UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE MEDICINA ... · Los derechos que como autores nos...
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA Genotipificación del gen Flagelar A en Campylobacter jejuni provenientes de los procesos de faenamiento industrial de pollos broiler Trabajo de grado presentado como requisito para optar el Título de Médico Veterinario Zootecnista AUTOR: JORGE LUIS PAGUANQUIZA USHIÑA TUTOR DR. CHRISTIAN VINICIO VINUEZA BURGOS PHD (c) Quito, Abril 2016
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
Genotipificación del gen Flagelar A en Campylobacter jejuni provenientes
de los procesos de faenamiento industrial de pollos broiler
Trabajo de grado presentado como requisito para optar el Título de
Médico Veterinario Zootecnista
AUTOR:
JORGE LUIS PAGUANQUIZA USHIÑA
TUTOR
DR. CHRISTIAN VINICIO VINUEZA BURGOS PHD (c)
Quito, Abril 2016
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AUTORIZACIÓN DE LA AUTORÍA INTELECTUAL
Yo, JORGE LUIS PAGUANQUIZA USHIÑA, en calidad de autor del
trabajo de investigación o tesis realizada sobre “GENOTIPIFICACIÓN
DEL GEN FLAGELAR A EN Campylobacter jejuni PROVENIENTES DE
LOS PROCESOS DE FAENAMIENTO INDUSTRIAL DE POLLOS
BROILER”, por la presente autorizo a la UNIVERSIDAD CENTRAL DEL
ECUADOR, hacer uso de todos los contenidos que me pertenecen o de
parte de los que contiene esta obra, con fines estrictamente académicos o
de investigación.
Los derechos que como autores nos corresponden, con excepción de la
presente autorización, seguirán vigentes a nuestro favor, de conformidad
con lo establecido en los artículos 5, 6, 8; 19 y demás pertinentes de la
Ley de Propiedad Intelectual y su Reglamento.
Quito, 4 de Abril del 2016.
_______________________
FIRMA
Jorge Luis Paguanquiza U.
C.C: 1722930888
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INFORME DE APROBACIÓN DEL TUTOR
En mi carácter de Tutor del Trabajo de Grado, presentado por el señor
Jorge Luis Paguanquiza Ushiña para optar por el Título o Grado de
Médico Veterinario Zootecnista cuyo título es: “GENOTIPIFICACIÓN DEL
GEN FLAGELAR A EN Campylobacter jejuni, PROCEDENTES DE LOS
PROCESOS DE FAENAMIENTO INDUSTRIAL DE POLLOS BROILER”.
Considero que dicho trabajo reúne todos los requisitos y méritos para ser
sometido a la presentación pública y evaluación por parte del jurado
examinador que se designe.
En la ciudad de Quito a los 12 días del mes de Abril de 2016.
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Dr. Christian Vinueza PHD (c).
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APROBACIÓN DE TRIBUNAL
GENOTIPIFICACIÓN DEL GEN FLAGELAR A EN Campylobacter
jejuni, PROCEDENTES DE LOS PROCESOS DE FAENAMIENTO
INDUSTRIAL DE POLLOS BROILER.
El tribunal constituido por:
Presidente: Dra. María Inés Baquero
Vocal Principal: Dr. Eduardo Aragón
Vocal Principal: Dra. Ana Luisa Cevallos
Vocal Suplente: Dr. Richard Rodríguez
Luego de receptar la presentación del trabajo de grado, previo a la
obtención del título o grado de Médico Veterinario Zootecnista,
presentado por el Sr. Jorge Luis Paguanquiza Ushiña.
Con el título:
“Genotipificación del gen Flagelar A en Campylobacter jejuni provenientes
de los procesos de faenamiento industrial de pollos broiler”.
Ha emitido el siguiente veredicto: APROBADO
En la Ciudad de Quito, a __________________ de 2015.
Para constancia de lo actuado firman:
Presidente: Dra. María Inés Baquero. ________________________
Vocal Principal: Dr. Eduardo Aragón. __________________________
Vocal Principal: Dra. Ana Luisa Cevallos. _______________________
Vocal Suplente: Dr. Richard Rodríguez _________________________
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INDICE GENERAL
AUTORIZACIÓN DE LA AUTORÍA INTELECTUAL .................................. iii
INFORME DE APROBACIÓN DEL TUTOR ............................................... v
APROBACIÓN DE TRIBUNAL ................................................................. xii
LISTA DE FIGURAS ............................................................................... xvi
LISTA DE TABLAS ................................................................................. xviii
RESUMEN ............................................................................................... xx
INTRODUCCIÓN ....................................................................................... 1
CAPITULO I ............................................................................................... 5
EL PROBLEMA ...................................................................................... 7
Planteamiento del Problema ............................................................ 7
Justificación ...................................................................................... 9
OBJETIVOS ...................................................................................... 11
CAPÍTULO II ............................................................................................ 13
MARCO TEÓRICO ................................................................................... 15
Antecedentes de la investigación ......................................................... 15
Fundamentación Teórica ...................................................................... 15
Historia ............................................................................................. 15
Taxonomía de Campylobacter spp. ............................................... 16
Morfología ........................................................................................ 17
Epidemiología .................................................................................. 18
Genoma de Campylobacter ............................................................ 20
Tipos de Flagelina ........................................................................... 22
Genes de Virulencia ........................................................................ 22
Genes de resistencia a los antibióticos ........................................ 24
Complejos clonales......................................................................... 26
PCR-RFLP ........................................................................................ 28
CAPÍTULO III ........................................................................................... 31
METODOLOGÍA ....................................................................................... 33
Tipo de investigación ............................................................................ 33
Diseño de la investigación .................................................................... 33
xv
Descripción de la zona de estudio ........................................................ 33
Población.............................................................................................. 33
Muestra ................................................................................................ 33
Procedimientos de la Investigación ...................................................... 34
1. Recolección de la información ............................................. 34
2. Procesamiento de las muestras en el laboratorio .............. 35
3. Procesamiento de la información obtenida ........................ 38
CAPÍTULO IV ........................................................................................... 39
RESULTADOS ..................................................................................... 41
DISCUSIÓN ......................................................................................... 50
CAPÍTULO V............................................................................................ 54
CONCLUSIONES: ................................................................................ 56
RECOMENDACIONES: ....................................................................... 57
REFERENCIAS BIBLIOFRÁFICAS ......................................................... 58
ANEXOS .................................................................................................. 70
xvi
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1. REPRESENTACIÓN CIRCULAR DEL GENOMA DE C. JEJUNI. ................ 21
FIGURA 2. ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA MUESTRAN BANDAS………..
ESPECÍFICAS PARA C. JEJUNI Y C. COLI. ....................................... 41
FIGURA 3. RELACIÓN PORCENTUAL DE LAS ESPECIES IDENTIFICADAS. .............. 42
FIGURA 4. RELACIÓN PORCENTUAL DE LAS ESPECIES IDENTIFICADAS …………
DEACUERDO A CADA MUESTREO (1-2). ........................................... 42
FIGURA 5. ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA MUESTRAN BANDAS ……….
ESPECÍFICAS PARA EL GEN FLA A EN AISLADOS DE C. JEJUNI..
………43
FIGURA 6. RELACIÓN PORCENTUAL DE CEPAS POSITIVAS AL GEN FLA A. ........... 43
FIGURA 7. ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA AL 2% DE LOS PERFILES DE
PCR-RFLP DE FLA A DIGERIDOS CON LA ENDONUCLEASA DDEL……..
EN AISLADOS DE C. JEJUNI. .......................................................... 43
FIGURA 8. DENDOGRAMA BASADO EN DEL ANÁLISIS NUMÉRICO (UPGMA)……..
(2% OPTIMIZACIÓN, 2% DE TOLERANCIA) MUESTRA LA DIVERSIDAD..
DE LAS CEPAS A NIVEL DE MUESTREO. ............................................ 45
FIGURA 9. DENDOGRAMA DEL MUESTREO 1 BASADO EN DEL ANÁLISIS ………..
NUMÉRICO (UPGMA) (2% OPTIMIZACIÓN, 2% DE TOLERANCIA). ........ 47
FIGURA 10. DENDOGRAMA DEL MUESTREO 2 BASADO EN EL ANÁLISIS ………...
NUMÉRICO (UPGMA) (2% OPTIMIZACIÓN, 2% DE TOLERANCIA). ....... 49
xvii
xviii
LISTA DE TABLAS
TABLA 1. CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA DE CAMPYLOBACTER SPP. .................. 17
TABLA 2. CLASIFICACIÓN DE ESPECIES DE CAMPYLOBACTER, FUENTES DE……
TRANSMISIÓN Y ENFERMEDADES QUE CAUSAN EN HUMANOS ………...
Y ANIMALES. ................................................................................. 19
TABLA 3. GENES DE VIRULENCIA CON SU RESPECTIVO PESO MOLECULAR ........ 24
TABLA 4. PRINCIPALES MECANISMOS DE RESISTENCIA FRENTE A………………
ANTIMICROBIANOS EN C. JEJUNI Y C. COLI. ...................................... 25
TABLA 5. GENES RESISTENTES A ANTIBIÓTICOS CON SU RESPECTIVO PESO…..
MOLECULAR. ................................................................................ 26
TABLA 6. PRINCIPALES COMPLEJOS CLONALES Y SU FUENTE. ......................... 27
TABLA 7. MUESTRAS DE CAMPYLOBACTER SPP. PERTENECIENTES AL BANCO…
DE CEPAS, QUE SE TOMARON DURANTE LA INVESTIGACIÓN. .............. 34
TABLA 8. PRIMERS PCR MULTIPLEX (CAMPYLOBACTER COLI Y ………………
CAMPYLOBACTER JEJUNI). ............................................................. 36
TABLA 9. PROGRAMA PARA TERMOCICLADOR PCR MULTIPLEX. ..................... 37
TABLA 10.RESULTADOS DE LOS PATRONES DE BANDA PRESENTES EN EL….
MUESTREO 1 Y LOS DIFERENTES GENOTIPOS PRESENTES EN LOS
DISTINTOS PUNTOS CRÍTICOS. ....................................................... 46
TABLA 11. RESULTADOS DE LOS PATRONES DE BANDA PRESENTES EN EL……..
