LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA P r c t i c a 7 Infecciones de vas respiratorias altas PRACTICA 7 Infeccin de vas respiratorias altas Sr. Franklin Espinosa M.7.1. INTRODUCCION Y EPIDEMIOLOGA 7.2. FLORA NORMAL DE LAS VAS RESPIRATORIAS 7.3. AGENTES PRODUCTORES DE ENFERMEDAD 7.3.2. ESTREPTOCOCOS 7.3.3. HAEMOPHILUS INFLUENZAE 7.3.5. ADENOVIRUS 7.3.6. INFLUENZA 7.3.7 RINOVIRUS 7.4 INFECCIONES DE LAS VIAS RESPIRATORIAS SUPERIORES 7.4.1 RESFRIADO COMN 7.4.2 FARINGITIS AGUDA Y AMIGDALITIS

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7.5 CULTIVOS DE IDENTIFICACION DE ESTREPTOCOCOS. 7.6 PROTEINA C REACTIVA (PCR) PRACTICA 7.7 RAPID STREP TEST O PRUEBA RPIDA DE DETECCIN DE ANTGENOS. 7.8 PCR CONVENCIONAL ESPECFICO PARA INFLUENZA TIPO A Y RTPCR EN TIEMPO REAL.

INTRODUCCIN Y EPIDEMIOLOGALas enfermedades respiratorias se han convertido en un problema de salud pblica en el Ecuador, al menos un 39% de las consultas son infecciones respiratorias agudas, y segn datos estadsticos de la OMS es la primera causa de muerte en la poblacin peditrica y una de las 10 primeras causas de muerte en la poblacin adulta, por esto el Ministerio de Salud Pblica, las ha propuesto como enfermedades de notificacin obligatoria. Los factores de riesgo, que permiten una infeccin de dicho tracto, como por ejemplo, asistencia a guarderas, hacinamiento, convivencia con enfermos de tuberculosis, los extremos de edad (infancia y tercera edad) aumentan en 8 veces el riesgo de desarrollar infecciones respiratorias graves como la neumona neumoccica. En el grupo de la infancia hay que tomar en cuenta que las infecciones respiratorias pueden ser virales, bacterianas, mixtas (bacterias-virus). El riesgo aumenta ms aun cuando el paciente peditrico no cuenta con la vacuna contra el neumococo asimismo con el paciente anciano. Los pacientes inmunodeprimidos, tienen una especial predisposicin para desarrollar infecciones respiratorias y sistmicas graves que pueden llevarlo a la muerte, como es el caso de las enfermedades fngicas, condicin para la cual, este grupo de riesgo presenta 100 veces ms posibilidades de evolucionar a un cuadro agudo y 1 mortal en la mayora de los casos . Las semanas epidemiolgicas que han permitido conocer las fluctuaciones de las infecciones respiratorias, notndose que los meses de invierno y los meses en la que los nios y nias se encuentran en vacaciones stas enfermedades tienen un pico ms elevado, en especial, las virales como lo fue la influenza AH1N1, 2 demostrado en un estudio realizado por el Dr. David Larretegui, Docente de nuestro laboratorio . As es como las enfermedades respiratorias han sido capaces de colapsar el sistema de salud, y sobretodo han llenado las camas de nuestros hospitales, ya que este grupo de sndromes representan al menos el 3 27,3% de las causas de hospitalizacin y de este porcentaje al menos el 1,6% desarrollan un enfermedad pulmonar nosocomial, y lo lamentable, mantienen niveles altos de morbilidad y mortalidad como fue 4 expuesto al inicio de ste acpite .

