CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -CONCYT- SECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -SENACYT-

FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -FONACYT- FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACIA

UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA-USAC

INFORME FINAL

“Caracterización Química y Análisis del Contenido Mineral de Smilax domingensis y Phlebodium pseudoaureum”

PROYECTO FODECYT No. 50-2006

RODOLFO MARINELI OROZCO CHILEL Investigador Principal

GUATEMALA, DICIEMBRE DEL 2010

AGRADECIMIENTOS La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro del Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología, -FONACYT- otorgado por la Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología –SENACYT- y al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología -CONCYT-.

AGRADECIMIENTOS A la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia Escuela de Química, Departamento de Fisicoquímica A la facultad de Agronomia Universidad de San Carlos de Guatemala

INDICE

RESUMEN ……………………………………..……………………….….. i SUMMARY ………………………………………………….……………… ii

PARTE I Página

I.1 INTRODUCCIÓN.........................................................................................01 I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA I.2.1 Antecedentes en Guatemala……….………...………………………03 I.2.2 Justificación del trabajo de investigación …..……………………….05 I.3 OBJETIVOS E HIPOTESIS I.3.1 Objetivos I.3.1.1 General y Específicos…..........................................................06 I.3.1.2 Hipótesis…...……………………………………....………..06 I.4 METODOLOGIA

I.4.1 Localización……................................................................................07 I.4.2 Medios.................................................................................................07 I.4.2.1 Recursos Humanos..................................................................07

I.4.2.2. Recursos Institucionales..........................................................07 I.4.3 Materiales y Reactivos........................................................................07 I.4.3.1 Trabajo de campo..................................................................07 I.4.3.2 Trabajo de laboratorio.............................................................08 I.4.4 Periodo de Trabajo de Campo.............................................................08 I.4.5 Muestreo..............................................................................................08 I.4.6 Colecta de material Vegetal................................................................08 I.4.7 Secado..................................................................................................08 I.4.8 Preparación de extractos crudos…......................................................08 I.4.9 Hidrólisis ácida de cada extracto vegetal………………………….…09 I.4.10 Separación por cromatografía en columna…..…..……………..........09 I.4.11 Extracción supercrítica con CO2......…………………………………09 I.4.12 Identificación de flavonoides por cromatografía HPLC………….....09 I.4.13 Identificación de saponinas por CCF………………………………...10 I.3.14 Determinación mineral por TFRX………………………………...…10

PARTE II II.1 MARCO TEORICO

II.1.1 Smilax domingensis…...........................................................................12 II.1.2 P. pseudoaureum…………………………...........................................13 II.1.3 Los Flavonoides……………………………………….……………....16 II.1.4 Las saponinas…………………………………….……………………19 II.1.5 Alimentos funcionales o nutraceuticos………………………………..22 II.1.6 Minerales…………………………….………………………………..22 II.1.7 Rayos X……………………………………………………………….23

PARTE III III.RESULTADOS.....................................................................................................30

III.1 Discusión de Resultados......................................................................41

PARTE IV IV.1 CONCLUSIONES..........................................................................................43 IV.2 RECOMENDACIONES.................................................................................44 IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................45 IV.4 ANEXOS……………………………………………………………………48 IV.4.1 Cromatogramas HPLC de los estándares………………………...... 49 IV.4.2 Cromatogramas HPLC de rizoma de P. pseudoaureum....................51 IV.4.3 Cromatogramas HPLC de fronda de P. pseudoaureum.....................53 IV.4.4 Cromatogramas HPLC de rizoma de S. domingensis........................54 IV.4.5 Cromatogramas HPLC de tallo de S. domingensis............................56 IV.4.6 Cromatogramas HPLC de hojas de S. domingensis…………….......59

IV.4.7 Curva de Calibración multielemental por TFRX….………………..61 IV.4.8 Espectro de rayos X de P. pseudoaureum.........................................61 IV.4.9 Fotos Cromatografía en Columna…………………………………..62 IV.4.9 Fotos de equipos HPLC y TFRX………………..………….……....63

PARTE V V.1 INFORME FINANCIERO.............................................................................64

INDICE DE TABLAS

Página

Tabla 1. Fracciones separadas por cromatografía en columna……………….… 32 Tabla 2. Tiempos de retención HPLC de estándares de flavonoides………….. 34 Tabla 3. Fracciones de rizoma de P. seudoaureum…………………………….. 34 Tabla 4. Fracciones de fronda de P. seudoaureum…………………………..… 35 Tabla 5. Fracciones de rizoma de S. domingensis…………………………….... 35 Tabla 6. Fracciones de tallo de S. domingensis……………... ……………….. . 36 Tabla 7. Fracciones de hoja de S. domingensis……………….…………………36 Tabla 8. Saponinas de las especies vegetales………………….………………. 37 Tabla 9. Material vegetal cultivado época lluviosa P. pseudoaureum………… 38 Tabla 10. Material vegetal cultivado época seca P. pseudoaureum………..…… 38 Tabla 11. Material vegetal silvestre época lluviosa P. pseudoaureum……..…… 38 Tabla 12. Material vegetal silvestre época seca P. pseudoaureum…..……..…… 38 Tabla 13. Material vegetal cultivado época lluviosa S. domingensis….………… 39 Tabla 14. Material vegetal cultivado época seca S. pdomingensis...………..…… 39 Tabla 15. Material vegetal silvestre época lluviosa S. domingensis….……..…… 39 Tabla 16. Material vegetal silvestre época seca S. domingensis….……..…..…… 30

INDICE DE GRAFICAS

Gráfica 1. Ruta biosintética de flavonoides………………………………..…… 18 Grafica 2. Ejemplo de enlace glicosídico ……………………………………… 19 Grafica 3. Ejemplo de espirostanos…………………………………………….. 20 Grafica 4. Esqueleto esteroide………………………………………………...... 21 Grafica 5. Variación creciente y discontínua de los rayos X…………………… 26 Grafica 6. Cromatograma extracto crudo etanólico…………………………….. 30 Grafica 7. Cromatograma extracto hidrolizado lavado…………………………. 30 Grafica 8. Cromatograma extracción supercrítica con CO2………….…………. 31 Grafica 9. Mezcla estándares de tres flavonoides………………………………. 33 Grafica 10. Mezcla estándares de cuatro flavonoides……………………………. 33 Grafica 11. Estándar de neoespiridina……………………………………………. 49 Grafica 12. Estándar de hiperósido……………………………………………..... 49 Grafica 13. Estándar de ácido clorogénicio………………………………………. 49 Grafica 14. Estándar de ácido cafeico……………………………………………. 50 Grafica 15. Estándar de rutina……………………………………………………. 50 Gráfica 16. Estándar de quercetina……………………………………………..... 50 Grafica 17. Estándar de kaemferol………………………………….……………. 51 Gráfica 18. Fracción 1 rizoma de calahuala……………………….………..……. 51 Gráfica 19. Fracción 2 rizoma de calahuala……………………….……………… 51