MUESTREO 2 Y LOS DIFERENTES GENOTIPOS PRESENTES EN LOS….
DISTINTOS PUNTOS CRÍTICOS. ....................................................... 48
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
ESCUELA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
Genotipificación del gen flagelar A en Campylobacter jejuni provenientes de los procesos de faenamiento industrial de pollos
broiler
Autor: Jorge Luis Paguanquiza U.
Tutor: Dr. Cristian Vinueza PHD (c).
Fecha: Abril de 2016.
RESUMEN La campilobacteriosis es una de las enfermedades entéricas bacterianas más frecuentes en los seres humanos, la principal vía de infección es la ingestión de alimentos de origen animal y en particular el consumo de carne de aves de corral. La mayoría de los casos de contagio son asociadas a Campylobacter jejuni, esta bacteria puede propagarse a través del proceso de faenamiento de pollos broiler. La evaluación de la diversidad genética de C. jejuni es fundamental para la comprensión de la epidemiología de esta bacteria y el desarrollo de eficaces estrategias de control contra las infecciones de C. jejuni. El objetivo del presente estudio fue genotipificar el gen Fla A en aislados de Campylobacter jejuni pertenecientes a un banco de cepas de la industria avícola ecuatoriana mediante la técnica de PCR-RFLP. Se analizaron 281 cepas de Campylobacter spp. de 2 muestreos en una planta de faenamiento. C. jejuni mostró mayor prevalencia con 56.9%, de estos aislados solo 90% resultaron positivas a la presencia del gen Fla A y se digirieron con la enzima de restricción Ddel, generando patrones de bandas que se analizaron en GelCompar II. Los dendogramas del muestreo 1 y 2 generaron 11 y 15 genotipos respectivamente. Varios de estos están presentes en los distintos puntos críticos de control. Esto demuestra la existencia de contaminación cruzada de genotipos de C. jejuni a lo largo de la cadena de procesamiento de carcazas.
Palabras clave: Campylobacter jejuni, PCR-RFLP, genotipos, dendograma.
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CENTRAL UNIVERSITY OF ECUADOR
FACULTY OF VETERINARY MEDICINE
SCHOOL OF VETERINARY MEDICINE
Genotyping Fla A gene in Campylobacter jejuni from the
processes of industrial slaughter of broilers.
By: Jorge Luis Paguanquiza U.
Tutor: Dr. Cristian Vinueza PHD (c).
Date: April 2016
SUMMARY
Campilobacteriosis is one of the most common bacterial enteric diseases
in humans. The major route of infection is the ingestion of food of animal
origin particularly poultry meat. Most cases of infection are associated with
Campylobacter jejuni, this bacteria can spread through the slaughter line.
The evaluation of genetic diversity among C. jejuni is critical for
understanding the epidemiology of this bacteria and the developing of
effective control strategies. The objective of this study was genotype the
Fla A gene in C. jejuni isolates Ecuadorian poultry industry by the PCR-
RFLP technique. 281 strains of Campylobacter spp from 2 sampling at
slaughterhouse were analyzed. C. jejuni showed higher prevalence with
56.9%.From these isolates only 90% were positive to the presence of the
Fla A gene and were digested with DdeI restriction enzyme, generating
various patterns of bands that where analyzed with GelCompar II.
Dendograms of sampling days 1 and 2 generated 11 and 15 genotypes
respectively. Several of these genotypes were present in different control
points. This demonstrates the existence of cross contamination of C. jejuni
genotypes throughout the slaughtering process.
Keywords: Campylobacter jejuni, PCR-RFLP, genotypes, dendrogram.
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1
INTRODUCCIÓN
2
3
Las enfermedades transmitidas por los alimentos (ETAs) son un serio
problema de salud pública en todo el mundo y una causa importante de
morbilidad, lo cual supone una carga económica significativa para las
naciones, perjuicios para los consumidores y un impacto al comercio
internacional de productos alimenticios. Más de 250 enfermedades
conocidas se transmiten a través de alimentos (Rodríguez-Lázaro &
Hernández, 2006).
La campilobacteriosis es una de las enfermedades entéricas bacterianas
más frecuentes en los seres humanos con presencia en gran cantidad de
países (Irving Nachamkin, 2002). La principal vía de infección es la
ingestión de alimentos de origen animal y en particular el consumo de
carne de aves de corral. La mayoría de los casos de contagio en
humanos son asociadas a Campylobacter jejuni, y en menor medida por
Campylobacter coli (Humphrey, O’Brien, & Madsen, 2007).
El tracto intestinal de los pollos proporciona un importante reservorio de
Campylobacter spp., esta bacteria puede propagarse a través de la
materia fecal antes o durante el sacrificio. La mayoría de las operaciones
de limpieza durante el procesamiento de faenamiento puede reducir pero
no eliminar este microorganismo (Ivanova et al., 2014).
La capacidad de las cepas de Campylobacter spp. para sobrevivir y
resistir a través de todos los procesos de faenamiento, para
contaminando el producto final, es en gran parte desconocida, la
evidencia circunstancial parece indicar que esta capacidad puede ser
dependiente de la cepa con propiedades mejoradas de virulencia (T. M.
Wassenaar & Newell, 2000).
Debido al hecho que las cepas individuales difieren en su patogénesis y
virulencia, es necesario genotipificar las cepas de Campylobacter spp.
(Steinhauserova, Ceskova, & Nebola, 2002).
El presente estudio aplicó las técnicas moleculares (PCR-RFLP), en el
laboratorio de Biología Molecular de la Facultad de Medicina Veterinaria y
Zootecnia, para la genotipificación de cepas de Campylobacter jejuni,
provenientes de los procesos de faenamiento industrial de pollos broiler.
4
5
CAPITULO I
6
7
EL PROBLEMA
Planteamiento del Problema
La incidencia de las enfermedades transmitidas por alimentos (ETAs) ha
aumentado considerablemente durante las últimas décadas por la rápida
globalización del mercado de alimentos y por los profundos cambios en
los hábitos alimenticios (John E. Moore et al., 2005). Además, este
problema se acrecienta con el surgimiento de nuevas formas de
transmisión, la aparición de grupos poblacionales vulnerables, y el
aumento de la resistencia a los compuestos antimicrobianos en los
microorganismos patógenos (John E Moore et al., 2005).
Campylobacter spp. es un género bacteriano reconocido de la enteritis
humana, varias especies de este género pueden causar diarrea en niños
de países desarrollados y en desarrollo. Estas bacterias se han aislado
con mayor frecuencia en los seres humanos, los animales, los alimentos y
en el agua (John E Moore et al., 2005). Una gran variedad de especies
animales puede albergar este microorganismo en el tracto
gastrointestinal, esta enfermedad en los seres humanos es aguda y tiende
a ser autolimitada, pero las complicaciones graves como el síndrome de
Guillain-Barré puede desarrollarse en un pequeño número de pacientes
(Jonker & Picard, 2009).
Campylobacter spp. puede sobrevivir principalmente en la carne fresca, la
leche o el agua, y en el caso de un manejo inadecuado, puede contaminar
los alimentos ya preparados (Steinhauserova et al., 2002). El mecanismo
preciso de la propagación de Campylobacter spp. en los establecimientos
de cría de animales y su traslado o de las fuentes de alimentos para los
seres humanos, ha sido objeto de muchos estudios y no ha sido hasta
ahora explicado adecuadamente (Steinhauserova et al., 2002). Las aves
son los hospedadores más comunes para Campylobacter spp.
posiblemente debido a la mayor temperatura de su cuerpo (Humphrey et
al., 2007).
8
Durante la última década, la aparición y propagación de Campylobacter
spp. en las parvadas de pollos de engorde convencionales se ha
estudiado intensamente, se cree que la principal fuente de
campilobacteriosis es la carne de pollo y sus subproductos, debido a las
grandes cantidades consumidas actualmente (Hansson, Nyman, Lahti,
Gustafsson, & Olsson Engvall, 2015).
Si la carne de pollo no se maneja adecuadamente, la exposición del
consumidor a Campylobacter spp. es inevitable. La cantidad de
Campylobacter spp. encontrado en las canales de las aves por lo general
varían entre las distintas operaciones de faenamiento (Hansson, Ederoth,
Andersson, Vågsholm, & Olsson Engvall, 2005).
Los métodos precisos para especiación y genotipificación son
particularmente importantes en este tipo de estudios. Hasta hace poco la
especiación de Campylobacter spp. era muy difícil (Koenraad, Ayling,
Hazeleger, Rombouts, & Newell, 1995). La diferenciación entre las
especies termófilas estrechamente relacionadas, como Campylobacter
jejuni, Campylobacter coli y Campylobacter lari, en base de las
características fenotípicas era en gran medida inexacta (Koenraad et al.,
1995).
9
Justificación
La carne de pollo es uno de los alimentos con mayor consumo en los
últimos tiempos, en el Ecuador el consumo per-cápita de pollo es de 35
Kg por persona al año (CONAVE, 2013).
Dos especies principales del género Campylobacter spp. que se han
encontrado en la industria de aves de corral son C. jejuni y C. coli (Jonker
& Picard, 2009).
Métodos basados en el ADN han sido ampliamente utilizados para la
tipificación de Campylobacter spp., ya que ofrecen mayor poder
discriminatorio, y están disponibles en una escala potencialmente
universal en comparación con los métodos fenotípicos, como
serotipificación (C.S. Harrington, Moran, Ridley, Newell, & Madden, 2003).
Los polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), se
basan en la amplificación selectiva de fragmentos de restricción de ADN
cromosómico, para la tipificación genética y diferenciación de cepas
bacterianas genéticamente relacionadas (Duim, Wassenaar, Rigter, &
Wagenaar, 1999).
Métodos de genotipado disponibles se han revisado recientemente, si
bien cada uno de estos tiene sus potenciales ventajas y desventajas. En
esta investigación se usó la técnica de la reacción en cadena de la
polimerasa seguida por la digestión con enzimas de restricción o
polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (en inglés, PCR-
RFLP) esta se ha convertido en una técnica de rutina debido a su
velocidad y simplicidad (C.S. Harrington et al., 2003).
Los resultados obtenidos al culminar el presente trabajo de investigación
aportarán al conocimiento epidemiológico del riesgo de contaminación por
C. jejuni en sistemas industrializados de procesamiento de la carne de
pollo en Ecuador.
