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CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA -CONCYT-

SECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA -SENACYT-

FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA -FONACYT-

UNIVERSIDAD DEL VALLE DE GUATEMALA

INFORME FINAL

“Evaluación del efecto de la aplicación de ácido acetilsalicílico en el

mejoramiento del sistema de resistencia sistémica adquirida (RSA) de

plantas de tomate susceptibles a virus.”

PROYECTO FODECYT No. 033-2009

Dra. Mónica Orozco

Investigador Principal

GUATEMALA, 1 de mayo de 2011.

ii

EQUIPO DE INVESTIGACION

Dra. Mónica Orozco – Investigador Principal

Licda. Margarita Palmieri – Investigador Asociado

Sr. Wilfredo López – Técnico de Laboratorio

Sr. Erik Pérez – Técnico de Invernadero

iii

AGRADECIMIENTO

La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro

del Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología, -FONACYT-, otorgado por La Secretaría

Nacional de Ciencia y Tecnología -SENACYT- y al Consejo Nacional de Ciencia y

Tecnología -CONCYT-.

iv

OTROS AGRADECIMIENTOS

Queremos agradecer a todos las personas que contribuyeron a llevar a cabo este

proyecto. Al Laboratorio de Protección Vegetal de la Universidad del Valle de

Guatemala, quién nos brindó apoyo a través del uso de sus instalaciones de laboratorio,

equipo, vehículos y apoyo logístico. Al personal del Laboratorio de Protección Vegetal,

quien desinteresadamente colaboró con este proyecto, en especial a los señores Leonel

Marroquín, Marlon Mejía y a Julio Granados. Especiales agradecimientos al Ing. Luis

Fernando Orellana de Bayer Crop Science, Guatemala, quién nos proporcionó semillas,

pilones, asesoría y apoyo en el campo. Finalmente, a la Universidad del Valle de

Guatemala por el apoyo brindado a este proyecto.

v

ÍNDICE

Pág.

RESUMEN ix

ABSTRACT x

PARTE I

I.1 INTRODUCCIÓN 1

I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 3

I.3 OBJETIVOS E HIPOTESIS 5 I.3.1 Objetivos

I.3.1.1 General 5

I.3.1.2 Específicos 5

I.3.1.3 Hipótesis 5

I.4 METODOLOGIA

I.4.1 Localización y condiciones atmosféricas 6

I.4.2 Las Variables 1.4.2.1 Variables dependientes 6

1.4.2.2 Variables Independientes 6

I.4.3 Indicadores 6 I.4.4 Estrategia Metodológica 6

I.4.3.1 Población y Muestra 6

1.4.5 El Método

I.4.5.1 Muestreo de plantas infectadas con virus 7 I.4.5.2 Evaluación preliminar de mecanismos de transmisión y capacidad de infección de

virus

7

I.4.5.2.1 Inoculación por transmisión mecánica 8 I.4.5.2.2 Inoculación por injerto 8

I.4.5.3 Evaluación de efectos de aplicación de ácido acetilsalicílico

(AAS) en plantas indicadoras de tomate variedad Silverado 8 I.4.5.3.1 Plantas indicadoras 9

I.4.5.3.2 Inoculación con virus y tratamiento con AAS 10

I.4.5.4 Análisis de Laboratorio 11

I.4.5.4.1 ELISA para detección de virus y determinación de carga viral 11

I.4.5.4.2. Enzimas antioxidantes 11

I.4.5.4.3 Evaluación de sintomatología 12 I.4.6 La Técnica Estadística 12

PARTE II

MARCO TEÓRICO (CONCEPTUAL) 13

II.1.1 Generalidades del tomate 13

II.1.2 Cultivo del tomate 13

II.1.2.1 Requerimientos para cultivo de tomate 14

II.1.2.2 Establecimiento de las plantas 15

II.1.2.3 Variedades de tomate 16

II.1.2.3.1 Rojo temprano primero (60 días o menos para cosechar) 16

II.1.2.3.2 Mediano temprano rojo (60 a 69 días) 16

II.1.2.3.3 Cultivo principal rojo (70 días o más) 17

II.1.2.3.4 Extra grande rojo 17

II.1.2.3.5 Variedad Silverado F1 18

II.1.2.4 Producción de tomate 18

vi

II.1.3 Patologías del tomate 19

II.1.3.1 Septoria 19

II.1.3.2 Alternaria 20

II.1.3.3 Fusarium 21

II.1.3.4 Verticillium 22

II.1.3.5 Manchas bacterianas 23

II.1.3.6 Geminivirus transmitidos por mosca blanca 23

II.1.3.7 TMV, TSWV y los potyvirus 25

II.1.4 Resistencia Sistémica Adquirida (RSA): 26

II.1.4.1 Acido salicílico y especies oxigenadas reactivas (EOR) 27

II.1.4.2 Biosíntesis del ácido salicílico (AS) 28 II.1.4.3 Inducción de tolerancia a estrés por acción de ácido acetilsalicílico (AAS) 29

PARTE III

III.1 RESULTADOS III.1.1 Ensayos de infectividad 30

III.1.2 Determinación de carga viral en plantas F1 31

III.1.3 Determinación de actividad enzimática en plantas F1 y F2 34 III.1.4 Severidad de infección utilizando escala de sintomatología en generación F1 36

III.1.5 Efectos del AAS en la transmisión del virus a una segunda generación de plantas

(F2)

38

III.2 DISCUSIÓN DE RESULTADOS 39

PARTE IV

IV.1 CONCLUSIONES 42

IV.2 RECOMENDACIONES 43

IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 44

IV.4 ANEXOS 46

PARTE V

V.1 INFORME FINANCIERO 56

vii

INDICE DE FIGURAS

Figura Pág.

1 Esquema de diseño experimental que incluye inoculación y tratamiento

de plantas indicadoras de tomate………………………………………. 9

2 Tomates en proceso de maduración (A) y flor de tomate (B)………….. 13

3 Esquema de características de variedades de tomate determinadas……. 15

4 Esquema de plantas de tomate indeterminadas………………………… 16

5 Tomates variedad Mountain Spring……………………………………. 17

6 Tomates Mountain Delight (A) y Floramerica (B)……………………... 18

7 Tomate variedad Beefmaster (A)………………………………………. 19

8 Tomates variedad Silverado F1………………………………………… 19

9 Distribución de tomate alrededor del mundo…………………………… 20

10 Manchas en hojas de tomate causadas por Septoria……………………. 21

11 Sintomatología causada por Alternaria en tomate……………………… 22

12 Marchitamiento causado por Fusarium………………………………… 23

13 Marchitez de hoja y pardeamiento de tubos conductores en tomate,

causados por Verticillium………………………………………………. 23

14 Sintomatología en hojas y plantas causada por Xanthomonas…………. 24

15 Síntomas de infección con virus TMV en plantas de tomate…………... 26

16 Sintomatología ocasionada por potyvirus en plantas de tomate……….. 27

17 Daños en frutos de tomate ocasionados por TSWV……………………. 27

18 Ruta metabólica y biosintética del AS y fenilpropanoides……………... 30

19 Plantas indicadoras de datura (A), nicotiana (B) y tomate Silverado (C)

inoculadas con potyvirus……………………………………………….. 32

20 Fuente de inóculo de TSWV encontrado en el campo (A) e inoculación

de plantas indicadoras de tomate var. Silverado con este inóculo (B)…. 32

21 Plantas indicadoras de tomate Silverado control e infectadas con virus

y tratadas con AAS……………………………………………………. 32

22 Sintomatología de plantas control infectadas con TSWV y plantas

infectadas y tratadas con 25 mM AAS………………………………… 38

23 Sintomatología de plantas infectadas con TSWV tratadas con

tratamientos de 50 y 100 mM AAS……………………………………. 38

viii

INDICE DE CUADROS

Cuadro Pág.

1 Localización de plantaciones de tomate muestreadas el 30 de

noviembre, 2010 para recolección de material infectado…………… 6

2 Cronograma de procedimientos y análisis de laboratorio realizados... 10

3 Porcentajes de inefectividad de distintas plantas indicadoras con

distintos virus y métodos de inoculación……………………………. 31

4 Equivalencias de diluciones en términos decimales………………… 33

5 Carga viral de plantas indicadoras F1 infectadas con TSWV y tratadas

con AAS, evaluación realizada el día 76………………….. 34

6 Resultados de la prueba de ELISA para determinar la presencia de

TSWV en plantas de tomate v. Silverado F1 en el día 100………… 35

7

Puntaje individual y puntaje total de enfermedad (PTE) de plantas de

tomate variedad Silverado F1 control e infectadas con TSWV y

tratadas con AAS (día 76)………………………………………….. 37

8 Resultados de la prueba de ELISA para determinar la presencia de

TSWV en plantas de tomate v. Silverado F2 en el día 121…………. 39

9

Puntaje individual y puntaje total de enfermedad (PTE) de plantas de

tomate variedad Silverado F2 (inoculadas con extracto de plantas

F1)………………………………………………………………… 39

INDICE DE GRAFICAS

Gráfica Pág.

1 Curva de calibración para determinar carga viral de plantas infectadas

con TSWV, realizada el día 76………………………………………….. 33

2 Curva de calibración para determinar carga viral de plantas infectadas

con TSWV, realizada el día 100…………………………………………. 34

3 Actividad de la guayacol peroxidasa (POX) en plantas de tomate

Silverado F1 infectadas con TSWV y tratadas con AAS……………….. 35

4 Actividad de la polifenol oxidasa (PPO) en plantas de tomate F1

infectadas con TSWV y tratadas con AAS………………………………. 36

5 Actividad de la polifenol oxidasa (PPO) en plantas de tomate Silverado

F2 inoculadas con material de generación F1 de tomate Silverado……… 36

6 Actividad de la guayacol peroxidasa (POX) en plantas de tomate

Silverado F2 inoculadas con material de generación F1 de tomate

Silverado………………………………………………………………… 37

ix

RESUMEN:

Las virosis en la agricultura generan grandes pérdidas económicas a pequeños

agricultores a lo largo del territorio nacional. Para controlar la propagación de los

vectores responsables de la transmisión de estos patógenos se ha recurrido al uso de

pesticidas químicos, cuyo uso extensivo e indiscriminado ha causado daño ecológico

considerable. Varios investigadores han explorado el uso de los mecanismos de defensa

innatos de la planta como una estrategia de protección contra patógenos, uno de ellos es

la estimulación de la resistencia sistémica adquirida (RSA) de plantas por medio de la

aplicación exógena de ácido salicílico y ácido acetilsalicílico (AAS). Este estudio tenía

como propósito evaluar los efectos de la aplicación de diferentes concentraciones de

AAS (25, 50 y 100 mM) en la RSA de plantas de tomate infectadas con virus. Entre los

objetivos secundarios de la propuesta se encuentra la estandarización de una metodología

basada en ensayos de ELISA que permita cuantificar carga viral en plantas, la

implementación de un sistema de evaluación de sintomatología viral usando una escala

numérica y la evaluación de la RSA por medio de la medición de la actividad enzimática

de dos enzimas antioxidantes: la guayacol peroxidasa (POX) y la polifenol oxidasa

(PPO). Se realizaron varias pruebas con una serie de virus candidatos y métodos de

inoculación para determinar qué virus y qué metodología permitían el mayor porcentaje

de infectividad en plantas de tomate. Media vez se hizo esta selección, se implementaron

métodos de cuantificación de carga viral, escala de sintomatología y actividad enzimática

que permitieron evaluar los efectos del AAS en la RSA del tomate variedad Silverado.

Se determinó que el virus del bronceado del tomate (TSWV) inoculado mecánicamente

es el que mejor porcentaje de infectividad tiene, por lo que este virus y esta técnica

fueron utilizadas en los ensayos posteriores. Otro de los hallazgos fue que el AAS en

concentraciones de 50 mM y 100 mM es capaz de evitar la infección de TSWV

reduciendo la carga viral y la severidad de los síntomas (medidos por escala de

sintomatología), pero es importante hacer notar que se deben seguir haciendo

aplicaciones continuas para conservar el efecto protector. No obstante, el AAS no

elimina completamente el virus de la planta y una planta infectada con el TSWV y

tratada con AAS si es capaz de infectar a otras plantas sanas. En términos de actividad

enzimática, la de la POX, se ve acrecentada en situaciones cuando existe una infección

viral. Aparentemente el AAS no tiene ningún efecto en las actividades de la PPO y la

POX. En general, el uso del AAS podría ser una herramienta para control de virosis, pero

es necesario hacer más estudios que exploren la eficiencia de este producto, así como los

efectos que podría tener en el rendimiento de los cultivos.

x

ABSTRACT:

Plant viruses cause great economic losses to small farmers in Guatemala. Chemical

pesticides have been used to control the vectors responsible for the transmission of these

pathogens, with the downside that their widespread and indiscriminate use has caused

severe ecological damage to local ecosystems. Several researchers have explored the

plant´s innate defense mechanisms as a protection strategy against pathogens. One of

these mechanisms is the stimulation of the plant´s acquired systemic resistance (ASR) by

exogenous applications of salicylic acid and acetylsalicylic acid (ASA). The aim of this

study was to evaluate the effects of the application of different concentrations of ASA

(25, 50 and 100 mM) on the ASR of tomato plants infected with virus. The secondary

objectives included the standardization of an ELISA-based method that would allow

quantifying viral load in plants, the implementation of a numerical scale system to

evaluate viral symptoms, and the evaluation of ASR through the enzymatic activity of

guayacol peroxidase (POX) and polyphenol oxidase (PPO). Several tests were

performed with a series of candidate viruses and inoculation methods to determine which

virus and method would allow the highest infectivity percentage of tomato plants. Once

this was determined, the viral load quantification, symptom scale and enzymatic activity

methods were implemented, allowing the evaluation of the effects of ASA on the ASR of

Silverado tomato plants. Results indicated that the mechanical inoculation of the tomato

spotted wilt virus (TSWV) had the best infectivity percentage, which made this virus

ideal for the rest of assays to be performed. Another finding showed that concentrations

of 50 and 100 mM ASA were capable of reducing the viral load and severity of

symptoms in plants inoculated with TSWV. It is necessary to make continuous

applications of the treatment to extend the protective effects of the ASA. However, AAS

doesn´t eliminate the virus completely and one plant infected with TSWV and treated

with ASA is still capable of infecting other healthy plants. In terms of enzymatic

activity, POX´s is higher during infection. Apparently, the ASA doesn´t have an effect

on PPO and POX activities. In general, the use of ASA might be a valuable tool to

control viral infections in plants, but it is necessary to perform more trials to explore the

efficacy of this product, as well as its effects on yield.

1

PARTE I

I.1 INTRODUCCIÓN

La economía guatemalteca se basa principalmente en la actividad agropecuaria.

Debido a la variedad de microclimas y la gran biodiversidad que posee el país, es

posible cultivar una amplia gama de cultivos los cuales representan una fuente de

ingresos para la mayoría de la población guatemalteca. Esta gran biodiversidad

también puede ser problemática ya que para cada cultivo que se siembra, hay un gran

número de plagas y enfermedades que los atacan. El uso de pesticidas, fungicidas,

agresivas y resistentes a los métodos tradicionales de control. La tecnología, de la

mano de la ciencia, ha generado maneras creativas y eficientes de tratar con este

problema, pero todavía existen problemas que deben resolverse.