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FLORA MICROBIANA El trmino flora microbiana normal se define en la poblacin de microorganismos que habitan la mucosa de 6 las vas respiratorias superiores de las personas sanas . La flora microbiana de la nariz consta principalmente de corinebacterias, estafilococos y estreptococos. La mucosa de la boca y faringe del recin nacido casi siempre es estril al nacimiento, 12 horas despus el Streptococo viridans coloniza de forma predominante y se establece como miembro ms notable de la flora residente, probablemente al paso por el canal de parto. En las primeras horas de vida tambin se adquiere estafilococos aerobios y anaerobios, diplococos gramnegativos, difteroides y en ocasiones lactobacilos. Cuando comienza la erupcin de los dientes se establecen espiroquetas anaerobias. Especies Actinomyces se encuentran normalmente en el tejido 5 amigdalino y en las encas de los adultos . En la faringe y trquea se encuentra flora microbiana muy similar, sin embargo en los bronquios normales hay muy pocas bacterias, los bronquios de pequeo calibre y los alveolos son estriles. Los microorganismos predominantes en las vas respiratorias superiores, principalmente en la faringe, son estreptococos no hemolticos, -hemolticos, neisserias (excepto Neisseria gonorrhoeae siempre es patgeno), estafilococos, difteroides, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis, neumococos, micoplasma, prevotellas, adems de laveduras como Candida albicans, virus como el adenovirus y, virus del herpes simple. Las infecciones de 5 la boca y vas respiratorias casi siempre son producidas por grmenes anaerobios . AGENTES PRODUCTORES DE ENFERMEDAD GNERO STREPTOCOCCUS Los Streptococcus son cocos grampositivos, aerobios facultativos, catalasa negativos que se disponen formando cadenas. Forman parte de la flora normal del ser humano, principalmente del tracto respiratorio. Poseen en su pared celular distintos tipos de polisacridos especficos que permiten su clasificacin en grupos serolgicos(A, B, C, D, etc.) denominados grupos de Lancefield (en honor a Rebeca Lancefield). De modo que las especies que poseen los antgenos polisacridos especficos en la pared se designan segn el 5 grupo serolgico al cual pertenecen . (Ver cuadro 1) En los medios de cultivo que tienen sangre la mayora de los estreptococos tienen la capacidad de causar hemlisis o destruccin de clulas rojas in vitro de diferentes grados, por ejemplo se conoce como hemlisis a la disrupcin completa de eritrocitos con aclaramiento de la sangre alrededor de las bacterias en crecimiento y se conoce como - hemlisis a la destruccin parcial de los hemates en el medio de cultivo y genera un halo de color verdoso alrededor de la colonia. El tipo de hemlisis en medios de agar sangre permite clasificar a los estreptococos en -hemolticos (producen hemlisis total), - hemolticos (producen 4 hemlisis parcial) y no hemolticos (estreptococos que no producen hemlisis) . (Ver cuadro 2) Cuadro 1. Clasificacin y caractersticas importantes de los estreptococosNombre Grupo Lancefield Hemlisis HbitatGarganta, piel Aparato genital Colon Colon Garganta aparato femenino al colon, genital

Enfermedad comnFaringitis, imptigo fiebre reumtica Sepsis, neonatal meningitis

Streptococcus pyogenes Streptococcus agalactiae Enterococcus Streptococcus bovis Streptococcus anginosus Streptococcus viridans Streptococcus pneumoniae

Aramnosa-N-acetil-glucosamina

, no No , , no , no

BRamnosa-glucosamina

Dglicerol de cido teicoico

Abscesos abdominales Endocarditis en cncer de colon Infecciones pigenas

Dglicerol de cido teicoico

Fglucopiranosil-Nacetilgalactosamina

No tipificable Ninguno

Boca, garganta, genital femenino

Garganta

Caries dental (S. mutans), endocarditis, abscesos Neumona, meningitis, endocarditis

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA P r c t i c a 7 Infecciones de vas respiratorias altasCuadro 2. Descripcin de los tipos de hemlisis Tipo de hemlisis Alfa () DescripcinHemlisis incompleta en agar sangre, presenta un halo verdoso alrededor, debido a la lisis incompleta de eritrocitos y por la generacin de biliverdina a partir de hemoglobina

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Ejemplo

Beta ()

Hemlisis completa en agar sangre, producen un halo transparente por accin total de las estreptolisinas O y/o S

Gamma ()

No hay accin de estreptolisinas, por lo tanto, no producen halo de hemolisis alguno

PATOGENIA Los estreptococos, expresan una serie de enzimas, toxinas, factores de adherencia que les permite realizar su accin patgena en el ser humano, es de particular importancia su conocimiento debido a que muchos de estos factores llevan a un dao tisular grave y hasta la muerte del paciente. ESTRUCTURA ANTIGNICA: Protena M.- es un factor importante para la virulencia del S. pyogenes del grupo A. La protena M tiene la apariencia de prolongaciones semejantes a pelos de la pared celular del estreptococo. Cuando la protena M est presente los estreptococos son virulentos y la ausencia de anticuerpos especficos 4 tipo M pueden resistir la fagocitosis efectuada por los leucocitos polimorfonucleares . Sustancia T.- este antgeno no tiene interrelacin con la virulencia de los estreptococos. Esta sustancia permite diferenciar ciertos tipos de estreptococos por aglutinacin antisueros especficos, en otras 4 especies, esta sustancia toma el nombre de protena T . Nucleoprotenas.- La extraccin de estreptococos con un lcali deben produce mezclas de protenas y otras sustancias con escasa especificidad serolgica llamadas: sustancias P, las cuales suelen 4 enmascarar la composicin de la pared de estas bacterias (variacin antignica) TOXINAS Y ENZIMAS: Estreptocinasa (fibrinolisina).- Esta sustancia transforma el plasmingeno del plasma humano en 4 plasmina, una enzima proteoltica activa que digiere la fibrina y otras proteinas . 4 Estreptodornasa.- La estreptodornasa despolimeriza el ADN Hialuronidasa.- desdobla el cido hialurnico en un componente importante de la sustancia 4 fundamental del tejido conectivo . Exotoxinas pirgenas.- Existen tres exotoxinas pirgenas: A, B y C, antgenamente distintas, se han 4 asociado con sndrome de choque txico estreptoccico y con fiebre escarlatina . Difosfopiridinanucleotidasa.- Esta enzima est relacionada con la capacidad de los organismos para 4 matar leucocitos .

