de sangre Unamayor cantidad de anticoagulante puede producir retraccioacuten celular condisminucioacuten del hematocrito y un aumento de la concentracioacuten media de lahemoglobina Un exceso de sangre con relacioacuten al anticoagulante produceformacioacuten de microagregados que pueden alterar los resultados El empleode tubos al vaciacuteo con una gota (50mL) de EDTA tripotaacutesica comercialpara 5 mL de sangre es de intereacutes praacutectico dado que es cien veces maacutessoluble facilitando la mezcla de sangre con anticoagulante

4212 Desventajas

Usado en exceso afecta a los eritrocitos y a los leucocitos a los cuales les produce encogimiento y cambios en su forma por ello debe cuidarse de agregar la cantidad correcta de sangre al anticoagulante

422 Anticoagulante de Wintrobe

Es una mezcla de oxalato de amonio y potasio Actuacutea por precipitacioacuten del calcio es faacutecil de preparar Se emplea en forma de polvo en proporcioacuten de 2 de oxalato de amonio por 1 de oxalato de potasio La cantidad recomendada es de 2 mg x mL de sangre Este anticoagulante no afecta el volumen globular medio y puede usarse para determinaciones de hemoglobina hematocrito y recuento globular pero para los extendidos queda limitada a los primeros minutos tampoco es uacutetil para el recuento plaquetario porque produce formacioacuten de agregados plaquetarios

423 Heparina

El nombre de heparina proviene del griego hepar que significa hiacutegado ya que fue aislado por primera vez de las ceacutelulas de este tejido Es un mucopolisacaacuterido aacutecido Presenta el

inconveniente de que si no se agita raacutepidamente con la sangre despueacutes de extraiacuteda

pueden formarse microcoaacutegulos aunque no altera el volumeneritrocitario ni la morfologiacutea de los leucocitos No es recomendablepara el frotis sanguiacuteneo porque produce un fondo azul en la laacutemina

La heparina de sodio o litio puede usarse en forma soacutelida o liacutequida en

proporcioacutende 01 - 02 mg de heparina por 1 mL de sangre

43 ANTICOAGULANTES LIacuteQUIDOS

431 Citrato trisoacutedico

Es de eleccioacuten para las pruebas de hemostasia y la velocidad de sedimentacioacuten

Actuacutea a traveacutes de la precipitacioacuten del calcio La concentracioacuten depende de

la prueba por realizar

bull Para pruebas de hemostasia se emplea en proporcioacuten de 1 9 (05 mL

deanticoagulante para 45 mL de sangre total)

bull Para la determinacioacuten de la VSG (Velocidad de Sedimentacioacuten Globular) es14

(05 mL de anticoagulante para 2 mL de sangre)

432 Oxalato soacutedico

Recomendado tambieacuten para las pruebas de hemostasia Se emplea en

proporcioacutende un volumen de anticoagulante para 4 vol de sangre

SECCIOacuteN 5

REALIZACIOacuteN Y TINCIOacuteN DEL FROTIS SANGUIacuteNEO

La praacutectica del frotis sanguiacuteneo tambieacuten llamado extendido es de gran importanciaen hematologiacutea ya que el diagnoacutestico de muchas enfermedadeshematoloacutegicas puede realizarse con soacutelo observar las caracteriacutesticasmorfoloacutegicas de las ceacutelulas sanguiacuteneas de manera que eacuteste no debe serexcesivamente grueso ni excesivamente fino Todas las laacuteminas por usarsobre todo nuevas deben ser limpiadas con algodoacuten y alcohol al 70 paraeliminar la grasa que viene adherida

51 MEacuteTODO DE LOS DOS PORTAOBJETOS

511 Materiales

- Alcohol al 70

- Algodoacuten

- Lanceta descartable

- Portaobjetos de vidrios limpios y desgrasados (25 x 75 mm)

512 Fundamento

Consiste en la extensioacuten de una gota de sangre sobre un portaobjeto (25 x 75)empleando el canto biselado de otro portaobjeto de igual dimensioacuten (Fig 12)

513 Procedimiento

5131 Una vez extraiacuteda la sangre con cualquiera de las metodologiacuteas secoloca una pequentildea gota de sangre (5mL) (aprox 3 mm de diaacutemetro)sobre un portaobjeto a 2 cm aproximadamente de uno de los extremos

5132 Colocar el canto de otro portaobjeto esmerilado sobre la superficiedel primer portaobjeto (en la que se encuentra la gota de sangre)formando un aacutengulo de 45ordm

5134 Deslizar suavemente y a velocidad moderada el portaobjeto sobre elotro en sentido longitudinal hasta que la gota de sangre quede bienextendida sobre la

superficie del primer portaobjeto El grosor delfrotis sanguiacuteneo puede variar seguacuten sea el aacutengulo que formen entresiacute ambos portaobjetos Asiacute si es superior a 45ordm la extensioacuten obtenidaseraacute gruesa y corta si es inferior a 45ordm seraacute larga y fina El secado delfrotis es a temperatura ambiente y en posicioacuten horizontal

Fig 12

1048729 Zona excesivamente gruesa Se halla en la regioacuten inmediata al punto departida de la extensioacuten (cabeza) En ella se aprecia siempre un aumento delinfocitos

1048729 Zona excesivamente fina Corresponde al final de la extensioacuten y termina enun aacuterea donde las ceacutelulas adoptan una posicioacuten acartonada (barbas) Enesta regioacuten existe un exceso de granulocitos y monocitos

1048729 Zona ideal Corresponde a la regioacuten intermedia del frotis y en ella existe unreparto equilibrado de ceacutelulas

52 COLORACIONES USADAS

Una vez seco el frotis se procede a la tincioacuten hematoloacutegica con el colorante deRomanowsky constituido por la mezcla de eosina y azul de metileno Dentrode eacutestas tenemos

521 Colorante de Giemsa

522 Colorante de May-Grunwald

523 Colorante de Wright

524 Colorante de Leishman

Preparacioacuten de colorantes (Anexo A)

1048729 Para el estudio de las ceacutelulas sanguiacuteneas utilizar el colorante 523 y 524

1048729 Para el estudio de hemoparaacutesitos utilizar el colorante 521

1048729 Utilizar el colorante 522 para casos especiales en que se desee observar

con mayor claridad y especificidad los graacutenulos de los neutrofilos

53 TINCIOacuteN CON COLORANTE DE WRIGHT

531 Fundamento

El colorante de Wright va a permitir suministrar un medio para estudiar lasangre y determinar las variaciones y anormalidades de estructura forma ytamantildeo de los eritrocitos su contenido de hemoglobina y sus propiedades decoloracioacuten La informacioacuten obtenida de un frotis de sangre perifeacuterica dependeen gran parte de la calidad del extendido y la coloracioacuten

532 Materiales

5321 Colorante de Wright (Anexo A)

5322 Frasco gotero

5323 Solucioacuten amortiguada tamponada (Anexo A)

533 Procedimiento

5331 Una vez obtenido el frotis sanguiacuteneo se le dejaraacute secar entre 15 y 20minutos

5332 Luego se coloca la preparacioacuten en un soporte y se cubre con el colorantede Wright dejaacutendolo por espacio de 5 minutos

5333 Posteriormente se antildeade solucioacuten amortiguada tamponada en partesiguales hasta obtener un brillo metaacutelico dejando 6 minutos adicionales

5334 Finalmente se lava con agua corriente y se deja secar

5335 Se coloca en el microscopio y con pequentildeo aumento se revisa lacalidad de la coloracioacuten la cantidad aproximada de gloacutebulos blancosy se escoge el sitio para iniciar el recuento Se coloca una gota deaceite de inmersioacuten y se enfoca a un aumento de 100xLa forma de los gloacutebulos rojos se examinaraacute detenidamente observandoademaacutes del color (cantidad de hemoglobina) presencia deplaquetas su agrupacioacuten y distribucioacuten

5336 Posteriormente se hace el recuento diferencial de gloacutebulos blancosen 100

ceacutelulas para lo cual se deberaacute conocer las diferencias entreneutroacutefilos eosinoacutefilos

linfocitos y monocitosUna extensioacuten de sangre bien tentildeida debe caracterizarse

por unabuena diferenciacioacuten de las estructuras subcelulares en los leucocitosuna

coloracioacuten rosada de los hematiacutees y la ausencia de precipitados

Los defectos maacutes frecuentes observados en la tincioacuten del frotis sanguiacuteneoson

Coloracioacuten excesivamente azul debido a

1048729 Frotis excesivamente grueso

1048729 Lavado insuficiente

1048729 Tincioacuten muy prolongada

1048729 Empleo de colorante excesivamente alcalino

Coloracioacuten con una tonalidad rosada

1048729 El colorante el tampoacuten o el agua de lavado tienen un pH demasiadoaacutecido

Presencia de precipitados

1048729 Obedecen a una accioacuten excesiva del colorante Esto se puede evitarcon la

filtracioacuten

SECCIOacuteN 6

HEMOGRAMA-HEMOGLOBINA-HEMATOCRITO

El hemograma de Shilling constituye uno de los exaacutemenes de laboratorio

maacutesusados en el campo de la hematologiacutea Comprende las siguientes pruebas

61 RECUENTO LEUCOCITARIO

Principio

La sangre anticoagulada se deposita en un liacutequido que permite evidenciar

losleucocitos mantenieacutendolos visibles mientras que los eritrocitos

sonhemolizados El recuento del nuacutemero de leucocitos o gloacutebulos blancos se

expresapor mm3 (miliacutemetro cuacutebico)

611 Equipos

- Microscopio

- Hemocitoacutemetro (Caacutemara de Neubauer)

Consta de los siguientes elementos

diams Una laacutemina portaobjeto gruesa en el centro se hallan dos

superficiescuadriculadas iguales separadas del resto de la laacutemina por surcos y

dosbarras transversales algo maacutes elevadas

diams Una laminilla cubreobjetos oacutepticamente plana que al colocarse sobrelas barras

elevadas de la laacutemina forma una caacutemara entre el cubreobjetosy la superficie

cuadriculadaLa altura entre el cubreobjetos y la laacutemina portaobjetos es de 01

mmCada cuadriacutecula mide 3 mm de lado y se divide en 9 cuadrados grandesCada

uno de los cuales mide 1 mm2 de superficie que se subdivide a suvez en 16

cuadrados medianos El cuadrado grande central se divide en25 cuadrados

pequentildeos y cada uno de ellos en 16 cuadraditos Cadacuadrado pequentildeo mide

02 mm de lado (004 mm2 de superficie) y cadacuadradito mide 005 mm de lado

(00025 mm2 de superficie)

612 Materiales y reactivos requeridos

6121 Pipeta de gloacutebulos blancos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0 a 100 mL)Presenta cerca del extremo superior una marca de 11 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla que funciona comomezcladora luego sigue el extremo maacutes largo de la pipeta (tallo) que estaacutedividida en 10 partes con 2 marcas 1 (parte final del bulbo) y 05 (a la mitaddel tallo) Se le acopla a su extremo superior 1 tubo de goma y una bombillapara aspirar

6122 Diluyente de gloacutebulos blancos Solucioacuten de Turk al 1

6123 Contador manual (Soacutelo si fuera necesario)

6124 Papel filtro

613 Procedimiento

6131 Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar deldedo se procede a aspirar la sangre con la pipeta de gloacutebulos blancoshasta la marca de 05 y a limpiar la punta con papel absorbente

6132 Introducir la pipeta en el tubo que contenga solucioacuten de Turk y absorberhasta la marca de 11 (no debe haber burbujas)

6133 Tapar ambos extremos y proceder a mezclar manualmente o en unrotador automaacutetico por 2 oacute 3 minutos

6134 Monte la laminilla de vidrio en la caacutemara para recuento que debe estarlimpia y seca

6135 Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocaruna gota pequentildea de esta solucioacuten en la caacutemara

6136 Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las ceacutelulas se sedimenten

6137 Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angularesCuando se usa la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002 mL) desangre total con anticoagulante o sangre capilar con anticoagulante yse diluye en un tubo que contenga 380 mL de solucioacuten de Turk (aquiacutetenemos una dilucioacuten 120)

LECTURA

Fig 13

La lectura se realiza en los campos 1 3 7 y 9 como estaacute indicado en la figuraAdemaacutes de los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes sedeben contar todos los leucocitos que se encuentren adheridos en la liacuteneahorizontal superior y vertical exterior o de lo contrario todos los leucocitosadheridos a la liacutenea horizontal inferior y vertical interior

614 Resultados

Nordm de leucocitos x mm3 = leucocitos contados en 4 camposdividealtura x dilucioacuten x aacuterea

Reemplazando = leucocitos contados en 4 camposdivide110 x 120 x 4=

Leucocitos contados en 4 camposdivide4200=

X1 divide4200= Nordm leucocitos contados x 50

615 Valores de referencia

5000 - 10 000 leucocitos mm3

616 Correccioacuten de valores para restar eritrocitos nucleados

Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el liacutequido de dilucioacuten por lo tantopueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con losleucocitos de tal manera que se debe emplear la siguiente foacutermula

Caacutelculo

La concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos (por litro) esNuacutemero de normoblatos contados x concentracioacuten o nuacutemero de leucocitos100 + Nordm de normoblastos contados

Ejemplo

Si se cuentan 50 normoblastos y la concentracioacuten del nuacutemero de leucocitos es16 x 109l la concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos seraacute

50 x16 = 53 x 109l

100 + 50

y la concentracioacuten de leucocitos corregida seraacute 16 - 53 = 107 x 109lEn unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitosse expresan por miliacutemetro cuacutebico En tales unidades el caacutelculo correspondienteal ejemplo que se ha dado seriacutea