Durante la década de los 90, varios científicos en el extranjero estudiaron los

mecanismos moleculares y fisiológicos de defensa contra patógenos en plantas,

principalmente de tabaco. Sus descubrimientos llevaron a entender los procesos que

se llevan a cabo en las plantas durante ataques de patógenos, especialmente de virus.

Uno de los principales descubrimientos fue la función fisiológica del ácido

acetilsalicílico (AAS) intrínseco en el sistema de resistencia sistémica adquirida

(RSA) de la planta y los efectos positivos de la aplicación externa del AAS. Se

encontró que este compuesto químico estimula la producción de proteínas que le

confieren resistencia a la planta contra infecciones subsecuentes y tiene un profundo

efecto en el sistema antioxidante de la planta, el cual a su vez es vital para la lucha

contra los patógenos invasores. Todavía hay algunas interrogantes que deben

resolverse, ya que la mayoría de estos estudios se llevaron a cabo con plantas de

tabaco y el virus del mosaico de tabaco (TMV). Por esta razón se requiere saber si el

AAS es igualmente eficaz en otros cultivos y por eso se eligió el tomate para la serie

de experimentos en esta propuesta. De igual importancia es la determinación de la

concentración mínima óptima de AAS a usarse ya que esto reducirá costos de

aplicación. También es necesario saber si las plantas que son tratadas con AAS

pueden ser reservorios de virus que pueden contaminar otras plantas y si las cargas

virales de las plantas infectadas se ven reducidas por el tratamiento con AAS. Por

otro lado, este estudio nos dará una mejor visión de los procesos fisiológicos que se

llevan a cabo durante una infección, específicamente de los cambios que ocurren en el

sistema antioxidante de una planta infectada que es tratada con AAS ya que éste

sistema está íntimamente relacionado con la RSA.

Entre los objetivos secundarios de la propuesta se encuentra la estandarización

de una metodología basada en ensayos de ELISA que permita cuantificar carga viral

en plantas, ya que los métodos existentes que utilizan biología molecular son caros y

complicados. También se desea implementar un sistema de evaluación de

sintomatología viral usando una escala numérica. Esto puede ser de gran utilidad a la

hora de evaluar daños causados por patógenos a gran escala en el campo y en el

laboratorio.

Debido a los altos costos de reactivos, no es posible efectuar análisis con todos

los virus que atacan al tomate en Guatemala. Esta es una gran limitante ya que no

podremos determinar la manera en que el tratamiento con AAS altera los ciclos de

vida y la virulencia de todos estos patógenos. Por esta razón se seleccionaron tres

2

tipos de virus, los cuales en la actualidad son los más problemáticos para los

agricultores de tomate. Conscientes de las limitaciones que se puedan tener, aún

creemos que este tipo de estudio nos dará herramientas para continuar explorando este

tema y nos dará información importante y útil.

3

I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

I.2.1 Antecedentes

A nuestro conocimiento no hay ningún estudio publicado sobre los efectos del

AAS en el mejoramiento de la resistencia a patógenos bajo condiciones de laboratorio

ni de campo en Guatemala. Nuestra propuesta está basada en los múltiples artículos

publicados por investigadores internacionales que han comprobado los efectos del

AAS en la RSA de plantas (Fodor et al, 1997; Enyedi et al, 1992; Yalpani et al, 1993;

Radwan et al, 2007). En Guatemala, algunas personas involucradas en el área del

manejo integrado de plagas nos han comentado que unos pocos agricultores han

utilizado de forma empírica este compuesto junto con otros compuestos químicos en

sus plantaciones pero sin tener conocimiento de las dosis óptimas a utilizarse ni del

modo de aplicación y su frecuencia. A pesar de que han obtenido resultados positivos,

no son capaces de afirmar si esto se debe al efecto único del AAS o si es resultado de

los planes integrados multi-componentes que aplican. En algunos casos han

combinado el AAS con otros micronutrientes lo que no permite diferenciar el efecto

individual del AAS. Además, estas personas no poseen un conocimiento real de la

eficacia del tratamiento ya que no cuentan con estudios científicos ni estadísticas para

comprobarlo. Por esta razón, es necesario hacer estudios exploratorios bajo

condiciones de invernadero controladas, en donde se midan parámetros cuantificables

que no se vean afectados por otras variables y así poder determinar la verdadera

eficacia de estos tratamientos.

Por otro lado, la técnica por excelencia para el control de plagas es el uso de

pesticidas, los cuales representan un grave peligro para las personas que lo aplican, el

medio ambiente, y el consumidor que sea alimenta con estos productos agrícolas.

Según los estudios científicos efectuados por investigadores en el extranjero (Radwan

et al, 2007; Fodor et al, 1997; Enyedi et al, 1992; Yalpani et al, 1993), las dosis de

AAS necesarias para obtener efectos significativos en la reducción de daño viral son

extremadamente bajas y no representan un peligro para los agricultores que lo

aplicarían ni para el consumidor de estos productos, todo lo anterior hace que este

compuesto sea una solución con mucho potencial de aplicación a gran escala.

4

I.2.2 Justificación del trabajo de investigación

Las virosis en la agricultura generan grandes pérdidas económicas a pequeños

agricultores a lo largo del territorio nacional. Para controlar la propagación de los

vectores responsables de la transmisión de estos patógenos se ha recurrido al uso de

pesticidas químicos, cuyo uso extensivo e indiscriminado ha causado daño ecológico

considerable. Además es necesario considerar los costos en los que deben incurrir los

pequeños agricultores para adquirir dichos productos.

Las nuevas prácticas agrícolas se enfocan en el manejo de plagas y patógenos

por medio de métodos ecológicos que sean eficientes y que causen el menor daño

posible a los ecosistemas. Con este estudio se desea proponer una estrategia de

reducción de daño causado por virus en cultivos de tomate, utilizando el propio

sistema de resistencia de la planta. La aplicación del ácido acetilsalicílico podría

representar una manera fácil y de bajo costo que podría beneficiar a muchas de las

familias que se dedican al cultivo de tomate en Guatemala. Por otra parte se elimina

el problema cada más frecuente de la resistencia de plagas a los pesticidas que se

utilizan para combatirlos ya que la estrategia de defensa contra el patógeno se basa en

fortalecer el sistema de defensa de la planta contra el virus y no en combatir el vector.

A la vez, este estudio es importante ya que nos dará información básica sobre

los procesos fisiológicos que ocurren en la planta durante un ataque por patógenos, lo

que es útil para aplicaciones futuras a gran escala. Nos permitirá además, estandarizar

y evaluar metodología que se puede usar en otro tipo de estudio o en aplicaciones que

se deriven de este mismo estudio.

5

I.3 OBJETIVOS E HIPOTESIS

I.3.1 Objetivos

I.3.1.1 General

Evaluar los efectos de la aplicación de diferentes concentraciones de ácido

acetilsalicílico (AAS) en la resistencia sistémica adquirida (RSA) de plantas de

tomate infectadas con virus.

I.3.1.2 Específicos

Realizar pruebas preliminares para determinar cuál es la mejor metodología de

inoculación de virus en plantas de tomate para los fines de este estudio.

Evaluar la capacidad de infección de tres virus que atacan cultivos de tomate

(TMV, TSWV y potyvirus) con el fin de seleccionar un virus que permita

llevar a cabo eficazmente los ensayos posteriores de esta propuesta.

Implementar la metodología para la cuantificación de carga viral en plantas

infectadas con virus.

Evaluar los efectos del ácido acetilsalicílico en la carga viral de plantas de

tomate infectadas.

Determinar la concentración óptima de ácido acetilsalicílico que se debe

aplicar para tener un efecto significativo en la reducción de síntomas de

infección por virus y en la carga viral en la planta.

Evaluar la RSA en plantas indicadoras infectadas con virus por medio de

marcadores de oxidación (enzimas antioxidantes peroxidasa y la polifenol

oxidasa) y registros de aparición de síntomas

Determinar si la aplicación del AAS afecta la capacidad del virus para re-

infectar otras plantas.

6

I.3.2 Hipótesis

La aplicación de ácido acetilsalicílico a plantas de tomate infectadas con virus

disminuirá significativamente el número de lesiones y la severidad de los síntomas

causados por la infección viral.

El efecto de la aplicación previa y posterior de AAS a plantas infectadas por virus

es dosis-dependiente.

La actividad de las enzimas antioxidantes peroxidasa y polifenol oxidasa de las

plantas de tomate infectadas con virus se alterará como resultado de la aplicación

de AAS.

La carga viral de las plantas infectadas se reducirá con la aplicación de

concentraciones de 25 mM de ácido acetilsalicílico.

7

I.4 METODOLOGIA

I.4.1 Localización y condiciones atmosféricas

Los ensayos de laboratorio, las pruebas de infectividad y la evaluación de la

efectividad del tratamiento fueron realizados en las instalaciones del Laboratorio de

Protección Vegetal, Universidad del Valle de Guatemala (UVG), en la ciudad capital.

El mantenimiento de plantas indicadoras e inoculaciones con virus se llevaron a cabo

en invernaderos con temperaturas controladas (18 -20°C) dentro del campus de la

UVG.

Se hizo una gira de campo en la que se colectó material con sintomatología

virótica, el cual fue utilizado para llevar a cabo las pruebas de infectividad, carga

viral, inoculación con virus, ensayos enzimáticos y efectividad de tratamiento. A

continuación se muestra un Cuadro con las características de localización de los sitios

muestreados para este fin.

Cuadro 1: Localización de plantaciones de tomate muestreadas el 30 de noviembre,

2010 para recolección de material infectado

Campo/Finca Localización Altura

Aldea Ramírez Bárcenas, Villa Nueva 1490 msnm

Retana Bárcenas, Villa Nueva 1510 msnm

Colonia 6 de enero Bárcenas, Villa Nueva 1539 msnm

- Villa Canales 1216 msnm

8

Figura 1: Localización geográfica de los lugares de colecta en plantaciones de tomate

muestreadas el 30 de noviembre, 2010 para recolección de material infectado.

(Fuente: FODECYT 033-2009)

I.4.2 Las variables

I.4.2.1 Variables dependientes: Carga viral, actividad enzimática, puntaje de

sintomatología

I.4.2.2 Variables independientes: Tratamientos de ácido acetilsalicílico en tres

distintas concentraciones: 25, 50 y 100 mM

I.4.3 Indicadores: Lecturas de absorbancia para determinación de presencia de

virus y carga viral, actividad enzimática (concentración de producto/ minuto),

presencia e intensidad de síntomas en plantas infectadas con TSWV

I.4.4 Estrategia Metodológica

I.4.4.1 Población y Muestra

La población son las plantas de tomate variedad Silverado y la muestra son los

lotes de plantas de tomate variedad Silverado que serán expuestas a infecciones con

virus y a tratamientos con ácido acetilsalicílico en diferentes concentraciones.

9

I.4.4.2 Localización geográfica del proyecto

El cultivo, cuidado e inoculación con virus de las plantas indicadoras de tomate

se llevó a cabo en los invernaderos de la Universidad del Valle de Guatemala. La

colección de material infectado que será utilizado como control positivo en los

ensayos de laboratorio se realizó en plantaciones en varios puntos de las localidades

de Bárcenas, Villa Nueva y Villa Canales (Ver Cuadro 1). Los ensayos de laboratorio

y pruebas bioquímicas se llevaron a cabo en los laboratorios del Departamento de

Protección Vegetal de la Universidad del Valle de Guatemala.

1.4.5 El Método

I.4.5.1 Muestreo de plantas infectadas con virus

Los muestreos de plantas para encontrar fuentes de inóculos de los virus de

interés se llevaron a cabo en plantaciones de tomate Bárcenas, Villa Nueva y Villa

Canales. Se contactaron a agricultores del área y se tomaron muestras de hojas de

tomate que presentaban la sintomatología característica de los virus a estudiar. Estas

hojas se almacenaron en bolsas plásticas cerradas y rotuladas. Las muestras se

guardaron en hieleras y fueron transportadas a las instalaciones de los laboratorios de

Protección Vegetal en la Universidad del Valle de Guatemala para su análisis

posterior.

También se utilizaron muestras de plantas encontradas en los jardines de la

Universidad del Valle que presentaban sintomatología de potyvirus, así como plantas

que fueron llevadas a los laboratorios del departamento de Protección Vegetal para ser

diagnosticadas.

I.4.5.2 Evaluación preliminar de mecanismos de transmisión y capacidad

de infección de virus

Para seleccionar el virus que sea más fácil de detectar y cuantificar así como el

mejor mecanismo de transmisión fue necesario hacer pruebas preliminares a manera

de optimizar la metodología de estudio. Se hicieron pruebas con varios virus en una

serie de plantas indicadoras. Los virus evaluados fueron el virus del bronceado del

tomate (TSWV), potyvirus, el virus del crisantemo B (CVB), el virus de la aspermia

del tomate (TAV) y el virus del mosaico del pepino (PepMV), virus del anillado de la

papaya (PRSV), virus del moteado verdel del pepino (CGmmV) y virus del mosaico

de la calabaza (SqMV). Originalmente se iban a evaluar únicamente el TSWV,

potyvirus y el virus del mosaico del tabaco (TMV), pero no fue posible encontrar

tejido vegetal infectado con TMV y los otros dos virus estaban siendo difíciles de

inocular por lo que se tuvo que probar con otros virus, otros buffers y otras plantas

indicadoras. Se utilizaron dos buffers de inoculación diferentes: 1. buffer de fosfatos

0.01 M pH 7.0 con 0.2 % de sulfito de sodio y 0.01 M de 2-β-mercaptoetanol y 2.

Buffer de fosfatos 0.001M pH 7.2 (Ver Cuadro 3 de RESULTADOS para las

especificaciones de cada ensayo). Además de plantas de tomate variedad Silverado,

se inocularon plantas de Nicotiana tabacum, N. glutinosa y Datura stramonium

también. Cuando ya se tenía un virus idóneo, se corrieron ensayos de ELISA para

evaluar obtener curvas de calibración lineales para la cuantificación de la carga viral

10

en los ensayos posteriores. Se utilizaron triplicados de todas las plantas por cada

virus que se evaluaba. Ver Anexo1 para metodología de ELISA.

I.4.5.2.1 Inoculación por transmisión mecánica

Para el inóculo se tomaron hojas superiores de plantas infectadas con uno de

los virus estudiados y se maceraron en un mortero con buffer de fosfatos 0.1 M, pH

7.9. Este homogenizado se filtró con gasa y se mantuvo en hielo hasta la inoculación.

Las hojas sanas de las plantas indicadoras se frotaron con carborundum y el

homogenizado de virus y luego se lavaron con agua destilada para evitar quemaduras

químicas. Ver Anexo 1 para procedimiento.