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Hemolisinas.- lo estreptococos beta hemolticos del grupo A, elabora dos tipos de hemolisinas, estreptolisina O y estreptolisina S. La estreptolisina O, acta en medios reducidos y pierde actividad en medios ricos en oxgeno, es responsable de algunos tipos de hemlisis que se ven en agar sangre, y es el fundamento de la prueba de ASTO (anticuerpos anti-estreptolisina O). La estreptolisina S, es responsable del halo hemoltico que se presentan en agar sangre, y se elabora en presencia de suero, 4 y a diferencia de la estreptolisina O, no estimula la produccin de anticuerpos

STREPTOCOCCUS PYOGENES S. pyogenes es un estreptococo -hemoltico perteneciente al grupo A de la clasificacin de Lancefield. Forma parte de la flora normal del hombre, coloniza un 15 20% de la poblacin, principalmente el aparato respiratorio de nios y adolescentes. La infeccin se produce por transmisin de persona a persona a travs 5 de secreciones respiratorias . Las infecciones ms frecuentes son: Infecciones respiratorias (faringitis, amigdalitis, sinusitis u otitis), infecciones de la piel (imptigo, erisipela, escarlinata), puede producir infecciones pigenas en pacientes inmunocompetentes. Las complicaciones producto de la infeccin de S. pyogenes pueden dar lugar a cuadros clnicos graves como la fiebre reumtica y la glomerulonefritis aguda, que pueden aparecer 5 semanas despus de una infeccin farngea o cutnea respectivamente . Fiebre reumtica: Es la secuela ms grave de infeccin por S. pyogenes, se presenta frecuentemente en 4 nios de 5 a 15 aos, de 2 a 4 semanas despus de atravesar una infeccin farngea . Daa el miocardio y las vlvulas cardiacas ya que ciertas cepas de estreptococos del grupo A contienen antgenos de la membrana que muestran reaccin cruzada con antgenos del tejido cardiaco humano. Las manifestaciones clnicas son 5 fiebre, poliartritis, afeccin cardiaca, ndulos subcutneos, eritema y corea . Glomerulonefritis aguda: Al igual que la fiebre reumtica es una complicacin posterior a la infeccin por S. pyogenes, la diferencia radica en que la glomerulonefritis se presenta posterior a una infeccin cutnea, afectando al glomrulo renal, que pierde su permeabilidad selectiva y se manifiesta por la aparicin de 5 edemas, hipertensin, hematuria y proteinuria . STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE S. pneumoniae o neumococo es un estreptococo - hemoltico, a la tincin gran aparecen como diplococos grampositivos alargados y que presentan una cpsula de polisacrido que permite tipificarlos con antisueros especficos. Habitan las vas respiratorias superiores en el 5-40% de individuos sanos y pueden causar 5 neumona, otitis, bronquitis, bacteriemia, meningitis y otros procesos infecciosos . Los neumococos producen enfermedad por su capacidad para multiplicarse en los tejidos. No producen toxinas significativas sin embargo la virulencia del germen depende de la funcin de la cpsula que evita o retarda la ingestin por las clulas fagocitarias. Un suero con anticuerpos contra el polisacrido de tipo especfico protege contra la infeccin. La inmunidad a la infeccin por neumococos es de tipo especfico y depende de los anticuerpos al polisacrido capsular y de la integridad de la funcin fagocitaria. Las vacunas 5 pueden inducir produccin de anticuerpos a los polisacridos capsulares . HAEMOPHILUS INFLUENZAE Es una bacteria que presenta morfologa variable. Se caracteriza por ser gramnegativa, inmvil, aerobia facultativa, oxidasa y catalasa positiva. Es una bacteria nutricionalmente exigente, requiere que el medio de cultivo contenga factores especiales de crecimiento. Los factores que requiere para crecer son hemina 5 (factor X) y nicotinamida adenindinucletido o NAD (factor V). Las cepas ms patgenas son encapsuladas . H. influenzae forma parte de la flora normal de las vas respiratorias superiores y tambin puede colonizar la mucosa del tracto genital. La transmisin ocurre de persona a persona a travs de secreciones respiratorias, por inhalacin de gotculas producidas al toser y por contacto directo con las secreciones. H. influenzae, es un patgeno sobre todo para nios entre 3 meses y 5 aos de edad, sin embargo tambin puede causar 5 infecciones en ancianos o pacientes con patologa subyacente .