10
11
OBJETIVOS
En el presente estudio se planteó los siguientes objetivos:
General:
Identificar la relación genética entre cepas de Campylobacter jejuni,
provenientes de puntos críticos de control en los procesos de
faenamiento industrial de pollos broiler.
Específicos:
1. Identificar C. jejuni, del banco de cepas del Laboratorio de
Bacteriología de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia,
provenientes de puntos críticos de control en los procesos de
faenamiento.
2. Analizar los patrones generados mediante la técnica de PCR-RFLP
para obtener un dendograma de relaciones genéticas entre cepas de
C. jejuni, provenientes de los procesos de faenamiento industrial de
pollos broiler.
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13
CAPÍTULO II
14
15
MARCO TEÓRICO
Antecedentes de la investigación
En Ecuador se han realizado varios estudios relacionados a la
campilobacteriosis en el campo de la biología molecular, entre ellas el
aislamiento y tipificación molecular en contenido cecal de pollos faenados
(Poma V., 2014). Cuantificación de Campylobacter spp. en un matadero
Semi-industrial de Aves, y posterior identificación molecular de especies
(Medina J., 2015). Sin embargo con respecto a la genotipificación de
Campylobacter jejuni mediante PCR-RFLP no se ha realizado ningún
estudio previo en Ecuador, a pesar que la campilobacteriosis tiene gran
importancia en el área de la Salud Pública.
Fundamentación Teórica
Historia
El microorganismo actualmente descrito como C. jejuni fue descubierto en
1931 por Jones y Cols, como microorganismo responsable de la
disentería invernal en el ganado. Transcurrieron 36 años antes de que
King describiera un grupo de bacilos curvos móviles microaerófilos
aislados de la sangre de niños con disentería, que designó como
“vibriones relacionados” porque éstas eran similares en varios aspectos al
Vibrio fetus (Koneman, E. W., Allen, S. D., Janda, W. M.,
Schreckenberger, P. C., & Winn, 2013).
El género Campylobacter no se estableció hasta el año de 1963, ya que,
estos microorganismos tenían diferentes características bioquímicas a los
del género Vibrio, se decidió entonces que Vibrio jejuni pasaría a tomar el
nombre de Campylobacter jejuni y Vibrio coli el nombre Campylobacter
coli, respectivamente (Torralbo Montoro, 2013).
Debido a su baja composición de bases de ADN, su metabolismo no-
fermentativa y sus necesidades de crecimiento microaerofílicas, el género
Campylobacter fue propuesto por primera vez en 1963 por Sebald y
Véron, distinguiéndolos de la "verdadera" Vibrio spp. Posteriormente, el
16
estudio de Butzler planteó el interés por Campylobacter spp. señalando su
alta incidencia en la diarrea humana (Silva et al., 2011).
En 1977, Martin Skirrow describió una técnica simple y directa, con la
participación de un cultivo en agar sangre que contiene vancomicina,
polimixina y trimetoprim. Las placas se incubaron a 43°C en un ambiente
de microaerofília que contenía 5% O2 (v/v), 10% CO2 (v/v) y 85% N2 (v/v).
Desde entonces, varias modificaciones metodológicas han surgido,
permitiendo de este modo la adopción universal de tales métodos y las
distintas variantes que permiten a los laboratorios de microbiología clínica
intentar el aislamiento de Campylobacter spp. a partir de muestras fecales
(John E Moore et al., 2005).
Taxonomía de Campylobacter spp.
La estructura y las relaciones de la familia taxonómica
Campylobacteraceae se han establecido por un enfoque integrado muy
similar (Vandamme et al., 1997), las especies del género Campylobacter,
se ubican en la clase Épsilon de las proteobacterias, en el orden
Campylobacterales, que incluye a las familias Wolinella,
Helicobacteraceae, Campylobacteraceae, esta última comprende los
géneros Campylobacter spp. y Arcobacter spp. (Lapierre, 2013).
El género Campylobacter consiste en un grupo grande y diverso de
bacterias que actualmente comprende 26 especies, mientras que las
especies C. jejuni y C. coli son causantes de la mayor cantidad de
infecciones en humanos (Fitzgerald, 2015). Debido a que Campylobacter
spp., es difícil de diferenciar fenotípicamente, muchos laboratorios clínicos
no identifican los aislados de Campylobacter a nivel de especie, la
verdadera importancia clínica y de salud pública de las otras especies
está por determinarse (Miller & Parker, 2011).
Las especies de Campylobacter restantes se dividen en general en 3
grupos:
1. Especies que causan la enfermedad con poca frecuencia en los
seres humanos y se asocian con animales de granja (por ejemplo,
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Campylobacter fetus, Campylobacter sputorum, y Campylobacter
hyointestinalis).
2. Especies implicadas en la enfermedad periodontal o aislada de los
seres humanos (por ejemplo, Campylobacter curvus,
Campylobacter rectus, Campylobacter showae, Campylobacter
concisus).
3. Especies que no han sido aisladas a partir de alimentos o el agua y
no están asociados con la enfermedad humana (por ejemplo,
Campylobacter insulaenigrae, Campylobacter canadensis). (Miller
& Parker, 2011).
La clasificación taxonómica de Campylobacter spp. se detalla en la tabla
1.
Tabla 1. Clasificación taxonómica de Campylobacter spp.
Dominio Bacteria
Filo Proteobacteria
Clase Épsilon Proteobacteria
Orden Campylobacterales
Familia Campylobacteraceae
Género Campylobacter
Fuente: (Lapierre, 2013)
Elaboración: El autor
Morfología
La familia Campylobacteriaceae posee unas dimensiones (de 0,2 hasta
0,9 µm de ancho y de 0,2 a 5,0 µm de largo), son muy diferentes de otros
patógenos asociados con enfermedades transmitidas por los alimentos,
ya que son esencialmente microaerofílicos (Humphrey et al., 2007). Su
crecimiento se da de mejor manera en una atmósfera que contiene
aproximadamente 10% CO2 y aproximadamente el 5% de O2. Las
especies patógenas para el hombre tienen un rango de temperatura más
estrecho para su crecimiento con una temperatura máxima de 46°C y una
18
mínima de 30°C. Estos se clasifican como Campylobacter termófilos
(Humphrey et al., 2007).
Las bacterias del género Campylobacter son gram negativas, tienen
forma de varillas delgadas espirales curvas. Cuando dos o más células
bacterianas se agrupan, forman una "S" o una "V" de forma similar a unas
alas de gaviota. La mayoría de las especies tienen un movimiento de
sacacorchos por medio de un solo flagelo polar desenvainado en uno o
ambos extremos de la célula. Las únicas excepciones son Campylobacter
gracilis que no son móviles y Campylobacter showae que tiene múltiples
flagelos (Silva et al., 2011).
Las colonias de Campylobacter spp. toman entre dos y cinco días para
crecer y no son hemolíticas, tienen forma plana, color gris y consistencia
mucoide. En las cajas petri pueden parecerse a las gotas de agua,
aunque Campylobacter spp. tiene una morfología típica, es catalasa y
oxidasa positivo, son difíciles de identificar a nivel de especie, ya que son
no-fermentativa y no reaccionan en muchas pruebas bioquímicas
(Koneman, E. W., Allen, S. D., Janda, W. M., Schreckenberger, P. C., &
Winn, 2013). Además, son susceptibles a ácido nalidíxico pero no a la
cefalotina. C. jejuni y C. coli se distinguen entre sí por su capacidad de
hidrolizar el hipurato de sodio (C. coli no hidroliza el hipurato de sodio
mientras que C. jejuni si lo hace). (Jonker & Picard, 2009).
Epidemiología
La campilobacteriosis es una zoonosis de distribución mundial. Esta
bacteria se halla habitualmente como comensal del tracto gastrointestinal
de vacas, ovejas, cerdos, cabras, perros, gatos, roedores silvestres o
domésticos y toda variedad de aves de corral, muchos de los casos de
enteritis humana se han asociados al contacto con animales, agua
contaminada o alimentos de origen animal (CDC, 2001). En países
desarrollados, un alto porcentaje de infecciones es provocado por
consumo de carne de ave mal cocida. En países en vías de desarrollo la
enfermedad parece ser más frecuente en niños de corta edad. C. jejuni y
19
C. coli son causas importantes de diarreas agudas, no soportan durante
mucho tiempo situaciones de desecación o congelamiento, característica
que limita su transmisión (CDC, 2001).
El riesgo para la salud pública dado por Campylobacter spp. es
probablemente su aumento en el futuro, debido a que nuevas especies
de Campylobacter se están descubriendo y un creciente número de cepas
resistentes a los antibióticos están apareciendo en la especie común C.
jejuni (Radice et al., 2011). Los hallazgos epidemiológicos pueden ser
utilizados para ayudar a resolver el riesgo influyendo la política en los
programas nacionales. Por ejemplo, Campylobacter spp. puede ser
transmitido a los seres humanos por varias vías, que varían en
importancia con el tiempo y la ubicación (WHO, 2000).
C. jejuni es aislado con mayor frecuencia a partir de pollos de engorde, y
C. coli con mayor frecuencia a partir de cerdos (Jonker & Picard, 2009).
La dosis infectante de Campylobacter spp. es baja, se necesita un inóculo
de 104 para producir la enfermedad, aunque se ha comprobado que 500
bacterias pueden ser un riesgo para el ser humano (CDC, 2001).
En la siguiente tabla se puede observar especies de Campylobacter, sus
fuentes y las distintas enfermedades que causan.
Tabla 2. Clasificación de especies de Campylobacter, fuentes de transmisión y enfermedades que
causan en humanos y animales.
Familia Fuente conocida Enfermedades asociadas
Humanos Animales
C. coli Cerdos, aves de corral
bovinos, ovejas
Gastroenteritis, septicemia Gastroenteritis
C. concius Hombre Enfermedad periodontal
gastroenteritis
Ninguno en la actualidad
C. curvus Hombre Enfermedad periodontal, gastroenteritis
Ninguno en la actualidad
C. fetus subsp. Fetus Bovinos, ovejas Septicemia, gastroenteritis
aborto, meningitis
Aborto espontaneo en bovinos y ovinos
C. fetus subsp. venerealis
Bovinos, Septicemia Infertilidad bovina
C. gracilis Hombre Enfermedad periodontal
empiema, abscesos
Ninguno en la actualidad
C. helveticus Gatos, perros Ninguno en la actualidad Gastroenteritis canina y
20
Tomado de: (Humphrey et al., 2007)
Elaboración: El autor
Varios factores determinan la prevalencia de esta bacteria durante el
sacrificio de las aves. Las etapas como el escaldado y el desplumado
contribuyen a la contaminación, y las condiciones de almacenamiento
facilita la supervivencia de Campylobacter spp. (El-Shibiny, Connerton, &
Connerton, 2009).