I.4.5.2.2 Inoculación por injerto

Se hizo un corte en forma de punta de una pequeña rama de la planta infectada

que mostraba el mayor daño por virus. El corte debe hacerse con una cuchilla estéril

para evitar infección con otros patógenos. En la planta indicadora sana se hizo otro

corte en forma de cuña y se introdujo la rama de la planta infectada. El injerto se fijó

a la planta indicadora con parafilm hasta que quedó firme.

I.4.5.3 Evaluación de efectos de aplicación de ácido acetilsalicílico (AAS)

en plantas indicadoras de tomate variedad Silverado:

Este fue un estudio de caso control en donde se utilizaron plantas de tomate

susceptibles a virosis de la variedad Silverado y material vegetal infectado con

TSWV, el cual fue seleccionado en base a su capacidad de infección en la fase

preliminar del estudio. El estudio se dividió en dos fases:

Fase 1: En esta fase se evaluaron los efectos de diferentes concentraciones de AAS

(25, 50 y 100 mM) en la capacidad antioxidante, carga viral y aparecimiento de

síntomas viróticos en 15 plantas indicadoras de tomate. Dicho grupo de plantas se

denominó la generación F1.

Fase 2: La segunda parte del experimento, en la cual se evaluó la capacidad del virus

de re-infectar otras plantas, usó otro grupo de 9 plantas provenientes de pilones

comerciales de tomate variedad Silverado; a este grupo se le denominó generación

F2.

11

El diseño experimental se ilustra en la siguiente figura:

Figura 1: Esquema de diseño experimental que incluye inoculación y tratamiento de

plantas indicadoras de tomate

FASE 1:

FASE 2:

(Fuente: FODECYT 033-2009)

I.4.5.3.1 Plantas indicadoras

Pilones de tomate (Lycopersicon esculentum) de la variedad Silverado de 40

días de edad se compraron en una distribuidora de pilones local. Estos se

trasplantaron a bolsas que contenían una mezcla de peet moss, arena blanca cernida y

tierra negra, en proporción 2:2:1. Durante 13 días los pilones se mantuvieron en el

invernadero de crecimiento, el cual se mantiene a temperaturas que varían de 20°C –

38°C. Al final de este período, las plantas se trasladaron al invernadero de

inoculación, el cual posee un sistema de control de temperatura que varía de 18°C a

21°C, con una humedad relativa de 60 – 70%. Las plantas fueron regadas y

fertilizadas por ferti-irrigación con spray con Nutrigold® 0-20-44 y Nutrigold® 9-45-

15 y fertilizadas foliarmente con 20-20-20 soluble. Inicialmente fue necesario hacer

15 plantas F1 de tomate variedad

Silverado en estadío de pilón de

7 días

3 plantas de

tomate (F1)

infectadas con

virus +

100 mM AAS

3 plantas de

tomate (F1)

infectadas con

virus +

50mM AAS

3 plantas de

tomate (F1)

infectadas con

virus +

25 mM AAS

3 plantas de

tomate (F1)

control

infectadas con

virus sin AAS

3 plantas de

tomate (F1)

control sanas

sin virus y sin

AAS

Obtención de hojas de plantas F1

3 plantas de

tomate (F2)

inoculadas con hojas F1

tratadas con

25 mM AAS

3 plantas de

tomate (F2)


tratadas con

50 mM AAS

3 plantas de

tomate (F2)


tratadas con

100 mM AAS

Inoculación con extractos de hojas de

plantas F1 en 9 plantas F2

3 plantas de

tomate (F2)

control sanas sin virus y sin

AAS

3 plantas de tomate (F2)

control

infectadas con

virus sin AAS

12

una aplicación preventiva de fungicida Benomil (Pronto 50 WP®) ya que las

aplicaciones foliares del AAS propiciaban el crecimiento de hongo en las hojas.

I.4.5.3.2 Inoculación con virus y tratamiento con AAS

Para poder evaluar los efectos del tratamiento con AAS fue necesario tomar

plantas de tomate Silverado e inocularlas intencionalmente con el TSWV, luego se les

debían hacer aplicaciones con el tratamiento y finalmente hacer análisis que

permitieran evaluar los efectos del AAS en la carga viral, intensidad de los síntomas

de la infección y la actividad de dos enzimas específicas. Para este fin, después de 7

días de crecimiento, las plantas sanas se separaron en los cinco grupos enumerados en

la sección I.4.4.4. Cada grupo consistió de tres réplicas. Las plantas de tomate de los

grupos control positivo, tratamientos 25, 50 y 100 mM fueron inoculadas

mecánicamente con el virus TSWV (como se explica en la sección I.4.5.2.1). El

grupo control negativo no fue inoculado ni se le aplicó tratamiento con AAS, mientras

que el grupo control positivo si se inoculó con virus pero tampoco se trató con AAS.

Los grupos experimentales inoculados con virus fueron tratados con 25, 50 y 100 mM

AAS por aspersión foliar y aplicación en suelo en tres ocasiones en distintos puntos

del desarrollo de la planta en un lapso de dos semanas:

1. Primera aplicación: 5 cc aplicación foliar + 10 cc aplicación en suelo

2. Segunda y tercera aplicación: 10 cc aplicación en suelo

Se tomaron varias muestras vegetales para análisis bioquímicos y de virología

según el siguiente cronograma:

Cuadro 2: Cronograma de procedimientos y análisis de laboratorio realizados

Día Procedimiento

Análisis de laboratorio a efectuarse

Enzimas

antioxidantes Carga

viral

Evaluación de

síntomas

ELISA

detección

virus

F1 F2 F1 F2 F1 F2 F1 F2

1 Siembra de semillas

de plantas F1

41 Trasplante a bolsa

54 Primera aplicación

AAS X

55 Inoculación de plantas

F1 con TSWV

61 Segunda aplicación

AAS

68 Tercera aplicación

AAS

76

Evaluación F1 e

inoculación de plantas

F2 con material de F1

X X X

100 Evaluación F1 X

121 Evaluación F2 X X

128 Evaluación F2 X

13

I.4.5.4 Análisis de Laboratorio

I.4.5.4.1 ELISA para detección de virus y determinación de carga viral

Se utilizaron kits comerciales de ELISA (Enzyme-linked immunosorbent

assay) para la detección de virus, marca Agdia® (Elkhart, IN, EEUU). Para la

selección del virus de trabajo, se analizaron plantas para detectar la presencia del virus

del bronceado del tomate (TSWV, no. de catálogo RSA 39300), potyvirus (no. de

catálogo SRA 27200), virus del mosaico del pepino (PepMV, no. catálogo SRA

13000), virus del crisantemo B (CVB, no. catálogo SRA 81000) y virus de la

aspermia del tomate (TAV, no. catálogo SRA 37001). Ver Anexo 2 para

metodología.

Para la elaboración de la curva de calibración se tomó una planta infectada con

TSWV, con sintomatología característica y severa de la enfermedad, y se obtuvo un

extracto de varias hojas. Dicho extracto se diluyó en las siguientes concentraciones:

1:10, 1:20, 1:50, 1:100, 1:500, 1:1000 y 1:10,000. Estas diluciones usadas para

construir una curva de calibración usando un ELISA, la cual permitió obtener una

escala relativa de concentraciones del control positivo vs. absorbancia. Con esta

curva, se obtuvo una línea de regresión que permitió extrapolar los valores de

absorbancia de las muestras problema y determinar de forma semi-cuantitativa una

concentración aproximada de carga viral en las plantas de estudio. Esta misma planta

se utilizó en todas las determinaciones posteriores y en la obtención de las curvas de

calibración para los ensayos de carga viral.

I.4.5.4.2. Enzimas antioxidantes

La evaluación de la capacidad antioxidante de la planta por medio de enzimas

se llevó a cabo cuantificando las enzimas guayacol peroxidasa (POX) así como la

polifenol oxidasa (PPO).

La actividad de la guayacol peroxidasa se llevó a cabo según el método de

Kiraly et al, 2002 (con algunas modificaciones), el cual consiste en triturar 0.5 g del

material de hojas a 4°C en un mortero con 2 ml de buffer de fosfatos 0.1 M pH 6.0

con 1mM EDTA-Na2. El homogenizado se centrifugó a 6,000 rpm a 4°C por 20

minutos. Los sobrenadantes se colectaron para medir la actividad de la POX y la

PPO. En el caso de la POX, se tomaron 50 µl del extracto y se mezclaron con 2.45 ml

de la mezcla de reacción. La mezcla de reacción contiene fosfato de sodio 0.1M a pH

6.0, guayacol 2 mM, peróxido de hidrógeno 1 mM. La actividad relativa de la POX

se determina como densidad óptica/g peso fresco/hora a 436 nm en un

espectrofotómetro. El incremento en la absorbancia fue medido a medida que el

conjugado se formaba usando un coeficiente de extinción de 26.6 mM-1

cm-1

que se

aplica en la ecuación de Beer-Lambert:

ΔA = abc

Donde:

ΔA = cambio de absorbancia en un minuto

a = absortividad molar

b= longitud del trayecto del haz de luz (1 cm)

c = concentración de producto formado por minuto

https://orders.agdia.com/InventoryD.asp?loc=IN&collection=PSA%2039300&attribute_Size=288

https://orders.agdia.com/InventoryD.asp?loc=IN&collection=SRA%2027200&attribute_Size=1000





14

La medición de la actividad de la PPO se llevó a cabo usando el método

propuesto por Kiraly, et al, 2002 con modificaciones. En este caso se homogenizaron

0.5 g de material de hoja a 0 – 4°C en 2 ml de buffer de fosfato 0.1M a pH 6.0 con

1mM de EDTA-Na2. Los homogenizados se centrifugan a 6000 rpm por 20 minutos a

4°C. La actividad enzimática soluble total se mide espectrofotométricamente en el

sobrenadante a 25°C. La actividad de la PPO se mide en 2.2 ml de una mezcla de

reacción que consiste de 0.1 M de buffer de fosfato de sodio a pH 6.0, EDTA-Na2 1

mM, catecol 20 mM y 200 ul de extracto de hojas. El incremento en la absorbancia a

390 nm se mide a medida que el catecol se oxida. La actividad de PPO se calcula

usando un coeficiente de extinción de 0.95/mM x cm para el producto de la quinona y

la ecuación de Beer-Lambert.

I.4.5.4.3 Evaluación de sintomatología

Se usó un puntaje total compuesto de dos componentes que evalúan la

severidad y tipo de sintomatología, así como el número de plantas que presentan

dichos síntomas. La evaluación de la severidad de síntomas se basa en la escala usada

por Radwan et al, 2007: 0 = no presenta síntomas, 1 = lesiones cloróticas locales y

mosaico leve, 2 = mosaico severo, 3 = malformaciones.

El puntaje total de enfermedad (PTE) se definió como:

PTE = (grado de severidad de síntomas x número de plantas en cada grado)

(Número total de plantas x grado de severidad de síntomas más alto)

El PTE sirve para determinar la severidad de la infección viral así como los

efectos del AAS.

I.4.6 La Técnica Estadística

Se realizaron estadísticas descriptivas para las variables de carga viral, puntaje

de sintomatología y actividad enzimática. Para analizar diferencias en actividad

enzimática, puntaje de sintomatología y en carga viral entre tratamientos se utilizó

una prueba t no apareada. Los resultados se compararán con los controles positivos

y negativos incluidos en el diseño experimental.

15

PARTE II

II.1 MARCO TEÓRICO

II.1.1 Generalidades del tomate

El tomate (Lycopersicon esculentum Mill.) es una solanácea estrechamente

relacionada a otros vegetales como la papa, berenjena y los pimientos. Es una

dicotiledónea perenne que crece anualmente en climas templados. Se originó en

América Central y fue llevada por los exploradores españoles a Europa y

Norteamérica. El tomate es rico en vitaminas A y C, calcio y potasio. (Department of

Horticulture and Landscape Architecture, sin fecha)

El fruto mide de 2 (tomates cherry) a 15 cm (tomates manzano). El color del

fruto va de amarillo a naranja a rojo oscuro (el color rojo se debe a la acumulación del

carotenoide licopeno). La forma del fruto va desde ovoide a tomates con forma de

pera. El sabor puede ser muy dulce a altamente ácido. Puede sembrarse en

invernadero o en condiciones de campo. (Department of Horticulture and Landscape

Architecture, sin fecha)

Figura 2: Tomates en proceso de maduración (A) y flor de tomate (B).

Fuente: Department of Horticulture and Landscape Architecture, sin fecha.

II.1.2 Cultivo de Tomate

El tomate (Lycopersicon esculentum), es una solanácea nativa del continente

americano (Morales y Anderson, 2001), ampliamente cultivada en esta región.

Inicialmente los primeros colonizadores de América creían que era una planta

venenosa y no fue sino hasta los 1800s que se reconoció como un vegetal útil. Este

vegetal crudo o cocinado de varias formas forma parte de la dieta de muchas personas

en el mundo. Cuando se cultivan como plantas en estaca, los tomates requieren

relativamente de espacio pequeño y son capaces de producir entre 8 y 10 libras de

fruto por planta. Los tomates son bajos en calorías y una buena fuente de vitamina C.

(Riofrio, 2000)

A

B

16

II.1.2.1 Requerimientos para cultivo de tomate

Los tomates son plantas de climas cálidos. La temperatura es un factor

importante en la producción ya que son particularmente sensibles a temperaturas

bajas. Pueden crecer en diferentes tipos de suelo, pero un suelo profundo, bien

drenado y con una buena fuente de materia orgánica es el mas adecuado para su

cultivo. Como la mayoría de los vegetales, los tomates crecen mejor en suelos ácidos

con un pH de 6.2 a 6.8. En términos del uso de fertilizantes, el tomate responde bien

a las aplicaciones de fósforo. Un exceso de fertilizantes nitrogenados puede resultar

en plantas extremadamente vigorosas pero con baja producción de frutos. La

aplicación del fertilizante debe realizarse más o menos dos semanas antes de

plantarlos. (Riofrio, 2000)

Los diferentes cultivares tienen diferentes períodos de maduración y pueden

ser clasificados como determinados (D) o indeterminados (I). Las plantas D crecen

hasta cierta altura y luego se detienen. También florecen y desarrollan frutos en un

período de tiempo relativamente corto. Esta es una ventaja si los tomates se cultivan

principalmente para ser enlatados. Otra característica que debe observarse es su

resistencia a enfermedades. Muchos cultivares pueden ser resistentes a Verticillium,

Fusarium o a nematodos. (Riofrio, 2000)

Figura 3: Esquema de características de variedades de tomate determinadas.

Adaptado de:

http://t1.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcQGfQbYN7A0C1GsxWxMgfX5l3Bd6R

0eVLH3DENjK06NhV-TiS1W

Los brotes terminales

dan fruto y detienen el

crecimiento de la planta. Planta no necesita estaca

Capullos y fruto se

desarrollan aprox. al

mismo tiempo.

Tiempo de cosecha

corto

http://t1.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcQGfQbYN7A0C1GsxWxMgfX5l3Bd6R0eVLH3DENjK06NhV-TiS1W

http://t1.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcQGfQbYN7A0C1GsxWxMgfX5l3Bd6R0eVLH3DENjK06NhV-TiS1W

17

Figura 4: Esquema de plantas de tomate indeterminadas.