Gráfica 20. Fracción 3 rizoma de calahuala………………………………..……. 52 Gráfica 21. Fracción 4 rizoma de calahuala……………………………………… 52 Gráfica 22. Fracción 5 rizoma de calahuala…..………………………………….. 52 Gráfica 23. Fracción 1 fronda de calahula………………………………………... 53 Gráfica 24. Fracción 2 fronda de calahuala………………………………………. 53 Gráfica 25. Fracción 3 fronda de calahula……………………………………….. 53 Gráfica 26. Fracción 4 fronda de calahuala………………………………………. 54 Gráfica 27. Fracción 5 fronda de calahula……………………………………….. 54 Gráfica 28. Fracción 1 rizoma de zarzaparrilla………………………………….…54 Gráfica 29. Fracción 2 rizoma de zarzaparrilla…………...………………………. 55 Gráfica 30. Fracción 3 rizoma de zarzaparrilla…………………………………… 55 Gráfica 31. Fracción 4 rizoma de zarzaparrilla…………...………………………. 55 Gráfica 32. Fracción 5 rizoma de zarzaparrilla…………………………………… 56 Gráfica 33. Fracción 6 rizoma de zarzaparrilla…………...………………………. 56 Gráfica 34. Fracción 1 tallo de zarzaparrilla…………………………………....... 56 Gráfica 35. Fracción 2 tallo de zarzaparrilla……………………………………… 57 Gráfica 36. Fracción 3 tallo de zarzaparrilla……………………………………… 57 Gráfica 37. Fracción 4 tallo de zarzaparrilla……………………………………… 57 Gráfica 38. Fracción 5 tallo de zarzaparrilla……………………………………… 58 Gráfica 38. Fracción 6 tallo de zarzaparrilla……………………………………… 58 Gráfica 40. Fracción 1 hojas de zarzaparrilla……………………….…………...... 58 Gráfica 41. Fracción 2 hojas de zarzaparrilla……………………….…………...... 59 Gráfica 42. Fracción 3 hojas de zarzaparrilla……………………….…………...... 59 Gráfica 43. Fracción 4 hojas de zarzaparrilla……………………….…………...... 59 Gráfica 44. Fracción 5 hojas de zarzaparrilla…………………….……………...... 60 Gráfica 45. Fracción 6 hojas de zarzaparrilla…………………….……………...... 61 Gráfica 46. Curva de Calibración multielemental…………….………………...… 61 Gráfica 47. Ejemplo de un espectro de rayos X de calahula………….….…………62 Gráfica 48. Cromatografía en Columna……………………………....…………… 62 Gráfica 49. Cromatografo Líquido HPLC………………………………………… 63 Gráfica 50. Espectrometro de rayos X………………………………….…………. 63

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RESUMEN

En Guatemala dos especies medicinales importantes por su amplio uso, volumen comercializado y valor económico son zarzaparrilla (Smilax domingensis) y calahuala (Phlebodium pseudoaureum). En este estudio se determinó el contenido de flavonoides y saponinas presentes en la fronda y el rizoma de la especie vegetal Phlebodium pseudoaureum y en la fronda, tallo y rizoma de la especie vegetal Smilax domingensis. También se determinó si existen diferencias cuantitativas en el contenido mineral de los rizomas, frondas, tallos y hojas de estas dos especies nativas de Mesoamerica.

Las especies de estudio fueron colectadas en la eco-parcela el Cacaotal Suchitepéquez y Finca Sabana Grande Escuintla, durante las estaciones lluviosa (julio) y seca (enero). Las muestras frescas fueron llevadas a un secador solar durante seis días a una temperatura de 50 oC y humedad relativa de 10%. Para determinar la presencia de los compuestos flavonoides y saponinas presentes en estas dos especies vegetales, se prepararon por maceración los extractos etanólicos de cada una y por el método de extracción supercrítica con CO2 para comparar la efectividad de cada extracción.

Los extractos crudos etanolicos fueron hidrolizados agregándoles 10ml de HCL 6M calentándolos en un baño de maria a 90 oC durante dos horas. Después de hidrolizarse, las muestras se dejaron enfriar y se filtraron. Posteriormente fueron separadas en una columna cromatográfica rellena con sílica gel 60 G y solvente acetato de etilo. Cada una de las fracciones fue colectada en frascos de color ámbar, algunas presentaban colores característicos (café, verde, amarillo, naranja, rojo) según la molécula aislada. La fase móvil utilizada con polaridad creciente fue: acetato de etilo/etanol (3:1), etanol/Agua (1:1) y ácido acético/agua (1:1).

Las fracciones fueron filtradas en membrana de 0.45 um whatman antes de la inyección HPLC. Los extractos fueron guardados durante tres semanas en frascos herméticos de color ámbar en refrigeración hasta su análisis. La columna utilizada fue una Rp-18 Purospher START-200 mm, con tamaño de partícula de 5 um, el porcentaje de flujo de la fase móvil fue 1.0 ml/min a una temperatura de 40 oC, los volúmenes inyectados de los estándares y extractos de las muestras fue de 10 ul. Todas las muestras fueron cromatografiadas utilizando para la separación tres solventes: a) agua 85% de ácido fosfórico (99.7:o.3 v/v), b) acetonitrilo y c) metanol con gradiente lineal. Los estándares (0.1 mg/mL) inyectados fueron: neoespiridina, hiperósido, ácido clorogénico, ácido cafeico, rutina, quercetina y kaemferol.

Los compuestos flavonoides fueron identificados comparando su tiempo de retención con respecto al estándar. Las moléculas que se aislaron e identificaron como marcador químico para P. pseudoaureum fue quercetina y para S. domingensis fue rutina. Estos flavonoides se presentaron en todas las especies de estudio. Los flavonoides detectados en estas dos especies fueron: rutina, quercetina, hiperósdido y ácido caféico.

La fluorescencia de rayos X es la técnica que nos permitió detectar y cuantificar los metales presentes en las muestras vegetales. Los minerales presentes en los rizomas, frondas, tallos y hojas de cada especie vegetal fueron: K, Ca, Fe, Mn, Zn y Sr. Los minerales mayoritarios se encontraron en el rizoma de P. pseudoaureum, el K 200 ppm y el Ca 300 ppm.

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SUMMARY

In Guatemala the most important species due to its use, comercialízate volume and economic value are sarsaparrilla and calahuala. In this study was conducted to determination of flavonoids and saponins presents in fronds and rizhome to vegetal specie P. pseudoaureum and leaves, stem and rizhome to vegetal specie S. domingensis. So was determinated if exist differences quantitatives in the mineral contend from rhizomes, fronds, stem and leaves of the two s Mesoamerican natives species.

The studied species were collected in the Cacaotal eco part, Suchitepequez and Big Sabana country house, Escuintla during the rains station (july) and dry station (January). The samples fresh was translated to solar dry for six days at 50 oC and relative humidity 10%. To determination the presence of flavonoids and saponins compounds in this two vegetables species. Macerations of the ethanolic extracts and supercritical extractions with CO2 was carried to efectividy comparation the each extraction.

To raw ethanolic extract 10 ml of 6M HCL was added. Hydrolysis was carried out in a shaking waterbath at 90 °C for 2 h. After hydrolysis the sample was allowed to cool, then it was filtered. After was separated in the chromatographic column fill with silica gel 60 G and ethyl acetate solvent. Each one vegetal specie was collected, some fractions present characteristic colour to isolate molecule. The flavonoids and saponins in amber bottle was collected. The mobile phase with polarity increasing consisted ethyl acetate / ethyl alcohol (3:1), ethyl acetate / water (1:1) and acetic acid / water (1:1).

The fractions was filtered again with 0.45 um Whatman membrane filter before injection into the HPLC. The extracts were kept in airtight amber bottles and stored in the freezer until analyzed. The column used was a Rp-18e Purospher START - 200 mm, particle size 5 um, the flow rate of the mobile phase was 1.0 mL/min at temperature (40 oC), and the injection volumes were 10 uL of the standars and the sample extracs. All flavonoids were chromatographic separation was carried out using three solvents a) water–85% phosphoric acid (99.7:0.3 v/v); b) acetonitrile; c) methanol in a linear gradient. Rutin, quercetin, hyperóside, neoespiridin, cafeic acid and chlorogenic acid was injected standard (0.1 mg/mL).

Flavonoids compounds was identified by yours retention times (tR) comparaded with standars. The molecule, can to be able with marking in the vegetable specie Phlebodium psedoaureum is quercetin and rutin to Smilax

domingensis. These flavonoids was presents in all the plant studies. The flavonoids detected in this two species was: rutin, quercetin, hyperoside and cafeic acid.

The X-ray fluorescence is a technique that allows detect and quantify the sample vegetal composition. The mineral presents in rhizome, frond, steam and leaves in both studies species was: K, Ca, Fe, Mn, Zn and Sr. The greatest minerals in the studies species was K y Ca. But the rhizome to Phlebodium pseudoaureum report the major contend K (200 ppm) and Ca (300 ppm)

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PARTE I

1.1 INTRODUCCION

Guatemala, por su ubicación geográfica, se caracteriza por tener una gran variedad de productos naturales, dentro de las cuales se encuentran las plantas medicinales, no solo para tratar padecimientos ya existentes, sino también para prevenir diversos desordenes de salud; esto, fundamentalmente guiado por el uso popular y la existencia de numerosas evidencias en la actividad terapéutica y porque en la mayoría de los casos se han utilizado desde hace muchos años, siendo más seguros en función de presentar menores contraindicaciones y efectos secundarios, que los encontrados en los productos de síntesis.