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ADENOVIRUS Son virus ADN, se conocen 41 serotipos implicados con gran variedad de cuadros clnicos, entre los que destacan infecciones de vas respiratorias, conjuntivitis y diarreas. Las infecciones por adenovirus se 5 caracterizan por tener una evolucin benigna . INFLUENZA YORTOMYXOVIRUS. Los ortomixovirus, se denominan as debido a la entidad clnica producto de la infeccin por virus de la gripe (influenza). El virus de la gripe es un virus ARN envuelto, entre cuyas estructuras cabe destacar la protena NP de la nucleocpside y la protena M de la membrana, con la que se diferencias los tipos, y la 5 hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA) con las que se diferencian los subtipos de gripe A . La gripe clnicamente se suele manifestar con fiebre, malestar general, cefaleas y dolores musculares generalizados, junto con la presencia de tos seca. El periodo de incubacin es de 1 4 das y el proceso suele durar entre 4 y 7 das. El contagio se produce por el contacto de las secreciones respiratorias de las personas enfermas, ocasionalmente pueden aparecer complicaciones como neumonas bacterianas por 5 sobreinfeccin con Streptococcus pneumoniae, Staphilococcus aureus o Haemophilus influenzae . RINOVIRUS Los rinovirus son los virus del catarro comn. Son agentes recuperados ms comnmente en personas con enfermedad respiratoria superior leve. Generalmente se las puede aislar en secreciones nasales, pero tambin se las puede conseguir de secreciones bucales o farngeas. Este es uno de los agentes principales de 5 las infecciones de vas respiratorias superiores, incluso el sndrome del catarro comn . INFECCIONES DE LAS VIAS RESPIRATORIAS SUPERIORES RESFRIADO COMN El resfriado comn se constituye de varias infecciones de las vas respiratorias superiores, provocados por varios agentes etiolgicos, su gran mayora constituidos por virus pertenecientes a varias familias, predominando en los adultos el rinovirus. Clnicamente se presenta con obstruccin y secrecin nasal, dolor de garganta severo, sin adenopatas, tos y malestar generalmente sin fiebre. Es un cuadro autolimitado de 7 das de duracin. La infeccin puede complicarse en los nios produciendo otitis media, sinusitis. El tratamiento va orientado a la sintomatologa, el uso de antibiticos solo est indicado ante la presencia de 5. una sobreinfeccin bacteriana FARINGITIS La faringitis es un proceso inflamatorio caracterizado por dolor farngeo, en ocasiones disfagia, enrojecimiento y presencia de exudado en las paredes de la faringe y amgdalas, que pueden cursar con fiebre. La etiologa es diversa, tanto vrica como bacteriana, siendo Mycoplasma pneumoniae y S. pyogenes las bacterias ms comunes. Los sntomas clnicos no permiten distinguir la etiologa. Las formas purulentas pueden ser producidas por bacterias o por virus. Los grmenes ms comunes causantes de 5 faringoamigdalitis son S.pyogenes y el virus de Eipsten Baar . El diagnstico etiolgico para confirmar o excluir la infeccin por Estreptococo del grupo A se hace a partir del exudado farngeo por medio de cultivo o pruebas de deteccin rpida del antgeno estreptoccico. Su aislamiento justifica la administracin de tratamiento antimicrobiano para acortar la duracin del cuadro clnico y evitar las secuelas de la fiebre reumtica. La muestra del cultivo se toma frotndola faringe y las amgdalas con un escobilln procurando no contaminarlo con saliva. El escobilln se introducir en un tubo con medio de transporte y se enviar rpidamente al laboratorio. El tratamiento de eleccin de la faringitis estreptoccica sigue siendo la penicilina.