Adaptado de: http://t3.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcRe24-5MuTHi6wtjrq-

kdPbvi8yW6turlTMjitlODTI-sESoaXz

II.1.2.2 Establecimiento de las plantas

Las plantas que se siembran individualmente o en semilleros individuales

experimentan poco estrés de trasplante y se establecen más rápidamente. Se debe

aplicar un fertilizante inicial alto en fósforo a la hora de la siembra. Las plantas sin

estaca usualmente se siembran a 3 pies de distancia en filas a 5 pies de distancia. Las

plantas con estaca se siembran a 2 pies de distancia en filas a 3-4 pies de distancia.

Las estacas se deben colocar a la hora de la siembra para no afectar a las raíces.

Cuando el espacio es limitado y las condiciones del suelo son pobres, las plantas se

pueden sembrar en contenedores libres de enfermedades con una mezcla de suelo.

Cualquier recipiente con un drenaje adecuado es propicio para la siembra del tomate.

(Riofrio, 2000)

Media vez se ha establecido el cultivo, se debe aplicar un medio para

conservar la humedad y suprimir el crecimiento de malezas. Si aparecen malezas,

pueden ser removidas a mano. Una fuente de humedad es importante, especialmente

cuando los frutos empiezan a desarrollarse. Si el suelo se vuelve muy seco, la

pudrición de los retoños puede darse. Si se aplica mucha agua el fruto en maduración

puede partirse. (Riofrio, 2000)

http://t3.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcRe24-5MuTHi6wtjrq-kdPbvi8yW6turlTMjitlODTI-sESoaXz

http://t3.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcRe24-5MuTHi6wtjrq-kdPbvi8yW6turlTMjitlODTI-sESoaXz

18

Las plantas con estaca usualmente se podan a un tallo único o doble

periódicamente y se ata suavemente a la estaca. La poda debe hacerse removiendo

todas las ramas que crecen de las hojas axilares, dejando únicamente el tallo principal

y una rama adicional cerca de la base. Las plantas sin soporte pueden dejarse sin

poda. Las plantas de tomate podadas y con estaca producen frutos menos abundantes

pero mas grandes que las plantas sin soporte. (Riofrio, 2000)

II.1.2.3 Variedades de tomate

Existen cientos de variedades de tomate disponibles comercialmente. Varían

grandemente en tamaño, forma, color, tipo de planta, resistencia a enfermedades y

época de maduración. Las variedades pueden clasificarse en distintas categorías.

II.1.2.3.1 Rojo temprano primero (60 días o menos para

cosechar)

Estas variedades tienen un crecimiento más compacto y las quemaduras por

sol son un problema en climas cálidos. Estas variedades son mas apropiadas para

áreas al norte, donde las épocas de crecimiento son cortas y los inviernos son mas

fríos. Tienen frutos rojos pequeños a medianos y no se pueden podar. Entre estas

variedades se encuentran: Sub Arctic Plenty (45 días para cosechar, determinado),

Early Cascade (55 días, indeterminado; resistente a Fusarium y Verticillium), Early

Girl (54 días indeterminado; resistente a Verticillium), Quick Pick (60 días, resistente

a Verticillium, Fusarium, Alternaria, Nemátodos, Virus del mosaico del tabaco).

(University of Illinois Extension, 2011).

II.1.2.3.2 Mediano temprano rojo (60 a 69 días)

Estas variedades son intermedias entre lo temprano de las variedades

anteriores y las características de producción de los tipos principales de tomate. El

tamaño del fruto es mejorado así como su calidad. Las variedades principales son:

Champion (65 días para cosecha, indeterminado; resistente a Verticillium, Fusarium,

nematodos y Virus del mosaico del tabaco), Mountain Spring (65 días, determinado,

resistente a Fusarium y Verticillium). (University of Illinois Extension, 2011).

Figura 5: Tomates variedad Mountain Spring.

Fuente: http://www.reimerseeds.com/determinate-tomato_1147.aspx

http://www.reimerseeds.com/determinate-tomato_1147.aspx

19

II.1.2.3.3 Cultivo principal rojo (70 días o más)

La mayoría de las variedades tienen un tamaño mediano a grande, un follaje

adecuado y están relativamente libres de rajaduras del fruto y otras deformidades.

Muchas pueden ser podadas y tutoreadas. Tienen una producción superior y mejor

calidad del fruto. Las variedades principales son: Celebrity (70 días para la cosecha,

determinada, resistente a varios patógenos), Mountain Delight (70 días, determinadas,

resistentes a Fusarium y Verticillium), Fantastic (70 días; alta productividad,

indeterminado), Better Boy (72 días, indeterminada, resistente a nematodos,

Verticillium y Fusarium), Mountain Pride (74 días; determinado; resistente a

Verticillium y Fusarium), Floramerica (75 días; determinado; resistente a Verticillium

y Fusarium). (University of Illinois Extension, 2011).

Figura 6: Tomates Mountain Delight (A) y Floramerica (B).

Fuente: http://www.reimerseeds.com/determinate-tomato_1147.aspx

II.1.2.3.4 Extra grande rojo

Estas variedades maduran relativamente tarde. Los frutos pueden ser

extremadamente grandes pero pueden sufrir daños, con tejido cicatrizante en la punta

del retoño. Este tejido debe ser cortado pero las ventajas del tamaño extra grande se

pierden. No tienen buen rendimiento pero tienen un gran tamaño. Las variedades

son: Delicious (OP) (77 días para la cosecha, indeterminado); Supersteak (80 días,

indeterminado; resistente a Verticillium, Fusarium y nemátodos); Beefmaster (81

días, indeterminado; reistente a Verticillium, Fusarium y nemátodos). (University of

Illinois Extension, 2011).

A B

http://www.reimerseeds.com/determinate-tomato_1147.aspx

20

Figura 7: Tomate variedad Beefmaster (A) (Tomado de: y Supersteak (B

Fuentes:http://t3.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcTNp4tvUjtfSUjk58YE-

DJKQsSrVwQ67MDLvQQLO8_kLLaB2LN--w) y Rosehill plantery.com

II.1.2.3.5 Variedad Silverado F1

La variedad Silverado fue desarrollada por la empresa Harris Moran. Esta es

una variedad indeterminada con alto rendimiento de un fruto brillante de madurez

media. Es adecuada para el cultivo en estaca. El fruto es mediano, de forma elongada

y con buena vida de anaquel. (Harris Moran, sin fecha) Por otro lado, esta variedad

es altamente susceptible al ataque por begomovirus transmitidos por mosca blanca

(Mejía, 2003) , lo que causa grandes pérdidas en las cosechas si no se tiene un control

adecuado de plagas.

Figura 8: Tomates variedad Silverado F1.

Fuente: Harris Moran Seed Company, sin fecha.

II.1.2.4 Producción de tomate

El tomate es el segundo vegetal más importante del mundo, después de la

papa. La producción actual mundial es de aproximadamente 100 millones de

toneladas de fruto fresco producidas en 3.7 millones de hectáreas. La producción de

tomate se ha reportado en 144 países, siendo China el mayor productor en ambas

A B

http://t3.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcTNp4tvUjtfSUjk58YE-DJKQsSrVwQ67MDLvQQLO8_kLLaB2LN--w

http://t3.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcTNp4tvUjtfSUjk58YE-DJKQsSrVwQ67MDLvQQLO8_kLLaB2LN--w

21

hectáreas de producción cosechada (1,255,100 hectáreas) y el peso del fruto

producido (30,102,040 Mt). Los países líderes en rendimiento de fruto por hectárea

son los Países Bajos (4,961,539 Hg/ha) y Bélgica (4,166,667 Hg/ha). Los principales

productores de tomate son los Estados Unidos, China, Turquía, Italia e India.

(Growing Tomatoes, 2005)

Figura 9: Distribución de tomate alrededor del mundo.

Fuente: http://faostat.fao.org/site/336/DesktopDefault.aspx?PageID=336

En Guatemala, la producción anual de tomate ronda alrededor de las 208,377

toneladas métricas, las cuales son cultivadas en una extensión de 4,522 hectáreas de

terreno. Las principales regiones de cultivo se encuentran en las zonas del altiplano,

occidental, oriental y central, así como en el departamento de Baja Verapaz, donde

este cultivo se encuentra ampliamente extendido. (MAGA, 2008)

Respecto a las importaciones que realiza el país, durante el período de 2001-

2007, según estadísticas del BANGUAT, Honduras fue el principal proveedor de

tomate para Guatemala, con un promedio anual de 177 TM. En este mismo período,

Guatemala también realizó importaciones desde El Salvador, México, Nicaragua y

Estados Unidos. En términos de exportaciones, el principal socio comercial de

Guatemala es El Salvador (97.9%), al cual le vende un promedio anual de 24,657 TM,

seguido por Honduras. Lastimosamente, las exportaciones de Guatemala han caído

drásticamente en el período 2001-2007, con una tasa de crecimiento anual de -13.

(MAGA, 2008)

Según los datos del BANGUAT, la producción local de tomate es suficiente

para satisfacer las demandas locales de este producto. El consumo anual nacional de

tomate es de 183,483 TM. Este consumo ha aumentado de 86,7761 TM en 2001 a

268,369 TM en el 2007. (MAGA, 2008)

II.1.3 Patologías del tomate

Existen varias patologías que pueden atacar a los cultivos de tomate, plantados

en exteriores y bajo condiciones de invernaderos.

http://faostat.fao.org/site/336/DesktopDefault.aspx?PageID=336

22

II.1.3.1 Septoria

Esta enfermedad es causada por el hongo Septoria lycopersici, y es una de las

enfermedades foliares más comunes del tomate. Primero aparece como manchas

pequeñas acuosas que pronto se convierten en manchas circulares de

aproximadamente 1/8 pulgadas de diámetro. Las lesiones pronto desarrollan centros

grisáceos con bordes oscuros. Cuando las condiciones son favorables, los cuerpos

fructíferos aparecen como manchas pequeñas negras en el centro de las manchas mas

grandes. Las esporas se propagan a nuevas hojas por medio de la lluvia. Las hojas

muy infectadas se vuelven amarillas, se marchitan y eventualmente se caen. Las

hojas inferiores generalmente se infectan primero y la enfermedad progresa cuando el

clima lluvioso persiste. La defoliación puede ser severa después de períodos

prolongados de calor húmedo. (Gleason y Edmunds, 2006)

El control de esta enfermedad es una combinación de prácticas culturales, las

cuales incluyen: sembrar plantas sanas lo suficientemente separadas para que no

estén muy apretadas cuando crezcan para que el follaje se seque rápidamente, regar

las plantas en la mañana y en la noche para minimizar el tiempo que las hojas están

mojadas, remover los desechos, rotar cultivos para que los tomates sean sembrados

cada 3 ó 4 años, evitar trabajar con las plantas cuando el follaje esté mojado para

evitar la propagación de la enfermedad. (Gleason y Edmunds, 2006)

Figura 10: Manchas en hojas de tomate causadas por Septoria.

Fuente: Gleason y Edmunds, 2006

II.1.3.2 Alternaria

El hongo Alternaria solani, causa una enfermedad caracterizada por la pérdida

prematura de hojas. Aparecen manchas cafés o negras de ¼ a ½ pulgada de diámetro

en las hojas inferiores. Las manchas frecuentemente se fusionan formando manchas

irregulares. Anillos oscuros concéntricos frecuentemente aparecen en las manchas de

las hojas. Las hojas se vuelven amarillas y se secan cuando hay pocas manchas

presentes. El hongo ocasionalmente ataca al fruto, causando hundimiento con anillos

concéntricos y una apariencia aterciopelada. (Gleason y Edmunds, 2006)

23

Los controles químicos y culturales son los mismos que se utilizan con la

Septoria. Adicionalmente, evitar las rotaciones con papa y cosechar todo el fruto

maduro para evitar infectar otros frutos. Existen algunas variedades de tomate que

son resistentes parcialmente a este hongo, como la Mountain Supreme, Pride, Gold,

Fresh y Belle. (Gleason y Edmunds, 2006)

Figura 11: Sintomatología causada por Alternaria en tomate.

Fuente: Gleason y Edmunds, 2006.

II.1.3.3 Fusarium

El Fusarium oxysporum f. sp. Lycopersici ataca únicamente ciertos cultivares

de tomate. Las plantas infectadas muestran amarillamiento de hojas y un proceso de

marchitamiento hacia arriba desde la base del tallo. Inicialmente, una rama o un lado

de la planta se verán afectados. Los síntomas rápidamente se propagan al resto de la

planta. Las hojas marchitas se caen prematuramente y las plantas afectadas mueren

tempranamente y producen poco o ningún fruto. (Gleason y Edmunds, 2006).

Para minimizar las pérdidas por Fusarium, se recomienda utilizar variedades

resistentes. Las variedades resistentes pueden infectarse pero la enfermedad no será

tan severa como en las variedades susceptibles y se obtendrá una producción

razonable. Adicionalmente, se debe utilizar semilla libre de la enfermedad o

trasplantes en medio libre de enfermedad y bien drenado. También se deben hacer

rotaciones de tomate cada cuatro años para reducir las poblaciones en el suelo y se

debe remover y destruir los residuos de plantas infectadas. Para la desinfección se

puede usar vapor. (Gleason y Edmunds, 2006).

24

Figura 12: Marchitamiento causado por Fusarium.


II.1.3.4 Verticillium

Verticillium albo-atrum y Verticillium dahliae, los hongos causantes del

marchitamiento por Verticillium, pueden atacar más de 200 especies vegetales,

incluyendo papa, pimientos, berenjena, fresa, sandía y rábano. Esta enfermedad

aparece en las hojas inferiores y progresa hacia arriba de la planta. Se desarrollan

manchas amarillas en las hojas superiores, las hojas rápidamente se tornan

completamente amarillas, se marchitan y caen. Las plantas infectadas pueden

sobrevivir a lo largo de una temporada de siembra, pero están achicadas y su

producción es reducida. Esta enfermedad causa pardeamiento interno del tejido

conductor de agua en los tallos. (Gleason y Edmunds, 2006)

Las medidas de control son similares a las del Fusarium. Existen variedades

resistentes a este hongo en el mercado. Es recomendable rotar cultivos que no

pertenezcan a la familia de las solanáceas, incluyendo pimientos, papa y berenjena por

lo menos en cuatro años. El maíz y el frijol son cultivos adecuados para la rotación.

(Gleason y Edmunds, 2006)

Figura 13: Marchitez de hoja y pardeamiento de tubos conductores en tomate,

causados por Verticillium.


25

II.1.3.5 Manchas bacterianas

Esta enfermedad es causada por la bacteria Xanthomonas campestris pv.

vesicatoria, la cual infecta tanto a tomates como a pimientos. Las manchas que

aparecen en tallos y hojas son pequeñas, circulares e irregulares y tienen una textura

ligeramente grasosa. A medida que las lesiones se agrandan, frecuentemente son

rodeadas por un halo amarillo. Si hay muchas manchas, éstas empiezan a fusionarse.