En Guatemala la salud constituye una de las causas de mayor preocupación,

siendo uno de los aspectos críticos la falta de acceso a los medicamentos. En la actualidad muchos guatemaltecos no cuentan con el ingreso económico mínimo para cubrir sus problemas básicos de salud; razón por la cual muchos de sus habitantes en especial los del área rural han recurrido al uso de la medicina natural en busca de curar sus enfermedades.

Una de las nuevas alternativas dentro del campo de la fitoterapia son el uso de los nutracéuticos y suplementos alimenticios, para lo cual ya existen algunos estudios con plantas alimenticias, generalmente exóticas; sin embargo son pocos los estudios realizados en plantas medicinales nativas que puedan ser utilizadas para estos fines. Los nutracéuticos se definen como compuestos que se encuentran en materias primas y alimentos de origen vegetal, tienen efectos positivos en la salud de las personas, se pueden consumir como una alternativa para la salud ya que proporcionan varios nutrientes esenciales para las funciones vitales de nuestro organismo. El estudio de plantas medicinales como potenciales nutracéuticos es un campo nuevo que se puede aprovechar si se conocen los componentes minerales de diversas especies vegetales nativas de la región.

El estudio de productos naturales ha adquirido gran importancia en los últimos años por la rapidez con la que se ha desarrollado la tecnología en esta área, ya que ha facilitado el análisis de plantas y extractos, permitiendo desarrollar nuevas técnicas de purificación e identificación de una amplia variedad de nuevos compuestos. Además, la tendencia cada vez más generalizada de utilizar productos naturales que sustituyan a los sintéticos, ha propiciado la búsqueda de fuentes alternas a la síntesis orgánica. Muchas investigaciones en productos naturales han revelado que existe una gran variedad de compuestos naturales (flavonoides, saponinas, alcaloides, etc.) que poseen importantes propiedades citotóxicas, antiinflamatorias, inmunomoduladoras, antimicrobianas, etc.

Las plantas medicinales más importantes de Guatemala según el estudio del mercado potencial de ocho plantas medicinales latinoamericanas del Proyecto financiado por OEA-AICD-2004. De las ocho especies, sobresalen por su producción y demanda estimadas de su materia prima son la calahuala (26 toneladas de rizomas

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y frondas de cultivo) y zarzaparrilla (100 toneladas de rizomas o raíces secas de extractivismo y cultivo).

Las únicas especies que se obtienen de cultivo son la calahuala (Phlebodium

spp.), el maracuyá (Passiflora spp.), la zarzaparrilla (Smilax spp.) y la juanilama (Lippia alba). Además es muy frecuente encontrar que las empresas utilizan para la elaboración de sus productos las especies: Smilax spp., Phlebodium spp. y Passiflora

spp. La importancia de la identificación de los metabolitos secundarios en los

rizomas de Smilx domingensis y Phlebodium pseudoaureum, se debe a su volumen comarcializado y económico, además estas especies son un recurso de la flora nativa de Mesoamérica con larga tradición de uso y de explotación como medicamento y materia prima industrial. Estos rizomas son utilizados como materia médica para el tratamiento de diversas enfermedades inflamatorias, infecciosas y dérmicas. Son especies promisorias para el país, ya que se pueden desarrollar nuevos productos beneficiando así a las comunidades que se dedican a la producción y al consumo.

Debido al amplio uso de estas dos especies, es importante aislar, identificar y determinar los metabolitos responsables de las diversas actividades farmacológicas tradicionalmente atribuidas a estas dos especies vegetales Smilax domingensis y

Phlebodium pseudoaureum de amplio uso en nuestro país. Con la presente investigación se pretende realizar la caracterización química con respecto a los compuestos flavonoides, saponinas y contenido mineral del rizoma, tallo y hojas de Smilax domingensis y rizoma y frondas de Phlebodium

pseudoaureum a través de la técnica de cromatografía líquida HPLC se lograron aislar e identificar de forma específica diversos flavonoides entre ellos están: quercitina, kaemferol, ácido cafeico e hiperósido. Cada compuesto fue identificado comparando su tiempo de retención con su respectivo estándar en las mismas condiciones de separación (columna, fases móviles, longitud de onda, caudal y detector).

Con la técnica de fluorescencia total de rayos X, se hizo la determinación de los minerales presentes en las muestras de estudio (rizoma, tallo, hoja y fronda) de las especies de estudio. Los metales K, Ca, Fe, Mn, Zn y Sr, fueron cuantificados en ppm. Para poderlos determinar con esta técnica analítica se realizó una curva de calibración multielemental que contenía los metales Elementos: S, K, Ca, V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Ga, As, Se, Hg, Pb, Rb, Y y Sr cada uno de ellos a una concentración de 5 ppm. Además se utilizó como estándar interno el itrio a la misma concentración.

La información obtenida servirá de base para posteriores investigaciones que

se realicen con el fin de determinar el potencial de Smilax domingensis y Phlebodium

pseudoaureum como nutracéuticos o suplementos alimenticios. Así también se considera que los resultados obtenidos, nos puedan servir como base para el análisis posterior de otras especies nativas y cultivadas en Guatemala con alto potencial como suplemento alimenticio. A través de su aprovechamiento sustentable que garantice la calidad de los productos de origen natural y logre el desarrollo de un mercado internacional y económico de nuestro país.

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I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

I.2.1 ANTECEDENTES EN GUATEMALA

Diversas investigaciones han demostrado que los beneficios medicinales atribuidos a estas dos especies vegetales, se deben principalmente a sus metabolitos secundarios conocidos como saponinas y flavonoides; pués presentan propiedades medicinales muy interesantes, desempeñan diversas funciones que benefician la salud de las cuales se pueden mencionar: antioxidantes, anticancerígenas, cardiotónicas, utilizadas para la fragilidad capilar, antitrombóticas, para disminuir el colesterol, para proteger al hígado y al estómago, antiinflamatorios, analgésicos y como antimicrobianos.

En Guatemala, en la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia de la

Universidad de San Carlos de Guatemaal se han realizado diversos estudios con respecto a las especies de zarzaparrilla (Phlebodium pseudoaureum) y calahuala

(Smilax domingensis) ya que dichas especies se han utilizado desde varias décadas por la población en general debido a las diversas propiedades atribuidas de cada una.

Teleguario (2008) utilizó el método de Baccou, J.C. para la cuantificación de sapogeninas totales mediante la ecuación de la curva de calibración del estándar de diosgenina y para los flavonoides totales utilizó la metodología de la Farmacopea Brasileña, expresando los resultados en quercetina. Los resultados obtenidos confirman la presencia de saponinas y flavonoides en la composición química de la especie S. domingensis 1.63% y 0.0871% respectivamente.

Garcia (2008) Determino las diferencias cualitativas y cuantitativas en el contenido de flavonoides totales y saponinas esteroidales totales en fronda y rizoma de la especie vegetal calahuala (Plhebodium pseudoaureum). Determinando que la fronda contiene 0.23% y el rizoma 0.04% de flavonoides totales. La cuantificación según el método de Baccou para la fronda es 0.15% y el rizoma 0.1% de sapogeninas esteroidales totales

Aldana (2007) determinó diferentes flavonoides por cromatografía en capa fina en las especies P. pseudoaureum, P. decumanum y P. trisereale. En las frondas se detectó: rutina, hyperósido, quercitrina y ácido clorogénico en las tres especies: en los rizomas se detectó ácido clorogénico en las tres especies evaluadas; adicionalmente, Polypodium triseriale registró presencia de Hyperósido y P.

decumanum presencia de Rutina.