50 x 16 000 = 5300 mm3

100 + 50

Recuento corregido de gloacutebulos blancos o leucocitos = 16 000 - 5300 = 10 700 mm3

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

62 RECUENTO DE GLOacuteBULOS ROJOS

Principio

La sangre se diluye en un liacutequido que nos permite observar claramente loshematiacutees luego esta dilucioacuten se coloca en una caacutemara de Neubauer con laayuda de una pipeta automaacutetica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopioa un objetivo de 40x para calcular el nuacutemero de gloacutebulos rojos por mm3

621 Equipos

- Microscopio

- Hemocitoacutemetro (caacutemara de Neubauer)

622 Materiales y reactivos requeridos

6221 Pipeta de gloacutebulos rojos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0-100 mL)

Presenta cerca del extremo superior una marca de 101 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla roja mezcladoraluego sigue el tallo (extremo maacutes largo) el cual estaacute dividido en 10 partescon 2 marcas 1 acabando el bulbo y 05 a la mitad del tallo Se requiereigual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar

6222 Diluyente de gloacutebulos rojos Cloruro de Sodio al 09 (ver anexo)

Diluyente de Hayem (ver anexo)

6223 Contador manual (soacutelo si fuera necesario)

6224 Papel filtro

623 Procedimiento

6231 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar

6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente

6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101

6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos

6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente

6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas

6237 Dejar en reposo por 3 minutos

6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)

6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos

LECTURA

Fig 14

624 Resultados

Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea

Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15

= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000

= hematiacutees contados x 10 000

625 Valores de referencia

(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)

Hombres 4 500 000 - 5 500 000

Mujeres 4 000 000 - 5 000 000

Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000

Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000

Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)

Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal

volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen

porcentaje o como valor decimal

Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre

total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)

631 Meacutetodo de Wintrobe

Materiales requeridos

- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm

- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia

- Tapoacuten de goma

Procedimiento

diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur

comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado

de no provocar espuma

diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten

diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos

Resultados (lectura)

Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos

Valores de referencia

Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

632 Meacutetodo de microhematocrito

Materiales requeridos

- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)

- Plastilina

Procedimiento

diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel

dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon

anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80

del capilar

diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina

diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma

diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm

Resultados (lectura)

La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio

Uso de la escala

diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero

diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la

columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical

diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos

Valores de referencia

Hombres 40 - 50

Mujeres 38 - 44

Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44

Lactantes (3 meses) 37 - 42

Recieacuten nacidos 50 - 58

La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)

64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA

Principio

La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre

641 Materiales y reactivos

6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro

6412 Pipetas

diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla

diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL

6413 Tubos de ensayo

6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten

Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia

inconveniente de que si no se agita raacutepidamente con la sangre despueacutes de extraiacuteda

pueden formarse microcoaacutegulos aunque no altera el volumeneritrocitario ni la morfologiacutea de los leucocitos No es recomendablepara el frotis sanguiacuteneo porque produce un fondo azul en la laacutemina

La heparina de sodio o litio puede usarse en forma soacutelida o liacutequida en

proporcioacutende 01 - 02 mg de heparina por 1 mL de sangre

43 ANTICOAGULANTES LIacuteQUIDOS

431 Citrato trisoacutedico

Es de eleccioacuten para las pruebas de hemostasia y la velocidad de sedimentacioacuten

Actuacutea a traveacutes de la precipitacioacuten del calcio La concentracioacuten depende de

la prueba por realizar

bull Para pruebas de hemostasia se emplea en proporcioacuten de 1 9 (05 mL

deanticoagulante para 45 mL de sangre total)

bull Para la determinacioacuten de la VSG (Velocidad de Sedimentacioacuten Globular) es14

(05 mL de anticoagulante para 2 mL de sangre)

432 Oxalato soacutedico

Recomendado tambieacuten para las pruebas de hemostasia Se emplea en

proporcioacutende un volumen de anticoagulante para 4 vol de sangre

SECCIOacuteN 5

REALIZACIOacuteN Y TINCIOacuteN DEL FROTIS SANGUIacuteNEO

La praacutectica del frotis sanguiacuteneo tambieacuten llamado extendido es de gran importanciaen hematologiacutea ya que el diagnoacutestico de muchas enfermedadeshematoloacutegicas puede realizarse con soacutelo observar las caracteriacutesticasmorfoloacutegicas de las ceacutelulas sanguiacuteneas de manera que eacuteste no debe serexcesivamente grueso ni excesivamente fino Todas las laacuteminas por usarsobre todo nuevas deben ser limpiadas con algodoacuten y alcohol al 70 paraeliminar la grasa que viene adherida

51 MEacuteTODO DE LOS DOS PORTAOBJETOS

511 Materiales

- Alcohol al 70

- Algodoacuten

- Lanceta descartable

- Portaobjetos de vidrios limpios y desgrasados (25 x 75 mm)

512 Fundamento

Consiste en la extensioacuten de una gota de sangre sobre un portaobjeto (25 x 75)empleando el canto biselado de otro portaobjeto de igual dimensioacuten (Fig 12)

513 Procedimiento

5131 Una vez extraiacuteda la sangre con cualquiera de las metodologiacuteas secoloca una pequentildea gota de sangre (5mL) (aprox 3 mm de diaacutemetro)sobre un portaobjeto a 2 cm aproximadamente de uno de los extremos

5132 Colocar el canto de otro portaobjeto esmerilado sobre la superficiedel primer portaobjeto (en la que se encuentra la gota de sangre)formando un aacutengulo de 45ordm

5134 Deslizar suavemente y a velocidad moderada el portaobjeto sobre elotro en sentido longitudinal hasta que la gota de sangre quede bienextendida sobre la

superficie del primer portaobjeto El grosor delfrotis sanguiacuteneo puede variar seguacuten sea el aacutengulo que formen entresiacute ambos portaobjetos Asiacute si es superior a 45ordm la extensioacuten obtenidaseraacute gruesa y corta si es inferior a 45ordm seraacute larga y fina El secado delfrotis es a temperatura ambiente y en posicioacuten horizontal

Fig 12

1048729 Zona excesivamente gruesa Se halla en la regioacuten inmediata al punto departida de la extensioacuten (cabeza) En ella se aprecia siempre un aumento delinfocitos

1048729 Zona excesivamente fina Corresponde al final de la extensioacuten y termina enun aacuterea donde las ceacutelulas adoptan una posicioacuten acartonada (barbas) Enesta regioacuten existe un exceso de granulocitos y monocitos

1048729 Zona ideal Corresponde a la regioacuten intermedia del frotis y en ella existe unreparto equilibrado de ceacutelulas

52 COLORACIONES USADAS

Una vez seco el frotis se procede a la tincioacuten hematoloacutegica con el colorante deRomanowsky constituido por la mezcla de eosina y azul de metileno Dentrode eacutestas tenemos

521 Colorante de Giemsa

522 Colorante de May-Grunwald

523 Colorante de Wright

524 Colorante de Leishman

Preparacioacuten de colorantes (Anexo A)

1048729 Para el estudio de las ceacutelulas sanguiacuteneas utilizar el colorante 523 y 524

1048729 Para el estudio de hemoparaacutesitos utilizar el colorante 521

1048729 Utilizar el colorante 522 para casos especiales en que se desee observar

con mayor claridad y especificidad los graacutenulos de los neutrofilos

53 TINCIOacuteN CON COLORANTE DE WRIGHT

531 Fundamento

El colorante de Wright va a permitir suministrar un medio para estudiar lasangre y determinar las variaciones y anormalidades de estructura forma ytamantildeo de los eritrocitos su contenido de hemoglobina y sus propiedades decoloracioacuten La informacioacuten obtenida de un frotis de sangre perifeacuterica dependeen gran parte de la calidad del extendido y la coloracioacuten

532 Materiales

5321 Colorante de Wright (Anexo A)

5322 Frasco gotero

5323 Solucioacuten amortiguada tamponada (Anexo A)

533 Procedimiento

5331 Una vez obtenido el frotis sanguiacuteneo se le dejaraacute secar entre 15 y 20minutos

5332 Luego se coloca la preparacioacuten en un soporte y se cubre con el colorantede Wright dejaacutendolo por espacio de 5 minutos

5333 Posteriormente se antildeade solucioacuten amortiguada tamponada en partesiguales hasta obtener un brillo metaacutelico dejando 6 minutos adicionales

5334 Finalmente se lava con agua corriente y se deja secar

5335 Se coloca en el microscopio y con pequentildeo aumento se revisa lacalidad de la coloracioacuten la cantidad aproximada de gloacutebulos blancosy se escoge el sitio para iniciar el recuento Se coloca una gota deaceite de inmersioacuten y se enfoca a un aumento de 100xLa forma de los gloacutebulos rojos se examinaraacute detenidamente observandoademaacutes del color (cantidad de hemoglobina) presencia deplaquetas su agrupacioacuten y distribucioacuten

5336 Posteriormente se hace el recuento diferencial de gloacutebulos blancosen 100

ceacutelulas para lo cual se deberaacute conocer las diferencias entreneutroacutefilos eosinoacutefilos

linfocitos y monocitosUna extensioacuten de sangre bien tentildeida debe caracterizarse

por unabuena diferenciacioacuten de las estructuras subcelulares en los leucocitosuna

coloracioacuten rosada de los hematiacutees y la ausencia de precipitados

Los defectos maacutes frecuentes observados en la tincioacuten del frotis sanguiacuteneoson

Coloracioacuten excesivamente azul debido a

1048729 Frotis excesivamente grueso

1048729 Lavado insuficiente

1048729 Tincioacuten muy prolongada

1048729 Empleo de colorante excesivamente alcalino

Coloracioacuten con una tonalidad rosada

1048729 El colorante el tampoacuten o el agua de lavado tienen un pH demasiadoaacutecido

Presencia de precipitados

1048729 Obedecen a una accioacuten excesiva del colorante Esto se puede evitarcon la

filtracioacuten

SECCIOacuteN 6

HEMOGRAMA-HEMOGLOBINA-HEMATOCRITO

El hemograma de Shilling constituye uno de los exaacutemenes de laboratorio

maacutesusados en el campo de la hematologiacutea Comprende las siguientes pruebas

61 RECUENTO LEUCOCITARIO

Principio

La sangre anticoagulada se deposita en un liacutequido que permite evidenciar

losleucocitos mantenieacutendolos visibles mientras que los eritrocitos

sonhemolizados El recuento del nuacutemero de leucocitos o gloacutebulos blancos se

expresapor mm3 (miliacutemetro cuacutebico)

611 Equipos

- Microscopio

- Hemocitoacutemetro (Caacutemara de Neubauer)

Consta de los siguientes elementos

diams Una laacutemina portaobjeto gruesa en el centro se hallan dos

superficiescuadriculadas iguales separadas del resto de la laacutemina por surcos y

dosbarras transversales algo maacutes elevadas

diams Una laminilla cubreobjetos oacutepticamente plana que al colocarse sobrelas barras

elevadas de la laacutemina forma una caacutemara entre el cubreobjetosy la superficie

cuadriculadaLa altura entre el cubreobjetos y la laacutemina portaobjetos es de 01

mmCada cuadriacutecula mide 3 mm de lado y se divide en 9 cuadrados grandesCada

uno de los cuales mide 1 mm2 de superficie que se subdivide a suvez en 16

cuadrados medianos El cuadrado grande central se divide en25 cuadrados

pequentildeos y cada uno de ellos en 16 cuadraditos Cadacuadrado pequentildeo mide

02 mm de lado (004 mm2 de superficie) y cadacuadradito mide 005 mm de lado

(00025 mm2 de superficie)

612 Materiales y reactivos requeridos

6121 Pipeta de gloacutebulos blancos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0 a 100 mL)Presenta cerca del extremo superior una marca de 11 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla que funciona comomezcladora luego sigue el extremo maacutes largo de la pipeta (tallo) que estaacutedividida en 10 partes con 2 marcas 1 (parte final del bulbo) y 05 (a la mitaddel tallo) Se le acopla a su extremo superior 1 tubo de goma y una bombillapara aspirar

6122 Diluyente de gloacutebulos blancos Solucioacuten de Turk al 1

6123 Contador manual (Soacutelo si fuera necesario)

6124 Papel filtro

613 Procedimiento

6131 Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar deldedo se procede a aspirar la sangre con la pipeta de gloacutebulos blancoshasta la marca de 05 y a limpiar la punta con papel absorbente

6132 Introducir la pipeta en el tubo que contenga solucioacuten de Turk y absorberhasta la marca de 11 (no debe haber burbujas)

6133 Tapar ambos extremos y proceder a mezclar manualmente o en unrotador automaacutetico por 2 oacute 3 minutos

6134 Monte la laminilla de vidrio en la caacutemara para recuento que debe estarlimpia y seca

6135 Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocaruna gota pequentildea de esta solucioacuten en la caacutemara

6136 Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las ceacutelulas se sedimenten

6137 Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angularesCuando se usa la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002 mL) desangre total con anticoagulante o sangre capilar con anticoagulante yse diluye en un tubo que contenga 380 mL de solucioacuten de Turk (aquiacutetenemos una dilucioacuten 120)

LECTURA

Fig 13

La lectura se realiza en los campos 1 3 7 y 9 como estaacute indicado en la figuraAdemaacutes de los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes sedeben contar todos los leucocitos que se encuentren adheridos en la liacuteneahorizontal superior y vertical exterior o de lo contrario todos los leucocitosadheridos a la liacutenea horizontal inferior y vertical interior

614 Resultados

Nordm de leucocitos x mm3 = leucocitos contados en 4 camposdividealtura x dilucioacuten x aacuterea