La sintomatología en el fruto es mas distintiva que en la hoja o tallo. Las manchas en

el fruto verde aparecen como puntos negros elevados rodeados de áreas acuosas. A

medida que las manchas se agrandan, se vuelven grises con centros hundidos.


La bacteria generalmente es llevada al campo en trasplantes infectados. El

clima lluvioso y cálido favorece su rápida propagación. Es crucial obtener plantas

libres de la enfermedad ya que la bacteria puede transmitirse a los semilleros por

medio de semillas contaminadas. Se debe evitar hacer rotaciones con pimientos. Se

recomienda no manipular las plantas más de lo necesario (podas y amarres por

ejemplo), ya que las heridas causadas por la manipulación permiten que la bacteria

ingrese a la planta. Tratamientos con productos que contengan cobre pueden reducir

la dispersión de la enfermedad en el jardín cuando aparezcan los primeros síntomas.


Figura 14: Sintomatología en hojas y plantas causada por Xanthomonas.


II.1.3.6 Geminivirus transmitidos por mosca blanca

Las patologías en el tomate son variadas pero unas de las más difíciles de

controlar son las virosis causadas por los geminivirus transmitidos por la mosca

blanca, principalmente la de la especie Bemisia tabaci.

Existen alrededor de 1140 especies de mosca blanca alrededor del mundo, de

las cuales 724 habitan en zonas tropicales. No todas las especies son pestes agrícolas,

26

únicamente algunas son reconocidas como vectores de virus de plantas, entre las

cuales se encuentran: Bemisia tabaci (Gennadius), Bemisia afer sens lat., Trialeurodes

vaporariorum (Westwood), Trialeurodes abutilonea (Hald.) y (Misra). Solo la

Bemisia tabaci es capaz de transmitir alrededor de 200 virus de plantas capaces de

causar pérdidas millonarias a la agricultura. (Morales, 2007)

La B. tabaci es capaz de causar daños directos e indirectos a cultivos de soya,

distintas variedades de frijol, tomate, chile, ocra, berenjena, camote, yuca, algodón,

tabaco, melón, sandía y cucúrbitas en general. Hasta 1986 solo se conocía un biotipo

de bemisia tabaci, el biotipo A, pero ese año se detectó un nuevo biotipo B, más

agresivo, capaz de adaptarse a nuevos ambientes y de infectar una variedad más

amplia de cultivos que incluyen la alfalfa, tomate, chile pimiento, coliflor y el brócoli.

En la actualidad este biotipo es considerado una peste mundial responsable de grandes

pérdidas agronómicas en Asia, Africa, Europa, el área del Pacífico y América

(Morales, 2007).

El daño directo ocasionado por la mosca blanca ocurre cuando ésta extrae

grandes cantidades de savia de la planta, debilitándola. Los daños indirectos ocurren

cuando grandes poblaciones de mosca blanca inducen el crecimiento de hongos

superficiales encima de secreciones de moscas inmaduras y adultas, reduciendo la

capacidad fotosintética lo que puede causar la muerte de la planta. El otro tipo de

daño es la infección viral, la cual puede causar clorosis, acolochamiento de hojas,

enanismo, y maduración irregular, entre otras. (Morales, 2007)

Los daños causados por geminivirus transmitidos por B. tabaci no solo son

estructurales sino que también afectan el contenido nutricional de los cultivos. En un

estudio por Raj y colegas (2005) se encontró que en los frutos de Momordica

charantia, las concentraciones de carotenoides y vitamina C disminuyeron en un 40%

y 50% respectivamente, mientras que el contenido de fenoles y la capacidad

antioxidante se vieron reducidas en un 50% y 43% respectivamente.

En Centroamérica, el Caribe y México, los cultivos más afectados por los

begomovirus transmitidos por B. tabaco son el frijol común (Phaseolus vulgaris),

chile pimiento y chiles picantes (Capsicum spp), cucúrbitas y el tomate

(Lycompersicon esculnetum). (Morales, 2007).

Alrededor del 90% de los virus transmitidos por B. tabaci pertenecen al género

de Begomovirus, familia de los Geminiviridae. Estos virus consisten de una sola

hebra de ADN encapsulada en dos partículas gemelas casi isométricas. La B. tabaci

también puede transmitir virus de ARN de una sola hebra, los cuales pertenecen a los

géneros Crinivirus, Carlavirus e Ipomovirus. (Morales, 2007)

En el área de México y Centroamérica se han detectado una gran cantidad de

begomovirus que atacan cultivos de tomate, entre ellos se encuentran: el virus del

acolochamiento y amarillamiento de las hojas del tomate (ToYLCV), el virus del

arrugamiento de hojas del tomate (ToLCV), virus del moteado amarillo del tomate

(ToYMoV), virus del moteado dorado del tomate (ToGMoV), virus del moteado leve

del tomate (ToMiMoV), virus del mosaico dorado de chile (PepGMV). (Nakhla, et al,

sin fecha)

27

Estudios científicos han comprobado que los virus de plantas afectan algunos

procesos fisiológicos como la fotosíntesis (reduciéndola según el estado de la

infección), disminuyendo el contenido de pigmentos, contenido de azúcares y

almidones, además de aumentar la tasa de respiración (Radwan et al, 2007).

II.1.3.7 TMV, TSWV y los potyvirus

El virus del mosaico del tabaco (TMV) está distribuido a nivel mundial,

causando grandes pérdidas económicas. Este virus se transmite mecánicamente por

actividades humanas o por medio de semillas en el caso del tomate. Este virus no se

dispersa por insectos. La sintomatología que presenta en el tomate varía de acuerdo a

las condiciones de temperatura y luz, a la variedad, la cepa de virus y el tiempo de

infección. Los síntomas más comunes son el mosaico verde oscuro que presentan las

hojas (ver figura 3). Algunas variedades pueden causar deformación de las hojas. En

términos de la calidad de los frutos, éstos pueden ser reducidos en tamaño y número y

en algunas ocasiones pueden presentar un defecto de oscurecimiento interno.

(Zitter y Providenti, sin fecha)

Figura 15: Síntomas de infección con virus TMV en plantas de tomate.

Fuente: Zitter y Providenti, sin fecha y University of Florida, 2008.

Los virus Y de la papa o potyvirus (PVY) son comúnmente encontrados en el

sur de Estados Unidos y en Centroamérica. Son transmitidos por áfidos y su

sintomatología a veces es confundida con la del TMV. Estos virus pueden causar

distorsión foliar y enanismo en plantas (Ver figura 16). (Zitter y Providenti, sin

fecha)

Figura 16: Sintomatología ocasionada por potyvirus en plantas de tomate.

Fuente: Zitter y Providenti, sin fecha

http://vegetablemdonline.ppath.cornell.edu/factsheets/Viruses_Tomato.htm#Click

http://erec.ifas.ufl.edu/tomato-scouting-guide/diseases/tomato-mottle-virus.shtml

http://vegetablemdonline.ppath.cornell.edu/factsheets/Viruses_Tomato.htm


28

El virus del bronceado del tomate (TSWV) es una especie del género de los

tospovirus, el cual infecta a su más importante vector, Frankliniella occidentalis, o el

trips occidental de flores (WFT) (Medeiros et al, 2004). Este virus causa daños

severos al tomate, resultando en necrosis, mosaico en tallos y pecíolos y moteado

severo del fruto, lo que lo hace imposible de mercadear (ver Figura 17). El control de

vectores por medio de insecticidas para eliminar los trips que lo transmiten es la

manera más común de controlar esta enfermedad.

(Zitter y Providenti, sin fecha)

Figura 17: Daños en frutos de tomate ocasionados por TSWV.

Fuente: Zitter y Providenti, sin fecha

II.1.4 Resistencia Sistémica Adquirida (RSA):

La existencia de la resistencia sistémica adquirida fue demostrada por primera

vez por Ross en 1961, en un experimento en el cual se utilizaron plantas de tabaco

infectadas con virus del mosaico del tabaco (TMV). Ross y sus colegas observaron

que la inoculación de una hoja con el TMV incrementaba la resistencia a infecciones

subsecuentes en hojas remotas al sitio de la primera inoculación, reduciéndose el

número de lesiones locales inducidas por la re-infección con TMV (Kiraly et al,

2002).

En la actualidad se sabe que las infecciones con patógenos necrotizantes como

virus, hongos o bacterias (Enyedi et al, 1992) usualmente conllevan al desarrollo de

resistencia a infecciones subsecuentes (Lee et al, 1992). Esta resistencia adquirida no

se limita al área de infección o entrada del patógeno sino que a toda la planta, de

manera sistémica. A la respuesta que se tiene con este primer contacto entre la planta

y el patógeno se le conoce como “respuesta hipersensible” (RH) (Chen et al, 1995;

Fodor et al, 1997; Barna et al, 2003). La HR restringe la dispersión del virus en la

planta, circunscribiéndola a una pequeña zona alrededor del sito de entrada del virus,

formando una lesión necrótica (Lee et al, 1995). Asociada a la HR se encuentra la

resistencia sistémica adquirida (RSA), la cual provee protección subsecuente a la

planta contra una variedad de patógenos durante varios meses. (Chen et al, 1995)

A principios y mediados de los noventa se llevaron a cabo varios experimentos

(Lee et al, 1992, Chen et al, 1995) con plantas de tabaco y el virus del mosaico de

tabaco (TMV) para estudiar las interacciones planta/patógeno. Los investigadores

observaron que plantas de tabaco presentaban niveles substancialmente mayores de

ácido acetilsalicílico (AAS) después de haber sido infectadas con TMV (Lee et al,

1992, Chen et al, 1995). Esta acumulación se presentaba en el sitio de infección y

luego se detectaba en las partes distales de la planta (Kiraly et al, 2002). A partir de

http://vegetablemdonline.ppath.cornell.edu/factsheets/Viruses_Tomato.htm


29

este momento, se dilucidaron los mecanismos moleculares que tenían lugar en la

RSA.

II.1.4.1 Acido salicílico y especies oxigenadas reactivas (EOR)

El ácido salicílico (AS) ha sido usado históricamente para inducir floración,

inhibir la absorción de fosfato y potasio y para inhibir la biosíntesis de etileno (Lee et

al, 1995). No fue hasta los años noventa cuando se empezó a elucidar el papel

regulatorio del AS endógeno en las plantas y su relación con el sistema de defensa

contra patógenos (Lee et al, 1995). El desarrollo de la RSA está asociado con la

expresión de un set de genes encargados del desarrollo de mecanismos de defensa en

la planta (Kiraly et al 2002), estos genes han sido relacionados con la patogénesis

(PR) y son denominados PR-1 y PR-2 (Fodor et al, 1997). Estudios científicos

demostraron que la aplicación exógena de AAS también induce la expresión de los

PR-1 y PR-2, de la misma forma como si fueran inducidos por un reto patológico.

(Kiraly et al, 2002). Al aumentar la expresión de los genes PR-1 y PR-2, aumenta la

síntesis de proteínas relacionada a la patogénesis (PR), lo que crea una mayor

resistencia a re-infecciones por hongos y bacterias así como a necrosis viróticas.

(Fodor et al, 1997; Enyedi et al, 1992; Yalpani et al, 1993)

La infección con patógenos necrotizantes resulta en la acumulación de

especies oxigenadas reactivas (EORs) como el superóxido, el peróxido de hidrógeno,

los radicales hidroxilos y el oxígeno singulete, causando lo que se denomina una

explosión oxidativa (Kiraly et al, 2002). Las EORs son moléculas altamente reactivas

que forman parte del sistema de defensa de las plantas y son liberadas en respuesta a

la invasión por patógenos. Se ha sugerido que estas moléculas están involucradas en

la traducción de señales además de limitar el ingreso de patógenos, pero a la vez

aumentan la necrosis de tejidos vegetales (Barna, et al, 2003). Algunos estudios

también han sugerido que el AAS potencia la explosión oxidativa, aumentando la

muerte celular en combinación con los EORs (Kiraly et al, 2002). La generación

descontrolada de EORs puede ser dañina para la planta y causar estrés oxidativo. Por

esta razón, la planta también cuenta con un mecanismo de defensa compuesto por

antioxidantes y enzimas antioxidantes, entre las cuales se encuentran la glutatión

peroxidasa (GSH), glutatión reductasa (GR) y la glutatión transferasa (GST).

Un incremento en la concentración de EOR estimula la expresión de genes

relacionados con el sistema de defensa de la planta, a la vez, disminuye la actividad

de las enzimas antioxidantes por lo que se reduce la capacidad antioxidante de la

planta. Con la capacidad antioxidante de la planta reducida, aumenta la peroxidación

de lípidos celulares causando apoptosis y consecuentemente necrosis tisular. (Fodor

et al, 1997). Esta serie de eventos ocurre durante la fase inicial de la infección, antes

de la aparición de síntomas y es necesaria ya que evita la propagación del virus al

eliminar las células infectadas con el virus.

Después del aparecimiento de síntomas, las altas concentraciones de ROS

estimulan la actividad de enzimas antioxidantes como la GR, GST, SOD y GSH,

brindando protección contra el daño oxidativo a los tejidos alrededor de las lesiones

necróticas, evitando así que se dispersen a otros sitios en la planta (Fodor et al, 1997).

30

Un estudio por Esmailzadeh y colegas (2008) demostró que las aplicaciones

exógenas de AS reducían la sintomatología causada por Alternaria alternata f. sp

lycopersici en tomate. Los hallazgos indicaron que fue necesario aplicar SA en

concentraciones de 400 uM para lograr un efecto significativo en la reducción del

índice de sintomatología en el tomate. Se encontraron efectos significativos en las

reacciones celulares de la planta en términos del porcentaje de penetración del hongo.

Las plantas que fueron pre-tratadas con AS tenían un mayor porcentaje de necrosis

celular individual (indicador de una respuesta hipersensible), pero menores áreas

dañadas y decoloraciones que las plantas control que no fueron tratadas con AS. Los

pre-tratamientos con AS causaron un aumento en el AS libre endógeno en las hojas de

tomate, lo cual resultó en la inducción de la resistencia sistémica adquirida.

(Esmailzadeh et al, 2008)

II.1.4.2 Biosíntesis del ácido salicílico (AS)

Experimentos realizados en los años sesenta sugieren que el AS es sintetizado a

partir del ácido cinámico por dos vías metabólicas posibles. Una involucra la

descarboxilación de la cadena lateral del ácido cinámico para producir ácido

benzóico, seguido por una hidroxilación del AS. La otra alternativa es que el ácido

cinámico primero podría ser hidroxilado a ácido o-cumárico y luego decarboxilado a

AS. Otros experimentos sugieren que los retoños de tomate infectados con

Agrobacterium tumefaciens sintetizan AS vía la ruta de ácido o-cumárico, mientras

que la ruta del ácido benzóico opera en plantas no infectadas. (Lee et al, 1995)

En el año 93, Yalpani y colegas reportaron estudios concluyentes que

demostraban la ruta biosintética del AS, la cual se muestra a continuación:

31

Figura 18: Ruta metabólica y biosintética del AS y fenilpropanoides.

Fuente: Lee et al, 1995.