Zuleta (2005) Determino las diferencias cualitativas por cromatografía en capa fina de la composición química de los rizomas de Phlebodium pseudoaureum provenientes de cinco regiones diferentes de nuestro país. Confirmando la presencia de alcaloides, taninos, flavonoides, saponinas y sesquiterpenlactonas en cada muestra seleccionada y además que no existe diferencia en la composición química de P.

pseudoaureum de las cinco regiones analizadas, al igual que las variedades guatemaltecas y la variedades extranjeras.

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En Mesoamérica se han utilizado ampliamente las especies vegetales S.

domingensis y P. pseudoaureum por sus múltiples propiedades medicinales atribuidas. La infusión y decocción del rizoma se usa oralmente para el tratamiento de afecciones gastrointestinales (diarreas, dolor de estomago, estreñimiento y gastritis) respiratorias (asma, tos, tos ferina) y cardiacas, dolor de huesos, reumatismo, diabetes, gota, hipertensión, purificar la sangre, parásitos, enfermedades venéreas, sífilis y afecciones renales (cálculos, hidropesía)

El género Phlebodium, representado por varias especies en la región, es un recurso de la flora nativa de Mesoamérica con larga tradición de uso y de explotación como medicamento y materia prima industrial, pero cuyo verdadero potencial debe estudiarse más a fondo. Estudios anteriores han demostrado la presencia de dichos compuestos en las especies de Phlebodium, demostrando actividad biológica importante y gran interés en la industria y medicina.

Con la presente investigación se pretende separar e identificar las estructuras químicas de los flavonoides y saponinas presentes en las dos especies de estudio y de esta forma caracterizar los marcadores químicos responsables de sus propiedades medicinales con la finalidad de estandarizar los extractos provenientes de dichas especies, contribuyendo así a garantizar la calidad de la materia prima y productos que se comercialicen.

También se determinarán y cuantificarán las concentraciones (ppm) de los diferentes elementos presentes en los rizomas y frondas de las especies estudiadas pudiéndose aprovechar el potencial de estas dos especies como suplementos nutracéuticos en la alimentación.

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I.2.2 JUSTIFICACION DEL TRABAJO DE INVESTIGACION

Guatemala es un país reconocido ampliamente por su riqueza natural y clima apropiado para el crecimiento de una gran variedad de plantas. Entre este tipo de vegetación se encuentran las especies vegetales de Phlebodium pseudoaureum y

Smilax domingensis, las cuales crecen en lugares húmedos y sombreados como los bosques. Además estas especies se han utilizado para el tratamiento de diversas afecciones y tienen aplicación industrial a nivel nacional e internacional. Por lo cual es importante establecer la composición química de cada una e identificar los metabolitos secundarios flavonoides y saponinas que puedan utilizarse como marcadores químicos que nos permitan establecer y determinar el contenido mineral en estas dos especies. Al determinar los marcadores de estas dos especies vegetal nos permitirá avanzar en el conocimiento químico de su contenido mineral, de sus flavonoides y saponinas, lo que permitirá garantizar la calidad de los extractos, permitiendo una mejor reproducibilidad lote a lote en la producción de diversos productos, con lo cual se podrá cumplir con parámetros y normas establecidas tanto a nivel nacional como internacional que beneficiarán a la industria y a la población en general. Así también será la base para el análisis posterior de otras especies nativas de Guatemala con potencial como suplemento alimenticio.

Actualmente existen pocos estudios sobre caracterización química y

determinación del contenido mineral del rizoma. No se reportan datos sobre el contenido mineral del tallo y follaje. También se desconoce la relación que pueda existir entre cada una de estas variables. Por esta razón, este estudio se plantea como la base para futuras investigaciones relacionadas con uso de diversas especies vegetales con alto potencial nutracéutico.

Los flavonoides, saponinas y minerales presentes en las dos especies de estudio participan en diversas actividades biológicas, teniendo amplia aplicación en la medicina, agricultura e industria. Con respecto a la salud humana, muchas de las propiedades terapéuticas encontradas en Smilax domingensis (zarzaparrilla) y

Phlebodium psedouaureum (calahuala), corresponden a sus flavonoides, lo cual coloca a estas dos especies vegetales en una posición de mucho interés, generando información que pueda conducirnos a entender en mejor forma su aplicabilidad y funcionalidad, en el campo de la fitoterapia y en la obtención de metabolitos aislados para diversos propósitos. Se considera de suma importancia realizar la caracterización química de estos metabolitos e identificarlos de forma específica, lo cual constituye un aporte para enriquecer el conocimiento en relación a su composición química, ante el creciente enfoque en la búsqueda de alternativas naturales que favorezcan y beneficien la salud humana.

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I.3 OBJETIVOS E HIPOTESIS I.3.1 OBJETIVO GENERAL

- Contribuir a la investigación química de las plantas medicinales que

garanticen la calidad de los extractos vegetales, como fuente de materia prima para la producción de fitoterápicos o nutracéuticos.

I.3.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS

- Caracterizar químicamente los flavonoides y las saponinas presentes en las especies Smilax domingensis y Phlebodium pseudoaureum.

- Desarrollar metodología analítica que permita estandarizar extractos de Smiilax domingensis y Phlebodium pseudoareum mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y GC masas.

- Cuantificar los minerales presentes en los rizomas y follaje de Smilax

domingensis y Phlebodium pseudoaureum por el método de fluorescencia total de rayos X.

- Evaluar el potencial de estas especies como nutracéuticos o fitoterápicos. I.3.2 HIPOTESIS Existen diferencias químicas en los compuestos flavonoides, saponinas y en el contenido mineral presentes en los rizomas, frondas, tallos y hojas de las especies vegetales Smilax domingénsis y Phlebodium pseudoaureum.

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I.4 METODOLOGIA I.4.1. Universo de Trabajo Muestras de rizoma, tallo y hojas de Smilax domingensis Finca “Sabana Grande”, Escuintla ubicada a 14° 10´60´´ de latitud norte y 90° 37´60´´ de longitud oeste, altitud de 740 msnm, temperatura promedio 24.4°C, precipitación media anual de 2500 mm y humedad relativa de 85%. Muestras de rizoma y frondas de Phlebodium pseudoareum

Finca “El Cacaotal”, Samayac Suchitepéquez: Coordenadas geográficas 14° 33´ 115´´ 91° 28´009´´, se encuentra localizada a una altura de 450 msnm, presenta una humedad relativa entre 66-90% y temperaturas entre 23-25°C. El promedio de precipitación oscila alrededor de 3,527 mm I.4.2 Medios I.4.2.1 Recursos Humanos - Lic. M.A Rodolfo Orozco

- Lic. Armando Cáceres - Lic. Abraham Vásquez - Licda. Sully Cruz - Br. Marvin Zacarias

I.4.2.1 Recursos Institucionales

- Laboratorio de Fisicoquímica, Escuela de Química, - Laboratorio de Investigación de Productos Naturales, departamento de

Farmacología y Fisiología de la Escuela de Química Farmacéutica. - Facultad de Agronomía y CCQQ y Farmacia de la USAC. - Laboratorio Fitofarmacéutico Farmaya S.A. - Unidad de Análisis Instrumental de la Escuela de Química, Facultad de

CCQQ y Farmacia. - Laboratorio de Investigación, Fisichem. - Biblioteca de la Facultad de CCQQ y Farmacia

I.4.3 Materiales y Reactivos I.4.3.1 Trabajo de campo - Muestras de rizoma, frondas, tallo y hojas - Piocha, azadon, machete - Bolsas plásticas de 2 , 5 lb y etiquetas - Cinta métrica, tijeras de poda - Marcador negro indeleble - Boletas de campo - Secador solar

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I.4.3.2 Trabajo de laboratorio - Estufa de calentamiento - Beakers, pipetas volumétricas 5, 10 y 25 ml - Micropipetas automáticas de 200 µl y 2 µl - Reflectores de cuarzo, lámpara IR - Sistema de Reflexión Total de Rayos X, con tubo de Molibdeno. - Generador de Rayos X Philips PW 1729 con una potencia máxima de 2,500 W, rango de voltaje de 5-50 Kv, rango de corriente de 0-100 mA. - Condiciones de operación 40 Kv y 20 mA. - Soluciones patrones de los metales a cuantificar. (Ca, Cu, Fe, Mg, Mn, K, Na, Cu y Zn) - Ácido nítrico y ácido clorhídrico concentrados - Estándar de Itrio 1000 ppm - Columnas para cromatografía - Cromatógrafo Líquido de Alta Resolución y CG- Masas I.4.4 Período de trabajo de campo El trabajo de campo se realizó durante los meses de Julio (2006) y Enero (2007) I.4.5 Muestreo

Los rizomas, frondas, tallos y hojas de S. domingensis y P. pseudoaureum fueron definidos por exploraciones de campo, al azar en la Finca “El Cacaotal” Suchitepequez, en donde cada especie se cultiva usando como tutor árboles de sombra de café o cacao y en la Finca “Sábana Grande” Escuintla, en donde cada una crece de forma silvestre.