Reemplazando = leucocitos contados en 4 camposdivide110 x 120 x 4=

Leucocitos contados en 4 camposdivide4200=

X1 divide4200= Nordm leucocitos contados x 50

615 Valores de referencia

5000 - 10 000 leucocitos mm3

616 Correccioacuten de valores para restar eritrocitos nucleados

Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el liacutequido de dilucioacuten por lo tantopueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con losleucocitos de tal manera que se debe emplear la siguiente foacutermula

Caacutelculo

La concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos (por litro) esNuacutemero de normoblatos contados x concentracioacuten o nuacutemero de leucocitos100 + Nordm de normoblastos contados

Ejemplo

Si se cuentan 50 normoblastos y la concentracioacuten del nuacutemero de leucocitos es16 x 109l la concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos seraacute

50 x16 = 53 x 109l

100 + 50

y la concentracioacuten de leucocitos corregida seraacute 16 - 53 = 107 x 109lEn unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitosse expresan por miliacutemetro cuacutebico En tales unidades el caacutelculo correspondienteal ejemplo que se ha dado seriacutea

50 x 16 000 = 5300 mm3

100 + 50

Recuento corregido de gloacutebulos blancos o leucocitos = 16 000 - 5300 = 10 700 mm3

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

62 RECUENTO DE GLOacuteBULOS ROJOS

Principio

La sangre se diluye en un liacutequido que nos permite observar claramente loshematiacutees luego esta dilucioacuten se coloca en una caacutemara de Neubauer con laayuda de una pipeta automaacutetica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopioa un objetivo de 40x para calcular el nuacutemero de gloacutebulos rojos por mm3

621 Equipos

- Microscopio

- Hemocitoacutemetro (caacutemara de Neubauer)

622 Materiales y reactivos requeridos

6221 Pipeta de gloacutebulos rojos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0-100 mL)

Presenta cerca del extremo superior una marca de 101 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla roja mezcladoraluego sigue el tallo (extremo maacutes largo) el cual estaacute dividido en 10 partescon 2 marcas 1 acabando el bulbo y 05 a la mitad del tallo Se requiereigual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar

6222 Diluyente de gloacutebulos rojos Cloruro de Sodio al 09 (ver anexo)

Diluyente de Hayem (ver anexo)

6223 Contador manual (soacutelo si fuera necesario)

6224 Papel filtro

623 Procedimiento

6231 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar

6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente

6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101

6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos

6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente

6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas

6237 Dejar en reposo por 3 minutos

6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)

6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos

LECTURA

Fig 14

624 Resultados

Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea

Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15

= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000

= hematiacutees contados x 10 000

625 Valores de referencia

(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)

Hombres 4 500 000 - 5 500 000

Mujeres 4 000 000 - 5 000 000

Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000

Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000

Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)

Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal

volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen

porcentaje o como valor decimal

Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre

total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)

631 Meacutetodo de Wintrobe

Materiales requeridos

- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm

- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia

- Tapoacuten de goma

Procedimiento

diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur

comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado

de no provocar espuma

diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten

diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos

Resultados (lectura)

Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos

Valores de referencia

Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

632 Meacutetodo de microhematocrito

Materiales requeridos

- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)

- Plastilina

Procedimiento

diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel

dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon

anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80

del capilar

diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina

diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma

diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm

Resultados (lectura)

La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio

Uso de la escala

diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero

diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la

columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical

diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos

Valores de referencia

Hombres 40 - 50

Mujeres 38 - 44

Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44

Lactantes (3 meses) 37 - 42

Recieacuten nacidos 50 - 58

La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)

64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA

Principio

La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre

641 Materiales y reactivos

6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro

6412 Pipetas

diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla

diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL

6413 Tubos de ensayo

6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten

Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia

SECCIOacuteN 5

REALIZACIOacuteN Y TINCIOacuteN DEL FROTIS SANGUIacuteNEO

La praacutectica del frotis sanguiacuteneo tambieacuten llamado extendido es de gran importanciaen hematologiacutea ya que el diagnoacutestico de muchas enfermedadeshematoloacutegicas puede realizarse con soacutelo observar las caracteriacutesticasmorfoloacutegicas de las ceacutelulas sanguiacuteneas de manera que eacuteste no debe serexcesivamente grueso ni excesivamente fino Todas las laacuteminas por usarsobre todo nuevas deben ser limpiadas con algodoacuten y alcohol al 70 paraeliminar la grasa que viene adherida

51 MEacuteTODO DE LOS DOS PORTAOBJETOS

511 Materiales

- Alcohol al 70

- Algodoacuten

- Lanceta descartable

- Portaobjetos de vidrios limpios y desgrasados (25 x 75 mm)

512 Fundamento

Consiste en la extensioacuten de una gota de sangre sobre un portaobjeto (25 x 75)empleando el canto biselado de otro portaobjeto de igual dimensioacuten (Fig 12)

513 Procedimiento

5131 Una vez extraiacuteda la sangre con cualquiera de las metodologiacuteas secoloca una pequentildea gota de sangre (5mL) (aprox 3 mm de diaacutemetro)sobre un portaobjeto a 2 cm aproximadamente de uno de los extremos

5132 Colocar el canto de otro portaobjeto esmerilado sobre la superficiedel primer portaobjeto (en la que se encuentra la gota de sangre)formando un aacutengulo de 45ordm

5134 Deslizar suavemente y a velocidad moderada el portaobjeto sobre elotro en sentido longitudinal hasta que la gota de sangre quede bienextendida sobre la

superficie del primer portaobjeto El grosor delfrotis sanguiacuteneo puede variar seguacuten sea el aacutengulo que formen entresiacute ambos portaobjetos Asiacute si es superior a 45ordm la extensioacuten obtenidaseraacute gruesa y corta si es inferior a 45ordm seraacute larga y fina El secado delfrotis es a temperatura ambiente y en posicioacuten horizontal

Fig 12

1048729 Zona excesivamente gruesa Se halla en la regioacuten inmediata al punto departida de la extensioacuten (cabeza) En ella se aprecia siempre un aumento delinfocitos

1048729 Zona excesivamente fina Corresponde al final de la extensioacuten y termina enun aacuterea donde las ceacutelulas adoptan una posicioacuten acartonada (barbas) Enesta regioacuten existe un exceso de granulocitos y monocitos

1048729 Zona ideal Corresponde a la regioacuten intermedia del frotis y en ella existe unreparto equilibrado de ceacutelulas

52 COLORACIONES USADAS

Una vez seco el frotis se procede a la tincioacuten hematoloacutegica con el colorante deRomanowsky constituido por la mezcla de eosina y azul de metileno Dentrode eacutestas tenemos

521 Colorante de Giemsa

522 Colorante de May-Grunwald

523 Colorante de Wright

524 Colorante de Leishman

Preparacioacuten de colorantes (Anexo A)

1048729 Para el estudio de las ceacutelulas sanguiacuteneas utilizar el colorante 523 y 524

1048729 Para el estudio de hemoparaacutesitos utilizar el colorante 521

1048729 Utilizar el colorante 522 para casos especiales en que se desee observar

con mayor claridad y especificidad los graacutenulos de los neutrofilos

53 TINCIOacuteN CON COLORANTE DE WRIGHT

531 Fundamento

El colorante de Wright va a permitir suministrar un medio para estudiar lasangre y determinar las variaciones y anormalidades de estructura forma ytamantildeo de los eritrocitos su contenido de hemoglobina y sus propiedades decoloracioacuten La informacioacuten obtenida de un frotis de sangre perifeacuterica dependeen gran parte de la calidad del extendido y la coloracioacuten

532 Materiales

5321 Colorante de Wright (Anexo A)

5322 Frasco gotero

5323 Solucioacuten amortiguada tamponada (Anexo A)

533 Procedimiento

5331 Una vez obtenido el frotis sanguiacuteneo se le dejaraacute secar entre 15 y 20minutos

5332 Luego se coloca la preparacioacuten en un soporte y se cubre con el colorantede Wright dejaacutendolo por espacio de 5 minutos

5333 Posteriormente se antildeade solucioacuten amortiguada tamponada en partesiguales hasta obtener un brillo metaacutelico dejando 6 minutos adicionales

5334 Finalmente se lava con agua corriente y se deja secar

5335 Se coloca en el microscopio y con pequentildeo aumento se revisa lacalidad de la coloracioacuten la cantidad aproximada de gloacutebulos blancosy se escoge el sitio para iniciar el recuento Se coloca una gota deaceite de inmersioacuten y se enfoca a un aumento de 100xLa forma de los gloacutebulos rojos se examinaraacute detenidamente observandoademaacutes del color (cantidad de hemoglobina) presencia deplaquetas su agrupacioacuten y distribucioacuten

5336 Posteriormente se hace el recuento diferencial de gloacutebulos blancosen 100

ceacutelulas para lo cual se deberaacute conocer las diferencias entreneutroacutefilos eosinoacutefilos

linfocitos y monocitosUna extensioacuten de sangre bien tentildeida debe caracterizarse

por unabuena diferenciacioacuten de las estructuras subcelulares en los leucocitosuna

coloracioacuten rosada de los hematiacutees y la ausencia de precipitados

Los defectos maacutes frecuentes observados en la tincioacuten del frotis sanguiacuteneoson

Coloracioacuten excesivamente azul debido a

1048729 Frotis excesivamente grueso

1048729 Lavado insuficiente

1048729 Tincioacuten muy prolongada

1048729 Empleo de colorante excesivamente alcalino

Coloracioacuten con una tonalidad rosada

1048729 El colorante el tampoacuten o el agua de lavado tienen un pH demasiadoaacutecido

Presencia de precipitados

1048729 Obedecen a una accioacuten excesiva del colorante Esto se puede evitarcon la

filtracioacuten

SECCIOacuteN 6

HEMOGRAMA-HEMOGLOBINA-HEMATOCRITO

El hemograma de Shilling constituye uno de los exaacutemenes de laboratorio

maacutesusados en el campo de la hematologiacutea Comprende las siguientes pruebas

61 RECUENTO LEUCOCITARIO

Principio

La sangre anticoagulada se deposita en un liacutequido que permite evidenciar

losleucocitos mantenieacutendolos visibles mientras que los eritrocitos

sonhemolizados El recuento del nuacutemero de leucocitos o gloacutebulos blancos se

expresapor mm3 (miliacutemetro cuacutebico)

611 Equipos

- Microscopio

- Hemocitoacutemetro (Caacutemara de Neubauer)

Consta de los siguientes elementos

diams Una laacutemina portaobjeto gruesa en el centro se hallan dos

superficiescuadriculadas iguales separadas del resto de la laacutemina por surcos y

dosbarras transversales algo maacutes elevadas

diams Una laminilla cubreobjetos oacutepticamente plana que al colocarse sobrelas barras

elevadas de la laacutemina forma una caacutemara entre el cubreobjetosy la superficie

cuadriculadaLa altura entre el cubreobjetos y la laacutemina portaobjetos es de 01

mmCada cuadriacutecula mide 3 mm de lado y se divide en 9 cuadrados grandesCada

uno de los cuales mide 1 mm2 de superficie que se subdivide a suvez en 16

cuadrados medianos El cuadrado grande central se divide en25 cuadrados

pequentildeos y cada uno de ellos en 16 cuadraditos Cadacuadrado pequentildeo mide

02 mm de lado (004 mm2 de superficie) y cadacuadradito mide 005 mm de lado

(00025 mm2 de superficie)

612 Materiales y reactivos requeridos

6121 Pipeta de gloacutebulos blancos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0 a 100 mL)Presenta cerca del extremo superior una marca de 11 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla que funciona comomezcladora luego sigue el extremo maacutes largo de la pipeta (tallo) que estaacutedividida en 10 partes con 2 marcas 1 (parte final del bulbo) y 05 (a la mitaddel tallo) Se le acopla a su extremo superior 1 tubo de goma y una bombillapara aspirar

6122 Diluyente de gloacutebulos blancos Solucioacuten de Turk al 1

6123 Contador manual (Soacutelo si fuera necesario)

6124 Papel filtro

613 Procedimiento

6131 Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar deldedo se procede a aspirar la sangre con la pipeta de gloacutebulos blancoshasta la marca de 05 y a limpiar la punta con papel absorbente

6132 Introducir la pipeta en el tubo que contenga solucioacuten de Turk y absorberhasta la marca de 11 (no debe haber burbujas)

6133 Tapar ambos extremos y proceder a mezclar manualmente o en unrotador automaacutetico por 2 oacute 3 minutos

6134 Monte la laminilla de vidrio en la caacutemara para recuento que debe estarlimpia y seca

6135 Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocaruna gota pequentildea de esta solucioacuten en la caacutemara

6136 Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las ceacutelulas se sedimenten

6137 Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angularesCuando se usa la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002 mL) desangre total con anticoagulante o sangre capilar con anticoagulante yse diluye en un tubo que contenga 380 mL de solucioacuten de Turk (aquiacutetenemos una dilucioacuten 120)

LECTURA

Fig 13

La lectura se realiza en los campos 1 3 7 y 9 como estaacute indicado en la figuraAdemaacutes de los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes sedeben contar todos los leucocitos que se encuentren adheridos en la liacuteneahorizontal superior y vertical exterior o de lo contrario todos los leucocitosadheridos a la liacutenea horizontal inferior y vertical interior

614 Resultados

Nordm de leucocitos x mm3 = leucocitos contados en 4 camposdividealtura x dilucioacuten x aacuterea

Reemplazando = leucocitos contados en 4 camposdivide110 x 120 x 4=

Leucocitos contados en 4 camposdivide4200=

X1 divide4200= Nordm leucocitos contados x 50

615 Valores de referencia

5000 - 10 000 leucocitos mm3

616 Correccioacuten de valores para restar eritrocitos nucleados

Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el liacutequido de dilucioacuten por lo tantopueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con losleucocitos de tal manera que se debe emplear la siguiente foacutermula

