Resolviendo Problemas

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Rutina de Inmunohematología

Pruebas Imunohematológicas

Fenotipificación ABO

Fenotipificación RhD

Test de Antiglobulina Directo (Coombs Directo)

Test de Antiglobulina Indireto (Coombs Indirecto)

Los métodos se basan en el principio de la

hemaglutinación

• Que debe Indicar si hubo o no unión del Anticuerpo con el antígeno

Gel TestPrueba en Tubo Microplaca

Principio de los Test Inmunohematológicos

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Principio de los Test Inmunohematológicos

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• La reacción de aglutinación es um

fenomemo complejo que involucra

muchas variábles.

• Aglutinación específica y

inespecífica.

• En ImH usamos la reacción de

aglutinación como una herramienta

que nos indica se hube o no la

union Ag-AC. (Agl específica).

• Ac conocidos Ag

Ag conocidos Ac

Reación de Aglutinación

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Aglutinación

• La aglutinación ocurri

cuando la fuerza de

repulsión entre los

hematíes es superado.

• Esto ocurre por alteración

de la membrana de los

hematies, o del medio en

lo cual ellos están en

suspensión.

Cuidado !

Ni siempre la presencia de aglutinación significa presencia de la reacción Ag-Ac

Ni siempre, la ausencia de aglutinación garantiza que no hubo la reacción Ag-Ac

La fenotipificación ABO corresponde a la pesquisa de los

antígenos A/B en los hematíes y de los anticuerpos naturales anti-

A, Anti-B del plasma.

Prueba Directa: se utilizan reactivos Anti-A y Anti-B comerciales

para la pesquisa de los antígenos

Prueba Inversa: se utilizan hematíes A1 y B para la pesquisa de

los anticuerpos naturales ABO (isoaglutininas)

Tab A

Fenotipificación ABO

Prova direta

Prova reversa

Prueba inversaPrueba directa

Prueba inversa

Discrepancias en la Fenotipificación ABO

Que es discrepancia ABO???

La discrepancia ocurre cuando el resultado de la Prueba Directa

no “concuerda”con el resultado de la Prueba inversa

Resultados discrepantes deben ser investigados para la liberación

de un resultado correcto

Qué hacer???

Identificar el problema:

En la mayoría de los casos, la discrepancia está relacionada a

problemas técnicos u otros:

• errores digitación

• problemas con Reactivos o Equipamientos

• errores durante el procedimiento

En otros casos, existe una discrepancia verdadera, relacionada con

la muestra (hematíes o plasma/suero)

Discrepancia em la Fenotipificación ABO

Errores Clericais:• tubos mal/no identificados

• muestra identificada incorrectamente (cambio de muestra)

• error de transcripción de resultado

• error de digitación

Problemas con Reactivos o Equipamientos:• reactivos vencidos

• reactivos contaminados

• equipamiento descalibrados

Errores de Procedimiento:• reactivos no adicionados

• no observar las orientaciones do fabricante

• suspensión de hematíes en concentración inadecuada

• lectura de los resultados (resuspensión inadecuada)

Discrepancias – Errores Técnicos

Problemas em la Prueba Directa (Hematíes):

• antígenos ABO con reatividad débil o ausente

• reatividad extra

Problemas em la Prueba inversa (Plasma):

• anticuerpos ABO con reatividad débil o ausente

• reatividad extra

Discrepancias ABO - Verdaderas

Prueba Direta - reatividad débil o ausente

Anti-A Anti-B Hematíe A1 Hematíe B

0 (2+) 0 0 4+

Discrepancias ABO

Subgrupos ABO:

presentan menos sitios antigénicos por hematíe – reatividad más débil o ausencia

de reatividad con los reactivos Anti-A/-B.

~ 80% de los indivíduos A/AB son A1; 19% A2, 1% otros subgrupos (A3, Ax, Am ,Aint, Ael

Ay,etc.)

Patologías (ex: leucemia)

RN (antígenos inmaduros)

Otros (reación con doble-población):

Transfusiones recientes (doble población)

Transplantes (quimeras)

Prueba Directa - reactividad débil o ausente

Cómo Resolver???

Subgrupos ABO:

• aumentar tiempo de incubación y disminuir temperatura de

incubación

• utilizar Anti-A1, Anti-H

• técnicas de fijación/elución

Verificar datos clínicos (RN, patología) - RN (repetir pruebas

posteriormente)

Discrepancias ABO

Ejemplo: Prueba Directa - reactividad débil o ausente

Histórico de tipificación Grupo O. Paciente saludable, sin histórico clínico.