I.4.6 Colecta de material vegetal Conforme a la naturaleza de la parte a estudiar, para cada especie vegetal (rizomas, frondas, tallos y hojas) se recolectaron muestras representativas de 1000g del material fresco, en las fincas de cultivo de cada especie vegetal. Estas fueron utilizadas para el análisis de contenido mineral y caracterización química. I.4.7 Secado La materia vegetal fresca de cada especies fue colocada en un secador solar a la sombra durante ocho días. La humedad de almacenamiento no fue mayor del 10%. Cada muestra vegetal seca se guardo en bolsas plásticas identificadas (lugar y fecha de muestreo) I.4.8 Preparación de extractos crudos de cada especie vegetal

Se pesaron 750 g de material vegetal y se colocaron en un percolador agregándoles el disolvente extractor, utilizando una percolación con el mismo durante un período de 5 días con recambios periódicos del disolvente hasta que la extracción fue exhaustiva. El extracto así obtenido se concentro a presión reducida a una temperatura inferior a 45°C en un evaporador rotatorio. Los extractos obtenidos fueron sometidos a una partición líquido-líquido. Tanto los extractos madre, como las fracciones obtenidas mediante la partición liquido-liquido.

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I.4.9 Hidrólisis Acida de cada extracto vegetal Los extractos vegetales de las dos especies de estudio fueron diluidos en

etanol-agua 1:1 y luego se le adiciono 0.2 mL de ácido clorhídrico concentrado. Se calentaron o en baño de maría, sin que el material alcanzara ebullición, a una temperatura alrededor de los 65° C durante un periodo de 45 minutos. Logrando disociar los enlaces glicosídicos entre las moléculas de los flavonoides y las saponinas, las cuales se pueden colectar de forma aislada. I.4.10 Separación por Cromatografía en Columna

Se empacaron 15 g de sílica gel 60 mesh 0.063 – 0.200 mm para cromatografía en columna, en vía húmeda con acetato de etilo (solvente de empaque) y se introdujo por medio de un embudo en una bureta de 50 ml, cuyo diámetro interno oscila entre 1.0 cm, la altura alcanzada por el empaque fue de alrededor de 32 cm de longitud. Se dejo reposar durante 60 minutos luego de preparada (tiempo en el cual se considera que todo el material se compacta).

En la parte superior de la columna se colocaron 2 ml de las muestras provenientes de la hidrólisis ácida y se procedió a separar los flavonoides y saponinas presentes en cada muestra, según su afinidad por las fases móviles que se utilizaron, siendo estas:

a) Acetato de etilo / etanol (3:1) b) Etanol / agua (1:1) c) Acido acético/agua (1:1)

Las diferentes fracciones colectadas se almacenaron en frascos de color ámbar en

refrigeración durante dos semanas para su posterior análisis e identificación. I.4.11 Extracción supercrítica con CO2 - Se procedió a armar el equipo supercrítico colocando en la celda de extracción 40 g de materia vegetal seco y molido de fronda de fronda de Phlebodium pseudoaureum. -Se agregaron 50 ml de co-solvente etanol grado analítico y el sistema de extracción se sello con teflón y llaves de tubo. -Se abrió la llave de paso del cilindro de CO2 a presión estática de 1300 psi, calentando la celda de extracción de acero inoxidable a una temperatura de 35 oC. -Se dejó reposar durante 30 minutos, se despresurizó y abrió la llave de salida del CO2. -Se colectó el extracto etanólico en recipiente de color ámbar de 25 ml y se refrigeró durante tres semanas para su posterior análisis e identificación. I.4.12 Identificación de Flavonoides por cromatografía HPLC Los análisis se realizaron utilizando un cromatografo líquido Shimadzu Prominence con detector ultravioleta visible, la columna utilizada fue una Rp-18 purospher START-200mm, con tamaño de partícula de 200 um.

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El porcentaje de flujo de la fase móvil fue de 1.0 ml/min a una temperatura de 40 oC y a una longitud de onda de 365 nm. Los volúmenes inyectados de los estándares y extractos vegetales fueron de 10 uL. Todas las muestras fueron analizadas por cromatografía líquida utilizando como fases móviles para su separación:

a) Agua al 85 % de ácido fosfórico (99:1 v/v) b) Acetonitrilo c) Metanol con gradiente lineal

Los estándares inyectados (0.1 mg/ml) fueron: neoesperidina, hiperosido, rutina, quercetina, kaemferol, ácido clorogénico y ácido cafeico. I.4.13 Identificación de Saponinas por cromatografía de capa fina

Cromatografía en capa fina: 2 g de material vegetal seco, se extrajeron con 10 ml de etanol al 70 % con reflujo por 10 minutos. Se evaporaron a 5 ml y se a aplicaron 25-40 µL en una cromatoplaca de silicagel 60 F254. Estándar de saponinas al 0.1 por ciento en metanol (10 µL). Fase móvil: cloroformo-metanol-agua (64:50:10), n-butanol-ácido acético-agua (50:10:40) Detección: Reactivo de sangre, zonas hemolíticas blancas en fondo rojo. (Reactivo de Liebermann-Burchard: UV-365 o VIS zonas azules y verdes de saponinas esteroidales, rojas y violetas de triterpenoides). (Reactivo de Komarowsky: zonas azules, amarillas y rojas). (Vainillina-ácido sulfúrico y anisaldehído-ácido sulfúrico: zonas azules, violetas, amarillentas). (30) I.4.14 Determinación mineral por fluorescencia de rayos X

I.4.14.1 Digestión ácida de material vegetal (rizoma, hoja y tallo)

- Se pesaron aproximadamente 0.5000 g de cada materia vegetal en un vaso de precipitar de 50 ml y adicionar cuidadosamente 3 ml de una mezcla de ácido nítrico y ácido clorhídrico concentrados en relación 2:1 respectivamente. - Se taparon con vidrio de reloj y calentaron lentamente en estufa hasta digestión completa de la muestra (tiempo aproximado 60 minutos) eliminando cuidadosamente los vapores ácidos en la campana de extracción -Se mantuvo el volumen constante del vaso de precipitar (aprox. 10 ml) adicionando agua desmineralizada durante el tiempo de eliminación de los vapores ácidos, tiempo aproximado 3 horas. -Se enfriaron el vaso de precipitar que contiene la muestra digerida y se trasvaso cuantitativamente a un balón aforado de 25 ml, adicionando 125 ul de solución estándar de itrio 1000 ppm y se aforo con agua desmineralizada.

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I.4.14.2 Cuantificación - Se procedió a encender y calibrar el equipo de Fluorescencia de Rayos X, fijando las condiciones de operación en 30 Kv, 20 mA y 200 s y el equipo se calibro en energías con respecto al Si y al Rh. - Se aplicaron 10 µl de la solución digerida en el reflector de cuarzo, secandolo con lámpara IR (aprox. 5 minutos) y se colocaron en el detector del sistema de Fluorescencia Total de Rayos X. - Se registraron las respectivas áreas de cada elemento presente en la muestra analizada y se compararon con la curva de calibración multielemental que contenía los elementos de interés en una concentración de 5 ppm de cada elemento y además el estándar interno de itrio a la misma concentración.

