ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA

PRÁCTICA Nº 04Método directo de determinación

de microorganismos mesófilos viables

ASIGNATURA :

Microbiología de los Alimentos I

DOCENTE :

Dra. Graciela Albino Cornejo

ALUMNO :

Rómulo Aycachi Inga

CICLO :

2007 - II

Lambayeque, 07 de febrero de 2008.

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PRÁCTICA Nº 04METODO DIRECTO DE DETERMINACION DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESOFILOS

VIABLES

I. Introducción:

El análisis de los alimentos y piensos para determinar la existencia, tipo y número de microorganismos es básico para la microbiología de alimentos. Sin embargo ninguno de los métodos utilizados habitualmente permite determinar el número exacto de microorganismos que existe en un determinado alimento. Son cuatro los métodos básicos utilizados para investigar el número “total” de microorganismos:

1.- Recuento en placa (SPC) para la determinación del número de células viables (entre las que se encuentran el metodo de la placa vertida, el de superficie y el de goteo).2.- Método del número más probable (MPN) de gérmenes como cálculo estadístico del número de células viables. 3.- Técnicas de reducción de colorantes para el cálculo del número de células viables con capacidad reductora. 4.- Recuento microscópico directo (DMC) tanto para células viables como para las no viables.

El recuento en placa es el método más utilizado para la determinación del número de células viables o unidades formadoras de colonias (u.f.c.) en un alimento. Los recuentos totales deben hacerse en función de uno de los siguientes factores:

- Método de muestreo utilizado - Distribución de los microorganismos en la muestra - Naturaleza de la microflora del alimento - Naturaleza del alimento - Antecedentes del alimento - Adecuación nutricional del medio de cultivo - Temperatura y medio de incubación - ph, aw, potencial de oxido – reducción del medio - Tipo de diluyente utilizado - Número relativo de microorganismos en la muestra

Los recuentos de microorganismos viables se basan en el número de colonias que se desarrollan en placas previamente inoculadas con una cantidad conocida de alimento e incubadas en unas condiciones ambientales determinadas. Estos recuentos no pueden considerarse como recuentos totales ya que solo son susceptibles del contaje aquellos microorganismos capaces de crecer en las condiciones establecidas. Se puede conseguir una amplia gama de condiciones variando la temperatura, la atmósfera, la composición del medio y el tiempo de incubación. El intervalo de temperaturas en el que crecen los microorganismos es muy amplio: de - 34º C a > 90º C. En función de esto se encuadra a los microorganismos en tres grupos:

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a) Los que crecen bien a 7º C o por debajo de esta temperatura cuya temperatura: psicrótofos.

b) Los que crecen entre 20 – 30º C, con una temperatura óptima de crecimiento está entre 30 – 40º C: mesófilos.

c) Los que crecen por encima de los 45º C: termófilos.

En el grupo de los mesófilos aerobios se incluyen todas las bacterias, mohos y levaduras capaces de desarrollarse a 30º C en las condiciones establecidas. En este recuento se estima la microflora total sin especificar tipos de microorganismos. Refleja la calidad sanitaria de un alimento, las condiciones de manipulación, las condiciones higiénicas de la materia prima. Un recuento bajo de aerobios mesófilos no implica o no asegura la ausencia de patógenos o sus toxinas, de la misma manera un recuento elevado no significa presencia de flora patógena. Ahora bien, salvo en alimentos obtenidos por fermentación, no son recomendables recuentos elevados.Un recuento elevado puede significar:

- Excesiva contaminación de la materia prima - Deficiente manipulación durante el proceso de elaboración - La posibilidad de que existan patógenos, pues estos son mesófilos - La inmediata alteración del producto

El recuento de mesófilos nos indica las condiciones de salubridad de algunos alimentos.

II. Objetivos:

- Conocer los métodos para determinar el número de microorganismos viables- Realizar un recuento de bacterias mesófilas viables en los alimentos como un

indicador microbiano de la calidad del alimento.

III. Materiales:

Medio de cultivo Plate Count Diluyente: agua peptonada al 0.1% Placas Tubos de dilución Frasco o matraz Anza calibrada Pipetas

Mechero Bunsen Licuadora Balanza Contador de colonias Espátula de Drigalsky

IV. Procedimiento:

a) Método de profundidad:

- Preparar la muestra de alimento traida según su tipo, si es líquido hay que homogenizar, si es sólido hay que licuar o triturar la mezcal por trituración en un vaso esterilizado de licuadora a una velocidad aproximada de 14.000 rpm y en un tiempo medio de 60-90 segundos.