SOLUCIÓN???

Fijación/ Elución: eluado reactivo

con hematíe A

Ex: A débil (probable subgrupo Ael)

Directa: “O” Inversa: “A”

Discrepancias ABO

Prueba Directa - recatividad extra

Reactivos/muestras (contaminación)

Rouleaux (test en tubo)

Muestra de cordón (gelatina de wharton)

Presencia de auto-anticuerpos fríos e IgG alto título

Poliaglutinación (ex: antígeno T)

Fenómeno B adquirido

Anti-A Anti-B Hematíe A1 Hematíe B

4+ 1+ 0 4+

Discrepancias ABO

Prueba Directa - reactividad extra

Cómo Resolver???

Realizar TAD (auto-anticuerpos fríos/calientes)

• lavar hematíes con solución salina calentada 37ºC/ID-Diluent 2

• utilizar técnicas de disociación de auto-anticuerpos

Hematíes de cordón (lavar hematíes)

Fenómeno B Adquirido y Poliaglutinación (Ex: antígeno T)

• utilizar reactivos monoclonales (menos proteico, no reacciona con antígeno

T, no reacciona con B adquirido)

Discrepancias ABO

Exemplo: Prueba Directa - reactividad extra

Ex: presencia de auto-anticuerpos fríos

fijados a los hematíes

Conducta inicial:

lavar hematíes con ID-Diluent 2 calentado o

salina calentada y repetir fenotipificación

Discrepancias ABO

Prueba Inversa - reatividad débil o ausente

Bajo título de anticuerpos (niños e ancianos)

Ausencia de anticuerpos (hipo o agamaglobulinemia, medicamentos)

Cómo resolver ???

Verificar datos clínicos (RN/ niños, ancianos, patología,

medicamentos)

Aumentar tiempo de incubación y disminuir temperatura de

incubación

Anti-A Anti-B Hematíe A1 Hematíe B

4+ 0 0 0

Discrepancias ABO

Ejemplo: Prueba Inversa - reactividad débil o ausente

Ex: anticuerpos anti-B en bajo título

4 oC

Directa: “A” Inversa: “O”

Discrepancias ABO

Prueba Inversa - reatividad extra

Auto-anticuerpos fríos libres en el plasma

Aloanticuerpos (reactivos a TA: anti-M,-N,-Le,-P1)

Patologías (uso de expansores plasmáticos, fibrinógeno elevado,

hipergamaglobulinemia)

Anti-A Anti-B Hematíe A1 Hematíe B

4+ 0 1+ 4+

Discrepancias ABO

Cómo resolver???

Autocontrol positivo: repetir PI a 37ºC (auto-anticuerpos fríos)

Autocontrol negativo: realizar la pesquisa e identificación de anticuerpos

irregulares (repetir PI a 37ºC)

• investigar subgrupos (presencia de anti-A1 natural )

Exemplo: Prueba Inversa - reactividad extra

Ex:auto-anticuerpos fríos

Repetir PI a 37oCRepetir PI con suero auto-adsorvido

Discrepancias ABO

El antígeno D es el más importante antígeno de grupo sanguíneo

después de los antígenos A y B.

El antígeno RhD pertenece al sistema Rh:

• sistema complejo que posee 49 antígenos

• principales antígenos: D; C/c; E/e

El antígeno RhD posee alta inmunogenicidad y está envuelto en la

EHRN y RHT.

La fenotipificación RhD corresponde a pesquisa del antígeno RhD

en los hematíes

Fenotipificación RhD

Fenotipaificación RhD

RhD negativo

RhD positivo:

RhD normal - 10.000 a 25.000

sitios/hematíes (resultados positivos

fuerte)

RhD débil - 66 a 5.000 sitios/hemácia

(en Tubo: detectado a través del test

de AGH. En Gel: detectado

directamente, reacciones < 3+)

RhD parcial - 500 a 25.000

sitios/hematíes (puede presentar

resultado positivo fuerte o positivo

débil).

RhD Normal RhD débil RhD parcial RhD parcial

Causas de Discrepancias RhD:

Polimorfismo del antígeno (D débil/D parcial)

Disponibilidad de diferentes reactivos para fenotipificación

(diferentes clones)

Presencia de auto-anticuerpos fijados in vivo (alo/EHRN) - TAD

positivo

Poliaglutinación (contaminación gelatina de wharton,

exposición de criptoantígenos)

Patologías

Contaminación de reactivos/muestras

Errores Técnicos : clerical/procedimientos

Discrepancias RhD

Cómo resolver???