II.1.4.3 Inducción de tolerancia a estrés por acción de ácido acetilsalicílico

(AAS)

Se ha demostrado el rol del ácido acetilsalicílico en la inducción de RSA en

varios cultivos. También se ha demostrado que concentraciones activas de AS y sus

derivados, tales como el ácido acetilsalicílico, también muestran tolerancia al estrés

en plantas. Estudios con tomate y frijol demostraron que las aplicaciones de AS y

AAS conferían resistencia a calor, frío y sequía a estos cultivos. Este grupo de

investigadores hipotetizó que estos compuestos tenían un rol de señalización que

llevaba a la expresión de tolerancia en la planta. (Senaratna et al, 2000)

32

PARTE III

III.1 RESULTADOS

III.1.1 Ensayos de infectividad

Cuadro 3: Porcentajes de infectividad de distintas plantas indicadoras con distintos

virus y métodos de inoculación

Plantas indicadoras Virus Método %

infectividad*

Tomate (var. Silverado)

Virus del

crisantemo B

(CVB) Inoculación mecánica

usando buffer de

fosfatos 0.01 M pH

7.2

50%

Virus de la

aspermia del

tomate (TAV)

50%

Virus del

bronceado del

tomate (TSWV)

0%

Nicotiana, tomate (var.

Silverado), glutinosa,

datura

Potyvirus Inoculación mecánica

usando buffer de

fosfatos 0.01 M pH

7.2

0%

Virus del

mosaico del

pepino dulce

(PepMV)

0%

Tomate (var. Silverado)

Virus del

anillado de la

papaya (PRSV) Inoculación

utilizando buffer de

fosfatos 0.01 M pH

7.0 con 0.2 % de

sulfito de sodio y

0.01 M de 2-β-

mercaptoetanol

0%

Virus del

moteado verdel

del pepino

(CGmmV)

0%

Virus del

mosaico de la

calabaza

(SqMV)

0%

Tomate (var. Silverado) TSWV Injerto 0%

Tomate (var. Silverado) TSWV

Inoculación mecánica

con buffer de fosfatos

0.01 M pH 7.2

100%

*El % de infectividad está dado por el porcentaje de plantas que se infectaron exitosamente con el virus

en cuestión

Fuente: FODECYT 033-2009

Dada la eficiencia de infectividad, se seleccionó el virus TSWV para hacer los

ensayos subsecuentes de carga viral, actividad enzimática y puntaje de sintomatología

en tomate variedad Silverado.

33

Figura 19: Plantas indicadoras de datura (A), nicotiana (B) y tomate Silverado (C)

inoculadas con potyvirus.


Figura 20: Fuente de inóculo de TSWV encontrado en el campo (A) e inoculación

de plantas indicadoras de tomate var. Silverado con este inóculo (B).


III.1.2 Determinación de carga viral en plantas F1

Figura 21: Plantas indicadoras de tomate Silverado control e infectadas con virus y

tratadas con AAS.


A B C

A B

34

Cuadro 4: Equivalencias de diluciones en términos decimales

Dilución en

fracción*

Dilución en decimales

1:10 0.1

1:20 0.05

1:50 0.02

1:100 0.01

1:500 0.002

1:1000 0.001

1:10,000 0.0001 *Este es un indicador de la dilución hecha en base a volumen. Por ejemplo: para la dilución 1:10 se

tomó 1 µL de extracto puro de planta infectada y se diluyó en 9 µL de agua destilada, esta dilución

equivale a 0.1.


Gráfica 1: Curva de calibración para determinar carga viral de plantas infectadas con

TSWV, realizada el día 76. Para construir esta curva se utilizó una planta de tomate

variedad Silverado infectada con TSWV para obtener el extracto y sus diluciones.

Ver Cuadro 1 con el cronograma de procedimientos y análisis de laboratorio

realizados para determinar el día cuando se realizó la prueba.


35

Cuadro 5: Carga viral de plantas indicadoras F1 infectadas con TSWV y tratadas con

AAS, evaluación realizada el día 76.

ID

planta

Planta

control

sin virus

Planta

control

con virus

Plantas infectadas

con TSWV y

tratamiento AAS

25 Mm

Plantas infectadas

con TSWV y

tratamiento AAS

50 mM

Plantas

infectadas con

TSWV y

tratamiento AAS

100 mM

1 0 0.93 0.95 0 0

2 0 0.92 0.85 0 0

3 0 0.78 0.98 0 0

4 0 0.89 0.97 0 0

5 0 0.91 0.86 0 0

6 0 0.92 0.58 0 0

Media ±

Desv Std

0.00 ±

0.00

0.89 ±

0.05 0.87 ± 0.15 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00

* No hay diferencias significativas entre control + y el tratamiento con 25 mM

AAS, usando un análisis de T de student no apareado


Gráfica 2: Curva de calibración para determinar carga viral de plantas infectadas con

TSWV, realizada el día 100. Para construir esta curva se utilizó una planta de tomate

variedad Silverado infectada con TSWV para obtener el extracto y sus diluciones.

(Ver Cuadro 1 con el cronograma de procedimientos y análisis de laboratorio

realizados para determinar la secuencia de pruebas realizadas.)

y = 0.5376x + 0.0553R² = 0.8106

-1

0

1

2

3

4

5

6

0 0.0001 0.001 0.002 0.01 0.02 0.05 0.1 1

Ab

sorb

anci

a

Dilución


36

Cuadro 6: Resultados de la prueba de ELISA para determinar la presencia de TSWV

en plantas de tomate v. Silverado F1 en el día 100

Réplica

de

planta

Control - Control + Tratamiento

25 mM

Tratamiento

50 mM*

Tratamiento

100 mM

1 - + + + -

2 - + + + -

3 - + + + -


III.1.3 Determinación de actividad enzimática en plantas F1 y F2

Gráfica 3: Actividad de la guayacol peroxidasa (POX) en plantas de tomate Silverado

F1 infectadas con TSWV y tratadas con AAS. Determinación realizada el día 76.

Columnas que comparten la misma letra no difieren estadísticamente entre ellas,

según prueba T de Student no apareada.

a

bb

aa

0

0.005

0.01

0.015

0.02

0.025

0.03

0.035

0.04

ctrl - ctrl + 25 mM 50 mM 100 mM

Act

ivid

ad e

nzi

mát

ica

PO

X(m

M p

rod

uct

o/m

in)

Tratamiento Fuente: FODECYT 033-2009

37

Gráfica 4: Actividad de la polifenol oxidasa (PPO) en plantas de tomate F1

infectadas con TSWV y tratadas con AAS. Determinación realizada el día 76.

Columnas que comparten la misma letra no difieren estadísticamente entre ellas,

según prueba T de Student no apareada.

a

b

a,b

c

a,c

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35


Act

ivid

ad e

nzi

mát

ica

PP

O(m

M p

rod

uct

o/m

in)

Tratamiento


Gráfica 5: Actividad de la polifenol oxidasa (PPO) en plantas de tomate Silverado F2

inoculadas con material de generación F1 de tomate Silverado. Determinación

realizada el día 121. Ninguno de los tratamientos difiere estadísticamente según

prueba de T de Student no apareada.

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

0.16

0.18


Act

ivid

ad e

nzi

mát

ica

PP

O(m

M p

rod

uct

o/m

in)

Tratamiento


38

Gráfica 6: Actividad de la guayacol peroxidasa (POX) en plantas de tomate Silverado

F2 inoculadas con material de generación F1 de tomate Silverado. Determinación

realizada el día 121. Columnas que comparten la misma letra no difieren

estadísticamente entre ellas, según prueba T de Student no apareada.

a

a,cb,c

b,c

b,c

0

0.002

0.004

0.006

0.008

0.01

0.012

0.014

0.016

0.018

0.02


Act

ivid

ad e

nzi

mát

ica

PO

X(m

M p

rod

uct

o/m

in)

Tratamiento


III.1.4 Severidad de infección utilizando escala de sintomatología en

generación F1

Cuadro 7: Puntaje individual y puntaje total de enfermedad (PTE) de plantas de

tomate Silverado F1 control e infectadas con TSWV y tratadas con AAS (día 76)

No. Tratamiento AAS Infección por virus Puntaje* PTE por tratamiento**

1 Control (-) No 0

0 2 Control (-) No 0

3 Control (-) No 0

4 0 mM TSWV 3

1 5 0 mM TSWV 3

6 0 mM TSWV 3

7 25 mM TSWV 3

1 8 25 mM TSWV 3

9 25 mM TSWV 3

10 50 mM TSWV 1

0.83 11 50 mM TSWV 2

12 50 mM TSWV 2

13 100 mM TSWV 0

0 14 100 mM TSWV 0

15 100 mM TSWV 0 * La evaluación de la severidad de síntomas está basada en la escala usada por Radwan et al, 2007: 0 =

no presenta síntomas, 1 = lesiones cloróticas locales y bronceado leve, 2 = bronceado severo, 3 =

malformaciones.

**Se calcula usando la siguiente fórmula:

PTE = (grado de severidad de síntomas x número de plantas en cada grado) (Número total de plantas x grado de severidad de síntomas más alto)

39

Figura 22: Sintomatología de plantas control infectadas con TSWV y plantas

infectadas y tratadas con 25 mM AAS.


Figura 23: Sintomatología de plantas infectadas con TSWV tratadas con tratamientos

de 50 y 100 mM AAS.


40

III.1.5 Efectos del AAS en la transmisión del virus a una segunda

generación de plantas (F2)

Cuadro 8: Resultados de la prueba de ELISA para determinar la presencia de TSWV

en plantas de tomate v. Silverado F2 en el día 121

Réplica

de

planta

Control - Control + Tratamiento

25 mM

Tratamiento

50 mM*

Tratamiento

100 mM

1 - - - - +

2 - - - + -

3 - - - + -


Cuadro 9: Puntaje individual y puntaje total de enfermedad (PTE) de plantas de

tomate variedad Silverado F2 (inoculadas con extracto de plantas F1). Evaluación

realizada el día 128

No.

Tratamiento

AAS Virus Puntaje*

PTE por

tratamiento**

1 Control (-) No 0

0 2 Control (-) No 0

3 Control (-) No 0

4 0 mM TSWV 1

1 5 0 mM TSWV 1

6 0 mM TSWV 1

7 0 mM TSWV trat. 25 mM F2 1

0.67 8 0 mM TSWV trat. 25 mM F2 1



0.55 11 0 mM TSWV trat. 50 mM F2 3



1 14 0 mM TSWV trat. 100 mM F2 1

15 0 mM TSWV trat. 100 mM F2 1 * La evaluación de la severidad de síntomas está basada en la escala usada por Radwan et al, 2007: 0 = no presenta síntomas, 1 = lesiones cloróticas locales y bronceado leve, 2 = bronceado severo, 3 =

malformaciones.

**Se calcula usando la siguiente fórmula:

PTE = (grado de severidad de síntomas x número de plantas en cada grado) (Número total de plantas x grado de severidad de síntomas más alto)


41

III.2 DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Este estudio podría considerarse un estudio piloto que permitió implementar y

probar metodologías que podrían servir para seguir explorando los efectos de los

tratamientos con ácido salicílico y ácido acetilsalicílico en la resistencia sistémica

adquirida (RSA) de plantas en general. Durante la ejecución de este proyecto resaltó

la importancia de tener métodos confiables y reproducibles para evaluar las variables

experimentales que permitan estudiar los cambios fisiológicos que se llevan a cabo

durante los procesos infectivos en plantas y sus mecanismos de defensa.

El primer reto fue el de encontrar un método de inoculación de plantas

indicadoras y un virus que fuera capaz de infectar plantas de tomate, específicamente

de la variedad Silverado. Esta variedad es altamente susceptible a ataques por

begomovirus transmitidos por mosca blanca (Mejía, 2003), pero no se tiene

información sobre su susceptibilidad a otros virus. La elección de la variedad de

tomate se hizo en base a su susceptibilidad a infecciones y al hecho de que es una de

las variedades que más se cultivan en el país debido a sus propiedades organolépticas.

Después de realizar varias pruebas con distintos virus, distintas variedades de plantas

indicadoras y distintas formas de inoculación, se hizo evidente que la elección del

buffer, las condiciones ambientales, las variedades de plantas indicadoras y el virus en

sí, son factores fundamentales que deben considerarse para realizar una inoculación

de virus exitosa. Fue posible determinar que el tomate v. Silverado no es un buen

hospedero de los virus TAV y CVB, ya que estos tienen porcentajes de infectividad

muy baja. Además, el tomate posiblemente tampoco sea un hospedero de los virus

PepMV, PRSV, CGmmV, SqMV ya que con ninguno de ellos se logró ninguna

infección, lo cual fue confirmado por ensayos de ELISA específicos para cada uno de

estos virus. Lo mismo ocurrió con un potyvirus encontrado en una planta ornamental

de la familia de las leguminosas. En términos de métodos de inoculación, en todas las

pruebas se observó que la inoculación mecánica es más eficiente que los injertos.

Este tipo de inoculación se optimiza aún más cuando se usa un buffer de fosfatos 0.01

M pH 7.2. Finalmente se logró encontrar un virus adecuado, con una infectividad del

100%: el virus del bronceado del tomate (TSWV), el cual puede inocularse

exitosamente mecánicamente pero que no pudo inocularse por medio de injertos

(Cuadro 3). Generalmente, las inoculaciones para este tipo de determinaciones se

hacen por medio de inoculación mecánica usando un abrasivo para introducir las

partículas virales dentro del tejido vegetal de la planta de estudio (Király et al, 2008;

Yalpani et al, 1993; Enyedi et al, 1992). Debido a la alta capacidad de infectividad del

TSWV, se decidió utilizar este virus para realizar todos los ensayos posteriores del

estudio. Se debe mencionar que la elección del TSWV no se hizo únicamente en base

a su capacidad de infectividad bajo condiciones de laboratorio, sino que también fue

uno de los pocos virus que se encontraron en plantaciones de tomate en el campo.

Hay que considerar que las variaciones en poblaciones de vectores, prácticas de

manejo de plantaciones y condiciones ambientales, entre otros, son factores que

determinan cuál o cuáles virus estarán presentes en un cultivo y época determinada.

Los resultados de estas pruebas también revelaron que la variedad de tomate

Silverado es susceptible a infecciones con el TSWV.

En el día 76 del cronograma de trabajo (Cuadro 2) se realizaron las evaluaciones

de sintomatología, carga viral y actividad enzimática de la generación F1 de plantas

de tomate. La Gráfica 1 muestra la curva de calibración realizada para determinar la

42

carga viral de las muestras del estudio. Esta regresión tenía un coeficiente de

correlación (r2) de 0.96, el cual es un indicador de linealidad adecuada que permite

predecir con bastante precisión las concentraciones de las muestras desconocidas.

Este ensayo mostró que las plantas pertenecientes al grupo control positivo

(infectadas con TSWV pero sin tratamiento) y las plantas infectadas y tratadas con

AAS en la menor concentración (25 mM) tenían una carga viral equivalente a la del

extracto de una planta control sin diluir. La carga viral de estos dos grupos no difirió

estadísticamente (p = 0.68). Por el contrario, las plantas tratadas con 50 y 100 mM de

AAS tenían una carga viral de 0, lo que no solo significa que no estaban infectadas

por el TSWV sino que el tratamiento fue sido capaz de evitar la infección con TSWV

inducida por las inoculaciones mecánicas que se le realizaron a estos lotes de plantas.

