TEST LALLIMULUS AMEBOCYTE LYSATE

Extracto de las células

sanguíneas del cangrejo

herradura que forma un

coágulo en presencia de endotoxinas

INTRODUCCIÓN Lisado de Amebocitos de Limulus

LAL

Las preparaciones de uso parenteral deben elaborarse por procedimientos que eviten la presencia de pirógenos.

La presencia de éstos en un preparado parenteral puede desencadenar reacciones febriles, acompañadas de escalofríos, aceleración del pulso, disnea, cefaleas y mialgias hasta shock séptico.

1876 Burdon-Sanderson utilizó por primera vez el término “pirógeno” para designar toda sustancia productora de fiebre. Noventa años después Seibert estableció la relación entre la fiebre y las sustancias de orígen bacteriano.

INTRODUCCION

En los últimos años, los principales organismos reguladores de productos farmacéuticos (Farmacopeas) exigen cada vez más en sus monografías la aplicación del método LAL para la determinación de pirógenos en productos parenterales terminados.

El análisis de pirógenos constituye uno de los principales ensayos en el Control de Calidad de la fabricación de inyectables por su repercusión en la salud humana, puesto que la presencia y administración de los mismos, es capaz de provocar una serie de respuestas fisiológicas, en su mayoría de carácter perjudicial y en casos extremos, la muerte del paciente.

INTRODUCCION

Son termoestables y resisten la esterilización en autoclave, pasan a través de la mayoría de los filtros de profundidad.

Actúan a dosis muy bajas, del orden del microgramo. Son solubles en agua e insolubles en solventes orgánicos. Estables alrededor de largos periodos de tiempo.

En el ser humano el tiempo de latencia luego de inyectar una solución con pirógenos es de (+/- 15 min) antes de que aparezca un pico febril, en el conejo el tiempo de latencia es más corto, pudiendo aparecer 2 o más picos febriles.

INTRODUCCION

LAL (Lisado de Amebocitos de Limulus)

Limulus poliphemus

• Método LAL, es un método in vitro que detecta con alta sensibilidad la presencia de endotoxinas bacterianas.

• Reactivo LAL, es el extracto acuoso de amebocitos extraidos de la sangre del cangrejo de herradura

LAL (Lisado de Amebocitos de Limulus)

El cangrejo de herradura presenta en su hemolinfa azul unas células únicas llamadas amebocitos que contienen los elementos responsables de la coagulación inducida por endotoxinas que son de naturaleza enzimática.

Palabras claves: Pirógeno ….. es cualquier agente productor de

fiebre. Son sustancias que actúan sobre los centros termorreguladores del hipotálamo produciendo un aumento de temperatura (fiebre). Por lo general son moléculas de alto peso molecular y de naturaleza polímera.

Endotoxina… es un componente de la pared celular de las bacterias Gram negativas constituida por lípidos y polisacáridos (LPS).

DEFINICIONES

Otra palabra clave es: Lipopolisacáridos (LPS)… son polímeros

complejos con restos de ácidos grasos como parte lipófila y cadenas características de oligosacáridos y polisacáridos, que forman la mayor parte de la capa externa de la membrana externa de bacterias Gram negativas.

Qué reacción existe entre el reactivo LAL y los

LPS?

DEFINICIONES

Reacción en cascada del LAL frente a las Endotoxinas (LPS)

Precauciones para evitar pirógenos

Durante la preparación de inyectables, los pirógenos pueden ser incorporados a la formulación por el disolvente (generalmente agua que es el foco de orígen más común de endotoxinas bacterianas), por las sustancias disueltas (activo y auxiliares de formulación) y por el material.

Para evitar la incorporación de pirógenos a través del agua es aconsejable:

-Utilizar agua no pirogénica desde el inicio del proceso de elaboración de productos estériles (agua que contiene menos o igual que 0.5 EU/mL)

-No almacenar agua innecesariamente

-Evitar en el diseño de canalizaciones y depósitos los puntos en que puedan producirse estancamientos

-Limpiar regular y rigurosamente todas las canalizaciones con soluciones antisépticas o vapor sobrecalentado

Resulta más sencillo conseguir productos químicos de síntesis libres de pirógenos, pero resulta más difícil en el caso de químicos producidos por fermentación (dextrosa, fructuosa,aminoácidos, algunos antibióticos), se recomienda que sean elaborados como libres de pirógenos si no resisten altas Tº.