Genoma de Campylobacter
El genoma de C. jejuni está representado por una molécula individual de
ADN circular (Taylor, Eaton, Yan, & Chang, 1992), el primer genoma de C.
jejuni fue secuenciado a partir de un clon de la cepa NCTC 11168 en el
año 2000, es una cepa altamente virulenta que exhibe características
patógenas únicas y es utilizada por muchos laboratorios de investigación.
felina C. hyointestinalis subsp. hyointestinalis
Cerdos, bovinos,
hámster, ciervos
Gastroenteritis Enteritis bovina y porcina
C. hyointestinalis subsp. lawsonii
Cerdos Ninguno en la actualidad Se desconoce
C. hyoilei Cerdos Ninguno en la actualidad Enteritis porcina proliferativa C. jejuni subsp. doylei Hombre Gastroenteritis, gastritis
septicemia
Ninguno en la actualidad
C. jejuni subsp. jejuni Aves de corral, cerdos,
bovinos, ovejas, perros,
gatos, pájaros, conejos,
insectos
Gastroenteritis, septicemia,
meningitis, aborto, proctitis
Síndrome de Guillan Barré
Gastroenteritis, hepatitis aviar
C. lari Pájaros, aves de corral, agua, perros, gatos, monos, caballos
Gastroenteritis, septicemia Gastroenteritis aviar
C. mucosalis Cerdos Ninguno en la actualidad Enteritis porcina necrótica C. rectus Hombre Enfermedad periodontal Ninguno en la actualidad C. showae Hombre Enfermedad periodontal Ninguno en la actualidad C. sputorum bv. Sputorum
Hombre, bovinos cerdos Abscesos, gastroenteritis Ninguno en la actualidad
C. sputorum bv. Faecalis
Ovejas, toros Ninguno en la actualidad Ninguno en la actualidad
C. upsaliensis Perros, gatos Gastroenteritis, septicemia abscesos
Gastroenteritis canina y felina
C. insulaenigrae Marsopas Ninguno en la actualidad Ninguno en la actualidad C. lanienae Bovinos, cerdos
humanos
Ninguno en la actualidad Ninguno en la actualidad
C. hominis Humanos Gastritis, inmunidad comprometida
21
El anuncio de su secuenciación fue un hito en la investigación de C. jejuni
(Gundogdu et al., 2007).
Figura 1. Representación Circular del genoma de C. jejuni.
Tomado de: (Parkhill et al., 2000)
La secuencia tiene un cromosoma circular de 1641481 pares de bases
(30,6% G + C), que codifica 1654 proteínas y 54 especies de ARN
estables, el genoma prácticamente no muestra secuencias de inserción y
tiene muy pocas secuencias repetidas. Un hallazgo interesante fue la
presencia de secuencias hipervariables, la alta tasa de variación puede
ser importante en la estrategia de supervivencia de C. jejuni (Parkhill et
al., 2000), sin embargo los últimos hallazgos sugieren que algunas
variantes de C. jejuni NCTC 11168 de diferentes laboratorios no sólo
pueden mostrar diferencias fenotípicas, sino que, pueden tener una
variabilidad genética que afecta negativamente a los resultados y a la
reproducibilidad de los experimentos (Revez, Schott, Rossi, & Hänninen,
2012).
Últimamente se ha revelado la secuenciación nucleotídica de varias cepas
de C. jejuni, por ejemplo C. jejuni RM1221 y C. jejuni 81-176 esto ha
22
contribuido a la hipótesis de que su gran diversidad genética es la
responsable de las características de virulencia tan diferentes de los
distintos aislados (Hofreuter et al., 2006).
Tipos de Flagelina
Se ha determinado la importancia de los flagelos para la colonización del
ciego aviar. Los flagelos de Campylobacter son estructuras superficiales
altamente inmunogénicas, esenciales para la motilidad y la virulencia (T M
Wassenaar, van der Zeijst, Ayling, & Newell, 1993).
C. jejuni (cepa 81116) posee dos genes de flagelina, Fla A y Fla B casi
idénticos que codifican la subunidad estructural del flagelo (T M
Wassenaar et al., 1993). Los dos genes de flagelina, Fla A y Fla B con 1,7
kb cada uno, están situados adyacentes entre sí, el gen Fla B no
necesariamente tiene la función de motilidad, se especula que sirve como
un depósito para la variación antigénica o tiene una función en la
motilidad bajo diferentes circunstancias (Alm, Guerry, & Trust, 1993).
Se ha demostrado que durante la colonización del intestino de pollo, en
las cepas mutantes inmóviles de C. jejuni, el gen Fla A se sometió a
reordenamientos dentro de su locus de flagelina, recuperando de esta
manera su capacidad de motilidad y colonización (Nuijten, van den Berg,
Formentini, van der Zeijst, & Jacobs, 2000).
Genes de Virulencia
Entre los principales genes de virulencia que posee C. jejuni tenemos: Fla
A, CADF, RACR, y dnAj.
El gen CIAB codifica una proteína secretada necesaria para la invasión
máxima de C. jejuni en células epiteliales cultivadas, y el gen pldA codifica
una proteína con actividad fosfolipasa. También se incluyen los genes
CADF y dnAj, responsables de la colonización de la bacteria (Ziprin et al.,
2001). Todos estos genes junto con el gen RACR son patogénicos
responsables de la expresión de la adherencia y la colonización (Brás,
Chatterjee, Wren, Newell, & Ketley, 1999).
23
Los genes patógenos CDTA, cdtB y CDTC son responsables de la
producción de citotoxina, C. jejuni codifica una toxina de distensión
citoletal (CDT) que hace que las células se detengan en la fase G2 de
transición / M del ciclo celular evitando que éstas entren en mitosis, y en
consecuencia conduciendo a la muerte celular. Estas toxinas también son
producidas por otros patógenos bacterianos importantes. La actividad
CDT requiere la función de 3 subunidades codificadas por los genes:
CDTA, CdtB y CDTC. Estudios recientes han establecido que CdtB es la
subunidad activa de CDT, esta deteriora el ADN y provoca la detención
del ciclo celular, a pesar de este descubrimiento se desconoce la función
de CDTA y CDTC. Cuando se combinan CDTA, CdtB, y CDTC interactúan
entre sí para formar la holotoxina tripartita activa que exhibe toxicidad
celular. El principal efecto que produce es la muerte de las células
eucariotas, probablemente al impedir la mitosis o inducir daño en el ADN
(Lara-Tejero & Galán, 2001).
En C. jejuni cepa 81-176, el gen virB11 se relaciona con la invasión, y los
plásmidos de esta cepa están implicados en la virulencia de un
subconjunto de C. jejuni patógenos (Bacon et al., 2000).
El gen CIAB codifica una proteína de 610 aminoácidos necesaria para la
internalización de C. jejuni en las células huésped, la secuencia deducida
de aminoácidos de la proteína comparte similitud con proteínas
secretadas CIAB tipo III, asociadas con la invasión de las células huésped
a partir de otros patógenos bacterianos más ampliamente caracterizados
(Konkel, Kim, Rivera-Amill, & Garvis, 1999).
El gen WLAN está involucrado en la expresión de gangliósidos que son
responsables directamente con el síndrome de Guillain-Barré (Linton et
al., 2000). A continuación se muestran los 12 principales genes de
virulencia.
24
Tabla 3. Genes de virulencia con su respectivo peso molecular
Gen Peso Molecular
Fla 855
CADF 400
RACR 584
dnAj 720
VirB 11 494
CIAB 986
pldA 913
CDTA 370
cdtB 620
CDTC 182
WLAN 762
ceuE 793
Tomado de: Zeng et al., 2016
Elaboración: El autor
Genes de resistencia a los antibióticos
El tratamiento para la infección por C. jejuni en humanos se basa en la
reposición de fluidos y electrolitos (García C, Valenzuela S, Rodríguez L,
León C, & Fernández J, 2009), se necesita una terapia antimicrobiana
únicamente para las infecciones graves y en pacientes
inmunocomprometidos. Actualmente, los macrólidos son los agentes
antimicrobianos más comunes prescritos cuando se requiere una
intervención terapéutica. Las quinolonas se recomiendan, ya que son los
fármacos de elección para el tratamiento empírico de diarreas agudas
provocadas por bacterias (Bianchini et al., 2014).
Sin embargo, existen diversos reportes sobre la aparición de resistencia a
fluoroquinolonas y tetraciclina a nivel mundial (García C et al., 2009).
En los seres humanos, una alta proporción de aislamientos de
Campylobacter fueron resistentes a ciprofloxacina y tetraciclina, mientras
que la resistencia a la eritromicina fue baja a moderada. La resistencia a
25
las fluoroquinolonas en algunos países es extremadamente alta, en tales
contextos la opción de tratamiento para infecciones de Campylobacter
spp. puede reducirse significativamente. En aislados de Campylobacter
obtenidos de aves de corral y carne de pollo se ha observado una mayor
a muy alta resistencia a la ciprofloxacina, ácido nalidíxico y tetraciclina,
mientras que se observaron niveles mucho más bajos para la eritromicina
y gentamicina. El aumento de resistencia a la ciprofloxacina se ha
observado en pollos de engorde (EFSA, 2015).
La resistencia a los macrólidos de alto nivel es conferida por mutaciones
puntuales del gen 23S rRNA (tabla 4). (Bianchini et al., 2014).
Tabla 4. Principales mecanismos de resistencia frente a antimicrobianos en C. jejuni y C. coli.
Grupo
antimicrobiano
Antimicrobiano Principal mecanismo
de resistencia
Otros
mecanismos
Quinolonas Ciprofloxacina,
ácido nalidíxico
Mutación en la
subunidad gyrA de la
enzima ADN girasa.