Caacutelculo

La concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos (por litro) esNuacutemero de normoblatos contados x concentracioacuten o nuacutemero de leucocitos100 + Nordm de normoblastos contados

Ejemplo

Si se cuentan 50 normoblastos y la concentracioacuten del nuacutemero de leucocitos es16 x 109l la concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos seraacute

50 x16 = 53 x 109l

100 + 50

y la concentracioacuten de leucocitos corregida seraacute 16 - 53 = 107 x 109lEn unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitosse expresan por miliacutemetro cuacutebico En tales unidades el caacutelculo correspondienteal ejemplo que se ha dado seriacutea

50 x 16 000 = 5300 mm3

100 + 50

Recuento corregido de gloacutebulos blancos o leucocitos = 16 000 - 5300 = 10 700 mm3

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

62 RECUENTO DE GLOacuteBULOS ROJOS

Principio

La sangre se diluye en un liacutequido que nos permite observar claramente loshematiacutees luego esta dilucioacuten se coloca en una caacutemara de Neubauer con laayuda de una pipeta automaacutetica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopioa un objetivo de 40x para calcular el nuacutemero de gloacutebulos rojos por mm3

621 Equipos

- Microscopio

- Hemocitoacutemetro (caacutemara de Neubauer)

622 Materiales y reactivos requeridos

6221 Pipeta de gloacutebulos rojos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0-100 mL)

Presenta cerca del extremo superior una marca de 101 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla roja mezcladoraluego sigue el tallo (extremo maacutes largo) el cual estaacute dividido en 10 partescon 2 marcas 1 acabando el bulbo y 05 a la mitad del tallo Se requiereigual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar

6222 Diluyente de gloacutebulos rojos Cloruro de Sodio al 09 (ver anexo)

Diluyente de Hayem (ver anexo)

6223 Contador manual (soacutelo si fuera necesario)

6224 Papel filtro

623 Procedimiento

6231 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar

6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente

6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101

6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos

6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente

6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas

6237 Dejar en reposo por 3 minutos

6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)

6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos

LECTURA

Fig 14

624 Resultados

Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea

Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15

= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000

= hematiacutees contados x 10 000

625 Valores de referencia

(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)

Hombres 4 500 000 - 5 500 000

Mujeres 4 000 000 - 5 000 000

Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000

Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000

Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)

Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal

volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen

porcentaje o como valor decimal

Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre

total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)

631 Meacutetodo de Wintrobe

Materiales requeridos

- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm

- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia

- Tapoacuten de goma

Procedimiento

diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur

comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado

de no provocar espuma

diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten

diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos

Resultados (lectura)

Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos

Valores de referencia

Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

632 Meacutetodo de microhematocrito

Materiales requeridos

- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)

- Plastilina

Procedimiento

diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel

dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon

anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80

del capilar

diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina

diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma

diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm

Resultados (lectura)

La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio

Uso de la escala

diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero

diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la

columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical

diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos

Valores de referencia

Hombres 40 - 50

Mujeres 38 - 44

Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44

Lactantes (3 meses) 37 - 42

Recieacuten nacidos 50 - 58

La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)

64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA

Principio

La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre

641 Materiales y reactivos

6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro

6412 Pipetas

diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla

diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL

6413 Tubos de ensayo

6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten

Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia

superficie del primer portaobjeto El grosor delfrotis sanguiacuteneo puede variar seguacuten sea el aacutengulo que formen entresiacute ambos portaobjetos Asiacute si es superior a 45ordm la extensioacuten obtenidaseraacute gruesa y corta si es inferior a 45ordm seraacute larga y fina El secado delfrotis es a temperatura ambiente y en posicioacuten horizontal

Fig 12

1048729 Zona excesivamente gruesa Se halla en la regioacuten inmediata al punto departida de la extensioacuten (cabeza) En ella se aprecia siempre un aumento delinfocitos

1048729 Zona excesivamente fina Corresponde al final de la extensioacuten y termina enun aacuterea donde las ceacutelulas adoptan una posicioacuten acartonada (barbas) Enesta regioacuten existe un exceso de granulocitos y monocitos

1048729 Zona ideal Corresponde a la regioacuten intermedia del frotis y en ella existe unreparto equilibrado de ceacutelulas

52 COLORACIONES USADAS

Una vez seco el frotis se procede a la tincioacuten hematoloacutegica con el colorante deRomanowsky constituido por la mezcla de eosina y azul de metileno Dentrode eacutestas tenemos

521 Colorante de Giemsa

522 Colorante de May-Grunwald

523 Colorante de Wright

524 Colorante de Leishman

Preparacioacuten de colorantes (Anexo A)

1048729 Para el estudio de las ceacutelulas sanguiacuteneas utilizar el colorante 523 y 524

1048729 Para el estudio de hemoparaacutesitos utilizar el colorante 521

1048729 Utilizar el colorante 522 para casos especiales en que se desee observar

con mayor claridad y especificidad los graacutenulos de los neutrofilos

53 TINCIOacuteN CON COLORANTE DE WRIGHT

531 Fundamento

El colorante de Wright va a permitir suministrar un medio para estudiar lasangre y determinar las variaciones y anormalidades de estructura forma ytamantildeo de los eritrocitos su contenido de hemoglobina y sus propiedades decoloracioacuten La informacioacuten obtenida de un frotis de sangre perifeacuterica dependeen gran parte de la calidad del extendido y la coloracioacuten

532 Materiales

5321 Colorante de Wright (Anexo A)

5322 Frasco gotero

5323 Solucioacuten amortiguada tamponada (Anexo A)

533 Procedimiento

5331 Una vez obtenido el frotis sanguiacuteneo se le dejaraacute secar entre 15 y 20minutos

5332 Luego se coloca la preparacioacuten en un soporte y se cubre con el colorantede Wright dejaacutendolo por espacio de 5 minutos

5333 Posteriormente se antildeade solucioacuten amortiguada tamponada en partesiguales hasta obtener un brillo metaacutelico dejando 6 minutos adicionales

5334 Finalmente se lava con agua corriente y se deja secar

5335 Se coloca en el microscopio y con pequentildeo aumento se revisa lacalidad de la coloracioacuten la cantidad aproximada de gloacutebulos blancosy se escoge el sitio para iniciar el recuento Se coloca una gota deaceite de inmersioacuten y se enfoca a un aumento de 100xLa forma de los gloacutebulos rojos se examinaraacute detenidamente observandoademaacutes del color (cantidad de hemoglobina) presencia deplaquetas su agrupacioacuten y distribucioacuten

5336 Posteriormente se hace el recuento diferencial de gloacutebulos blancosen 100

ceacutelulas para lo cual se deberaacute conocer las diferencias entreneutroacutefilos eosinoacutefilos

linfocitos y monocitosUna extensioacuten de sangre bien tentildeida debe caracterizarse

por unabuena diferenciacioacuten de las estructuras subcelulares en los leucocitosuna

coloracioacuten rosada de los hematiacutees y la ausencia de precipitados

Los defectos maacutes frecuentes observados en la tincioacuten del frotis sanguiacuteneoson

Coloracioacuten excesivamente azul debido a

1048729 Frotis excesivamente grueso

1048729 Lavado insuficiente

1048729 Tincioacuten muy prolongada

1048729 Empleo de colorante excesivamente alcalino

Coloracioacuten con una tonalidad rosada

1048729 El colorante el tampoacuten o el agua de lavado tienen un pH demasiadoaacutecido

Presencia de precipitados

1048729 Obedecen a una accioacuten excesiva del colorante Esto se puede evitarcon la

filtracioacuten

SECCIOacuteN 6

HEMOGRAMA-HEMOGLOBINA-HEMATOCRITO

El hemograma de Shilling constituye uno de los exaacutemenes de laboratorio

maacutesusados en el campo de la hematologiacutea Comprende las siguientes pruebas

61 RECUENTO LEUCOCITARIO

Principio

La sangre anticoagulada se deposita en un liacutequido que permite evidenciar

losleucocitos mantenieacutendolos visibles mientras que los eritrocitos

sonhemolizados El recuento del nuacutemero de leucocitos o gloacutebulos blancos se

expresapor mm3 (miliacutemetro cuacutebico)

611 Equipos

- Microscopio

- Hemocitoacutemetro (Caacutemara de Neubauer)

Consta de los siguientes elementos

diams Una laacutemina portaobjeto gruesa en el centro se hallan dos

superficiescuadriculadas iguales separadas del resto de la laacutemina por surcos y

dosbarras transversales algo maacutes elevadas

diams Una laminilla cubreobjetos oacutepticamente plana que al colocarse sobrelas barras

elevadas de la laacutemina forma una caacutemara entre el cubreobjetosy la superficie

cuadriculadaLa altura entre el cubreobjetos y la laacutemina portaobjetos es de 01

mmCada cuadriacutecula mide 3 mm de lado y se divide en 9 cuadrados grandesCada

uno de los cuales mide 1 mm2 de superficie que se subdivide a suvez en 16

cuadrados medianos El cuadrado grande central se divide en25 cuadrados

pequentildeos y cada uno de ellos en 16 cuadraditos Cadacuadrado pequentildeo mide

02 mm de lado (004 mm2 de superficie) y cadacuadradito mide 005 mm de lado

(00025 mm2 de superficie)

612 Materiales y reactivos requeridos

6121 Pipeta de gloacutebulos blancos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0 a 100 mL)Presenta cerca del extremo superior una marca de 11 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla que funciona comomezcladora luego sigue el extremo maacutes largo de la pipeta (tallo) que estaacutedividida en 10 partes con 2 marcas 1 (parte final del bulbo) y 05 (a la mitaddel tallo) Se le acopla a su extremo superior 1 tubo de goma y una bombillapara aspirar

6122 Diluyente de gloacutebulos blancos Solucioacuten de Turk al 1

6123 Contador manual (Soacutelo si fuera necesario)

6124 Papel filtro

613 Procedimiento

6131 Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar deldedo se procede a aspirar la sangre con la pipeta de gloacutebulos blancoshasta la marca de 05 y a limpiar la punta con papel absorbente

6132 Introducir la pipeta en el tubo que contenga solucioacuten de Turk y absorberhasta la marca de 11 (no debe haber burbujas)

6133 Tapar ambos extremos y proceder a mezclar manualmente o en unrotador automaacutetico por 2 oacute 3 minutos

6134 Monte la laminilla de vidrio en la caacutemara para recuento que debe estarlimpia y seca

6135 Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocaruna gota pequentildea de esta solucioacuten en la caacutemara

6136 Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las ceacutelulas se sedimenten

6137 Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angularesCuando se usa la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002 mL) desangre total con anticoagulante o sangre capilar con anticoagulante yse diluye en un tubo que contenga 380 mL de solucioacuten de Turk (aquiacutetenemos una dilucioacuten 120)

LECTURA

Fig 13

La lectura se realiza en los campos 1 3 7 y 9 como estaacute indicado en la figuraAdemaacutes de los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes sedeben contar todos los leucocitos que se encuentren adheridos en la liacuteneahorizontal superior y vertical exterior o de lo contrario todos los leucocitosadheridos a la liacutenea horizontal inferior y vertical interior

614 Resultados

Nordm de leucocitos x mm3 = leucocitos contados en 4 camposdividealtura x dilucioacuten x aacuterea

Reemplazando = leucocitos contados en 4 camposdivide110 x 120 x 4=

Leucocitos contados en 4 camposdivide4200=

X1 divide4200= Nordm leucocitos contados x 50

615 Valores de referencia

5000 - 10 000 leucocitos mm3

616 Correccioacuten de valores para restar eritrocitos nucleados

Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el liacutequido de dilucioacuten por lo tantopueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con losleucocitos de tal manera que se debe emplear la siguiente foacutermula

Caacutelculo

La concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos (por litro) esNuacutemero de normoblatos contados x concentracioacuten o nuacutemero de leucocitos100 + Nordm de normoblastos contados

Ejemplo

Si se cuentan 50 normoblastos y la concentracioacuten del nuacutemero de leucocitos es16 x 109l la concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos seraacute

50 x16 = 53 x 109l

100 + 50

y la concentracioacuten de leucocitos corregida seraacute 16 - 53 = 107 x 109lEn unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitosse expresan por miliacutemetro cuacutebico En tales unidades el caacutelculo correspondienteal ejemplo que se ha dado seriacutea

50 x 16 000 = 5300 mm3

100 + 50

Recuento corregido de gloacutebulos blancos o leucocitos = 16 000 - 5300 = 10 700 mm3

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

62 RECUENTO DE GLOacuteBULOS ROJOS

Principio

La sangre se diluye en un liacutequido que nos permite observar claramente loshematiacutees luego esta dilucioacuten se coloca en una caacutemara de Neubauer con laayuda de una pipeta automaacutetica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopioa un objetivo de 40x para calcular el nuacutemero de gloacutebulos rojos por mm3

621 Equipos

- Microscopio

- Hemocitoacutemetro (caacutemara de Neubauer)

622 Materiales y reactivos requeridos

6221 Pipeta de gloacutebulos rojos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0-100 mL)

Presenta cerca del extremo superior una marca de 101 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla roja mezcladoraluego sigue el tallo (extremo maacutes largo) el cual estaacute dividido en 10 partescon 2 marcas 1 acabando el bulbo y 05 a la mitad del tallo Se requiereigual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar

6222 Diluyente de gloacutebulos rojos Cloruro de Sodio al 09 (ver anexo)

Diluyente de Hayem (ver anexo)