Si en la etiqueta de un producto estéril declara como libre de pirógenos o no pirogénico significa que el producto ha sido evaluado y encontrado que contiene menos o igual que 0.5 EU/mL.

En este tipo de poductos el riesgo de una reacción pirogénica está basada en la dosis a ser administrada y la velocidad de administración por hora.

Si la cantidad de endotoxinas del producto excede el límite de 5 EU/Kg/hr, el producto o el lote debe ser rechazado.

En 1984 los límites de endotoxínas bácte-rianas fueron asignados a cinco productos de agua USP:

agua para inyección agua estéril para inyección y agua estéril para irrigación agua bacteriostática para inyección agua estéril para inhalación

Existen productos que no tienen que estar libres de pirógenos , solo ser no pirogénicos, pueden contener un nivel de pirógenos por debajo de 5 EU/ Kg/hr que al ser inyectado a un paciente no causa una reacción pirogénica.

Existen 3 que son los mas conocidos: Método de coagulación ó Gel-clot, es el mas utilizado y

sencillo, establecido por la USP y la EP. También el menos costosos.

Métodos turbidimétricos, se fundamentan por el aumento de la turbidez en la mezcla de reacción provocado por el incremento de la concentración de coagulina insoluble, la cual se monitorea espectrofotométricamente.

Métodos cromogénicos, se fundamentan en el empleo de un sustrato cromogénico sintético incoloro que desarrolla un color amarillo en presencia de endotoxinas.

Metodos LAL

• Medicamentos parenterales• Dispositivos médicos• Productos biológicos• Medios de cultivo para células• Soluciones de hemodiálisis• Agua ultra pura para la industria• Endotoxinas ambientales y transportadas

por el aire

CUALES SON LAS APLICACIONES DEL LAL?

Líquidos Polvos (solubles en agua, estables

después de la rehidratación) Dispositivos médicos (cortar ó desarmar,

extraer, enjuagar a presion, tiempo de exposicion, temperatura, volumen de extracto o enjuague se obtienen de la FDA)

Tipo de materiales que se pueden analizar

• Seguir una técnica aséptica (mantener la esterilidad de objetos estériles)

• Mantener los recipientes cerrados• Transferir materiales estériles a recipientes

estériles• Proteger los recipientes abiertos del polvo sin tocar• Colocar barreras físicas• Utilizar materiales de uso exclusivo para la Prueba

LAL (despirogenizados con calor seco)• No mover los tubos de reacción mientras se lleva a

cabo la reacción.

Como se manipulan las muestras?

Los recipientes y aparatos de transferencia deben:

Estar libres de niveles detectables de endotoxinas

No adsorventes Sin “extractables que causen interferencia”

Que tipo de material debería utilizarse?

Que es?Es el proceso controlado por tiempo y temperatura por el cual se destruye o eliminan por incineración pirógenos, en particular endotoxinas bacterianas Gram-negativas (pirógeno mas significativo)

El ciclo de despirogenización estándar es de no menos de 250 ºC por 30 minutos ó 3 horas a no menos de 180 ºC

Se han descrito otros ciclos en cuanto a tiempo y temperatura pero se demostraron que por debajo de 180 ºC la despirogenización puede ser incompleta incluso después de largos períodos.

DESPIROGENIZACION

Cuales son los factores mas importantes?

Los factores mas importantes son la temperatura y el tiempo del proceso.

Deben ser seleccionados con mucho cuidado en funcion al tipo de estufa.

Se puede agregar un factor de seguridad ya sea al tiempo o a la temperatura

VALIDACION DE PROCESOS DE DESPIROGENIZACION (por calor seco)

Se requieren dos fases:

1. Establecer características físicas del calentamiento del horno e identificar los puntos fríos. (Config. común sondas en forma de X).

2. Después del ciclo propuesto debe ser puesto a prueba con endotoxinas

VALIDACION DE PROCESOS DE DESPIROGENIZACION (por calor seco)

Método Gel-clot…………….

1.- Confirmación de la Etiquetaλ Sensibilidad del reactivo LALλ = 0.125 EU mlCurva de calibración que se hace

diariamente:

2λ λ 1/2λ 1/4λ Control Neg.

Método Gel-Clot……………..

0.25 0.125 0.06 0.03 C Neg

+ + - -

La sensibilidad se elige de acuerdo al producto o sobre la base de los requerimientos

Concentraciones de Estandar (EU/ml)

• El punto final confirma la sensibilidad de la etiqueta• El error del ensayo es +/- un tubo de dilución

Se ha establecido que el limite pirogénico para seres humanos es aproximadamente 5 EU por K de peso de cuerpo por hora.