Bomba de
eflujo
CmeABC
Macrólidos Eritromicina Mutación en el gen
23S rRNA o en las
proteínas ribosómicas
L4 o L22 Metilación
en el gen 23S rRNA.
Bomba de
eflujo
CmeABC
Aminoglucósidos Estreptomicina,
gentamicina
Enzimas modificadoras
de antimicrobiano
(fosfotransferasas,
adenililtransferasas o
acetiltransferasas).
Fuente: Ugarte Ruiz, 2015
Elaboración: El autor
En Campylobacter, hay dos mecanismos bien descritos en la resistencia a
fluoroquinolonas (FQ): la inactivación del objetivo de FQ y el flujo de
salida de FQ. Estos dos mecanismos trabajan de forma sinérgica. En
general, los dos objetivos enzimáticos intracelulares de FQ son la ADN
girasa (codificada por gyrA y gyrB) y la topoisomerasa IV estructuralmente
26
relacionada (codificada por parC y parE). Las fluoroquinolonas forman un
complejo estable con estas enzimas, lo que lleva a la disminución de la
replicación del ADN, la transcripción, y en última instancia a la muerte
celular, la resistencia a FQ en C. jejuni y C. coli se produce a través de
mutaciones puntuales específicas en la región de resistencia de
determinación de la quinolona (QRDR) del gen gyrA (tabla 5). (Iovine,
2013).
La adquisición de genes adicionales que imparten resistencia a los
antibióticos es probable. Por lo tanto, la comprensión de los mecanismos
de resistencia a antibióticos en C. jejuni son necesarios para proporcionar
una terapia adecuada tanto en poblaciones humanas y animales (Iovine,
2013).
Tabla 5. Genes resistentes a antibióticos con su respectivo peso molecular.
Gen Peso Molecular
gyrA 673
parC 912
clase 1 integornes int 1 230
tet (o) 559
CJ1/DP1 300
mutación 300
CJ18/CJ19 800
CJ20/CJ21 600
Fuente: Zeng et al., 2016
Elaboración: El autor
Complejos clonales
La alta diversidad genética y antigénica de C. jejuni y C. Coli, han
demostrado ser obstáculos en la vigilancia de rutina, la identificación de
brotes, y la atribución de origen (CDC, 2008). Un importante hallazgo
inicial fue que los tipos secuenciales (ST) de Campylobacter se agrupan
en "complejos clonales" definidos como grupos de ST que comparten un
mínimo de cuatro alelos idénticos o más loci con un ST que se ha definido
como un "genotipo central" (Colles & Maiden, 2012).
27
El uso de un complejo clonal como una unidad primaria de análisis ha
sido de gran valor en una amplia gama de estudios de Campylobacter, y
el análisis de la secuencia del genoma completo han confirmado que los
miembros del complejo clonal corresponden a linajes bacterianos, cuyos
miembros comparten un ancestro común y, por lo tanto comparten
propiedades fenotípicas (Dingle, McCarthy, Cody, Peto, & Maiden, 2008).
Los complejos ST-21 y ST-45, son particularmente diversos y se aíslan
con frecuencia en una amplia variedad de fuentes, en la tabla 6 se
observa la distribución de los aislados con fuentes comunes reportados
entre complejos clonales seleccionados, dichos complejos clonales
muestran marcadas diferencias en la probabilidad de estar asociados con
las fuentes de aislamiento particulares (Dingle et al., 2008).
Tabla 6. Principales complejos clonales y su fuente.
28
Fuente: pubMLST, 2012
Elaboración: El autor
PCR-RFLP
La diversidad dentro de C. jejuni y C. coli ha sido bien establecida y es
detectable tanto en niveles fenotípicos como genotípicos (T. M.
Wassenaar & Newell, 2000), son pocos los métodos fenotípicos
(serotipificación, biotipificación, tipificación por fagos) que diferencien
satisfactoriamente una especie o subespecie. Este inconveniente se
agrava porque todos ellos revelan una enorme diversidad (Giacoboni,
Echeverría, & Perfumo, 2005).
Los métodos moleculares basados en la amplificación del ADN son una
gran alternativa para la detección de microorganismos, la detección
basada en PCR ofrece varias ventajas como rapidez, especificidad y
sensibilidad. En la actualidad, una serie de métodos basados en PCR han
sido reportados para la detección de Campylobacter en distintos tipos de
muestras (Mateo, Cárcamo, Urquijo, Perales, & Fernández-Astorga,
2005).
Actualmente, la biología molecular aporta una amplia variedad de técnicas
para subtipificar genotípicamente al Campylobacter spp. Debido al hecho
que las cepas individuales difieren en su patogénesis y virulencia, es
necesario genotipificar las cepas de Campylobacter spp. (Steinhauserova
et al., 2002). Métodos de genotipado disponibles se han revisado
recientemente, e incluyen la electroforesis en gel de campo pulsado
(PFGE), amplificación aleatoria de ADN polimórfico (RAPD) y el
polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados (AFLP). Si bien cada
uno de estos métodos tiene sus potenciales ventajas y desventajas
variando las demandas en el equipo, tiempo y el costo de las pruebas. La
genotipificación del gen flagelar A mediante la reacción en cadena de la
polimerasa seguida por la digestión con enzimas de restricción o
29
polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (PCR-RFLP) se
ha convertido en una técnica de rutina debido a su velocidad y simplicidad
(C.S. Harrington et al., 2003).
El locus del gen de flagelina de C. jejuni contiene dos genes Fla A y Fla B,
que están dispuestos en tándem y están separados por aproximadamente
170 nucleótidos. Debido a que ambos presentan regiones variables este
locus es adecuado para el análisis por RFLP. Las regiones variables de
este locus también están parcialmente presentes en especies distintas de
C. jejuni. Por lo tanto, los cebadores utilizados para desarrollar un sistema
de tipificación de C. jejuni puede ser utilizado para generar sistemas
similares para los patógenos relacionados. De hecho la tipificación de Fla
A ha demostrado ser útil para la mayoría de cepas de C. coli y algunas
cepas de Campylobacter lari, Campylobacter helveticus y C. jejuni subsp.
Doylei (Wassenaar & Newell, 2000).
La técnica de PCR-RFLP para el gen Fla A se basa en la amplificación del
gen de la flagelina por PCR, seguida de la digestión con enzimas que
generen fragmentos. La diferencia en la distribución de los sitios de
restricción en los genes Fla entre las cepas generarán fragmentos de
diferente tamaño y por lo tanto un modelo de banda diferente, que se
visualizará cuando se los separa por electroforesis (Giacoboni et al.,
2005).
Las enzimas de restricción que se han utilizado para generar los
fragmentos de productos de PCR también difieren significativamente. Las
enzimas Alu I, DdeI, Hin Fi, EcoRI y PstI se utilizan en todo momento, en
diversas combinaciones. La digestión con Hin Fi por sí sola no es
suficientemente discriminatoria, mientras que AluI produce bandas que
son demasiado pequeñas para ser analizadas. La enzima DdeI parece
proporcionar la mejor discriminación, al menos para los aislamientos de
origen animal (Wassenaar & Newell, 2000).
Dentro de la oferta de posibilidades de las técnicas de biología molecular,
la elección depende del objetivo del trabajo y las posibilidades de acceder
30
a ellas, pues requieren un equipamiento especial y altos costos en los
elementos que se utilizan para realizarlas.
31
CAPÍTULO III
32
33
METODOLOGÍA
Tipo de investigación
El tipo de investigación de este proyecto es observacional, descriptiva con
identificación de casos.
Diseño de la investigación
En el presente proyecto se utilizó un diseño observacional descriptivo, se
estudió en un grupo de cepas características de interés, sin manipulación
deliberada de las variables.
Descripción de la zona de estudio
El trabajo de laboratorio para la genotipificación de cepas de
Campylobacter jejuni, pertenecientes al banco de cepas, se realizó en el
laboratorio de Bacteriología y en el laboratorio de Biología Molecular de la
Facultad de Medicina Veterinaria Y Zootecnia, ambos laboratorios son
parte de la Universidad Central del Ecuador y se encuentran ubicados en
las calles Jerónimo Leiton y Gato Sobral, dentro de la ciudadela
Universitaria, cantón Quito, en la provincia Pichincha.
Población
La población objeto de estudio correspondió al banco de cepas de
Campylobacter spp. del Laboratorio de Bacteriología de la FMVZ, del
proyecto: “Estudio de Prevalencia de Escherichia coli BLEE,
Campylobacter spp. y Salmonella spp. en el tracto gastrointestinal de
pollos faenados en camales industriales de la Provincia de Pichincha”.
Muestra
Se trabajó con cepas de Campylobacter spp. de origen aviar, la
tipificación molecular y posterior genotipificación del gen Fla A se realizó
en las cepas positivas a C. jejuni. Se tomaron las cepas de 2 muestreos
de un total de 5, pertenecientes a la empresa cuyo código es 1CT.
34
En la siguiente tabla se detalla el número de muestras que se tomó
durante la investigación, así como el código y el punto de muestreo
respectivo.
Tabla 7. Muestras de Campylobacter spp. pertenecientes al banco de cepas, que se tomaron
durante la investigación.
MUESTREO 1 MUESTREO 2
Punto Crítico Número de muestra
Número de Cepas
Punto Crítico Número de muestra
Número de Cepas
Después del Desplume
P1 20 Después del Desplume
P1 20
P2 20 P5 19
Eviscerado E1 17 Eviscerado E2 19
E2 20 E4 19
Antes del Pre-chiller
A1 20 Antes del Pre-chiller
A1 20
A2 20 A5 13
Después del Chiller
D1 8 Después del Chiller
D1 20
D2 20 D4 6
Total: 145 Total: 136
Fuente: Investigación Directa
Elaboración: El autor
Procedimientos de la Investigación
El presente trabajo de investigación se llevó a cabo en tres etapas:
recolección de la información, procesamiento de las muestras en el
laboratorio y procesamiento de la información obtenida.
1. Recolección de la información
Los códigos de las cepas, las muestras a la cual estas pertenecen y el
punto crítico de control de faenamiento de donde provienen (tabla 1), se
obtuvieron a partir de la base de datos del proyecto “Estudio de
Prevalencia de Escherichia coli BLEE, Campylobacter spp. y Salmonella
spp. en el tracto gastrointestinal de pollos faenados en camales
industriales de la Provincia de Pichincha”.
