TECNICAS Y METODOS PARA LE ESTUDIO DE LA CELULA

PRESENTADO POR:Kelly Bermúdez Villarroya

Stephanie Ariza lunaAnyela Ariza RodríguezMaría Alejandra Badran

Lisa Becerra

KELLY BERMUDEZ VILLARROYA

FUNDAMENTO DEL PROCESO DE FIJACIÓN

TISULAR

VIDA

El proceso dinámico por el que los organismos completan su ciclo biológico

MUERTE

Nivel metabólico a partir del cual las células que componen esos organismos no son capaces de recuperar las funciones

vitales que le son propias

AUTOLISIS PUTREFACCION

• De la localización y la naturaleza del tejido considerado• De la temperatura existente en el medio donde se encuentra el tejido.

¿QUE ES FIJACION TISULAR?

Es interrumpir los procesos de

degradación que aparecen tras la muerte celular,

tratando de conservar la arquitectura y

composición tisular lo mas próxima posible a como se encontraba en

el organismo vivo

ENTONCES, ¿QUÉ ES

MAGEN REAL?

¡ Es la imagen que tenia el

tejido cuando estaba vivo !

…Es la imagen obtenida

después de la manipulación, y que comprende

fijación, inclusión, corte y coloración

¿Y, LA IMAGEN EQUIVALENTE?

CONDICIONES FUNDAMENTALES

1. La propiedad denominada constancia: la imagen equivalente ha de observarse en todo los tejidos idénticos obtenidos de distintos individuos de su misma especie animal.

2. Su reproductividad en todas las preparaciones histológicas obtenidas a partir de dichos tejidos independientes del proceso de fijación empleado.

PRINCIPIOS GENERALES DE LA FIJACION

1. No existe un método universal de fijación.

2. No todos los fijadores conservan indefinidamente el tejido.

3. Un defecto de fijación jamás puede ser corregido.

4. Es inútil realizar un estudio histológico sobre un material con graves defectos de fijación.

TIPOS DE FIJACION

• Fijación Histológica o Citológica: esta pretende principalmente la conservación de la arquitectura y estructura de los tejidos y cedulas, sin considerar los cambios moleculares inducidos sobres sus componentes bioquímicos

 • Fijación histoquímica: para esta es mas

trascendental preservar la composición molecular y bioquímica de los tejidos que conservar los propios detalles morfológicos celulares.

FASES DEL PROCESO DE FIJACIÓN

• La fijación inicial o primaria, que es la realizada sobre el tejido fresco.

• La fijación secundaria o refijacion, que consiste en colocar un tejido ya fijado en un segundo fijador para demostrar algún componente tisular específico o simplemente para intensificar la fijación inicial.

CLASES DE AGENTE FIJADORES SEGÚN SU MECANISMO DE ACTUACION

Fijadores por métodos físicos

Es el método de elección para realizar estudios morfológicos o funcionales en los que se requiera conservar intacta la estructura antigua del tejido o se contenido enzimático, en este se emplea el enfriamiento por congelación del tejido como método para detener la autolisis y putrefacción tisular.

Fijadores por métodos químicos

En este los agentes fijadores, generalmente en forma liquida, actúan desnaturalizando e insolubilizando las proteínas tisulares lo cual bloquea la autolisis por inactivación enzimática. Además algunos de estos líquidos fijadores impiden el crecimiento bacteriano.

CRIODESECACION (liofilización)

Fijación instantánea

por congelación en

nitrógeno liquido

Desecación por sublimación

directa de agua congelada a vapor en una

bomba al vacío.

CRIOSUSTITUCION

Congelación lenta y progresiva del agua congelada de un tejido por un liquido fijador, en ocasiones puede actuar simultáneamente como medio de inclusión.

CARACTERISTICAS FUNDAMENTALES QUE DEBE POSEER EL LIQUIDO FIJADOR IDEAL.

1. Capacidad para bloquear de inmediato la

autolisis

2. Efecto microbicida

3. No provocar reacciones o distorsiones

4. Inducción de cambios en la textura y

composición tisular

REGLAS GENERALES A CONSERVAR EN EL EMPLEO DE LIQUIDOS FIJADORES

1. Para evitar la autolisis, el tejido debe ser colocando lo mas rápidamente posible en el liquido fijador.

2. El tejido debe estar seleccionado3. El volumen necesario de fijador esta determinado

por el del tejido que se va a fijar.4. La presión osmótica del líquido fijador y la del

tejido serán equivalente.5. El pH del líquido fijado debe aproximarse al pH

fisiológico, salvo que su composición deba contener ácidos.