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- Luego preparamos las diluciones correspondientes, generalmente hacemos 6 diluciones (de 10-1 a 10-6).

- Luego de hacer las diluciones, y de haber agregado los inóculos, pasamos a agregar a cada placa el agar Plate Cound, este debe estar a 45 – 46 ºC (10 a 15 mL por placa).

- Luego hacemos la mezcla (agar + inóculo).- La mezcla se realiza de la sgte. Manera: hacer rotaciones 5 veces sentido horario, 5

veces de abajo arriba, 5 veces antihorario y 5 veces derecha e izquierda.- Luego esperamos que solidifique el medio y luego incubamos a 29 – 31 ºC por 24h

(dejamos una placa control).- Realizamos las lecturas a las 24 y 48 h.- Se puede realizar un computo de recuento estandar en placa o computo estimado de

recuento estandar en placa.- Hay que elegir placas que tengan de 30 a 300 colonias.- Para contar usamos el contador de colonias.

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10-5

10-410-310-210-1

10 g de muestra + 90 mL de diluyente AP AL 0.1%

10-6

Pasamos

9 mL. DAP

9 mL. DAP

9 mL. DAP

9 mL. DAP

9 mL. DAP

1mL

1mL 1mL 1mL 1mL 1mL

b) Método de superficie:

- Se usa el mismo número de placas pero con agar (Plate Count) servido y controlado.- También se usa dos placas por dilución- El inóculo de la solución va a ser 0.1 mL en la superficie de la placa y luego se la

expande usando la espátula de Drigalsky.

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10-5

10-410-310-210-1

10 g de muestra + 90 mL de diluyente AP AL 0.1%

10-6

Pasamos

9 mL. DAP

9 mL. DAP

9 mL. DAP

9 mL. DAP

9 mL. DAP

0.1mL 0.1mL 0.1mL 0.1mL 0.1mL 0.1mL

Primero agregamos a las placas el agar PC y esperar a que solidifique

Luego agregamos el inóculo y lo esparcimos

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6

c) Método por goteo:

- Se puede emplear una placa por dilución y se lo divide entre dos.- En cada lado se colocan gotas de la dilución correspondiente a unos 5 cm uno de

otro (0.02 mL de gota).

V. Resultados:

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- Se realizó el conteo de las diferentes placas a las 24 y 48 horas:

MÉTODOCONTEO x TIEMPO

24 H 48 H

Promedio PromedioEn Profundidad

10-1 Incontables Incontables

10-2 A 460420

776736

10-2 B 380 696

10-3 A 400401

416490

10-3 B 402 564

Por Goteo

10-2 A Incontables---

Incontables---

10-2 B Incontables Incontables

10-3 A Incontables---

Incontables---

10-3 B Incontables Incontables

Por superficie10-1 Incontables --- Incontables ---10-2 Incontables --- Incontables ---10-3 72 --- Incontables ---

- De los resultados obtenidos se interpretó de la sgte. manera: Para el método de conteo por profundidad:

Como se puede observar en el cuadro solo se pudo realizar el conteo en las diluciones 10-2 y 10-3, de las diluciones se sacó el promedio por horas.

En la dilución 10-2 se obtuvo (en promedio) a las 24 h. 420 colonias y a las 48h. 736 colonias.

En la dilución 10-3 se obtuvo (en promedio) a las 24 h. 401 colonias y a las 48 h. 490 colonias.

Para que los resultados de las diluciones estén bien la dilución menor debe contener a la mayor en 2 veces, así que dividimos:

A las 24 h. A las 48 h.10-2 → 420 = 1.1 10-2 → 736 = 1.510-3 → 401 10-3 → 490

En la división de los resultados a las 48 h. el resultado es igual a 1.5, o sea, redondeando, 2 (es decir que lo contiene exactamente), por lo tanto tomamos el valor de la menor dilución (10-3): 490 y con este resultado realizamos los cálculos.