Esto significa que concentraciones de endotoxinas de 5 EU/K/hr o mayores pueden generar una reacción pirogénica.

Este límite se ha fijado para la mayoría de productos inyectables

LIMITE DE ENDOTOXINA

El límite de endotoxinas esta representado por la letra K .

El valor de K es 5 EU/Kg/hr para inyectables. Para aquellos que se administran en forma

intratecal K es 0.2 EU/Kg/hr. El peso promedio de un individuo es 70 Kg,

la cantidad maxima de endotoxinas que puede ser administrada a un paciente, al que se la ha dado un producto no intratecal , no puede exceder los 350 EU/hr (70 x 5EU/hr)

LIMITE DE ENDOTOXINA

El límite de la USP para PGV es 0.5 EU/ml y se ha derivado de una dosis de un conejo de 10 ml/Kg para el test de pirógenos.

Un típico PGV administrado a 700 ml/hr tambien da un límite de 0.5 EU/ml.

El límite de endotoxinas para agua API es de 0.25 EU/ml .

Para aparatos médicos es de 20 EU/aparato, y 2.15 EU/aparato pasra artefactos que entran en contacto con el fluido cerebroespinal

LIMITE DE ENDOTOXINA

El objetivo de la prueba es asegurar que la muestra que se esta probando no entregue mas de 5 (ó 0.2) EU/Kg/hr de endotoxinas a un paciente.

El límite de endotoxinas para un producto específico depende de la dosis máxima del producto que el paciente podría recibir.

Entre mas pequeña sea la dosis del producto por Kg, mas alto será el límite de endotoxinas por unidad de dosis del producto

LIMITE DE ENDOTOXINA

La letra M es usada para expresar la dosis maxima.

Cuando se calcula el límite de endotoxinas en productos, si la dosis es expresda para todo el cuerpo (adulto) primero se divide por 70 Kg para expresar en Kg.

Despues se divide K ( 5 EU/Kg, 0.2EU/Kg) para dar el límite de endotoxinas por unidad peso/volumen/unidades internacionales etc.

Determinación del límite de Endotoxinas a un Producto

Ejemplo: El producto A tiene una dosis para seres humanos (todo el cuerpo) de 1.0 g

Cálculo del límite de endotoxinas para un inyectable

Dosis por Kg= 1𝑔 70𝐾=0.0143g/Kg = 14.3 mg/Kg

𝐿𝑖𝑚𝑖𝑡𝑒 𝑑𝑒 𝑒𝑛𝑑𝑜𝑡𝑜𝑥𝑖𝑛𝑎𝑠 = 𝐾= 5 𝐸𝑈/𝐾𝑔𝑀 14.3 𝑚𝑔/𝐾𝑔 = 0.35 𝐸𝑈/𝑚𝑔

Usar la concentración del producto (la potencia en el producto final) para convertir el límite de endotoxinas en EU/ml.

Usando el ejemplo anterior, si la concentración del producto en el envase es de 100 mg/ml, o si la mayoria del producto es disuelto para dar 100mg/ml:

Cálculo del límite de endotoxinas para un inyectable

Límite de endotoxinas

L de E= 0.35EU/mg x 100 mg/ml= 35 EU/ml

Convertir el límite a EU/ml porque esas son las unidades de los estándar de endotoxinas en las pruebas LAL

Cálculo del límite de endotoxinas para un inyectable

PYROSATECARACTERISTICAS:~ Diseñado especialmente para probar aguas.~ Pyrosate es un producto nuevo y muy fácil de usar en la determinación de endotoxinas.~ No requiere un entrenamiento previo para su uso.~ Pyrosate fue diseñado de tal forma de evitar diluciones de la muestra.

PYROSATE

CARACTERISTICAS:~ El nuevo kit de Pyrosate es un ensayo gel-clot cinético.~ Resultados en menos de 30 minutos.~ Tiene una sensibilidad () de 0.25 EU/ml que puede lograrse en menos de 30 minutos.~ Acorta la prueba gel-clot tradicional en la mitad.

VENTAJAS DE PYROSATE

~ No se requiere conocimiento técnico.~ Tiempo de ensayo más corto - 0.25 EU/ml en menos de 30 minutos.~ Formulación específica para endotoxinas.~ No se requiere diluciones u otros reactivos.~ Incluye un control positivo específico de 2.~ Viales muy fáciles de abrir.