Verificar: procedimientos/ reactivos

• repetir pruebas

• verificar resultado del ctl de D

Realizar TAD (presencia auto-anticuerpos/ aloanticuerpos fijados

in vivo)

• ctl positivo: lavar hematíes

• repetir test con reactivos monoclonales

• utilizar técnicas de disociación de anticuerpos

Discrepancias RhD

Reacciones en GEL para RhD

Cómo resolver???

Pesquisa de D débil/parcial

• utilizar otros reactivos

• tipificación D parcial

• estudios moleculares

Tipificación D parcial

Discrepancias RhD

Ej: paciente con histórico de resultado RhD negativo y RhD positivo (Ddébil)

Discrepancias RhD

RhD débil RhD neg

RhD parcial categoria VI

Prueba simple y eficiente, utilizado para demostrar la presencia de

inmunoglobulinas y/o fracciones de complemento fijados a los

hematíes. Utilizado para:

Investigación de AHAI

Investigación de la hemólisis inducida por drogas

Investigación da Enfermedad Hemolítica Peri-Natal (EHRN)

Investigación de Reación Hemolítica Transfusional

Test de Antiglobulina Directo (TAD) o Coombs Directo

TAD Poliespecífico TAD Monoespecífico

IgG Subclase IgG Dilución

Test de Antiglobulina Directo

Causas de resultados falso positivos:

Suspensión de hematíes en concentración inadecuada (superior

a lo indicado)

Centrifugación por tiempo y velocidad sobre lo indicado (tubo)

Poliaglutinación (rouleaux, gelatina de Wharton)

Contaminación de reactivos/muestras

Muestra de sangre inapropiada

Test de Antiglobulina Directo (TAD)

Causas de resultados falso negativos:

Suspensión de hematíes inadecuada (inferior a lo indicado)

Centrifugación por tempo y velocidad inferiores a lo indicado

(tubo)

Lectura inadecuada de la reacción aglutinación (tubo)

Lavado inadecuada de los hematíes antes del test (tubo)

Reactivos inadecuados/contaminación (cambio de cuenta-gotas y

neutralización de la AGH) (tubo)

Importante: realizar control de Coombs: hematíes sensibilizados

por IgG (tubo)

Test de Antiglobulina Directo (TAD)

Test realizado para verificar la presencia de anticuerpos anti-

eritrocitarios en el suero/plasma.

Utiliza el suero de Coombs o suero antiglobulina humana (AGH)

Anticuerpos anti-eritrocitarios están implicados:

Enfermedad Hemolítica Peri-Natal* (EHRN)

Reacciones Transfusionales Hemolíticas

Test de Antiglobulina Indirecto o Coombs Indirecto

Consideraciones Importantes:

El Test de Antiglobulina Indirecto debe ser realizado utilizando

hematíes de fenotipo conocido que presentan los principales

antígenos de importancia clínica (Tabla 1)

Resultados negativos deben ser confirmados con hematíes control

de Coombs (tubo)

Resultados positivos:

• realizar autocontrol

• realizar identificación de anticuerpos irregulares (Tabla 2)

Anticuerpos no implicados en EHRN:

• clase IgM

• anticuerpos direccionados a antígenos inmaduros o ausentes en los

hematíes fetales/RN

Test de Antiglobulina Indirecto

Referencias Bibliográficas

• DANIEL, G. & BROMILOW, I. Essential Guide to Blood Groups.

Oxford: Blackwell Publishin, 2007. 99p

• RUDMANN, S. V. Serologic Problem-Solving. Bethesda: AABB

Press, 2005. 193p

Hematíes para Pesquisa de Anticuerpos Irregulares

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Hematíes para Identificación Anticuerpos Irregulares

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ANTI-A

+

ANTI-B

O

-AB

ANTI-AB

ANTI-BA

Anticuerpos

naturales en

el plasma

Antígenos

en los

hematíes

Grupo

ABO

N-acetil galactosamina Galactosamina se asemeja a

D-galactosa (antígeno B)

Acción de enzima

bacteriana remueve el

grupo acetil

Fenómeno B Adquirido

Individuo Grupo A B Adquirido

Gracias!

clauperon@hotmail.com