6. El tiempo de fijación es especifico para cada fijador.

LAVADO POSTFIJACION

Se realiza con los siguientes objetivos:

1. Limitar el tiempo de contacto entre el fijador y el tejido.

2. Impedir el contacto del fijador con los medios de inclusión utilizados para proseguir el tratamiento de la muestra.(porque existe incompatibilidad química entre ambos)

LIQUIDOS FIJADORES SIMPLES1. FIJADORES POR DESHIDRATACIÓN TISULARLos principales agentes fijadores por deshidratación son los alcoholes esencialmente el metílico, y el etílico, la acetona, y el cloroformo. Los únicos que se utilizan como fijadores simples son: el alcohol etílico y la acetona.

2. FIJADORES POR CAMBIO EN EL ESTADO COLOHIDAL DE LAS PROTEINAS. Todos los fijadores contemplados en este grupo son de carácter acido, se emplean formando parte de mezclas fijadoras y poseen una gran velocidad de penetración en los tejidos y algún poder de decalcificación.

LIQUIDOS FIJADORES SIMPLES3. FIJADORES QUE ACTUAN POR FORMACION DE SALES CON LOS TEJIDOS Por lo general todos los agentes de este grupo poseen una gran velocidad de fijación ya que la formulación de las sales se produce instantáneamente. La precipitación metálicas por el tejido provoca un notable endurecimiento, lo que obliga a emplearlo en mezclas fijadoras que amortigüen este efecto.

4. FIJADORES QUE ACTUAN POR RETICULARIZACION DE LAS PROTEINAS.Los principales agentes fijadores que actúan por este mecanismo son los aldehídos o potentes oxidantes como el tetróxido de osmio.

SOLUCIONES FIJADORAS SIMPLES QUE CONTIENEN FORMALDHIDO

A. FormolsalinoB. Formalina neutraC. Formol tamponadoD. Formalina acidaE. Formol calciso, solución de beaker

STEPHANIE ARIZA LUNA

MICROTOMOS Y TECNICAS DE CORTE DE LOS TEJIDOS.

EL MICRÓTOMO

Instrumento mecánico con el cual se realizan secciones

tisulares para la observación en el

microscopio.http://www.youtube.com/watch?v=twPmE-4py2c&feature=player_embedded

El micrótomo se encuentra conformado por:

Porta bloques• Porta cuchillas clásico

Mecanismo de avance del portabloques sobre la cuchilla

• Rueda micrométrica

MICRÓTOMO

TIPOS DE MICRÓTOMO

1. Micrótomo de oscilación o balanceo:

2. Micrótomo de rotación o tipo Minot

http://www.youtube.com/watch?v=GIlF3AW

3uhU

3. Micrótomo de desplazamiento

3.1De portabloques deslizante o tipo leitz

3.2 De cuchilla móvil o tipo reichert-jung

3.3 Tipo tetrander

MICRÓTOMO DE DESLIZAMIENTO DE TIPO CUCHILLA MÓVIL O TIPO REICHERT-JUNG.

MICRÓTOMO DE DESLIZAMIENTO TIPO CUCHILLA MÓVIL O TIPO REICHERT-JUNG.

MICRÓTOMO DE DESLIZAMIENTO DE PORTABLOQUE DESLIZANTE O TIPO LEITZ

MICRÓTOMO DE CONGELACIÓN

CRIOSTATO O CRIOTOMO

ULTRAMICRÓTOMO

Es un micrótomo básicamente derivado del Minot pero con mejoras:

• Sistema de iluminación.• Platina portacuchillas• Sistema óptico con microscopio.

ULTRAMICROTOMO

TIPOS DE CUCHILLAS PARA EL MICRÓTOMO

• La selección y cuidado del las cuchillas era para

confeccionar buenas preparaciones histológicas.