Ufc/gr de muestra

=Nº de

coloniasx

Factor de dilución

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Ufc/gr de muestra

= 490 x 103 = 49 x 104 ufc/gr

Entonces el recuento de bacterias aerobias mesófilas viables es igual a 49 x 104 ufc/gr en la muestra de ceviche procedente de el Restaurante “El Muelle”.

Para el método de conteo por Goteo.

En las dos diluciones no se pudo llegar a contar el número de colonias que crecieron en el medio, por lo tanto no se pudo realizar los cálculos

Para el método de Superficie: Igual que en el método anterior, no se obtuvo ningún resultado,

ya que no pudo llegar a el número de colonias que crecieron en el medio.

Profundidad 10 -1 (48 h) 10 -2 A (48 h) 10 -2 B (48 h) 10 -3 A (48 h) 10 -3 B (48 h)

Superficie 10 -1 (48 h) 10 -2 (48 h) 10 -3 (48 h)

Goteo 10 -2 (48 h) Goteo 10 -3 (48 h)

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VI. Cuestionario:

- ¿Qué otras sustancias se utilizan como diluyentes para realizar los análisis microbiológicos en alimentos?- Además del Agua de Peptona Tamponada (BPW), es muy común el uso del

Diluyente Agua de Triptona (Tryptone Water: TW) y la Solución Tinger ¼, cuyas composiciones son las sgtes.:

Tryptone Water Solución Tánger ¼ BPWTriptona 10 g Cloruro sódico 9 g Peptona 10 g

Cloruro de sodio 5 gCloruro cálcico anhidro

0.42 g Cloruro sódico 5 g

Agua destilada 1 000 mLHidrógeno carbonato sódico

0.20 g Fosfato sódico 9 g

Agua destilada 1 000 mL Fosfato potásico 1.5 gAgua destilada 1 000 mL

- También se podría usar el Solución Salina Fisiológica (SSF) como diluyente, esta solo contiene 0.900 g de cloruro de sodio para 100 mL de agua destilada.

- ¿Cuáles son las ventajas y desventajas de los tres métodos usados?

- Entre las ventajas que tenemos por estos métodos es que se hace un recuento “total” que incluye todas las bacterias, mohos y levaduras capaces de desarrollarse a 30 ºC en las condiciones establecidas, además refleja la calidad sanitaria de un alimento, las condiciones de manipulación y las condiciones higiénicas de la materia prima.

- Entre las desventajas tenemos que estos recuentos no pueden considerarse como “totales” ya que solo son susceptibles del contaje aquellos microorganismos capaces de crecer en las condiciones establecidas, además se estima la microflora total sin especificar los tipos de microorganismos y por último, si tener un recuento bajo de aerobios mesófilos eso no nos asegura la ausencia de patógenos o sus toxinas; de la misma manera que un recuento elevado no significa presencia de flora patógena.

- ¿Cuál es la composición del medio de cultivo usado?- El Agar Plate Count (PCA) tiene la sgte. composición:

Plate Count Agar (PCA)Triptona 5 g

Extracto de levadura 2.50 gDextrosa 1 g

Agar 2 gAgua destilada 1 000 mL

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- ¿Por cuánto tiempo y a cuántas revoluciones por minuto se debe tratar una muestra sólida para ser homogenizada?- Para tratar una muestra sólida hay que licuarla o triturarla en un vaso esterilizado

de licuadora a una velocidad aproximada de 14.000 rpm y en un tiempo medio de 60-90 segundos.

VI. Referencias:

- Análisis de microorganismos mesófilos aerobios (2003) obtendido el 01 de febrero de 2008 en http://www.analizacalidad.com/arm2004-4.pdf

- JEFE DE LABORATORIO (1998) Instructivo de análisis: Recuento Aerobios Mesófilos. Obtenido el 01 de febrero de 2008 en http://www.geocities.com/seguridad_alimentaria/meofilos.rtf

- L. ORTIZ, M. (2003) Material didactico de Microbiologia de Alimentos: Recuento de microorganismos aerobios mesófilos. Obtenido el 01 de febrero de 2008 en http://www2.uah.es/farmacia/programas/microbiologia/material_didactico_de_microlimentos.htm

- THATCHER, F. S. y D. S., CLARK (1993) Análisis Microbiológico de los Alimentos. Edit. Acribia. Zaragoza.

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