6223 Contador manual (soacutelo si fuera necesario)

6224 Papel filtro

623 Procedimiento

6231 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar

6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente

6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101

6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos

6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente

6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas

6237 Dejar en reposo por 3 minutos

6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)

6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos

LECTURA

Fig 14

624 Resultados

Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea

Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15

= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000

= hematiacutees contados x 10 000

625 Valores de referencia

(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)

Hombres 4 500 000 - 5 500 000

Mujeres 4 000 000 - 5 000 000

Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000

Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000

Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)

Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal

volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen

porcentaje o como valor decimal

Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre

total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)

631 Meacutetodo de Wintrobe

Materiales requeridos

- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm

- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia

- Tapoacuten de goma

Procedimiento

diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur

comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado

de no provocar espuma

diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten

diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos

Resultados (lectura)

Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos

Valores de referencia

Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

632 Meacutetodo de microhematocrito

Materiales requeridos

- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)

- Plastilina

Procedimiento

diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel

dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon

anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80

del capilar

diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina

diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma

diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm

Resultados (lectura)

La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio

Uso de la escala

diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero

diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la

columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical

diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos

Valores de referencia

Hombres 40 - 50

Mujeres 38 - 44

Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44

Lactantes (3 meses) 37 - 42

Recieacuten nacidos 50 - 58

La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)

64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA

Principio

La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre

641 Materiales y reactivos

6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro

6412 Pipetas

diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla

diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL

6413 Tubos de ensayo

6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten

Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia

Preparacioacuten de colorantes (Anexo A)

1048729 Para el estudio de las ceacutelulas sanguiacuteneas utilizar el colorante 523 y 524

1048729 Para el estudio de hemoparaacutesitos utilizar el colorante 521

1048729 Utilizar el colorante 522 para casos especiales en que se desee observar

con mayor claridad y especificidad los graacutenulos de los neutrofilos

53 TINCIOacuteN CON COLORANTE DE WRIGHT

531 Fundamento

El colorante de Wright va a permitir suministrar un medio para estudiar lasangre y determinar las variaciones y anormalidades de estructura forma ytamantildeo de los eritrocitos su contenido de hemoglobina y sus propiedades decoloracioacuten La informacioacuten obtenida de un frotis de sangre perifeacuterica dependeen gran parte de la calidad del extendido y la coloracioacuten

532 Materiales

5321 Colorante de Wright (Anexo A)

5322 Frasco gotero

5323 Solucioacuten amortiguada tamponada (Anexo A)

533 Procedimiento

5331 Una vez obtenido el frotis sanguiacuteneo se le dejaraacute secar entre 15 y 20minutos

5332 Luego se coloca la preparacioacuten en un soporte y se cubre con el colorantede Wright dejaacutendolo por espacio de 5 minutos

5333 Posteriormente se antildeade solucioacuten amortiguada tamponada en partesiguales hasta obtener un brillo metaacutelico dejando 6 minutos adicionales

5334 Finalmente se lava con agua corriente y se deja secar

5335 Se coloca en el microscopio y con pequentildeo aumento se revisa lacalidad de la coloracioacuten la cantidad aproximada de gloacutebulos blancosy se escoge el sitio para iniciar el recuento Se coloca una gota deaceite de inmersioacuten y se enfoca a un aumento de 100xLa forma de los gloacutebulos rojos se examinaraacute detenidamente observandoademaacutes del color (cantidad de hemoglobina) presencia deplaquetas su agrupacioacuten y distribucioacuten

5336 Posteriormente se hace el recuento diferencial de gloacutebulos blancosen 100

ceacutelulas para lo cual se deberaacute conocer las diferencias entreneutroacutefilos eosinoacutefilos

linfocitos y monocitosUna extensioacuten de sangre bien tentildeida debe caracterizarse

por unabuena diferenciacioacuten de las estructuras subcelulares en los leucocitosuna

coloracioacuten rosada de los hematiacutees y la ausencia de precipitados

Los defectos maacutes frecuentes observados en la tincioacuten del frotis sanguiacuteneoson

Coloracioacuten excesivamente azul debido a

1048729 Frotis excesivamente grueso

1048729 Lavado insuficiente

1048729 Tincioacuten muy prolongada

1048729 Empleo de colorante excesivamente alcalino

Coloracioacuten con una tonalidad rosada

1048729 El colorante el tampoacuten o el agua de lavado tienen un pH demasiadoaacutecido

Presencia de precipitados

1048729 Obedecen a una accioacuten excesiva del colorante Esto se puede evitarcon la

filtracioacuten

SECCIOacuteN 6

HEMOGRAMA-HEMOGLOBINA-HEMATOCRITO

El hemograma de Shilling constituye uno de los exaacutemenes de laboratorio

maacutesusados en el campo de la hematologiacutea Comprende las siguientes pruebas

61 RECUENTO LEUCOCITARIO

Principio

La sangre anticoagulada se deposita en un liacutequido que permite evidenciar

losleucocitos mantenieacutendolos visibles mientras que los eritrocitos

sonhemolizados El recuento del nuacutemero de leucocitos o gloacutebulos blancos se

expresapor mm3 (miliacutemetro cuacutebico)

611 Equipos

- Microscopio

- Hemocitoacutemetro (Caacutemara de Neubauer)

Consta de los siguientes elementos

diams Una laacutemina portaobjeto gruesa en el centro se hallan dos

superficiescuadriculadas iguales separadas del resto de la laacutemina por surcos y

dosbarras transversales algo maacutes elevadas

diams Una laminilla cubreobjetos oacutepticamente plana que al colocarse sobrelas barras

elevadas de la laacutemina forma una caacutemara entre el cubreobjetosy la superficie

cuadriculadaLa altura entre el cubreobjetos y la laacutemina portaobjetos es de 01

mmCada cuadriacutecula mide 3 mm de lado y se divide en 9 cuadrados grandesCada

uno de los cuales mide 1 mm2 de superficie que se subdivide a suvez en 16

cuadrados medianos El cuadrado grande central se divide en25 cuadrados

pequentildeos y cada uno de ellos en 16 cuadraditos Cadacuadrado pequentildeo mide

02 mm de lado (004 mm2 de superficie) y cadacuadradito mide 005 mm de lado

(00025 mm2 de superficie)

612 Materiales y reactivos requeridos

6121 Pipeta de gloacutebulos blancos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0 a 100 mL)Presenta cerca del extremo superior una marca de 11 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla que funciona comomezcladora luego sigue el extremo maacutes largo de la pipeta (tallo) que estaacutedividida en 10 partes con 2 marcas 1 (parte final del bulbo) y 05 (a la mitaddel tallo) Se le acopla a su extremo superior 1 tubo de goma y una bombillapara aspirar

6122 Diluyente de gloacutebulos blancos Solucioacuten de Turk al 1

6123 Contador manual (Soacutelo si fuera necesario)

6124 Papel filtro

613 Procedimiento

6131 Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar deldedo se procede a aspirar la sangre con la pipeta de gloacutebulos blancoshasta la marca de 05 y a limpiar la punta con papel absorbente

6132 Introducir la pipeta en el tubo que contenga solucioacuten de Turk y absorberhasta la marca de 11 (no debe haber burbujas)

6133 Tapar ambos extremos y proceder a mezclar manualmente o en unrotador automaacutetico por 2 oacute 3 minutos

6134 Monte la laminilla de vidrio en la caacutemara para recuento que debe estarlimpia y seca

6135 Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocaruna gota pequentildea de esta solucioacuten en la caacutemara

6136 Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las ceacutelulas se sedimenten

6137 Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angularesCuando se usa la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002 mL) desangre total con anticoagulante o sangre capilar con anticoagulante yse diluye en un tubo que contenga 380 mL de solucioacuten de Turk (aquiacutetenemos una dilucioacuten 120)

LECTURA

Fig 13

La lectura se realiza en los campos 1 3 7 y 9 como estaacute indicado en la figuraAdemaacutes de los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes sedeben contar todos los leucocitos que se encuentren adheridos en la liacuteneahorizontal superior y vertical exterior o de lo contrario todos los leucocitosadheridos a la liacutenea horizontal inferior y vertical interior

614 Resultados

Nordm de leucocitos x mm3 = leucocitos contados en 4 camposdividealtura x dilucioacuten x aacuterea

Reemplazando = leucocitos contados en 4 camposdivide110 x 120 x 4=

Leucocitos contados en 4 camposdivide4200=

X1 divide4200= Nordm leucocitos contados x 50

615 Valores de referencia

5000 - 10 000 leucocitos mm3

616 Correccioacuten de valores para restar eritrocitos nucleados

Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el liacutequido de dilucioacuten por lo tantopueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con losleucocitos de tal manera que se debe emplear la siguiente foacutermula

Caacutelculo

La concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos (por litro) esNuacutemero de normoblatos contados x concentracioacuten o nuacutemero de leucocitos100 + Nordm de normoblastos contados

Ejemplo

Si se cuentan 50 normoblastos y la concentracioacuten del nuacutemero de leucocitos es16 x 109l la concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos seraacute

50 x16 = 53 x 109l

100 + 50

y la concentracioacuten de leucocitos corregida seraacute 16 - 53 = 107 x 109lEn unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitosse expresan por miliacutemetro cuacutebico En tales unidades el caacutelculo correspondienteal ejemplo que se ha dado seriacutea

50 x 16 000 = 5300 mm3

100 + 50

Recuento corregido de gloacutebulos blancos o leucocitos = 16 000 - 5300 = 10 700 mm3

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

62 RECUENTO DE GLOacuteBULOS ROJOS

Principio

La sangre se diluye en un liacutequido que nos permite observar claramente loshematiacutees luego esta dilucioacuten se coloca en una caacutemara de Neubauer con laayuda de una pipeta automaacutetica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopioa un objetivo de 40x para calcular el nuacutemero de gloacutebulos rojos por mm3

621 Equipos

- Microscopio

- Hemocitoacutemetro (caacutemara de Neubauer)

622 Materiales y reactivos requeridos

6221 Pipeta de gloacutebulos rojos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0-100 mL)

Presenta cerca del extremo superior una marca de 101 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla roja mezcladoraluego sigue el tallo (extremo maacutes largo) el cual estaacute dividido en 10 partescon 2 marcas 1 acabando el bulbo y 05 a la mitad del tallo Se requiereigual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar

6222 Diluyente de gloacutebulos rojos Cloruro de Sodio al 09 (ver anexo)

Diluyente de Hayem (ver anexo)

6223 Contador manual (soacutelo si fuera necesario)

6224 Papel filtro

623 Procedimiento

6231 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar

6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente

6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101

6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos

6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente

6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas

6237 Dejar en reposo por 3 minutos

6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)

6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos

LECTURA

Fig 14

624 Resultados

Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea

Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15

= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000

= hematiacutees contados x 10 000

625 Valores de referencia

(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)

Hombres 4 500 000 - 5 500 000

Mujeres 4 000 000 - 5 000 000

Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000

Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000

Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)

Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal

volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen

porcentaje o como valor decimal

Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre

total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)

631 Meacutetodo de Wintrobe

Materiales requeridos

- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm

- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia

- Tapoacuten de goma

Procedimiento

diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur

comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado

de no provocar espuma

diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten

diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos

Resultados (lectura)

Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos

Valores de referencia

Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

632 Meacutetodo de microhematocrito

Materiales requeridos

- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)

- Plastilina

Procedimiento

diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel

dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon

anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80

del capilar

diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina

diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma

diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm

Resultados (lectura)

La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio

Uso de la escala

diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero

diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la

columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical

diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos

Valores de referencia

Hombres 40 - 50

Mujeres 38 - 44

Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44

Lactantes (3 meses) 37 - 42

Recieacuten nacidos 50 - 58

La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)

64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA

Principio

La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre

641 Materiales y reactivos

6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro

6412 Pipetas

diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla

diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL

6413 Tubos de ensayo

6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten

Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia

5335 Se coloca en el microscopio y con pequentildeo aumento se revisa lacalidad de la coloracioacuten la cantidad aproximada de gloacutebulos blancosy se escoge el sitio para iniciar el recuento Se coloca una gota deaceite de inmersioacuten y se enfoca a un aumento de 100xLa forma de los gloacutebulos rojos se examinaraacute detenidamente observandoademaacutes del color (cantidad de hemoglobina) presencia deplaquetas su agrupacioacuten y distribucioacuten

5336 Posteriormente se hace el recuento diferencial de gloacutebulos blancosen 100

ceacutelulas para lo cual se deberaacute conocer las diferencias entreneutroacutefilos eosinoacutefilos

linfocitos y monocitosUna extensioacuten de sangre bien tentildeida debe caracterizarse

por unabuena diferenciacioacuten de las estructuras subcelulares en los leucocitosuna

coloracioacuten rosada de los hematiacutees y la ausencia de precipitados

Los defectos maacutes frecuentes observados en la tincioacuten del frotis sanguiacuteneoson

Coloracioacuten excesivamente azul debido a

1048729 Frotis excesivamente grueso

1048729 Lavado insuficiente

1048729 Tincioacuten muy prolongada

1048729 Empleo de colorante excesivamente alcalino

Coloracioacuten con una tonalidad rosada

1048729 El colorante el tampoacuten o el agua de lavado tienen un pH demasiadoaacutecido

Presencia de precipitados

1048729 Obedecen a una accioacuten excesiva del colorante Esto se puede evitarcon la

filtracioacuten

SECCIOacuteN 6

HEMOGRAMA-HEMOGLOBINA-HEMATOCRITO

El hemograma de Shilling constituye uno de los exaacutemenes de laboratorio

maacutesusados en el campo de la hematologiacutea Comprende las siguientes pruebas