35
2. Procesamiento de las muestras en el laboratorio
2.1 Fase microbiológica
Técnica de aislamiento de Campylobacter spp.
Procedimiento de siembra
Se descongelaron las cepas de Campylobacter spp. almacenadas en un
criocongelador a -80oC, se tomó una asada del microtubo y se realizó una
estriación simple del inóculo bacteriano en una caja petri con el medio
MCCDA OXOID® CM0739. Luego de la siembra las muestras se
incubaron en microaerofilia (5-6% de oxígeno, 10% CO2 y 84-85%
nitrógeno) por 48 horas a 42°C (Poma V., 2014).
Extracción de ADN.
Se seleccionó con un asa varias colonias de cada cepa, éstas se
suspendieron y homogenizaron en 300 µl de buffer TE en tubos
Eppendorf® de 1.5 ml. Los tubos se colocaron en un termo bloque a
100oC durante 10 minutos. Se centrifugaron y el sobrenadante se guardó
a -20oC.
2.2 Genotipificación Molecular
Para la genotipificación se siguieron 3 procedimientos: tipificación
molecular mediante PCR Multiplex, amplificación del gen Fla A en cepas
C. jejuni (PCR-Fla A), y digestión del gen Fla A con la enzima Ddel.
Tipificación molecular mediante PCR Multiplex
Se siguió el protocolo descrito por (Vandamme et al., 1997). Se realizó un
mastermix en un tubo Eppendorf® de 1,5 ml y se dispensó 24 μl de
solución en tubos de reacción para PCR de 200ul. Para la amplificación
36
específica del producto de PCR (C. coli y C. jejuni) se utilizaron los
cebadores descritos en la tabla 8.
Tabla 8. Primers PCR Multiplex (Campylobacter coli y Campylobacter jejuni).
Fuente: Vandamme et al., 1997
Elaboración: El autor
La mezcla de reacción de PCR (25 μl) estaba compuesta por: tampón de
PCR (GoTaq® Flexi Buffer 5X) 5 μl, MgCl2 (1.5 μl), cebadores (0.2 μl),
TAQ (GoTaq® DNA Polymerase) (0.25 μl), dNTP (Nucleotide Mix®) (0.25
μl), agua ultrapura (Nuclease-Free Water®) (15.7 μl) y se añadió 1 µl de
muestra de ADN para completar el volumen final por reacción. Los tubos
de reacción para PCR se colocaron en el termociclador con los siguientes
datos (tabla 9).
GEN PRIMERS TAMAÑO
C. Coli Forward COL1 (5 '-AGG CAA GGG AGC CTT TAA TC-3') 364pb
Reverse COL2 (5'TAT CCC TAT CTA CAA ATT CGC-3')
C. jejuni Forward JUN3 (5 '-CAT CTT CCC TAG TCA AGC CT-3') 773pb
Reverse JUN4 (5 '-AAG ATA TGG CTC TAG CAA CAG-3')
Programa Temperatura Tiempo Ciclos
Desnaturalización inicial 94°C 5min 1
Desnaturalización 94°C 1min
2
Alineación de Primers 64°C 1min
Extensión de la Cadena 72°C 1min
Desnaturalización 94°C 1min 2
Alineación de Primers 62°C 1min
Extensión de la Cadena 72°C 1min
Desnaturalización 94°C 1min 2
Alineación de Primers 60°C 1min
Extensión de la Cadena 72°C 1min
Desnaturalización 94°C 1min 2
Alineación de Primers 58°C 1min
Extensión de la Cadena 72°C 1min
Desnaturalización 94°C 1min 2
Alineación de Primers 56°C 1min
Extensión de la Cadena 72°C 1min
Desnaturalización 94°C 1min 30
Alineación de Primers 54°C 1min
Extensión de la Cadena 72°C 1min
Elongación final 72°C 10 min 1
37
Tabla 9. Programa para termociclador PCR Multiplex.
Fuente: (Vandamme et al., 1997)
Elaboración: El autor
Electroforesis
Los productos de la PCR se detectaron por electroforesis en gel de
agarosa al 1%. En 50ml de TBE a 0,5X, se agregó 0,5g de agarosa (Ultra
Pure Agarose InvitrogenTM) se calentó la mezcla en un horno microondas
hasta que se disolvió por completo. A esta mezcla se agregó 5µl de
SYBER® Safe y se agitó la solución hasta homogenizarla. Se vertió la
mezcla en un molde y se colocó un peine para separar cada reacción de
PCR, una vez solidificado el gel se colocó en la cámara de electroforesis
a 100 V, 400 mA por 30 min. En cada pocillo moldeado por el peine, se
añadió 5 µl de producto amplificado más 2 µl de buffer de carga (5X verde
GoTaq Flexi Buffer, Promega).También se incluyó un marcador de
tamaño molecular de 100 pb (Bench Top 100bp DNA Ladder Promega),
dos controles positivos C. jejuni (773 pb) y C.coli (364 pb) y una muestra
en blanco que sólo contenía la mezcla de reacción. El resultado se
visualizó en un transiluminador y se registró en un sistema de foto
documentación digital.
Fla A–RFLP
Para la amplificación específica del gen Fla A de1.728 pb se utilizó los
siguientes cebadores: CJUNF (5 '-GGA TTT CGT ATT ACA CAA ATG
GTG C- 3') y CJUNR (5 '-CTG TAG TAA TCT TAA AAC ATT TTG- 3')(T
M Wassenaar & Newell, 2000).
La mezcla de reacción de PCR (25 μl) contenía: tampón de PCR 5X (5 μl),
MgCl2 25 mM (1.5 μl), cebadores 100 pmol (0.25 μl), TAQ 5U/l (0.2 μl),
dNTP 10 mM de cada uno (0.25 μl), agua ultrapura (16,55 μl), muestra de
ADN (1 μl).
38
La reacción incluyó desnaturalización inicial de ADN a 94 ° C durante 60
seg, seguido de 30 ciclos a 94 °C durante 15 seg (desnaturalización), 45
°C durante 45 seg (hibridación), 72 ° C durante 150 seg (extensión), y una
extensión final a 72 ° C durante 5 min.
Los productos de PCR se detectaron por electroforesis en gel de agarosa
al 1% con el procedimiento descrito anteriormente.
PCR-RFLP
Después de la amplificación, los productos de ADN fueron digeridos con
la enzima DdeI (Ddel Promega), con secuencia de reconocimiento: 5’
…CTNAG…3’, 5’ …GANTC …3’ la reacción se llevó a cabo en un
volumen final igual a 20.5 µl que contenía; 20 µl producto amplificado y
0.5 µl de enzima y se incubó durante 30 minutos a 37ºC (Messens,
Herman, De Zutter, & Heyndrickx, 2009).
El producto digerido se analizó mediante electroforesis en gel de agarosa
al 2% 100 V, 400 mA por 2 horas. En cada pocillo moldeado por el peine
se añadió los 20.5 µl de producto digerido más 5 µl de buffer de carga,
también se incluyó un marcador de tamaño molecular de 100 pb y para
una mejor visualización, el gel se dispuso en el siguiente orden: Escalera -
nueve muestras - escalera - ocho muestras – escalera.
El resultado se visualizó en un transiluminador y se registró en un sistema
de foto documentación digital.
3. Procesamiento de la información obtenida
A. Técnica de procesamiento de los datos
Se realizó un análisis por computador de las imágenes usando
GelCompar II® - (Applied Maths. Belgium), los datos se importaron para
su posterior asignación de bandas.
B. Análisis de los datos
39
Los códigos y resultados se almacenaron en una base de datos y se
analizaron con el algoritmo de Unweighted Pair Group Method with
Arithmetic Mean (UPGMA) y una posición de tolerancia del 2% para la
generación de dendogramas.
CAPÍTULO IV
40
41
RESULTADOS
Después de realizar la PCR Multiplex se observaron bandas específicas
para Campylobacter jejuni de 773pb y Campylobacter coli de 364pb.
(Fig.2)
Figura 2. Electroforesis en gel de agarosa muestran bandas específicas para C. jejuni y C. coli.
Ladder. Escalera de 100 pb, Ctrl coli +. Control positivo C. coli (364pb), Ctrl jejuni +. Control
positivo C. jejuni (773pb) Crtl -. Control negativo Agua.
42
De las 281 cepas analizadas, el 56.9% (160) resultaron positivas a C.
jejuni, 17.7% (50) positivas a Campylobacter coli, 4.9% (14) positivas a C.
jejuni-C. coli y 20.2% (57) fueron negativas. Estos resultados se muestran
en la figura 3.
De las 281 cepas analizadas el 51.6% (145) correspondieron al muestreo
1 y 48.3% (136) correspondieron al muestreo 2. Las proporciones C.
jejuni, Negativas, C. coli, y C. jejuni-C. coli en los 2 muestreos, se pueden
visualizar en la figura 4.
57% 18%
5%
20%
C. jejuni
C. coli
C. jejuni-C. coli
Negativas
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Campylobacter jejuni Negativas Campylobacter coli C. jejuni-C. Coli
Muestreo 1 Muestreo 2
Figura 3. Relación Porcentual de las especies identificadas.
Figura 4. Relación Porcentual de las especies identificadas de acuerdo a cada muestreo (1-2).
43
90%
10%
Fla A
Negativas
Figura 6. Relación Porcentual de cepas positivas al gen Fla A.
Ladd
er
16P
1.3
72P
2.3
84P
2.3
1114
P2.3
1215
P2.3
1316
P2.3
149E
1.3
159A
2.3
Ladd
er
1610
A2.3
1711
A2.3
1817
A2.3
195D
1.3
222D
2.3
3911
P1.3
4113
A2.3
Ladd
er
Se tomaron únicamente las cepas de C. jejuni para la amplificación del
gen Fla A, después de realizar la PCR se observó la amplificación
específica del gen Fla A de1.728 pb, (Fig. 5).
De las 160 cepas de C. jejuni analizadas, el 90% (144) resultaron
positivas para la presencia del gen Fla A (Fig. 6).
Se
obtuvi
eron
patron
es de
banda
s para
Figura 5. Electroforesis en gel de agarosa muestran bandas específicas para el gen Fla A en
aislados de C. jejuni. Ladder. Escalera de 100 pb, Ctrl +. Control positivo Fla A (1.728 pb), Crtl -.