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PARTE II

II.1 MARCO TEORICO II.1.1 Descripción Taxonómica de Zarzaparrilla Nonmbre científico: Smilax domingensis Willd. Familia: Smilacaceae Sinónimos: S. lanceolata L. Sp. Pl. S. caudata Lundell. S. microscola (Robinson) Killip & Morton. Nombres Comunes: cocolmeca, coculmeca, coculmeca roja (Cos., Gua., Méx., Nic.) zarzaparrilla (Gua.), corona de cristo (Gua., Hon.) tietie, china-root (etnia garifona Gua., etnia afrocostarricense Cos. )

II.1.1.1 Descripción taxonómica:

Planta glabra completamente. Tallos teretes, escasamente armados en la parte inferior con aguijones robustos recurvados e inermes en la parte superior. Hojas 6-15 x 1.5-10 cm, 1.4-6 veces más largas que anchas, ovadas, lanceolado-ovadas, o lanceoladas, cartáceas, inermes, 5-nervias desde la base, las nervaduras primarias prominentes en el envés, no impresas en la haz, el par exterior sub marginal, las nervaduras secundarias conspicuas, algo prominentes, reticuladas, el ápice brevemente acuminado o brevicuspidado, la base aguda, el margen entero; pecíolo 0.5-2.

Umbelas estaminadas solitarias; pedúnculo 1-5 mm, más corto que el pecíolo subyacente, subterete. Tépalos de las flores estaminadas 4-6 mm; filamentos 2-4 mm; anteras 1-2 mm. Tépalos de las flores pistiladas cerca de 4 mm. Bayas 7-10 mm de diámetro, rojas, purpúreas o negras (HUFT, 1994).

Diagnosis taxonómica:

Enredadera ramificada, con aguijones robustos recurvados en la parte inferior; zarcillos en los tallos superiores; Hojas ovadas, con 7 nervaduras, lanceolado-ovadas, o lanceoladas; flores en las ramas superiores blancas, plantas femeninas con frutos en bayas de 12.4-13.6 mm de diámetro, rojas, purpúreas o negras; rizoma amarillo a anaranjado a veces con partes expuestas sobre el suelo. En Costa Rica, FERRUGINO (2003), hace referencia a que se caracteriza por el rizoma tuberoso rojo o morado.

Hábito o forma de vida:

Enredadera ramificada de hasta 15 m de largo cuando la planta es adulta.

Anualismo-perennidad: Especie perenne.

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II.1.1.2 Distribución geográfica y hábitat Es una planta común en los terrenos pedregosos de las montañas y colinas calcáreas de todas las provincias. Bosques húmedos, espesuras de 0-2100 m. Crece en el Caribe, México, Honduras, El Salvador, Costa Rica, Panamá y Guatemala (Alta y Baja Verapaz, Izabal, Zacapa, Escuintla, Sacatepéquez) (Standley & Williams, 1970; Huft, 1994). II.1.1.3 Usos etnomédicos y modo de empleo El cocimiento del rizoma se usa como depurativo, sudorífico. Grosourdy le atribuye propiedades antiblenorrágicas, sudorífica, antiasmáticas y antiherpéticas. Se emplea contra diversas manifestaciones de la sífilis, afecciones de origen reumático y enfermedades crónicas de la piel. Se le considera un gran depurativo, se estima muy buena para la sangre y los riñones, para fortalecer, se utiliza cuando hay picazón y dolor en la piel (Roig, 1992). Se emplea en afecciones gastrointestinales y nerviosas (Alcorn, 1984). II.1.1.4 Actividad farmacológica, biológica, química y toxicidad De acuerdo a la revisión en la base de datos NAPRALERT no se reporta ninguna información. En la ejecutividad de proyectos con OEA, CATIE-FONTAGRO y DIGI estudios antimicrobianos demostraron que el extracto etanólico del rizoma presentó actividad contra Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, Mycobacterium smegmatis, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia

coli y Cryptococcus neoformans, se realizó la partición líquido-líquido del extracto etanólico y la fracción de acetato de etilo presentó una concentración inhibitoria mínima (CIM) de 0.25 mg/ml contra B. subtilis, C. neoformans y Candida albicans; 1 mg/ml contra E. coli y M. smegmatis; 0.5 mg/ml contra P. aeruginosa, S. typhi y S.

aureus; no presentó actividad contra Leishmania brasilensis, L. mexicana, Trypanosoma cruzi, Artemia salina y Aedes aegypti.

En la parte química se han realizado algunos trabajos preliminares de tamizaje fitoquímico mediante ensayos macro y semimicro y cromatografía en capa fina, evidenciándose la presencia de esteroides mediante las pruebas de Salkowsky, Liebermann Burchard y la prueba de espuma, lo cual es indicativo de posibles saponinas esteroidales, así como presencia de flavonoides y antocianos. El rango de Rf de las muestras se encuentra entre 0.24-0.89. Estudios preliminares indican que los antocianos tienen actividad antioxidante.

II.2.1 Descripción Taxonómica de Calahuala

Nombre Científico: Phlebodium pseudoaureum

Familia: Polypodiaceae Sinonimia: Polypodium pseudoaureum Cav. Goniophlebium areolatum (Humb. et Bonpl. ex Willd.) C. Presl. Phlebodium aureum auct., en parte (L.) J. Sm. Polypodium areolatum Humb. et Bonpl. ex Willd. Polypodium areolatum var. loreum J. Bommer Polypodium aureum auct., en parte L.

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Nombres Comunes

calahuala, calaguala (Gua., Hon., Pan.). helecho azul, calaguala (Cos.)

II.2.1.2 Descripción Taxonómica

Rizoma de 0.7-1.5 cm de ancho, generalmente farinoso, escamas 5-8 mm subenteras a moderadamente denticuladas, la farina blanca, las escamas concoloras, generalmente anaranjadas, no clatradas; hojas monomorfas, pinnati-sectas, a menudo glaucas en el envés, articuladas al rizoma; con ápice atenuado, agudo o acuminado; pinnas de 10-33x1-3 cm, glabras en el envés, los márgenes engrosados y cartilaginosos, enteros o casi enteros; nervaduras areoladas, las aréolas con o sin nérvulos incluidos; soros redondeados, sin parafisos, dispuestos en el ápice fusionado de 2 nérvulos incluidos, en 1-7 series entre la costa y el margen; esporas hialinas; x = 37. 4 especies (MORAN, 1995).

En Mesoamérica, se le ha llamado P. aureum, sin embargo según MORÁN (1995) la primera es sólo conocida de Florida, Sudamérica, la Bahamas, Puerto Rico y las Antillas Menores. P. decumanum y P. pseudoaureum, ambas diploides, han hibridizado dando origen a P. aureum, una tetraploide. La evidencia morfológica que sustenta este parentesco es que P. aureum tiene un número intermedio de series de soros (2-3) entre el de P. psuedoaureum (1) y el de P. decumanum (3-7). También se señala que P. decumanum y P. pseudoaureum (tratada como P. aureum) se ha entrecruzado en Honduras produciendo un híbrido (posiblemente P.

dictyocallis) con 74 cromosomas no apareados, 37 de los cuales son grandes y 37 pequeños (MORAN, 1995).

Diagnósis taxonómica: Planta epifita con frondes glabros en el envés, no son partidas hasta el raquis; en el envés un sola fila de soros. Rizoma de 0.7-1.5 cm de ancho que forma varias ramificaciones, farinoso, con escamas generalmente anaranjadas a café.

Hábito o forma de vida: Especie epífita, ocasionalmente rupícula o terrestre.

Anualismo-perennidad: Perenne, con producción de frondas anualmente ya que al final de la época lluviosa se secan y caen.

II.2.1.3 Distribución geográfica y hábitat

Nativas de Centro América. Crecen silvestres en troncos de palmas, árboles de encino y roca caliza desintegrada, en lugares de gran humedad a la sombra. Se encuentran desde Florida, México y Centro hasta Sur América en alturas de 1,000-2,600 msnm. En Guatemala se ha descrito en Alta Verapaz, Baja Verapaz, Chimaltenango, Escuintla, Guatemala, Huehuetenango, Jalapa, Quetzaltenanago, Suchitepéquez y Zacapa (Stole, 1981).