61 RECUENTO LEUCOCITARIO

Principio

La sangre anticoagulada se deposita en un liacutequido que permite evidenciar

losleucocitos mantenieacutendolos visibles mientras que los eritrocitos

sonhemolizados El recuento del nuacutemero de leucocitos o gloacutebulos blancos se

expresapor mm3 (miliacutemetro cuacutebico)

611 Equipos

- Microscopio

- Hemocitoacutemetro (Caacutemara de Neubauer)

Consta de los siguientes elementos

diams Una laacutemina portaobjeto gruesa en el centro se hallan dos

superficiescuadriculadas iguales separadas del resto de la laacutemina por surcos y

dosbarras transversales algo maacutes elevadas

diams Una laminilla cubreobjetos oacutepticamente plana que al colocarse sobrelas barras

elevadas de la laacutemina forma una caacutemara entre el cubreobjetosy la superficie

cuadriculadaLa altura entre el cubreobjetos y la laacutemina portaobjetos es de 01

mmCada cuadriacutecula mide 3 mm de lado y se divide en 9 cuadrados grandesCada

uno de los cuales mide 1 mm2 de superficie que se subdivide a suvez en 16

cuadrados medianos El cuadrado grande central se divide en25 cuadrados

pequentildeos y cada uno de ellos en 16 cuadraditos Cadacuadrado pequentildeo mide

02 mm de lado (004 mm2 de superficie) y cadacuadradito mide 005 mm de lado

(00025 mm2 de superficie)

612 Materiales y reactivos requeridos

6121 Pipeta de gloacutebulos blancos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0 a 100 mL)Presenta cerca del extremo superior una marca de 11 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla que funciona comomezcladora luego sigue el extremo maacutes largo de la pipeta (tallo) que estaacutedividida en 10 partes con 2 marcas 1 (parte final del bulbo) y 05 (a la mitaddel tallo) Se le acopla a su extremo superior 1 tubo de goma y una bombillapara aspirar

6122 Diluyente de gloacutebulos blancos Solucioacuten de Turk al 1

6123 Contador manual (Soacutelo si fuera necesario)

6124 Papel filtro

613 Procedimiento

6131 Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar deldedo se procede a aspirar la sangre con la pipeta de gloacutebulos blancoshasta la marca de 05 y a limpiar la punta con papel absorbente

6132 Introducir la pipeta en el tubo que contenga solucioacuten de Turk y absorberhasta la marca de 11 (no debe haber burbujas)

6133 Tapar ambos extremos y proceder a mezclar manualmente o en unrotador automaacutetico por 2 oacute 3 minutos

6134 Monte la laminilla de vidrio en la caacutemara para recuento que debe estarlimpia y seca

6135 Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocaruna gota pequentildea de esta solucioacuten en la caacutemara

6136 Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las ceacutelulas se sedimenten

6137 Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angularesCuando se usa la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002 mL) desangre total con anticoagulante o sangre capilar con anticoagulante yse diluye en un tubo que contenga 380 mL de solucioacuten de Turk (aquiacutetenemos una dilucioacuten 120)

LECTURA

Fig 13

La lectura se realiza en los campos 1 3 7 y 9 como estaacute indicado en la figuraAdemaacutes de los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes sedeben contar todos los leucocitos que se encuentren adheridos en la liacuteneahorizontal superior y vertical exterior o de lo contrario todos los leucocitosadheridos a la liacutenea horizontal inferior y vertical interior

614 Resultados

Nordm de leucocitos x mm3 = leucocitos contados en 4 camposdividealtura x dilucioacuten x aacuterea

Reemplazando = leucocitos contados en 4 camposdivide110 x 120 x 4=

Leucocitos contados en 4 camposdivide4200=

X1 divide4200= Nordm leucocitos contados x 50

615 Valores de referencia

5000 - 10 000 leucocitos mm3

616 Correccioacuten de valores para restar eritrocitos nucleados

Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el liacutequido de dilucioacuten por lo tantopueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con losleucocitos de tal manera que se debe emplear la siguiente foacutermula

Caacutelculo

La concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos (por litro) esNuacutemero de normoblatos contados x concentracioacuten o nuacutemero de leucocitos100 + Nordm de normoblastos contados

Ejemplo

Si se cuentan 50 normoblastos y la concentracioacuten del nuacutemero de leucocitos es16 x 109l la concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos seraacute

50 x16 = 53 x 109l

100 + 50

y la concentracioacuten de leucocitos corregida seraacute 16 - 53 = 107 x 109lEn unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitosse expresan por miliacutemetro cuacutebico En tales unidades el caacutelculo correspondienteal ejemplo que se ha dado seriacutea

50 x 16 000 = 5300 mm3

100 + 50

Recuento corregido de gloacutebulos blancos o leucocitos = 16 000 - 5300 = 10 700 mm3

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

62 RECUENTO DE GLOacuteBULOS ROJOS

Principio

La sangre se diluye en un liacutequido que nos permite observar claramente loshematiacutees luego esta dilucioacuten se coloca en una caacutemara de Neubauer con laayuda de una pipeta automaacutetica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopioa un objetivo de 40x para calcular el nuacutemero de gloacutebulos rojos por mm3

621 Equipos

- Microscopio

- Hemocitoacutemetro (caacutemara de Neubauer)

622 Materiales y reactivos requeridos

6221 Pipeta de gloacutebulos rojos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0-100 mL)

Presenta cerca del extremo superior una marca de 101 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla roja mezcladoraluego sigue el tallo (extremo maacutes largo) el cual estaacute dividido en 10 partescon 2 marcas 1 acabando el bulbo y 05 a la mitad del tallo Se requiereigual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar

6222 Diluyente de gloacutebulos rojos Cloruro de Sodio al 09 (ver anexo)

Diluyente de Hayem (ver anexo)

6223 Contador manual (soacutelo si fuera necesario)

6224 Papel filtro

623 Procedimiento

6231 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar

6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente

6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101

6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos

6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente

6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas

6237 Dejar en reposo por 3 minutos

6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)

6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos

LECTURA

Fig 14

624 Resultados

Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea

Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15

= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000

= hematiacutees contados x 10 000

625 Valores de referencia

(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)

Hombres 4 500 000 - 5 500 000

Mujeres 4 000 000 - 5 000 000

Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000

Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000

Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)

Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal

volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen

porcentaje o como valor decimal

Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre

total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)

631 Meacutetodo de Wintrobe

Materiales requeridos

- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm

- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia

- Tapoacuten de goma

Procedimiento

diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur

comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado

de no provocar espuma

diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten

diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos

Resultados (lectura)

Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos

Valores de referencia

Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

632 Meacutetodo de microhematocrito

Materiales requeridos

- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)

- Plastilina

Procedimiento

diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel

dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon

anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80

del capilar

diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina

diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma

diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm

Resultados (lectura)

La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio

Uso de la escala

diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero

diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la

columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical

diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos

Valores de referencia

Hombres 40 - 50

Mujeres 38 - 44

Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44

Lactantes (3 meses) 37 - 42

Recieacuten nacidos 50 - 58

La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)

64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA

Principio

La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre

641 Materiales y reactivos

6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro

6412 Pipetas

diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla

diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL

6413 Tubos de ensayo

6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten

Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia

SECCIOacuteN 6

HEMOGRAMA-HEMOGLOBINA-HEMATOCRITO

El hemograma de Shilling constituye uno de los exaacutemenes de laboratorio

maacutesusados en el campo de la hematologiacutea Comprende las siguientes pruebas

61 RECUENTO LEUCOCITARIO

Principio

La sangre anticoagulada se deposita en un liacutequido que permite evidenciar

losleucocitos mantenieacutendolos visibles mientras que los eritrocitos

sonhemolizados El recuento del nuacutemero de leucocitos o gloacutebulos blancos se

expresapor mm3 (miliacutemetro cuacutebico)

611 Equipos

- Microscopio

- Hemocitoacutemetro (Caacutemara de Neubauer)

Consta de los siguientes elementos

diams Una laacutemina portaobjeto gruesa en el centro se hallan dos

superficiescuadriculadas iguales separadas del resto de la laacutemina por surcos y

dosbarras transversales algo maacutes elevadas

diams Una laminilla cubreobjetos oacutepticamente plana que al colocarse sobrelas barras

elevadas de la laacutemina forma una caacutemara entre el cubreobjetosy la superficie

cuadriculadaLa altura entre el cubreobjetos y la laacutemina portaobjetos es de 01

mmCada cuadriacutecula mide 3 mm de lado y se divide en 9 cuadrados grandesCada

uno de los cuales mide 1 mm2 de superficie que se subdivide a suvez en 16

cuadrados medianos El cuadrado grande central se divide en25 cuadrados

pequentildeos y cada uno de ellos en 16 cuadraditos Cadacuadrado pequentildeo mide

02 mm de lado (004 mm2 de superficie) y cadacuadradito mide 005 mm de lado

(00025 mm2 de superficie)

612 Materiales y reactivos requeridos

6121 Pipeta de gloacutebulos blancos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0 a 100 mL)Presenta cerca del extremo superior una marca de 11 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla que funciona comomezcladora luego sigue el extremo maacutes largo de la pipeta (tallo) que estaacutedividida en 10 partes con 2 marcas 1 (parte final del bulbo) y 05 (a la mitaddel tallo) Se le acopla a su extremo superior 1 tubo de goma y una bombillapara aspirar

6122 Diluyente de gloacutebulos blancos Solucioacuten de Turk al 1

6123 Contador manual (Soacutelo si fuera necesario)

6124 Papel filtro

613 Procedimiento

6131 Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar deldedo se procede a aspirar la sangre con la pipeta de gloacutebulos blancoshasta la marca de 05 y a limpiar la punta con papel absorbente

6132 Introducir la pipeta en el tubo que contenga solucioacuten de Turk y absorberhasta la marca de 11 (no debe haber burbujas)

6133 Tapar ambos extremos y proceder a mezclar manualmente o en unrotador automaacutetico por 2 oacute 3 minutos

6134 Monte la laminilla de vidrio en la caacutemara para recuento que debe estarlimpia y seca

6135 Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocaruna gota pequentildea de esta solucioacuten en la caacutemara

6136 Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las ceacutelulas se sedimenten

6137 Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angularesCuando se usa la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002 mL) desangre total con anticoagulante o sangre capilar con anticoagulante yse diluye en un tubo que contenga 380 mL de solucioacuten de Turk (aquiacutetenemos una dilucioacuten 120)

LECTURA

Fig 13

La lectura se realiza en los campos 1 3 7 y 9 como estaacute indicado en la figuraAdemaacutes de los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes sedeben contar todos los leucocitos que se encuentren adheridos en la liacuteneahorizontal superior y vertical exterior o de lo contrario todos los leucocitosadheridos a la liacutenea horizontal inferior y vertical interior

614 Resultados

Nordm de leucocitos x mm3 = leucocitos contados en 4 camposdividealtura x dilucioacuten x aacuterea

Reemplazando = leucocitos contados en 4 camposdivide110 x 120 x 4=

Leucocitos contados en 4 camposdivide4200=

X1 divide4200= Nordm leucocitos contados x 50

615 Valores de referencia

5000 - 10 000 leucocitos mm3

616 Correccioacuten de valores para restar eritrocitos nucleados

Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el liacutequido de dilucioacuten por lo tantopueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con losleucocitos de tal manera que se debe emplear la siguiente foacutermula

Caacutelculo

La concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos (por litro) esNuacutemero de normoblatos contados x concentracioacuten o nuacutemero de leucocitos100 + Nordm de normoblastos contados

Ejemplo

Si se cuentan 50 normoblastos y la concentracioacuten del nuacutemero de leucocitos es16 x 109l la concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos seraacute

50 x16 = 53 x 109l

100 + 50

y la concentracioacuten de leucocitos corregida seraacute 16 - 53 = 107 x 109lEn unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitosse expresan por miliacutemetro cuacutebico En tales unidades el caacutelculo correspondienteal ejemplo que se ha dado seriacutea

50 x 16 000 = 5300 mm3

100 + 50

Recuento corregido de gloacutebulos blancos o leucocitos = 16 000 - 5300 = 10 700 mm3

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

62 RECUENTO DE GLOacuteBULOS ROJOS

Principio

La sangre se diluye en un liacutequido que nos permite observar claramente loshematiacutees luego esta dilucioacuten se coloca en una caacutemara de Neubauer con laayuda de una pipeta automaacutetica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopioa un objetivo de 40x para calcular el nuacutemero de gloacutebulos rojos por mm3

621 Equipos

- Microscopio

- Hemocitoacutemetro (caacutemara de Neubauer)

622 Materiales y reactivos requeridos

6221 Pipeta de gloacutebulos rojos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0-100 mL)

Presenta cerca del extremo superior una marca de 101 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla roja mezcladoraluego sigue el tallo (extremo maacutes largo) el cual estaacute dividido en 10 partescon 2 marcas 1 acabando el bulbo y 05 a la mitad del tallo Se requiereigual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar

6222 Diluyente de gloacutebulos rojos Cloruro de Sodio al 09 (ver anexo)

Diluyente de Hayem (ver anexo)

6223 Contador manual (soacutelo si fuera necesario)

6224 Papel filtro

623 Procedimiento

6231 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar

6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente

6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101

6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos

6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente

6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas

6237 Dejar en reposo por 3 minutos

6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)

6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos

LECTURA

Fig 14

624 Resultados

Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea

Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15

= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000

= hematiacutees contados x 10 000

625 Valores de referencia

(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)

Hombres 4 500 000 - 5 500 000

Mujeres 4 000 000 - 5 000 000

Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000

Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000

Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)

Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal

volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen

porcentaje o como valor decimal

Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre

total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)

631 Meacutetodo de Wintrobe

Materiales requeridos

- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm

- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia

- Tapoacuten de goma

Procedimiento

diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur

comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado

de no provocar espuma

diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten

diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos

Resultados (lectura)

Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos

Valores de referencia

Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

632 Meacutetodo de microhematocrito

Materiales requeridos

- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)

- Plastilina

Procedimiento

diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel

dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon

anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80

del capilar

diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina

diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma

diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm

Resultados (lectura)

La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio

Uso de la escala

diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero

diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la

columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical

diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos

Valores de referencia

Hombres 40 - 50

Mujeres 38 - 44

Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44

Lactantes (3 meses) 37 - 42

Recieacuten nacidos 50 - 58

La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)

64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA

Principio

La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre

641 Materiales y reactivos

6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro

6412 Pipetas

diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla

diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL

6413 Tubos de ensayo

6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten

Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia

uno de los cuales mide 1 mm2 de superficie que se subdivide a suvez en 16

cuadrados medianos El cuadrado grande central se divide en25 cuadrados

pequentildeos y cada uno de ellos en 16 cuadraditos Cadacuadrado pequentildeo mide

02 mm de lado (004 mm2 de superficie) y cadacuadradito mide 005 mm de lado

(00025 mm2 de superficie)

612 Materiales y reactivos requeridos

6121 Pipeta de gloacutebulos blancos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0 a 100 mL)Presenta cerca del extremo superior una marca de 11 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla que funciona comomezcladora luego sigue el extremo maacutes largo de la pipeta (tallo) que estaacutedividida en 10 partes con 2 marcas 1 (parte final del bulbo) y 05 (a la mitaddel tallo) Se le acopla a su extremo superior 1 tubo de goma y una bombillapara aspirar

6122 Diluyente de gloacutebulos blancos Solucioacuten de Turk al 1

6123 Contador manual (Soacutelo si fuera necesario)

6124 Papel filtro

613 Procedimiento

6131 Una vez obtenida la sangre con anticoagulante o sangre capilar deldedo se procede a aspirar la sangre con la pipeta de gloacutebulos blancoshasta la marca de 05 y a limpiar la punta con papel absorbente

6132 Introducir la pipeta en el tubo que contenga solucioacuten de Turk y absorberhasta la marca de 11 (no debe haber burbujas)

6133 Tapar ambos extremos y proceder a mezclar manualmente o en unrotador automaacutetico por 2 oacute 3 minutos

6134 Monte la laminilla de vidrio en la caacutemara para recuento que debe estarlimpia y seca

6135 Agitar la pipeta y descartar las cuatro primeras gotas para luego colocaruna gota pequentildea de esta solucioacuten en la caacutemara

6136 Deje reposar por espacio de 3 minutos para que las ceacutelulas se sedimenten

6137 Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angularesCuando se usa la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002 mL) desangre total con anticoagulante o sangre capilar con anticoagulante yse diluye en un tubo que contenga 380 mL de solucioacuten de Turk (aquiacutetenemos una dilucioacuten 120)

LECTURA

Fig 13

La lectura se realiza en los campos 1 3 7 y 9 como estaacute indicado en la figuraAdemaacutes de los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes sedeben contar todos los leucocitos que se encuentren adheridos en la liacuteneahorizontal superior y vertical exterior o de lo contrario todos los leucocitosadheridos a la liacutenea horizontal inferior y vertical interior

614 Resultados

Nordm de leucocitos x mm3 = leucocitos contados en 4 camposdividealtura x dilucioacuten x aacuterea

Reemplazando = leucocitos contados en 4 camposdivide110 x 120 x 4=

Leucocitos contados en 4 camposdivide4200=

X1 divide4200= Nordm leucocitos contados x 50

615 Valores de referencia

5000 - 10 000 leucocitos mm3

616 Correccioacuten de valores para restar eritrocitos nucleados

Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el liacutequido de dilucioacuten por lo tantopueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con losleucocitos de tal manera que se debe emplear la siguiente foacutermula

Caacutelculo

La concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos (por litro) esNuacutemero de normoblatos contados x concentracioacuten o nuacutemero de leucocitos100 + Nordm de normoblastos contados

Ejemplo

Si se cuentan 50 normoblastos y la concentracioacuten del nuacutemero de leucocitos es16 x 109l la concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos seraacute

50 x16 = 53 x 109l

100 + 50

y la concentracioacuten de leucocitos corregida seraacute 16 - 53 = 107 x 109lEn unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitosse expresan por miliacutemetro cuacutebico En tales unidades el caacutelculo correspondienteal ejemplo que se ha dado seriacutea

50 x 16 000 = 5300 mm3

100 + 50

Recuento corregido de gloacutebulos blancos o leucocitos = 16 000 - 5300 = 10 700 mm3

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

62 RECUENTO DE GLOacuteBULOS ROJOS

Principio

La sangre se diluye en un liacutequido que nos permite observar claramente loshematiacutees luego esta dilucioacuten se coloca en una caacutemara de Neubauer con laayuda de una pipeta automaacutetica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopioa un objetivo de 40x para calcular el nuacutemero de gloacutebulos rojos por mm3

621 Equipos

- Microscopio

- Hemocitoacutemetro (caacutemara de Neubauer)

622 Materiales y reactivos requeridos

6221 Pipeta de gloacutebulos rojos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0-100 mL)

Presenta cerca del extremo superior una marca de 101 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla roja mezcladoraluego sigue el tallo (extremo maacutes largo) el cual estaacute dividido en 10 partescon 2 marcas 1 acabando el bulbo y 05 a la mitad del tallo Se requiereigual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar

6222 Diluyente de gloacutebulos rojos Cloruro de Sodio al 09 (ver anexo)

Diluyente de Hayem (ver anexo)

6223 Contador manual (soacutelo si fuera necesario)

6224 Papel filtro

623 Procedimiento

6231 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar

6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente

6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101

6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos

6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente

6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas

6237 Dejar en reposo por 3 minutos

6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)

6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos

LECTURA

Fig 14

624 Resultados

Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea

Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15

= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000

= hematiacutees contados x 10 000

625 Valores de referencia

(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)

Hombres 4 500 000 - 5 500 000

Mujeres 4 000 000 - 5 000 000

Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000

Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000

Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)

Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal

volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen

porcentaje o como valor decimal

Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre

total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)

631 Meacutetodo de Wintrobe

Materiales requeridos

- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm

- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia

- Tapoacuten de goma

Procedimiento

diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur

comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado

de no provocar espuma

diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten

diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos

Resultados (lectura)

Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos

Valores de referencia

Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

632 Meacutetodo de microhematocrito

Materiales requeridos

- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)

- Plastilina

Procedimiento

diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel

dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon

anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80

del capilar

diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina

diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma

diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm

Resultados (lectura)

La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio

Uso de la escala

diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero

diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la

columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical

diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos

Valores de referencia

Hombres 40 - 50

Mujeres 38 - 44

Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44

Lactantes (3 meses) 37 - 42

Recieacuten nacidos 50 - 58

La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)

64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA

Principio

La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre

641 Materiales y reactivos

6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro

6412 Pipetas

diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla

diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL

6413 Tubos de ensayo

6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten

Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia

6137 Enfocar con objetivo de 10x y contar en 4 cuadrados grandes angularesCuando se usa la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002 mL) desangre total con anticoagulante o sangre capilar con anticoagulante yse diluye en un tubo que contenga 380 mL de solucioacuten de Turk (aquiacutetenemos una dilucioacuten 120)

LECTURA

Fig 13

La lectura se realiza en los campos 1 3 7 y 9 como estaacute indicado en la figuraAdemaacutes de los leucocitos contados dentro de cada uno de los cuadrantes sedeben contar todos los leucocitos que se encuentren adheridos en la liacuteneahorizontal superior y vertical exterior o de lo contrario todos los leucocitosadheridos a la liacutenea horizontal inferior y vertical interior

614 Resultados

Nordm de leucocitos x mm3 = leucocitos contados en 4 camposdividealtura x dilucioacuten x aacuterea

Reemplazando = leucocitos contados en 4 camposdivide110 x 120 x 4=

Leucocitos contados en 4 camposdivide4200=

X1 divide4200= Nordm leucocitos contados x 50

615 Valores de referencia

5000 - 10 000 leucocitos mm3

616 Correccioacuten de valores para restar eritrocitos nucleados

Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el liacutequido de dilucioacuten por lo tantopueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con losleucocitos de tal manera que se debe emplear la siguiente foacutermula

Caacutelculo

La concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos (por litro) esNuacutemero de normoblatos contados x concentracioacuten o nuacutemero de leucocitos100 + Nordm de normoblastos contados

Ejemplo

Si se cuentan 50 normoblastos y la concentracioacuten del nuacutemero de leucocitos es16 x 109l la concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos seraacute

50 x16 = 53 x 109l

100 + 50

y la concentracioacuten de leucocitos corregida seraacute 16 - 53 = 107 x 109lEn unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitosse expresan por miliacutemetro cuacutebico En tales unidades el caacutelculo correspondienteal ejemplo que se ha dado seriacutea

50 x 16 000 = 5300 mm3

100 + 50

Recuento corregido de gloacutebulos blancos o leucocitos = 16 000 - 5300 = 10 700 mm3

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

62 RECUENTO DE GLOacuteBULOS ROJOS

Principio

La sangre se diluye en un liacutequido que nos permite observar claramente loshematiacutees luego esta dilucioacuten se coloca en una caacutemara de Neubauer con laayuda de una pipeta automaacutetica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopioa un objetivo de 40x para calcular el nuacutemero de gloacutebulos rojos por mm3

621 Equipos

- Microscopio

- Hemocitoacutemetro (caacutemara de Neubauer)

622 Materiales y reactivos requeridos

6221 Pipeta de gloacutebulos rojos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0-100 mL)

Presenta cerca del extremo superior una marca de 101 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla roja mezcladoraluego sigue el tallo (extremo maacutes largo) el cual estaacute dividido en 10 partescon 2 marcas 1 acabando el bulbo y 05 a la mitad del tallo Se requiereigual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar

6222 Diluyente de gloacutebulos rojos Cloruro de Sodio al 09 (ver anexo)

Diluyente de Hayem (ver anexo)

6223 Contador manual (soacutelo si fuera necesario)

6224 Papel filtro

623 Procedimiento

6231 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar

6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente

6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101

6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos

6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente

6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas

6237 Dejar en reposo por 3 minutos

6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)

6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos

LECTURA

Fig 14

624 Resultados

Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea

Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15

= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000

= hematiacutees contados x 10 000

625 Valores de referencia

(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)

Hombres 4 500 000 - 5 500 000

Mujeres 4 000 000 - 5 000 000

Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000

Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000

Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)

Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal

volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen

porcentaje o como valor decimal

Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre

total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)

631 Meacutetodo de Wintrobe

Materiales requeridos

- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm

- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia

- Tapoacuten de goma

Procedimiento

diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur

comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado

de no provocar espuma

diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten

diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos

Resultados (lectura)

Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos

Valores de referencia

Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

632 Meacutetodo de microhematocrito

Materiales requeridos

- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)

- Plastilina

Procedimiento

diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel

dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon

anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80

del capilar

diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina

diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma

diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm

Resultados (lectura)

La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio

Uso de la escala

diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero

diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la

columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical

diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos

Valores de referencia

Hombres 40 - 50

Mujeres 38 - 44

Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44

Lactantes (3 meses) 37 - 42

Recieacuten nacidos 50 - 58

La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)

64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA

Principio

La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre

641 Materiales y reactivos

6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro

6412 Pipetas

diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla

diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL

6413 Tubos de ensayo

6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten

Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia

615 Valores de referencia

5000 - 10 000 leucocitos mm3

616 Correccioacuten de valores para restar eritrocitos nucleados

Los normoblastos no se destruyen (lisis) en el liacutequido de dilucioacuten por lo tantopueden observarse al realizar el recuento leucocitario y confundirse con losleucocitos de tal manera que se debe emplear la siguiente foacutermula

Caacutelculo

La concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos (por litro) esNuacutemero de normoblatos contados x concentracioacuten o nuacutemero de leucocitos100 + Nordm de normoblastos contados

Ejemplo

Si se cuentan 50 normoblastos y la concentracioacuten del nuacutemero de leucocitos es16 x 109l la concentracioacuten del nuacutemero de normoblastos seraacute

50 x16 = 53 x 109l

100 + 50

y la concentracioacuten de leucocitos corregida seraacute 16 - 53 = 107 x 109lEn unidades tradicionales las concentraciones de normoblastos y leucocitosse expresan por miliacutemetro cuacutebico En tales unidades el caacutelculo correspondienteal ejemplo que se ha dado seriacutea

50 x 16 000 = 5300 mm3

100 + 50

Recuento corregido de gloacutebulos blancos o leucocitos = 16 000 - 5300 = 10 700 mm3

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

62 RECUENTO DE GLOacuteBULOS ROJOS

Principio

La sangre se diluye en un liacutequido que nos permite observar claramente loshematiacutees luego esta dilucioacuten se coloca en una caacutemara de Neubauer con laayuda de una pipeta automaacutetica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopioa un objetivo de 40x para calcular el nuacutemero de gloacutebulos rojos por mm3

621 Equipos

- Microscopio

- Hemocitoacutemetro (caacutemara de Neubauer)

622 Materiales y reactivos requeridos

6221 Pipeta de gloacutebulos rojos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0-100 mL)

Presenta cerca del extremo superior una marca de 101 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla roja mezcladoraluego sigue el tallo (extremo maacutes largo) el cual estaacute dividido en 10 partescon 2 marcas 1 acabando el bulbo y 05 a la mitad del tallo Se requiereigual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar

6222 Diluyente de gloacutebulos rojos Cloruro de Sodio al 09 (ver anexo)

Diluyente de Hayem (ver anexo)

6223 Contador manual (soacutelo si fuera necesario)

6224 Papel filtro

623 Procedimiento

6231 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar

6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente

6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101

6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos

6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente

6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas

6237 Dejar en reposo por 3 minutos

6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)

6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos

LECTURA

Fig 14

624 Resultados

Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea

Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15

= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000

= hematiacutees contados x 10 000

625 Valores de referencia

(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)

Hombres 4 500 000 - 5 500 000

Mujeres 4 000 000 - 5 000 000

Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000

Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000

Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)

Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal

volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen

porcentaje o como valor decimal

Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre

total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)

631 Meacutetodo de Wintrobe

Materiales requeridos

- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm

- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia

- Tapoacuten de goma

Procedimiento

diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur

comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado

de no provocar espuma

diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten

diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos

Resultados (lectura)

Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos

Valores de referencia

Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

632 Meacutetodo de microhematocrito

Materiales requeridos

- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)

- Plastilina

Procedimiento

diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel

dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon

anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80

del capilar

diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina

diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma

diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm

Resultados (lectura)

La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio

Uso de la escala

diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero

diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la

columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical

diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos

Valores de referencia

Hombres 40 - 50

Mujeres 38 - 44

Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44

Lactantes (3 meses) 37 - 42

Recieacuten nacidos 50 - 58

La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)

64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA

Principio

La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre

641 Materiales y reactivos

6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro

6412 Pipetas

diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla

diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL

6413 Tubos de ensayo

6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten

Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia

62 RECUENTO DE GLOacuteBULOS ROJOS

Principio

La sangre se diluye en un liacutequido que nos permite observar claramente loshematiacutees luego esta dilucioacuten se coloca en una caacutemara de Neubauer con laayuda de una pipeta automaacutetica o pipeta Pasteur y se cuentan en el microscopioa un objetivo de 40x para calcular el nuacutemero de gloacutebulos rojos por mm3

621 Equipos

- Microscopio

- Hemocitoacutemetro (caacutemara de Neubauer)

622 Materiales y reactivos requeridos

6221 Pipeta de gloacutebulos rojos (De Thoma) o pipeta automaacutetica (de 0-100 mL)

Presenta cerca del extremo superior una marca de 101 inmediatamentecontinuacutea una dilatacioacuten (bulbo) que contiene una perla roja mezcladoraluego sigue el tallo (extremo maacutes largo) el cual estaacute dividido en 10 partescon 2 marcas 1 acabando el bulbo y 05 a la mitad del tallo Se requiereigual que el recuento de leucocitos una boquilla para aspirar

6222 Diluyente de gloacutebulos rojos Cloruro de Sodio al 09 (ver anexo)

Diluyente de Hayem (ver anexo)

6223 Contador manual (soacutelo si fuera necesario)

6224 Papel filtro

623 Procedimiento

6231 Mezclar la sangre obtenida con el anticoagulante o tomar sangre capilar

6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente

6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101

6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos

6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente

6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas

6237 Dejar en reposo por 3 minutos

6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)

6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos

LECTURA

Fig 14

624 Resultados

Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea

Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15

= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000

= hematiacutees contados x 10 000

625 Valores de referencia

(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)

Hombres 4 500 000 - 5 500 000

Mujeres 4 000 000 - 5 000 000

Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000

Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000

Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)

Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal

volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen

porcentaje o como valor decimal

Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre

total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)

631 Meacutetodo de Wintrobe

Materiales requeridos

- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm

- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia

- Tapoacuten de goma

Procedimiento

diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur

comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado

de no provocar espuma

diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten

diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos

Resultados (lectura)

Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos

Valores de referencia

Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

632 Meacutetodo de microhematocrito

Materiales requeridos

- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)

- Plastilina

Procedimiento

diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel

dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon

anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80

del capilar

diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina

diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma

diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm

Resultados (lectura)

La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio

Uso de la escala

diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero

diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la

columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical

diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos

Valores de referencia

Hombres 40 - 50

Mujeres 38 - 44

Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44

Lactantes (3 meses) 37 - 42

Recieacuten nacidos 50 - 58

La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)

64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA

Principio

La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre

641 Materiales y reactivos

6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro

6412 Pipetas

diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla

diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL

6413 Tubos de ensayo

6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten

Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia

6232 Llenar la pipeta de gloacutebulos rojos con sangre hasta la marca de 05para realizar una dilucioacuten de 1200 y si se carga hasta 1 la dilucioacutenseraacute 1100 Limpiar la punta con gasa o papel absorbente

6233 Introducir la pipeta en el tubo o frasquito conteniendo diluyente (Hayem)y llenar de liacutequido de dilucioacuten hasta la marca de 101

6234 Se coloca en un rotador automaacutetico o se hace rotar manualmente de2 a 3 minutos

6235 Agitar bien la pipeta y descartar 3 a 4 gotas del tallo luego colocar unagota pequentildea cerca de un extremo de la caacutemara para que por capilaridadse llene exactamente

6236 Hacer el recuento con objetivo de 40xSe puede realizar con la pipeta automaacutetica se toma 20 mL (002mL)de sangre total con anticoagulante o sangre capilar y se deposita enun tubo de 12 x 75 que contenga 4 mL de solucioacuten de Hayem (aquiacute setiene una dilucioacuten de 1200) Se deja reposar aproximadamente 5minutos y se procede a cargar la caacutemara con la misma pipeta usandoun nuevo tip El inconveniente aquiacute es el gasto de reactivo (4 mL) perolas medidas son mas exactas

6237 Dejar en reposo por 3 minutos

6238 Enfocar la cuadriacutecula a 10x luego con el objetivo de 40x contar sobreel cuadrado grande central de la caacutemara soacutelo en 5 cuadrados pequentildeosuno central y cuatro angulares (80 cuadraditos en total)

6239 En el recuento se incluyen las ceacutelulas que cubren o tocan por dentroo por fuera las liacuteneas limitantes superior e izquierda en el cuadradopequentildeo de recuento y no se consideran los correspondientes a losliacutemites inferior y derechoSe hace el recuento en los puntos ABCD y Ey se sigue los mismos paraacutemetros del recuento de leucocitos

LECTURA

Fig 14

624 Resultados

Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea

Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15

= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000

= hematiacutees contados x 10 000

625 Valores de referencia

(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)

Hombres 4 500 000 - 5 500 000

Mujeres 4 000 000 - 5 000 000

Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000

Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000

Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)

Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal

volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen

porcentaje o como valor decimal

Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre

total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)

631 Meacutetodo de Wintrobe

Materiales requeridos

- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm

- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia

- Tapoacuten de goma

Procedimiento

diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur

comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado

de no provocar espuma

diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten

diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos

Resultados (lectura)

Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos

Valores de referencia

Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

632 Meacutetodo de microhematocrito

Materiales requeridos

- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)

- Plastilina

Procedimiento

diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel

dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon

anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80

del capilar

diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina

diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma

diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm

Resultados (lectura)

La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio

Uso de la escala

diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero

diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la

columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical

diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos

Valores de referencia

Hombres 40 - 50

Mujeres 38 - 44

Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44

Lactantes (3 meses) 37 - 42

Recieacuten nacidos 50 - 58

La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)

64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA

Principio

La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre

641 Materiales y reactivos

6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro

6412 Pipetas

diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla

diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL

6413 Tubos de ensayo

6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten

Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia

Fig 14

624 Resultados

Nordm de hematiacutees x mm3 = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeosaltura x dilucioacuten X aacuterea

Reemplazando = hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos110 x 1200 x 15

= hematiacutees contados en 5 cuadrados pequentildeos divide 110 000

= hematiacutees contados x 10 000

625 Valores de referencia

(Unidades tradicionales millones de ceacutelulasmm3)

Hombres 4 500 000 - 5 500 000

Mujeres 4 000 000 - 5 000 000

Nintildeos (4 antildeos) 4 200 000 - 5 200 000

Lactantes (1 - 6 meses) 3 800 000 - 5 200 000

Recieacuten nacidos 5 000 000 - 6 000 000

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)

Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal

volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen

porcentaje o como valor decimal

Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre

total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)

631 Meacutetodo de Wintrobe

Materiales requeridos

- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm

- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia

- Tapoacuten de goma

Procedimiento

diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur

comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado

de no provocar espuma

diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten

diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos

Resultados (lectura)

Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos

Valores de referencia

Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

632 Meacutetodo de microhematocrito

Materiales requeridos

- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)

- Plastilina

Procedimiento

diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel

dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon

anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80

del capilar

diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina

diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma

diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm

Resultados (lectura)

La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio

Uso de la escala

diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero

diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la

columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical

diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos

Valores de referencia

Hombres 40 - 50

Mujeres 38 - 44

Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44

Lactantes (3 meses) 37 - 42

Recieacuten nacidos 50 - 58

La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)

64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA

Principio

La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre

641 Materiales y reactivos

6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro

6412 Pipetas

diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla

diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL

6413 Tubos de ensayo

6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten

Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

63 DETERMINACIOacuteN DEL VOLUMEN GLOBULAR (Hematocrito)

Mide la fraccioacuten que comprende a los gloacutebulos rojos (masa globular) respectoal

volumen total de la muestra de sangre venosa o capilar Puede expresarseen

porcentaje o como valor decimal

Hto= altura de la columna de gloacutebulos rojosdivide altura de la columna de sangre

total(gloacutebulos rojos maacutes plasma)

631 Meacutetodo de Wintrobe

Materiales requeridos

- Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm

- Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia

- Tapoacuten de goma

Procedimiento

diams Llenar la sangre extraiacuteda con anticoagulante con una pipeta pasteur

comenzandodesde el fondo hasta la marca superior de 100 mm teniendocuidado

de no provocar espuma

diams Tapar el tubo con un tapoacuten de goma para evitar la evaporacioacuten

diams Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos

Resultados (lectura)

Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos

Valores de referencia

Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

632 Meacutetodo de microhematocrito

Materiales requeridos

- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)

- Plastilina

Procedimiento

diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel

dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon

anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80

del capilar

diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina

diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma

diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm

Resultados (lectura)

La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio

Uso de la escala

diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero

diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la

columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical

diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos

Valores de referencia

Hombres 40 - 50

Mujeres 38 - 44

Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44

Lactantes (3 meses) 37 - 42

Recieacuten nacidos 50 - 58

La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)

64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA

Principio

La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre

641 Materiales y reactivos

6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro

6412 Pipetas

diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla

diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL

6413 Tubos de ensayo

6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten

Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia

Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de gloacutebulosrojos

Valores de referencia

Hombres 40 - 54Mujeres 38 - 48

Fuente Manual de teacutecnicas baacutesicas para un laboratorio de salud OPS Nordm 2

632 Meacutetodo de microhematocrito

Materiales requeridos

- Capilares rojos y azules (75 mm x 15 mm)

- Plastilina

Procedimiento

diams Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejodel

dedo o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosacon

anticoagulante de Wintrobe o EDTA Debe llenarse aproximadamente70 - 80

del capilar

diams Ocluir (tapar) un extremo del capilar con plastilina

diams Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centriacutefuga demicrohematocrito con el extremo ocluido adherido al reborde externo de laplataforma

diams Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm

Resultados (lectura)

La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio

Uso de la escala

diams Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columnade eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismonivel de la liacutenea horizontal correspondiente al cero

diams Desplace el tubo a traveacutes de la escala hasta que la liacutenea marcada con elnuacutemero 10 quede al nivel del tope de la columna de plasma Vigile que elfondo de la

columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical

diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos

Valores de referencia

Hombres 40 - 50

Mujeres 38 - 44

Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44

Lactantes (3 meses) 37 - 42

Recieacuten nacidos 50 - 58

La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)

64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA

Principio

La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre

641 Materiales y reactivos

6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro

6412 Pipetas

diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla

diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL

6413 Tubos de ensayo

6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten

Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia

columna de eritrocitos continuacutee sobre la liacutenea cero El tubodebe encontrarse completamente en posicioacuten vertical

diams La liacutenea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicaraacute lafraccioacuten de volumen de eacutestos

Valores de referencia

Hombres 40 - 50

Mujeres 38 - 44

Nintildeos (5 antildeos) 38 - 44

Lactantes (3 meses) 37 - 42

Recieacuten nacidos 50 - 58

La disposicioacuten celular esParte superior una columna de plasmaEn la interfase estaacuten los leucocitos yplaquetasParte inferior estaacute la columna deeritrocitos (Fig 15)

64 DOSAJE DE HEMOGLOBINA

Principio

La sangre se diluye en liacutequido de Drabkin el cual hemoliza los hematiacutees yconvierte la hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina)La solucioacuten que se produce se lee por medio de un espectrofotoacutemetro ofotocoloriacutemetro Su grado de absorbancia es proporcional a la cantidad dehemoglobina que contenga la sangre

641 Materiales y reactivos

6411 Un coloriacutemetro fotoeleacutectrico o un espectrofotoacutemetro

6412 Pipetas

diams Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 002 mL contubo de goma y boquilla

diams Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL

6413 Tubos de ensayo

6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten

Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia

6413 Tubos de ensayo

6414 Reactivo de Drabkin para dilucioacuten

Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1litro de agua destilada Si se dispone de una balanza analiacutetica la preparacioacutense puede hacer en el laboratorio Esta solucioacuten se puedeconservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro Deseacutechese sise enturbia