Radwan y colaboradores encontraron la misma tendencia en su estudio (Radwan et al,

2007). Este grupo hizo una única aplicación de ácido salicílico a 10, 50 y 100 mM en

tres lotes de cucúrbitas (Cucurbita pepo). Sus resultados demostraron que el

tratamiento tenía una menor infección (evaluado con un DAS-ELISA) y que la

concentración más efectiva fue la de 100 mM.

En el día 100 se realizó otra curva de calibración para evaluar la carga viral de

las plantas nuevamente (Gráfica 2), pero en este caso no se obtuvo una buena

linealidad en la curva de regresión (r2 = 0.86). Esto se debió a que la carga viral en la

planta madre que sirvió de fuente de extracto para construir la curva era demasiado

alta y la prueba de ELISA no fue capaz de distinguir entre las 5 diluciones mas

concentradas del extracto lo que hizo que una sección de la curva fuera totalmente

plana, reduciendo así la linealidad de la distribución. Esto no permitió evaluar la

carga viral de las plantas de estudio, pero si se logró determinar que las muestras de

los lotes de control positivo y tratado con 25 mM AAS seguían infectadas. Estos

resultados no permiten la recomendación de este método para determinar la carga

viral de una planta, ya que con altas concentraciones de virus, no se obtienen

resultados confiables. En la actualidad se están desarrollando sistemas para

cuantificación de carga viral con tecnología de punta como el Realtime PCR

(Fundación Ciencia para la Vida, sin fecha), los cuales son altamente sensibles y

específicos pero lamentablemente tienen costos muy elevados. Por otro lado, al

realizar estas pruebas se encontró que el lote tratado con 50 mM AAS desarrolló

infección mientras que el lote tratado con 100 mM AAS siguió sano (Cuadro 6), pero

los títulos de las plantas tratadas con 50 mM AAS eran menores que los del lote de 25

mM AAS. Esto podría ser una indicación de que el tratamiento con AAS a ciertas

concentraciones no elimina el virus completamente y este queda en un estado

“latente” y puede desarrollar una infección si no se siguen haciendo aplicaciones

periódicas del tratamiento.

La actividad enzimática de las plantas del estudio fue medida con el fin de

evaluar uno de los componentes de la resistencia sistémica adquirida (RSA) y

determinar cómo la infección con TSWV y los tratamientos con AAS alteran la

actividad enzimática de la polifenol oxidasa (PPO) y la guayacol peroxidasa (POX).

Los análisis de actividad enzimática se realizaron durante los días 76 al lote de plantas

F1 y en el día 121 a las plantas F2, al igual que la carga viral y escala de

sintomatología. Durante el día 76 se vio una clara diferencia en la actividad

enzimática de la POX entre los grupos control y tratamiento 25 mM y el resto de los

lotes de plantas, ambos grupos además tenían infecciones activas por el TSWV y

cargas virales altas (Gráfica 3). Estos dos grupos presentaron actividades enzimáticas

43

superiores que el resto de lotes y esto se debe probablemente a que durante un proceso

de infección, el sistema de defensa de la planta aumenta la producción de radicales

libres que causarán necrosis en el tejido vegetal con el fin de detener la propagación

de la infección al resto de la planta. Las enzimas antioxidantes son fundamentales

para modular la acción de estos radicales libres ya que en grandes cantidades pueden

causar daños severos a la planta y por eso es posible que sus actividades estuvieran

aumentadas durante este período de infección. Nuestros hallazgos contradicen los

encontrados por Radwan et al (2007), quienes encontraron mayor actividad

enzimática en plantas de calabaza que fueron tratadas con ácido salicílico que sus

controles pero si había una tendencia a que la actividad enzimática se redujera a

medida que aumentaba la concentración del ácido salicílico. Királi y colaboradores

(2002) por otro lado encontraron una reducción en la actividad de la POX en plantas

infectadas y tratadas con AS en comparación con las que no estaban tratadas con este

compuesto, esto apoya nuestros hallazgos.

En cuanto a la PPO, los mismos dos grupos presentaron actividades enzimáticas

significativamente mayores, pero también el grupo control negativo mostró actividad

alta, que no difirió estadísticamente del grupo de 25 mM (Gráfica 4). En este caso el

efecto de infección y tratamiento en la actividad enzimática no es tan claro, lo cual

podría significar que esta enzima no es un buen marcador de actividad enzimática

durante infecciones virales. Aparentemente, la concentración de AAS no altera

significativamente la actividad de estas enzimas, sino que ellas están más

influenciadas por los procesos de infección del virus.

Al realizar las pruebas enzimáticas a las plantas F2, se observaron hallazgos

interesantes. En este caso, no habían diferencias significativas en la actividad de la

PPO entre ninguno de los grupos experimentales (Gráfica 5), mientras que para la

POX únicamente el grupo control negativo era estadísticamente inferior a los otros

cuatro grupos (control positivo, tratamientos 25, 50 y 100 mM AAS), aunque existía

una tendencia a que los grupos de 25 y 50 mM fueran más altos que los demás, lo cual

corresponde al hecho de que estos grupos empezaban a mostrar infecciones activas

con TSWV (Gráfica 6). En base a esto, se hace evidente que la actividad de la enzima

POX es un mejor indicador de los cambios que ocurren durante infecciones virales

que la PPO.

Finalmente se evaluó la severidad de la sintomatología utilizando una puntaje de

severidad propuesto por Radwan et al, 2007. La Cuadro 6 muestra el puntaje

individual y el puntaje total de enfermedad (PTE) del lote de plantas F1, evaluado el

día 76 del estudio. Los resultados muestran que como era de esperarse, los controles

negativos no mostraban ninguna sintomatología, mientras que las plantas del grupo

control positivo si presentaban una fuerte sintomatología grado 3 con malformaciones

en fruto y hojas (Figura 28). Los grupos experimentales de 25, 50 y 100 mM AAS

mostraron un gradiente de sintomatología, es decir, las plantas tratadas con 25 mM

AAS presentaban sintomatología grado 3, mientras que la mayoría de las plantas del

grupo de 50 mM tenían sintomatología grado 2. En el caso del grupo de 100 mM

AAS, las plantas no mostraron ninguna sintomatología (Figura 29) y tenían un PTE de

cero. En el estudio de Radwan et al, 2007, los puntajes de severidad también fueron

inversamente proporcionales a la concentración del tratamiento aplicado, lo que da

mas soporte a los hallazgos encontrados en este estudio. El PTE no resultó ser un

buen indicador ya que no considera el caso en el que todas las plantas del grupo

44

tengan la misma sintomatología ya que algebraicamente este puntaje dará 1, lo que

ocurre en el caso de que todas las plantas tienen sintomatología grados 3, 2 ó 1.

En este estudio también se evaluó la capacidad del virus de infectar otras plantas

que no han sido tratadas con AAS, después de haber estado en un hospedero que si

fue tratado con este químico. Para ello se tomaron muestras del tejido vegetal de las

plantas F1 y se inoculó un nuevo lote de plantas sanas que no fue tratado con AAS.

La evaluación de presencia de virus por medio de ELISA realizada durante el día 121

reveló que algunas de las plantas del grupo tratado con AAS 50 y 100 mM

presentaban infección (Cuadro 8). Posteriormente, en el día 128, se hizo la evaluación

de sintomatología de este lote y se observó que los controles negativos tuvieron un

PTE de cero como era de esperarse, los controles positivos mostraron sintomatología

leve grado 1 pero en esta ocasión, todos los grupos experimentales mostraron

sintomatología como mínimo de grado 1 (Cuadro 9). Esto demuestra que los virus

pueden quedar de forma persistente en el tejido tratado con AAS y son capaces de

infectar otras plantas. El AAS aparentemente disminuye la aparición de síntomas y

reduce la carga viral, pero no es capaz de eliminar el virus por completo de la planta

infectada.

Este estudio evidenció la capacidad del AAS en reducir la carga viral del TSWV

en plantas de tomate Silverado en forma dosis-dependiente por medio de un aumento

en la RSA de la planta. Es importante resaltar que se deben hacer varias aplicaciones

del tratamiento (100 mM es la dosis óptima) a lo largo de todo el desarrollo de la

planta, pero esto podría tener efectos negativos en el rendimiento de la cosecha ya que

un estado permanente de defensa acrecentada podría causar que la planta invierta

recursos en defenderse y no en producir una mayor cantidad de fruto. Otro de los

hallazgos interesantes fue el de la actividad enzimática de la POX, la cual se ve

acrecentada en situaciones cuando existe una infección viral. Aparentemente el AAS

no tiene ningún efecto en las actividades de la PPO y la POX.

45

PARTE IV

IV.1 CONCLUSIONES

1. Se realizaron pruebas preliminares para determinar cuál es la mejor

metodología de inoculación de virus en plantas de tomate para los fines de este

estudio y se determinó que la mejor metodología de inoculación de virus en

plantas de tomate era la inoculación mecánica con buffer de fosfatos 0.01 M

pH 7.2.

2. Se evaluó la capacidad de infección de tres virus que atacan cultivos de tomate

(TMV, TSWV y potyvirus) con el fin de seleccionar un virus que permitiera

llevar a cabo eficazmente los ensayos de esta propuesta y se determinó que el

virus del bronceado del tomate (TSWV) es el virus que presentó el mejor

porcentaje de infectividad en plantas indicadoras de tomate variedad

Silverado.

3. Se implementó la metodología para la cuantificación de carga viral en plantas

infectadas con virus, pero esta funciona únicamente cuando la carga viral de la

planta fuente de inóculo no es muy alta.

4. Se evaluaron los efectos del ácido acetilsalicílico en la carga viral de plantas

de tomate infectadas y se observó que el ácido acetilsalicílico es capaz de

reducir la carga viral de plantas de tomate infectadas con TSWV en forma

dosis-dependiente.

5. Se determinó la concentración óptima de ácido acetilsalicílico que se debe

aplicar para tener un efecto significativo en la reducción de síntomas de

infección por virus y en la carga viral en la planta, la cual es de 100 mM.

6. Se evaluó la RSA en plantas indicadoras infectadas con virus por medio de

marcadores de oxidación (enzimas antioxidantes guayacol peroxidasa y

polifenol oxidasa) y se determinó que ésta no se ve alterada por la aplicación

de tratamientos de AAS, pero si por la presencia de infección con el virus

TSWV.

7. Se determinó que la aplicación del AAS no afecta la capacidad del virus para

re-infectar otras plantas

8. Las aplicaciones de AAS disminuyen la aparición de síntomas de TSWV de

forma dosis dependiente, según la escala de puntaje de síntomas utilizada en

este estudio.

46

IV.2 RECOMENDACIONES

1. Después de realizar pruebas preliminares para determinar cuál es la mejor

metodología de inoculación, se hizo evidente que siempre que se hagan

ensayos de inoculación, se deben explorar varias metodologías para optimizar

los porcentajes de infección con virus en plantas indicadoras.

2. Se deben realizar experimentos que midan la capacidad de infección de varios

virus que atacan tomate o estudiar mas a fondo las infecciones mixtas que

podrían atacar al tomate.

3. Es necesario realizar más pruebas de laboratorio para encontrar una

metodología que pueda utilizarse para medir la carga viral de plantas

infectadas con virus, ya que la metodología propuesta no funciona para plantas

que tienen infecciones muy fuertes y cargas virales muy altas.

4. Como futuros proyectos de investigación se recomienda realizar ensayos más

largos con más aplicaciones de tratamiento, lo que permitirá determinar si el

efecto protector del AAS permanece más tiempo y si este tiene efectos en el

rendimiento del cultivo de tomate.

5. Se deberían de evaluar otras enzimas antioxidantes que puedan servir como

biomarcadores de cambios en la RSA de plantas infectadas con virus.

6. Se han estudiado ampliamente los efectos del ácido salicílico en otros cultivos

como tabaco y cucúrbitas, pero existe una gran variedad de cultivos que aún

quedan por evaluar por lo que se recomienda hacer estudios con otros cultivos

que no sean hortalizas, por ejemplo, árboles frutales.

7. Después de haber realizado varios estudios bajo condiciones de invernadero

sería interesante realizar ensayos en campo a gran escala, ya que las

condiciones de invernadero son bastante controladas y no es posible saber cuál

será el efecto que ejerce la presión ambiental en los efectos observados bajo

condiciones de laboratorio.

8. En esta ocasión se realizaron experimentos con un solo virus, pero en el

campo existen infecciones mixtas que podrían ser más difíciles de controlar.

Es necesario explorar los efectos que el ácido salicílico podría tener en

cultivos que presenten infecciones virales mixtas o con otros patógenos.

9. El diseño experimental de este estudio consistió en hacer aplicaciones de AAS

antes de inocular la planta con el virus, pero no se sabe cuáles son los efectos

de tratamiento después de que virus ha infectado planta. Es necesario

determinar si este tratamiento es curativo o preventivo.

47

IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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ick.



50

IV.4 ANEXOS

51

ANEXO 1: Inoculación mecánica de virus en plantas indicadoras

1. Selección de plantas

indicadoras en estadío

adecuado para inoculación

2. Selección de material

infectado como fuente de

inóculo. Se debe escoger

material que presente la

sintomatología característica

del virus a inocular.

3. Maceración de tejido

infectado con virus de interés,

utilizando buffer de fosfatos

0.01M pH 7. Es importante

utilizar hielo para evitar la

degradación del virus.

4. Inoculación de la planta

indicadora: Se debe agregar

carborundum en la hoja a

inocular y frotar con el pistilo

que contiene la fuente de

inóculo de forma suave,

evitando dañar demasiado la

hoja.

52

(Fotos tomadas de FODECYT 033-2009)

5. Otra opción es utilizar un

hisopo para hacer la

inoculación. Esto es adecuado

cuando se utilizan plantas con

hojas delicadas que pueden

sufrir mucho daño mecánico

al ser inoculadas.

6. Lavar con agua corriente las

hojas recién inoculadas para

eliminar el carborundum

excedente.

53

ANEXO 2: Método de detección de TSWV por medio de ELISA

1. Preparación de soluciones buffer de trabajo:

- Buffer de Extracción General (GEB 1X) Disolver en 1000 mL de buffer PBST 1X: 1.3 g de sulfito de sodio anhidro, 20 g de

polyvinilpirrolidona (PVP), 0.2 g de azida de sodio, 2.0 g de albúmina de huevo

(pollo) Grado II y 20 g de Tween 20. Ajustar el pH a 7.4 y almacenar a 4°C.

- Buffer PBST (buffer de lavado) Disolver en 1000 mL de agua destilada: 8.0 g de cloruro de sodio (NaCl), 0.2 g de

fosfato de potasio anhidro (KH2PO4), 1.15 g de fosfato de sodio dibásico anhidro

(NaHPO4) y 0.2 g de cloruro de potasio (KCl). Ajustar el pH a 7.2 – 7.4. Agregar 0.5

g de Tween 20. Ajustar el pH a 7.4 y almacenar a 4° C.