Se caracteriza por un hábito epífito distribuida en un rango de altura de 4 a 12

m sobre el dosel de los árboles y estar acompañada de otras especies vegetales. Las condiciones climáticas bajo las cuales se encuentra la calahuala (P. pseudoauruem) se caracterizan por un clima templado, por época lluviosa no bien definida, alta nubosidad que favorece la precipitación horizontal a partir de una altitud de 800 hasta los 1200 msnm, estableciéndose las condiciones típicas de un bosque nuboso

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donde la preciptación horizontal es más frecuente en época seca, esta última condición se da en la posición noreste de las montañas.

La humedad relativa promedio requerida por la calahuala es de al menos el

80%, esta condición ambiental es la que presenta menor variación a lo largo del tiempo, esta característica de variación se relaciona con el hábito y las condiciones de bosque nuboso. La nubosidad atmosférica predominante tiene mayor influencia en la distribución húmeda ambiental como precipitación horizontal y no como condicionante de la luminosidad, ya que la calahuala requiere de condiciones particulares de cobertura de dosel para su establecimiento, crecimiento y desarrollo. La presencia de calahuala inicia a la altitud de 800 msnm y a partir de los 1000 msnm hasta los 1225 msnm, la presencia y abundancia de calahuala aumenta considerablemente en relación a los otros estratos altitudinales (Garcia, 2005).

El sustrato y las demandas nutricionales de calahuala tienen una estrecha

relación, por lo que la planta requiere de un sustrato de origen orgánico con una retención de humedad mayor al 80% y más del 100% de absorción de humedad en relación al peso del mismo, un contenido de al menos 1% de nitrógeno, 1.5% de potasio, una adecuada relación de calcio y magnesio con concentraciones menores al 1% y una alta concentración de elementos menores. Las relaciones simbióticas encontradas son de tipo comensalista en el caso de los soportes arbóreos y las plantas epifitas acompañantes tipo bromelias; de depredación en el caso de los masticadores de hojas y no definida en el caso de agallas, aunque este produce una interferencia negativa por adición a la planta de calahuala (GARCÍA, 2005). II.2.1.4 Drogas empleadas y uso tradicional

La infusión y decocción del rizoma se usa oralmente para tratar afecciones gastrointestinales (diarreas, dolor de estómago, estreñimiento, gastritis), respiratorias (asma, tos, tos ferina) y cardíacas, dolor de huesos, reumatismo diabetes, gota, hipertensión, purificar la sangre, parásitos, enfermedades venéreas, sífilis y afecciones renales (cálculos, hidropesía) (Cáceres, 1996).

Tópicamente se usa la infusión en emplasto y cataplasma para el tratamiento de contusiones, reumatismo, úlceras, quebraduras, cáncer, cierto tipo de tumores, psoriasis y eczema. La decocción de las hojas se usa para detener las hemorragias. Se le atribuye propiedad analgésica, antihemorrágica, depurativa, diurética, desinflamante, emenagoga, espasmolítica, expectorante, febrífuga, laxante, pectoral, purgante, sudorífica y tranquilizante (Cáceres, 1996). II.2.1.5 Composición Los estudios de composición química se ha realizado en algunas de las especies, pero aún es incompleto. El rizoma de P. aureum contiene azúcar, aceite esencial, mucílago, almidón, nitrato de potasio y colorante rojo, además contiene calagualina, polipodina, aceites grasos y taninos, así como esteroides (ecdisterona y dos ecdisonas como la polipodaureina). (Morton, 1981). Las especies usadas medicinalmente en El Salvador contienen alcaloides, sesquiterpenlactonas y taninos (Planter, 1989).

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II.2.1.6 Experimentos In Vitro Estudios antimicrobianos demuestran que el extracto acuoso tiene alguna

actividad antibacteriana, aunque en otros estudios los extractos acuoso y etanólico fueron inactivos contra E. coli y S. aureus. El extracto de hojas es activo contra bacterias fitopatógenas (Xanthomonas campestris). PUNZON, et al. (2003) demostró la actividad antiinflamatoria in vitro del extracto acuoso de Phlebodium

decumanum el cual inhibió el factor de necrosis tumoral (TNF) por la producción de macrófagos activados con lipopolisacaridos (LPS) o LPS interferon (IFN)-g. El extracto hidrofílico presentó actividad fotoprotectora en células humanas de la piel contra daño celular inducida por los rayos UV (Alonso L. et al. 2003). II.2.1.7 Experimentos In Vivo

La calagualina es una saponina aislada del rizoma que tiene actividad antitumoral. La decocción del rizoma produce moderada actividad diurética en ratas. En tejido tumoral, una de sus saponinas (anapsos) reduce la incorporación de nucleoproteínas y precursores por un mecanismo anabolizante opuesto a la acción de citostáticos (Vargas, 1981 & Manna, 2003).

La administración oral del extracto acuoso tiene acción inmunomoduladora medida por proliferación del bazo de ratón con Coen A (Fernandez, 1992). La administración de una fracción del extracto acuoso (anapsos) en ratas produce hipoactividad cerebral dosis-dependiente posiblemente por variación en los niveles de IL-1β hipotalámica (Anton, 1992). El extracto acuoso prolonga la sobrevivencia de aloinjertos cutáneos en ratones, sugiriendo una actividad inmunosupresora (Tuominen, 1991). II.2.1.8 Toxicidad Aguda

Los extractos acuoso y etanólico del rizoma (500mg/kg) no fueron tóxicos a peces del género Mollinesia (Planter, 1989). En la revisión de literatura y bases de datos realizada no se encontró ninguna referencia sobre su toxicidad en humanos.

II.3.1 Los Flavonoides

También conocidos como bioflavonoides, son complejos multifenólicos por lo que se les denomina polifenoles. Los alimentos procesados y preparados pierden gran parte de estos elementos delicados y solubles en agua. Por ello, frecuentemente, se prefieren los extractos de alimento concentrado ya que poseen hasta 500 veces la concentración de los principios activos presentes en el material original vegetal y además estarán libres de otros ingredientes como el azúcar. Son compuestos polifenólicos caracterizados por una estructura química basada en un esqueleto C6-C3-C6, esto es un anillo bencénico unido a una cadena propánica y esta a su vez a otro anillo bencénico. Dependiendo del grado de saturación y patrón de sustitución de grupos funcionales en la estructura base, se da lugar a flavonoides con designaciones comunes como flavanóles, flavónas, chalcónas, aurónas, isoflavonóides, etc., así como a sus derivados glicósidados que portan moléculas de azúcares e incluso derivados ácidos de azúcares. Suelen encontrarse también parcialmente polimerizados dando lugar a dímeros, trímeros, etc., hasta formar complejos multi enlazados como los taninos condensados.

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Los flavonoides se clasifican basándose en sus variaciones estructurales. A continuación se muestra una lista de los hasta ahora considerados más relevantes: Flavonas: Apigenina que se encuentra en la alfalfa y en la manzanilla. Flavonoles: Uno de ellos es la quercetina que es un fiavonoide no cítrico que frecuentemente es extraído, para la elaboración de suplementos alimenticios. Se cree que es el flavonoide aislado biológicamente más activo (los PACs y las antocianidinas no son flavonoides aislados sino combinaciones de diferentes flavonoides que aparecen juntos en algunas plantas). Inhibe la liberación de histamina y la formación de leucotrienos, por lo que reduce las reacciones alérgicas e inflamatorias. Podría disminuir el crecimiento de ciertos tipos de cáncer y proteger a los pulmones frente a agentes contaminantes del ambiente y el humo del cigarrillo. Inhibe la producción de aldolasa reductasa, una enzima responsable de la conversión de la glucosa en sorbitol (el sorbitol está muy implicado en el desarrollo de ciertas afecciones diabéticas degenerativas tales como las cataratas). Resultará muy útil en caso de retinopatia diabética, así como en la neuropatía y en la nefropatía diabética. Mejora la función inmunológica, la estructura vascular. Posee una importante actividad antioxidante y es un potente agente antiviral (Yochum, 1999)