Control negativo agua.
Figura 7. Electroforesis en gel de agarosa al 2% de los perfiles de PCR-RFLP de Fla A digeridos con
la endonucleasa Ddel en aislados de C. jejuni. Ladder. Escalera de 100 pb usada como marcador
molecular.
44
144 cepas de C. jejuni (Fig. 7).
En total, 144 aislamientos de C. jejuni se tipificaron con éxito por el
método Fla A-PCR-RFLP (32 aislamientos para el muestreo 1 y 112 para
el muestreo 2), en la Figura 8 se muestra un dendograma denotando las
relaciones genotípicas entre las cepas de los dos muestreos. Este
dendograma demostró que las cepas se agrupan genotípicamente en dos
grupos, pertenecientes a cada muestreo.
45
Figura 8. Dendograma basado en del análisis numérico (UPGMA) (2% optimización, 2% de
tolerancia) muestra la diversidad de las cepas a nivel de muestreo. Muestreo 1.
31
70
67
100
100
84
30
41
29
69
75
35
51
77
89
100
95
100
80
80
81
94
83
84
84
78
RFLP FlaA Q 10-3
100
99
98
97
96
95
94
93
92
91
90
89
88
87
86
85
84
83
82
81
80
79
78
77
76
75
74
73
72
71
70
69
68
67
66
65
64
63
62
61
60
59
58
57
56
55
54
53
52
51
50
49
48
47
46
45
44
RFLP FlaA Q
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A1.
E4.
A1.
P1.
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D1.
E4.
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A5.
E2.
E4.
P5.
A5.
E2.
E2.
E4.
D1.
E2.
P5.
A1.
P5.
A1.
P5.
A1.
P5.
E2.
E4.
D1.
E4.
P5.
D1.
E2.
P5.
A5.
D1.
E2.
E4.
A5.
E2.
P5.
E2.
E4.
P5.
A1.
E2.
P5.
P5.
A5.
E2.
E4.
E4.
E4.
E4.
E4.
E4.
E2.
A1.
A1.
P5.
A1.
A5.
D1.
D1.
P1.
E2.
E2.
A1.
D1.
D1.
D1.
P1.
P1.
P1.
P1.
E2.
E4.
P1.
P5.
P1.
A5.
E2.
D1.
D1.
D1.
P1.
A1.
P1.
A1.
P1.
A1.
P1.
A1.
A1.
D1.
P1.
P1.
A1.
D1.
D1.
D1.
D1.
E4.
A1.
E2.
E4.
E2.
P1.
P1.
A5.
A5.
A5.
A2.
A1.
D2.
D2.
E1.
D2.
P2.
P1.
E1.
P2.
P2.
P2.
P2.
E1.
E1.
P1.
P1.
A2.
E2.
E2.
A2.
P1.
D1.
P1.
A2.
A2.
P2.
P1.
A2.
A2.
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46
Muestreo 2.
En el muestreo 1, los 32 aislamientos se tipificaron con éxito y 11
genotipos diferentes fueron definidos por el método Fla A-PCR-RFLP. El
genotipo con patrón de bandas más frecuente de los aislamientos fue 1.7
(25%) (Tabla 10). El genotipo 1.11 está representado por un único
aislado.
Tabla 10. Resultados de los patrones de banda presentes en el muestreo 1 y los
diferentes genotipos presentes en los distintos puntos críticos.
El análisis filogenético basado en el dendrograma ubicó a los genotipos
en 3 clústers: 18.1% (2) de los 11 genotipos fueron encontrados en el
grupo I y el 54.5% (6/11) y el 27.2% (3/11) de los genotipos pertenecían a
los grupos II y III, respectivamente (Fig. 9).
GENOTIPOS DEFINIDOS EN EL MUESTREO 1
Genotipos Después del Desplume
(P)
Eviscerado (E)
Antes del Pre-chiller
(A)
Después del Chiller (D)
Total
1.1 0(0%) 0(0%) 2(20%) 0(0%) 2(6.2%)
1.2 0(0%) 0(0%) 2(20%) 0(0%) 2(6.2%)
1.3 0(0%) 0(0%) 2(20%) 1(25%) 3(9.3%)
1.4 0(0%) 0(0%) 0(0%) 1(25%) 1(3.1%)
1.5 0(0%) 1(16.6%) 0(0%) 1(25%) 2(6.2%)
1.6 2(16.6%) 0(0%) 0(0%) 0(0%) 2(6.2%)
1.7 5(41.6%) 3(50%) 0(0%) 0(0%) 8(25%)
1.8 1(8.3%) 0(0%) 1(10%) 0(0%) 2(6.2%)
1.9 2(16.6%) 2(33.3%) 2(20%) 1(25%) 7(21.8%)
1.10 1(8.3%) 0(0%) 1(10%) 0(0%) 2(6.2%)
1.11 1(8.3%) 0(0%) 0(0%) 0(0%) 1(3.1%)
Total 12(37.5%) 6(18.7%) 10(31.2%) 4(12.5%) 32(100%)
47
Desplume Evisceración Pre-enfriamiento Post-enfriamiento
Figura 9. Dendograma del muestreo 1 basado en del análisis numérico (UPGMA) (2% optimización, 2%
de tolerancia).
48
En el muestreo 2, 112 aislamientos se tipificaron y 15 genotipos diferentes
se definieron. El genotipo con patrón de banda más frecuente fue 2.4
(35.7%) (Tabla 11). Tres genotipos (2.6, 2.10, 2.15) están representados
por un único aislado.
Genotipos definidos en el muestreo 2
Genotipos
Después del Desplume
(P)
Eviscerado (E)
Antes del Pre-chiller
(A)
Después del Chiller
(D)
Total
2.1 0(0%) 2(5.7%) 0(0%) 0(0%) 2(1.7%)
2.2 1(3%) 3(8.5%) 1(3.8%) 0(0%) 5(4.4%)
2.3 1(3%) 10(28.5%) 3(11.5%) 0(0%) 14(12.5%)
2.4 13(39.3%) 13(37.1%) 9(34.6%) 5(27.7%) 40(35.7%)
2.5 2(6%) 0(0%) 0(0%) 0(0%) 2(1.7%)
2.6 1(3%) 0(0%) 0(0%) 0(0%) 1(0.8%)
2.7 0(0%) 0(0%) 0(0%) 2(11.1%) 2(1.7%)
2.8 1(3%) 2(5.7%) 2(7.6%) 3(16.6%) 8(7.1%)
2.9 6(18.1%) 0(0%) 0(0%) 0(0%) 6(5.3%)
2.10 0(0%) 1(2.8%) 0(0%) 0(0%) 1(0.8%)
2.11 2(6%) 1(2.8%) 1(3.8%) 2(11.1%) 6(5.3%)
2.12 4(12.1%) 0(0%) 6(23%) 6(33.3%) 16(14.2%)
2.13 2(6%) 3(8.5%) 0(0%) 0(0%) 5(4.4%)
2.14 0(0%) 0(0%) 3(11.5%) 0(0%) 3(2.6%)
2.15 0(0%) 0(0%) 1(3.8%) 0(0%) 1(0.8%)
Total 33(29.4%) 35(31.2%) 26(23.2%) 18(16%) 112(100%)
Tabla 11. Resultados de los patrones de banda presentes en el muestreo 2 y los diferentes
genotipos presentes en los distintos puntos críticos.
En el dendrograma se ubicó a los genotipos en 3 clústeres (40%) 6 de los
15 genotipos fueron encontrados en el grupo I y el 53.3% (8/15) en el
grupo 2 y un solo genotipo el 6.6% pertenecían al grupo III (Fig. 10).
49
Desplume Evisceración Pre- enfriamiento Post-enfriamiento
Figura 10. Dendograma del muestreo 2 basado en el análisis numérico (UPGMA) (2% optimización, 2% de
tolerancia).
50
DISCUSIÓN
El objetivo del presente estudio fue genotipificar el gen Fla A en cepas de
Campylobacter jejuni pertenecientes al banco de cepas de la Facultad de
Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Central del Ecuador,
mediante la técnica de PCR-RFLP. De las 160 cepas de C. jejuni
analizadas, el 90% se genotipificaron con éxito, generando diversos
dendogramas donde varios genotipos fueron definidos. La técnica de la
PCR multiplex demostró ser una herramienta rápida, simple y práctica
para la identificación de especies de Campylobacter, corroborando varios
estudios realizados en Dinamarca, Canadá y Japón (On & Jordan, 2003;
Persson & Olsen, 2005; Wang et al., 2002; Yamazaki-Matsune et al.,
2007) y los recientemente realizados en Ecuador (Medina J., 2015; Poma
V., 2014). C. jejuni demostró ser la especie más prevalente con 56.9%, C.
coli se presentó con 17.7%. El 4.9% de las muestras tuvieron
amplificación de secuencias específicas de cada especie mientras el
20.2% no mostraron amplificación para ninguna especie, pudiendo
tratarse de especies distintas a las estudiadas. La mayor prevalencia de
C. jejuni es similar a una investigación realizada en un matadero de aves
en Francia con una presencia de C. jejuni de 80% (Rivoal, Denis, Salvat,
Colin, & Ermel, 1999) por otra parte estos resultados difieren con
investigaciones realizadas en Ecuador donde la mayor prevalencia se da
en C. coli (Medina J., 2015; Poma V., 2014). En este estudio se usó el
método de genotipificación por PCR-RFLP para exponer la diversidad
genética entre las cepas de Campylobacter spp. como lo ha comprobado
otro estudio realizado en Dinamarca (C.S. Harrington et al., 2003). De las
160 cepas de C. jejuni analizadas, el 90% resultaron positivas a la
presencia del gen Fla A. La genotipificación brindó datos para poder
discriminar diferentes genotipos con éxito, como lo han demostrado varios
estudios realizados en Dinamarca y Estados Unidos en los que se evaluó
varios métodos de PCR-RFLP para la genotipificación de C. jejuni (C.S.