- Buffer ECI

Disolver en 1000 mL de PBST 2.0 g de albúmina sérica bovina (BSA), 20.0 g de

polivinilpirrolidona (PVP), 0.2 g de azida sódica (NaN3). Ajustar el pH a 7.4.

Almacenar a 4°C.

- Buffer de sustrato PNP (1X)

Disolver en 800 mL de agua destilada: 0.1 g de cloruro de magnesio hexahidratado,

0.2 g de azida de sodio y 97 mL de dietanolamina. Ajustar el pH a 9.8 con HCl.

Aforar a 1000 mL con agua destilada. Almacenar a 4°C.

- Buffer de carbonato de cobertura (1X)

Disolver en 1000 mL de agua destilada 1.59 g de carbonato de sodio anhidro, 2.93 g

de bicarbonato de sodio y 0.2 g de azida de sodio. Ajustar el pH a 9.6 y almacenar a

4°C.

2. Mapa de la placa:

Antes de empezar a trabajar, utilizar el cuadro de abajo para hacer un mapa de la

colocación de las muestras en la placa de ELISA. Todas las muestras, controles y

blanco se trabajan en duplicado. Se pueden trabajar un máximo de 46 muestras por

placa, más los controles positivo y negativo y blanco.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B

C

D

E

F

G

H

54

3. Preparación, adición e incubación con anticuerpo de captura:

- Anticuerpo debe ser diluido con buffer de carbonato antes de usarse. Preparar

de la siguiente forma:

Para 96 pozos:

En un beaker de vidrio de 50 ml colocar 10 ml de buffer de carbonato y 50 l de

anticuerpo de detección (Agdia).

Agitar por aproximadamente 10 minutos.

Para un menor número de pozos:

- (número de pozos + 2) x (10 ml/96 pozos)= ml de buffer de carbonato

- (ml de buffer carbonato) x (1/200*)ml x (1000l/1ml)= l de anticuerpo de captura

* Se refiere a la dilución del anticuerpo según casa comercial (puede ser 100 ó 200)

- Agregar 100 uL de anticuerpo de captura por cada pozo.

- Incubar la placa por 4 horas a temperatura ambiente o toda la noche a 4°C.

4. Lavado de placas

- Remover el tape con cuidado.

- Vaciar la placa (sacudiéndola fuerte pero no bruscamente sobre el lavadero).

- Llenar los pozos de la placa con PBST (buffer de lavado).

- Se sacude y se seca somatando sobre servilletas hasta que quede bien seca.

- Se llena inmediatamente con el reactivo del siguiente paso.

- Se deja 3 minutos entre cada lavado, esto se hace 6 veces más.

5. Preparación de muestras:

Trabajar todas las muestras en duplicado. Se pueden trabajar 46 muestras máximo,

más los controles positivo y negativo.

Preferiblemente tomar muestras con sintomatología. Se pueden analizar muestras

compuestas de hasta 10 hojas por pozo, no obstante, muchas plantas por pozo

pueden reducir la sensibilidad del ensayo.

En un vial de poliestireno de 7 ml pesar 1 g de cada muestra y agregar 10 ml de

buffer de extracción general (GEB). Macerar hasta que el tejido quede homogéneo.

Entre cada muestra lavar el macerador con solución de cloro 10% y desaguar con

agua destilada.

6. Colocación de las muestras:

- Colocar en los pozos A1 y A2 100 μL buffer de extracción indirecto el cual servirá

de blanco.

- Colocar 100μl de control positivo de Agdia® en los pozos A3 y A4 (si no hay

control positivo de Agdia® puede colocar muestra de una hoja infectada). Al

control congelado agregarle 100μl de buffer de extracción directo y resuspenderlo.

- Colocar 100μl control negativo de Agdia® en los pozos A5 y A6 (si no hay control

negativo de Agdia® puede colocar muestra de una hoja no infectada). Al control

congelado agregarle 100μl de buffer de extracción directo y resuspenderlo.

55

- Colocar 100l de cada muestra macerada en los pozos correspondientes. Hacerlo

en duplicado.

- Cubrir con tape

- Incubar 1 hora en cámara húmeda

7. Preparación del conjugado enzimático

Preparar el conjugado dentro de los 10 minutos previos a su uso.

Para 96 pozos:

En un beaker de vidrio de 50 ml colocar 10 ml de buffer ECI y 50 l de conjugado

enzimático (Agdia).

Agitar por aproximadamente 10 minutos.

Para un menor número de pozos:

- (número de pozos + 2) x (10 ml/96 pozos)= ml de buffer ECI

- (ml de buffer ECI) x (1/200*)ml x (1000l/1ml)= l de conjugado enzimático

* Se refiere a la dilución del anticuerpo según casa comercial (puede ser 100 ó 200)

Lavar la placa como se indica en paso 4.

8. Adición de conjugado enzimático:

Agregar 100l de conjugado enzimático en cada pozo y cubrir con tape. Incubar

durante 1 hora en una cámara húmeda a temperatura ambiente.

9. Preparación de la solución de PNP:

Unos 15 minutos antes de que termine el período de incubación anterior, agregar una

pastilla de PNP por cada 5ml de buffer de revelado (1 mg/mL) y disolverla hasta que

desaparezca la pastilla.

NOTA: No tocar las tabletas de PNP o exponer la solución de PNP a luz fuerte. Luz

o contaminación pueden causar color de fondo en pozos negativos.

Lavar la placa según se indica en paso 4.

10. Revelado de placa con solución de PNP:

Agregar 100ul de la solución de PNP a cada pozo. Colocar la placa en una cámara

oscura (sin tape) por una hora.

11. Lectura de placa:

Se hacen de dos a tres lecturas (una hora, dos horas o hasta tres horas después de

haber agregado la solución de PNP, siempre y cuando los pozos negativos y del

buffer permanezcan incoloros).

- Encender el lector de placas de ELISA 15 minutos antes de hacer la lectura para

que caliente la lámpara

- Hacer lecturas de absorbancia a 405 nm

NOTA: Las burbujas de aire pueden alterar las lecturas por lo que se recomienda

eliminarlas antes de cada lectura.

56

ANEXO 3: Simposio “Mecanismos de defensa de plantas contra patógenos”

Del 28 al 31 de marzo, 2011 se llevo a cabo un simposio donde varios

expositores trataron temas relacionados a las interacciones patógeno-hospedero y los

mecanismos moleculares y fisiológicos que se llevan a cabo en una planta al ser

atacada por una diversidad de patógenos e insectos. El simposio contó con la

presencia de participantes provenientes de instituciones como el Ministerio de

Agricultura y Ganadería (MAGA), la Facultad de Agronomía de la Universidad de

San Carlos de Guatemala, empresas privadas y estudiantes de distintas carreras de la

Universidad del Valle de Guatemala.

Entre los expositores se encontraban el Ing. Emerson Herrera quién dio una

charla introductoria sobre los procesos de infección en plantas. Posteriormente se

expusieron los resultados del proyecto FODECYT 033-2009 en una plática titulada

“Resistencia Sistémica Adquirida (RSA) en plantas”. La Dra. Krisztina Ríos-

González profundizó en el tema de la protección de las plantas contra el estrés,

enfocándose en el sistema de defensa antioxidante de las plantas. Durante el segundo

día del evento, la Licda. Margarita Palmieri expuso las generalidades de los virus de

plantas. El Dr. Manuel Porres habló del control preventivo de plagas y enfermedades

en varios cultivos de interés en Guatemala, y finalmente la Dra. Mónica Stein expuso

los hallazgos de su tesis doctoral en una charla titulada: “La resistencia “No huésped”

de plantas contra hongos”. En el tercer día del simposio, el Dr. Jack Schuster hizo

una exposición ilustrativa de varios ejemplos de interacciones insecto-hospedero,

posteriormente se tocó el tema de la ingeniería genética y la factibilidad de su

introducción en Guatemala, así como las controversias que esta tecnología presenta.

Las charlas de ese día culminaron con la plática del Ing. Gustavo Alvarez, de la

USAC, quien habló de la fisiopatología de las infeccione por nematodos en plantas.

Finalmente, el evento terminó con dos charlas, una de ellas dada por el Ing. Luis

Fernando Orellana de Bayer CropScience, Guatemala, en donde se expusieron las

nuevas opciones disponibles en el mercado para el control de plagas por medio de

agroquímicos. La plática final fue impartida por la Licda. Margarita Palmieri, quien

expuso la situación actual del país en términos de las plagas y enfermedades vegetales

presentes.

Durante el simposio se dieron coffee breaks cada día del evento y se hizo

entrega de un diploma de participación a todos los asistentes del simposio. Merck

Guatemala hizo una donación de lapiceros y DILABSA de bloques de notas para ser

entregados como material a todos los participantes. Lastimosamente el Dr. Pedro

Ramos del IIFT de Cuba no pudo obtener la autorización de salida a tiempo por lo que

no pudo asistir a la actividad. En su lugar, la Dra. Ríos-González y el Dr. Schuster

dieron pláticas relacionadas al tema general del simposio.

El programa de la actividad se muestra a continuación, junto con algunas

fotografías del evento.

57

PROGRAMA SIMPOSIO “Mecanismos de Defensa de Plantas Contra Patógenos

Lunes 28 de marzo Martes 29 de

marzo

Miércoles 30 de

marzo Jueves 31 de marzo

Generalidades de

los procesos de

infección en plantas Ing. Emerson Herrera,

MSc

Universidad del Valle de Guatemala

Virus de plantas Licda. Margarita Palmieri Universidad del Valle de

Guatemala

Misceláneos sobre

interacciones

insecto-hospedero Dr. Jack Schuster, PhD


Control de plagas

por medio de

agroquímicos Ing. Luis Fernando

Orellana, MSc Bayer CropScience

Guatemala

Coffee Break Coffee Break Coffee Break Coffee Break

Resistencia

Sistémica

Adquirida (RSA)

en plantas Dra. Mónica Orozco, PhD


Control preventivo

de plagas y

enfermedades Dr. Manuel Porres, PhD Universidad del Valle de

Guatemala

¿Es posible

desarrollar

ingeniería genética

agrícola en

Guatemala? Dra. Mónica Stein, PhD Universidad del Valle de

Guatemala

La situación actual

de las plagas en

cultivos de

Guatemala Licda. Margarita Palmieri


Protección Contra

Estrés: Sistema de

Defensa

Antioxidante en

Plantas Dra. Krisztina Ríos-

González


La resistencia "No

huésped" de

plantas contra

hongos biotróficos Dra. Mónica Stein, PhD Universidad del Valle de

Guatemala

Fisiopatología de

las infecciones por

nematodos Ing. Gustavo Alvarez Universidad de San

Carlos de Guatemala

Cierre de la

actividad

58

Presentación dada por el Ing. Emerson Herrera durante el simposio


Presentación dada por la Dra. Mónica Orozco durante el simposio


56

PARTE V

V.1 INFORME FINANCIERO

AD-R-0013

Nombre del Proyecto:

Numero del Proyecto: 033-2009

Investigador Principal y/o Responsable del Proyecto: DRA. MÓNICA NINNETTE OROZCO FIGUEROAMonto Autorizado: Q168,685.00

Plazo en meses 12 meses 1a.

Fecha de Inicio y Finalización: 01/06/2009 al 31/05/2010 2a.

Menos (-) Mas (+)

1 Servicios no personales

181

Estudios, investigaciones y proyectos de

factibilidad 39,300.00Q 37,800.00Q 1,500.00Q

181

Estudios, investigaciones y proyectos de

factibilidad (Evaluación Externa de Impacto) 8,000.00Q 8,000.00Q

121 Divulgación e información 500.00Q 96.00Q 404.00Q

122 Impresión, encuadernación y reproducción 2,500.00Q 2,000.00Q 247.50Q 4,252.50Q

133 Viáticos en el interior 4,000.00Q 4,000.00Q

163

Mantenimiento y reparación de equipo médico-

sanitario y de laboratorio 5,450.00Q 1,375.00Q 4,075.00Q

185 Servicios de capacitación 28,000.00Q 3,500.00Q 24,500.00Q

2 MATERIALES Y SUMINISTROS

211 Alimentos para personas 231.80Q -231.80 Q

223 Piedra, arcilla y arena 500.00Q 500.00Q

241 Papel de escritoiro 300.00Q 216.00Q 84.00Q

243 Productos de papel o cartón 200.00Q 341.40Q -141.40 Q

249 Otros productos de papel, cartón e impresos 200.00Q 200.00Q

252 Artículos de cuero 109.98Q 109.98Q -Q

261 Elementos y compuestos químicos 40,000.00Q 24,575.95Q 15,912.86Q -488.81 Q

262 Combustibles y Lubricantes 4,000.00Q 524.97Q 3,475.03Q

263 Abonos y fertilizantes 2,500.00Q 2,131.00Q 369.00Q

264 Insecticidas, fumigantes y similares 2,500.00Q 717.50Q 3,217.50Q -Q

267 Tintes, pinturas y colorantes 1,000.00Q 1,000.00Q

268 Productos plásticos, nylon, vinil y pvc 3,000.00Q 2,068.57Q 23,088.70Q 1,792.13Q 22,228.00Q

269 Otros productos químicos y conexos 3,000.00Q 3,000.00Q

272 Productos de vidrio 3,000.00Q 3,000.00Q

283 Productos de metal 224.97Q 224.97Q -Q

286 Herramientas menores 400.00Q 1,019.90Q 1,419.90Q -Q

291 Útiles de oficina 500.00Q 1,500.00Q 207.20Q 1,792.80Q

292 Útiles de limpieza y productos sanitarios 1,000.00Q 569.95Q 430.05Q

295

Útiles menores, médico-quirúrgicos y de

laboratorio 500.00Q 2,300.96Q 3,138.41Q -337.45 Q

297 Útiles, accesorios y materiales eléctricos 2,000.00Q 817.49Q 1,182.51Q

299 Otros materiales y suministros 1,000.00Q 382.37Q 617.63Q

3

PROPIEDAD, PLANTA, EQUIPO E

INTANGIBLES

GASTOS DE ADMÓN. (10%) 15,335.00Q 15,335.00Q -Q

168,685.00Q 30,962.01Q 30,962.01Q 85,273.94Q 83,411.06Q

MONTO AUTORIZADO 168,685.00Q Disponibilidad 83,411.06Q

(-) EJECUTADO 85,273.94Q

SUBTOTAL 83,411.06Q

(-) CAJA CHICA

TOTAL POR EJECUTAR 83,411.06Q

PRÓRROGA AL 30/11/2010

FICHA DE EJECUCIÓN PRESUPUESTARIA

LINEA:

FODECYT

"Evaluación del efecto de la aplicación de ácido acetilsalicílico en el mejoramiento del sistema

de resistencia sistémica adquirida (RSA) de plantas de tomate susceptibles a virus"

Orden de Inicio (y/o Fecha primer pago):

PRÓRROGA AL 31/03/2011

Grupo Renglon Nombre del Gasto Asignacion

Presupuestaria

TRANSFERENCIA En Ejecuciòn

Ejecutado Pendiente de

Ejecutar

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