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DIAGNSTICO DE LABORATORIO Estos mtodos nos permiten identificar ciertas caractersticas morfolgicas, antignicas y de susceptibilidad que en los estreptococos se presentan, estas se resumen en el cuadro 3: Cuadro 3. Mtodos de Diagnstico, Estreptococos Mtodo de diagnsticoTincin Gram

DescripcinPermite identificar la morfologa celular que en este caso son cocos, y su distribucin caracterstica en forma de cadenas

Ejemplo

Cultivos

Se utiliza agar sangre de cordero, donde se presentan como colonias pequeas, translcidas o blanquecinas, lisas brillantes, de bordes completos, con halo de hemlisis completa y un punto negro central

Catalasa

Una reaccin negativa, aumenta la posibilidad de ser un estreptococo, descartando as estafilococos

Prueba de Bacitracina (Disco Taxo A)

sta prueba ayuda a identifiar estreptococos, por el principio de que la mayora de estas bacterias son sensibles a bacitracina, y por ende en agar sangre veremos un halo de inhibicin alrededor del disco con el antibitico (Disco A, en la imagen)

Test de CAMP (Christie, Atkins, Munch-Peterson Test)

En agar sangre hacemos dos inculos en forma de T, en la horizontal de la T inocularemos Stafilococcus, y en la vertical Streptococcus pyogenes, si se forma una flecha de beta hemlisis confimamos el diagnstico de Estreptococo beta hemoltico del grupo A, es decir, el Test de CAMP es positivo

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA P r c t i c a 7 Infecciones de vas respiratorias altasMtodo de diagnstico DescripcinSe toman cultivos puros y se hace una suspensin en 50 uL de solucin salina y se les agrega discos con reactivo pirrolidonil-beta-naftilamida, si el disco se tie de rojo-rosa es positivo si es blanco es negativo, ayuda a identificar S.pyogenes y Enterococcus

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Prueba PYR (Hidrlisis de L-pirrolidonil-2naftilamida)

Reaccin de Quellung

Se agregan anticuerpos contra polisacridos de cpsula de Neumococos o antisuero polivalente en un portaobjetos, observaremos una edematizacin de las cpsulas.

Solubilidad en bilis-esculina.

Algunos microorganismos se lisan en presencia de bilis. Se inocula un caldo nutritivo sin glucosa y con pH alrededor de 7 con el microorganismo durante 24 h y se le aade a la solucin de bilis al 10% (generalmente desoxicolato de sodio). Se incuba a 35-37C y si antes de 3 h se produce un aclaramiento en el contenido del tubo se identifica Streptococcus pneumoniae.

Prueba de Susceptibilidad a Optoquina

Tiene el mismo fundamento que la prueba de bacitracina, aqu veremos la inhibicin por parte de Streptococcus pneumoniae a la optoquina (Disco P, en la imagen)

PRUEBA DE DIAGNSTICO INDIRECTAS (SEROLGICO) ANTIESTREPTOLISINA O (ASTO) Mtodo de semicuantificacin que mide la respuesta de anticuerpos generados por la presencia de la estreptolisina del Streptococcus pyogenes Materiales Centrfuga de 2.500 r.p.m. Mezclador, Jeringuillas de 5 ml. Tubo tapa roja de 10 ml de capacidad Tubo pequeo de 5 ml de capacidad Lminas oscuras con celdillas de 18 mm de dimetro Pipetas automticas graduables Puntas amarillas, Torundas, Torniquete Palillos, Separadores de suero Timer Reactivo de ASTO Controles de sueros humanos estabilizados (positivo negativo)

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Procedimiento cualitativo Utilizando una pipeta, se dispensa una gota de suero del paciente (0,05 ml) en un anillo de la lmina, se utiliza suero sin diluir no plasma. Mezclar y homogenizar el reactivo de ASTO y agregar una gota junto al suero Mezclar con un palillo las dos gotas y extenderlas en toda la superficie del crculo Hacer rotar la lmina en forma de 8 horizontal o ponerla sobre el rotor durante 2 minutos Observar si se producen grumos o partculas grandes o gruesas; si no existen las partculas quiere decir que no hay aglutinacin. Resultado Si existe aglutinacin Si no existe aglutinacin El resultado es expresado en Unidades TOOD (UT) INTERPRETACIN Adultos Nios menores de 2 aos Nios entre 2 y 4 aos Nios entre 4 y 12 aos Fiebre Reumtica Fiebre reumtica con complicacin Fiebre reumtica inactiva

PRUEBA POSITIVA PRUEBA NEGATIVA