Harrington et al., 2003; I Nachamkin, Bohachick, & Patton, 1993). En el
presente estudio, se obtuvieron 3 dendogramas, el primero muestra que
51
los genotipos de cada muestreo son diferentes y se encuentran
agrupados según su respectivo muestreo. Estos hallazgos concuerdan
con investigaciones que indican que varios genotipos de Campylobacter
spp., se pueden encontrar dentro de una misma población avícola (Alter,
Weber, Hamedy, & Glünder, 2011; Chuma, Makino, Okamoto, & Yugi,
1997).
Este estudio reveló una gran diversidad de genotipos en puntos críticos
entre diferentes muestreos, los dendogramas del muestreo 1 y 2
generaron 11 y 15 genotipos respectivamente. Estos resultados difieren
con otros estudios realizados en un banco de cepas de Campylobacter
spp. de origen aviar en Estados Unidos donde se definieron 19 genotipos
(Behringer, Miller, & Oyarzabal, 2011) y sobre aislados en un camal de
cerdos con tan solo 4 genotipos definidos (J. E. Moore et al., 2002). En el
dendograma del muestreo 1 el genotipo 1.9 está presente en todos los
puntos críticos de faenamiento mientras que en muestreo 2, 3 genotipos
están presentes a lo largo de todo el proceso (2.4, 2.8 y 2.11) lo que
demuestra la presencia y contaminación de diversos genotipos a nivel de
todo el proceso de faenamiento como lo han demostrado Rivoal et al.,
(1999), quienes realizaron un análisis de contaminación cruzada en un
camal en distintos lotes de aves. Al examinar la asociación genética de C.
jejuni en el muestreo 1 y 2, los genotipos se agruparon en tres clústers
que se diferencian por el número de genotipos que representa cada uno
según su similitud, la mayoría de genotipos se encontraron en el clúster 2
en ambos muestreos. Las diferencias en la variación genética entre cepas
de C. jejuni ha sido bien documentada, en las que se ha demostrado que
C. jejuni es el más activo al intercambio de alelos sobre otras especies
como C.coli y C. lari (Meinersmann, Patton, Evins, Wachsmuth, & Fields,
2002). Estas observaciones apoyan la hipótesis que mediante la
generación de diversidad genética, C. jejuni puede mejorar su aptitud
fenotípica para sobrevivir y colonizar lotes posteriores (Parkhill et al.,
2000; Ridley, Toszeghy, Cawthraw, Wassenaar, & Newell, 2008). Los
diferentes resultados de este estudio con respecto al número de
52
genotipos obtenidos y su presencia en los diferentes puntos podrían ser
explicados por la diversidad geográfica, diferencia del origen de las cepas
y diferente número de los aislados en comparación con otros estudios
(Carreira, 2015; C.S. Harrington et al., 2003; Miwa, Takegahara, Terai,
Kato, & Takeuchi, 2003; Rivoal et al., 1999). Estos hallazgos indican que
el análisis RFLP puede contribuir a los estudios epidemiológicos de C.
jejuni en la contaminación de camales y sugieren el riesgo de
contaminación cruzada con diferentes genotipos de C. jejuni en el proceso
de faenamiento industrial de pollos broiler (Chuma et al., 1997; C.S.
Harrington et al., 2003). Sin embargo el reagrupamiento de las secuencias
de genes y la recombinación argumentan en contra de la estabilidad a
largo plazo de la genotipificación de Fla A como lo han expuesto varios
estudios en los que se ha demostrado la recombinación dentro y entre los
loci de Fla A en C. jejuni (C S Harrington, Thomson-Carter, & Carter,
1997). Los resultados expuestos en esta investigación servirán como
referencia para posteriores estudios epidemiológicos de Campylobacter
spp. en la cadena productiva de carne de pollo.
53
54
CAPÍTULO V
55
56
CONCLUSIONES:
Se identificó Campylobacter jejuni. como la especie con mayor
prevalencia en los todos los puntos críticos de faenamiento de
pollos broiler.
Se demostró que varios genotipos de C. jejuni están presentes en
los distintos puntos críticos de control de forma secuencial, lo que
confirma que existe una contaminación cruzada de las carcasas
durante el proceso de faenamiento de pollos de engorde.
57
RECOMENDACIONES:
Identificar las especies de Campylobacter spp. presentes en las
muestras que no pudieron ser diagnosticadas con los primers
utilizados.
Mejorar el método de extracción de ADN con la utilización de kits.
Añadir al estudio muestras de contenido cecal para comprender el
aporte de los genotipos de C. jejuni de granja en el proceso
industrial.
58
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70
ANEXOS
Anexo 1. Detalles y especificaciones de los materiales que se usaron
para la genotipificación.
MATERIALES FÍSICOS
Procesamiento Genotipificación Campylobacter spp:
Guantes estériles XS
Puntas con filtro 10 µl Bolsa Marca Axygen
Puntas con filtro 20 µl Bolsa Marca Axygen
Puntas con filtro 30 µl Bolsa Marca Axygen
Puntas con filtro 50 µl Bolsa Marca Axygen
Puntas con filtro 100 µl RACK Marca Axygen
Puntas con filtro 300 µl RACK Marca Axygen
Puntas con filtro 1000 µl RACK Marca Axygen
Tubos para 1,5 ml Ependorf®
Tubos para PCR de 200 ul Marca Axygen
PCR-Cooler 0,2 ml Ependorf®
Gradilla Congelada
Gradilla plástica para tubos de 2ml
Pinza anatómica diente de ratón
Marcador permanente punta fina Faber-Castell
Cajas de cartón criogénicas (130mm x 130mm)
PCR-Cooler 0,2 ml Ependorf®
Gradilla plástica para tubos de 2ml
Guantes estériles XS
Puntas sin filtro 10 µl Bolsa Marca Axygen
71
ELECTROFORESIS
Guantes estériles XS
Bata descartable
Frasco de tapa azul de 250 ml
Probeta Graduada 50 ml
Probeta Graduada 1000 ml
Molde para gel de Agarosa
Peines
Fundas pasticas 6cm x10cm
Etiquetas Adhesivas
Parafilm
Tijeras
Rollo de Papel
MATERIALES QUÍMICOS
Procesamiento
GoTaq® Flexi Buffer 5X Green buffer Lote 0000084758
Kit Go Taq G2® Flexi DNA Polymerase, Promega, Lote
106023, Madison USA
MgCl2 Solution, 25mM1, Promega Lote 0000084758
PCR Nucleotide Mix, 10mM, Promega Lote 0000084758
Nuclease-Free Water to
Primers de Campylobacter coli 1 SY140127478-001
,SYGMA
Primers de Campylobacter coli 2 SY140127481-005,
SYGMA
Primers de Campylobacter jejuni 3 SY130807052-019
SYGMA
Primers de Campylobacter jejuni 4 SY130807052-020
SYGMA
Primer CJUNF 5 '-GGA TTT CGT ATT ACA CAA ATG GTG
C- 3'
72
Primer CJUNR 5 '-CTG TAG TAA TCT TAA AAC ATT TTG-
3'
Enzima DdeI (Enzima Fast Digest,Thermoscientific)
Tampón de enzima HPyF 31 (FastDigest Buffer,
Thermoscientific)
Marcador de peso molecular 100bp DNA Ladder
INVITROGENTM, Lote:1430972
Loading Buffer ® Promega
SYBER®Safe, DNA gel Stain, Invitrogen Lote 1430972
TBE 5 x, CHEM CruzTM
Ultra PureTM Agarose Invitrogen Lote: 373099.
MATERIALES BIOLÓGICOS:
Cepas Campylobacter spp preservadas en glicerol
ADN proveniente de cepas Campylobacter spp.
EQUIPOS
Procesamiento de PCR simple:
o PRE-PCR
Pipeta (Rango: 0,2-2ul) marca Gilson, modelo pipetman, Nº
serie CE54359
Pipeta (Rango: 1 - 10ul) marca Gilson, modelo pipetman, Nº
serie CH57383
Pipeta (Rango: 2 - 20ul) marca Gilson, modelo pipetman, Nº
serie CD72184
Pipeta (Rango: 20-100ul) marca Gilson, modelo pipetman,
Nº serie CH56071
Pipeta (Rango: 50 - 200 ul) marca Gilson, modelo pipetman,
Nº serie CD63213
Pipeta (Rango: 200 - 1000 ul) marca Gilson, modelo
pipetman, Nº serie CG53113
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Soporte para Pipetas marca Gilson, modelo pipetman.
Refrigerador de 4", una puerta, marca General Electric, Nº
serie TAD4DO4
Congelador horizontal de 7" marca Frigidaire, modelo
FFCO723DW11, serie WB70839264
Cámara de flujo laminar marca Cleair, modelo CLB-2015-03
Purificador de agua marca Merk Millipore, modelo Direct-Q,
Nº serie 2RQ
Vortex marca Heidolph, modelo Rea-top Nº serie 129700479
Vortex marca Heidolph, modelo Rea-top Nº serie 129700479
Incubadora, Marca Haeareus. Capacidad de 155l a 35°C.
Serie 7500700
Pipeta (Rango: 0,1-2,0ul) marca Biopette Nº serie
544010504
Mini centrifugadora PRISM mini Labnet
Termociclador BioRad® C1000 TouchThermalCicler.
Software GelCompar II® - Applied Maths
Autoclave, Modelo SIM-E. Serie 058592, Markel Forge
ELECTROFORESIS
Balanza analítica eléctrica marca Mettler Toledo, modelo
AB104 Nº serie 1117023810
Refrigerador 10", dos puertas marca Indurama modelo RI-
375 Nº serie 103305420054
Pipeta (Rango: 05-10ul) marca Biopette Nº serie 544020620
Pipeta (Rango: 10-100ul) marca Biopette Nº serie
544040199
Pipeta (Rango: 100-1000ul) marca Biopette Nº serie
544061420
74
Transluminador marca Labnet modelo TM-26 Nº serie
U1000-562
Cámara de Electroforesis horizontal marca Labnet modelo
XL ULTRA V-2 Nº serie 00866
Fuente de poder para electroforesis marca Fhisher modelo
FB 300
Microondas marca Panasonic Nº serie 6B07030259
Congelador vertical de 17" marca Frigidaire modelo
FFU1764FW4 Nº serie WB71026007
Sistema digital de Foto documentación de Geles marca DNR
modelo Minilumi Nº serie 9000362,00
Fuente de Poder marca Bio-Rad modelo AC-Converter Nº
serie TC-200W
UPS Samrt Tower Hospital Medical marca AVR