• Actualmente se usan dispositivos de cuchillas

desechables , desplazando las cuchillas

permanentes.• Cuchilla planocóncavas : Tipo A y B• Biplana, en cuña o de tipo c• Biplana con faceta o tipo D

CUCHILLAS BICÓNCAVA EN AMBAS CARAS

TÉCNICA DE CORTE SOBRE BLOQUE DE PARAFINA

La confección de cortes en parafina consta de seis pasos:

1. Talladado y enfriamiento del bloque.2. Fijación al portabloques.3. Orientación del bloque.4. Orientación de la cuchilla del micrótomo y

devastado del bloque.5. Selección del espesor del bloque6. Realización de las secciones.7. Estirado de los cortes y confesión de las

preparaciones8. Secado de las preparaciones histológicas

TÉCNICA DE CORTE PARA MATERIAL INCLUIDO EN CELOIDINA.

Comprende varias operaciones sucesivas:

1. Conservación ,tallado y fijación de bloques al

micrótomo.

2. Orientación de la cuchilla

3. Obtención y manipulación de cortes

TÉCNICA DE CORTE SOBRE MATERIAL CONGELADO

Corte en el micrótomo de congelación.1. Congelación del bloque2. Obtención de secciones3. Confección de preparaciones

Técnica de corte en el criostato

4. Congelación del material5. Realización de las secciones6. Soluciones adherentes para portaobjetos

Corte en el micrótomo de congelación1. Congelación del bloque2. Obtención de secciones3. Confección de preparaciones

Técnica de corte en el criostato4. Congelación del material5. Realización de las secciones6. Soluciones adherentes para portaobjetos

Técnica de corte y manejo de la secciones en microscopia eléctrica.1. Espesor de los cortes ultra finos2. Cuchillas de ultramicrotomo3. Técnica de corte ultramicrotomia

TINCIONANYELA ARIZA RODRIGUEZ

COLORANTE

• Sustancia que puesta en contacto con un soporte adecuado, se une a el de forma perdurable transmitiéndole su color

• Pueden emplearse para distinguir entre diferentes tipos de células o para revelar la presencia de determinados constituyentes de la célula

TIPOS DE COLORANTE

NATURALES ARTIFICIALES

Se obtienen a partir del extracto de plantas e insectos

•Colorantes nucleares:Hematoxilina Carmín

•Colorantes citoplasmáticos:SafraninaOrceina

Obtienen a partir del carbón y en la actualidad se sintetizan en el laboratorio

Su gama aumenta continuamente

Los colorantes naturales y artificiales presentan un soporte químico que son :

LOS ANILLOS AROMATICOS

Derivados del benceno

Gran diversidad de derivados del

benceno y por ende de colorantes de

anilina

GRUPOS CROMOFOROS

Radicales químicos responsables de la modificación molecular a la que se debe la aparición del color

CROMÓGENO: Conjunto formado por el grupo cromoforo mas anillo aromático

No es un colorante

No se liga con los tejidos

COLORANTES SEGÚN SUS GRUPOS CROMOFOROS

FUNCION

GRUPO CROMOGENO

•Colorantes nitrados y nitrosados•Colorantes azoicos•Colorantes derivados de la antraquinona•Colorantes derivados de la acridina

•Colorantes derivados de iminas quinonicas•Colorantes derivados del difenilmetano•Colorantes derivados del xanteo•Colorantes derivados de la ftalocianinas

GRUPOS AUXOCROMOS Dotados de carga

eléctrica,

es decir, poseen carácter ácido o

básico

Son responsables de que el colorante tenga mayor o menor afinidad por la estructura que se va a teñir, es decir que fija eficazmente el colorante

CLASIFICACION DE LOS COLORANTES SEGÚN SUS GRUPOS AUXOCROMOS Y

APETENCIA TISULAR

• COLORANTES BASICOS

• COLORANTES ACIDOS

• COLORANTES NEUTROS

• COLORANTES INDIFERENTES

• COLORANTES METACROMATICOS

MECANISMOS GENERALES DE COLORACION

•Mecanismos de carácter físico•Mecanismos de carácter fisicoquímico o histoquímico

Combinados explican las particularidades de las principales técnicas de tinción e n anatomía patológica

COLORACIONES NUCLEARES

Entre ellos están colorantes básicos como:

•Galocianina•El verde de metilo•El azul de azilarina S•La fucsina básica•El violeta de cresilo o rojo nuclear extra

Entre los de mayor importancia que son de origen natural están:

•El carmín•La safranina•La hematoxilina

Que es el colorante nuclear por excelencia

COLORANTES CITOPLASMATICOS

En general son menos específicos que los nucleares, pues se fijan a los componentes extracelulares de los tejidos provocando su tinción simultanea

• COLORANTES XANTENICOS:EosinaFloxina

• CROMOTROPO 2R