Flavononas: Hesperldina, flavonoide que será particularmente activo en la prevención de enfermedades cardíacas. Se encuentra en las frutas cítricas, como limones, naranjas, mandarinas y pomelos. Flavanololes: Como por ejemplo la taxifolina en la corteza de pino. Chalconas: Son pigmentos amarillos que pueden encontrarse en plantas como el sauce (isosalipurpósido), regaliz (isoliquiritósldo e isoliquiritigenósido) y en las hojas de olivo (olivina). lsoflavonoides: Las isoflavonas de la soja son uno de los fitoquímicos más estudiados en la actualidad por su efecto fitoestrogénico. Los compuestos activos conocidos incluyen la genisteína y la daidzeína. En los casos en los cuales el cuerpo no produce suficiente estrógeno, como en las mujeres menopáusicas y postmenopáusicas, el aporte fitoestrogénico, por medio de las isoflavonas de la soja, nos aporta una actividad estrogénica de sólo 1/1.000 de la actividad del estrógeno. Por lo tanto, puede servimos como un aporte suave sin los efectos secundarios consabidos de la terapia hormonal sustitutiva (habitualmente utilizada para evitar la pérdida de masa ósea). Además, ésta débil actividad fitoestrogénica permite a las isoflavonas unirse a los receptores de estrógeno, evitado la acción nociva de niveles elevados de estrógenos al competir por sus receptores (Ballester, 2006)

II.3.1.1 Los flavonoides en las plantas Origen evolutivo

Los flavonoides aparecieron por primera vez en los ancestros de las embriofitas, que comprende al grupo monofilético de todas las plantas terrestres (musgos, helechos, gimnospermas y angiospermas). Se cree que fueron una de las adaptaciones clave para la transición a la vida terrestre desde el alga verde ancestral, debido a su capacidad de absorber la radiación ultravioleta, mucho más intensa en la atmósfera que en el agua.

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Fig. 1 RUTA BIOSINTETICA DE LOS FLAVONOIDES

(Graf., 2005)

La ruta biosintética de los flavonoides se ha conservado enormemente en el transcurso de la evolución de las plantas, pero ha habido considerable divergencia tanto en los roles que fueron cumpliendo sus productos finales, como en los mecanismos que regulan su expresión.

II.3.1.2 Propiedades de los Flavonoides

En general actúan como antioxidantes neutralizando las moléculas reactivas llamadas “radicales libres’. Estos radicales libres son una de las causas (pero no la única) de ciertos tipos de cáncer, por lo tanto evitando su acción podemos disminuir el riesgo de padecerlos. Participan en la inhibición de la lipoxigenasa, enzima que convierte el ácido araquidónico en leucotrienos (mediadores en el asma, alergia e inflamación). Estabilizan el colágeno (proteína principal en el músculo y en el tejido conectivo). Intervienen en la inhibición de la transcriptasa inversa, enzima utilizada por los virus que contienen ARN (p.e. VIH) para la replicación. También inhiben la aldolasa reductasa, un enzima pivotal que convierte la glucosa suministrada en exceso al ojo en sorbitol. Se piensa que el sorbitol, y

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“polioles” (o polialcoholes) similares, son la causa de las cataratas de los diabéticos. Mejoran los síntomas alérgicos y de artritis, aumentan la actividad de la vitamina C, refuerzan los vasos sanguíneos, bloquean la progresión de las cataratas y la degeneración macular, tienen actividad biológica con propiedades diversas como antioxidantes, antimicrobianos, anticancerígenos, antimutagénicos, etc. (Hertog M. Et al. 1995)

II.4.1 Las Saponinas Las saponinas son glicósidos (fig. 2) en los cuales varias unidades de monosacáridos se enlazan mediante un enlace glicosídico a un resto denominado aglicón. El aglicón puede ser de naturaleza triterpénica o esteroidal y en función de esto las saponinas se clasifican en saponinas triterpénicas y saponinas esteroidales respectivamente.

Fig. 2 Ejemplo de enlace glicosídico

O

O

O

Rha

GluRha

MONOSACARIDOS

AGLICON

ENLACE GLICOSIDICO

A B

C D

E

F

1

2

3

45

6

7

9

810

1 1

12

13

14 15

1617

18

19

20

21

22 2324

2526

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El aglicón en las saponinas esteroidales (sapogenina) presenta el esqueleto tetracíclico característico de este tipo de compuestos, denominado gonano (ciclopentanoperhidrofenantreno) en el caso de ser saturado. La característica estructural fundamental de estas sapogeninas radica es la presencia de dos anillos adicionales que se originan a partir del C-17 del esqueleto base y están contenidos respectivamente en dos planos perpendiculares entre sí. Además, el átomo de carbono común a estos dos nuevos anillos está unido a dos átomos de oxígeno (estructura de un cetal) por los que a esta “cadena” lateral se le ha dado el nombre de cadena espirocetálica . Las sapogeninas pueden clasificarse de acuerdo a la estructura de los anillos E y F en espirostanos, furostanos y furoespirostanos fundamentalmente, siendo el primer grupo el más importante (fig. 2).

Estos compuestos pueden presentar unión trans (serie 5α) o cis (serie 5β) entre los anillos A y B, además todos presentan grupos metilos en C-10 y C-13 dirigidos hacia la cara β de la molécula. En el caso de que las sapogeninas posean una insaturación entre C-5 y C-6 se clasifican como ∆5 espirostanos.

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Fig. 3 ESTRUCTURAS DE ESPIROSTANOS

O

O

CH

H

3

HOHO

3

H

CH

O

O

A B

(García, 2008) A) 3β-hidroxi-5α, 25R-espirostano. B) 3β-hidroxi-25S-espirost-5-eno.

Las saponinas esteroidales poseen de una a seis unidades de monosacáridos unidas entre sí mediante enlaces glicosídicos. Estas unidades son comúnmente hexosas, pentosas y deoxihexosas, entre los que se encuentran principalmente glucosa, rhamnosa, galactosa y xilosa. Los enlaces glicosídicos pueden tener configuración α o β. Este resto glicosídico, que puede ser lineal o ramificado en la mayoría de los casos se une con el aglicón a través del C-3 del mismo.

II.4.1.1 Usos de las Saponinas

La hidrólisis de las saponinas mediante óxidos o enzimas, elabora un azúcar (generalmente una glucosa) y una sapogenina; algunos de éstos azúcares son utilizados como materias primas para sintetizar hormonas esteroides. La industria farmacéutica también utiliza diversas drogas con saponósidos por sus propiedades detergentes y emulsionantes.

Se utilizan como analgésicas, expectorantes, diuréticas y cicatrizantes. Por otro lado, la industria farmacéutica utiliza drogas con saponósidos esteroídales como materia prima para la hemisíntesis de principios activos esteroídicos (antiinflamatorios, andrógenos, estrógenos, diuréticos) y como anticonceptivos. Inicialmente, estos principios activos se obtuvieron a partir de ovarios, testículos y orina, luego a partir de ácidos biliares, pero actualmente la mayor parte de ellos se obtienen a partir de los saponósidos esteroídicos de origen vegetal.

II.4.1.2 Propiedades de las Saponinas

En general, los saponósidos son solubles en mezclas hidroalcohólicas e insolubles en disolventes orgánicos de media y baja polaridad. Sin embargo, las geninas libres no son solubles en agua y sí en disolventes orgánicos apolares. Su principal propiedad física es que en solución acuosa son agentes tensioactivos, es decir, son capaces de formar espuma y emulsiones. Son difíciles de cristalizar.

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En contacto con la sangre son hemolíticos, ya que interaccionan con el colesterol de la membrana de los eritrocitos. El poder hemolítico es característico de los saponósidos triterpénicos, pero es variable según los sustituyentes de la estructura. Así, los saponósidos monodesmosídicos son hemolíticos mientras que los bidesmosídicos no lo son. Debido a su poder hemolítico resultan muy tóxicos si se administran por vía intravenosa, ya que de esta manera contactan directamente con la sangre, mientras que por vía oral su toxicidad es muy baja. La mayoría de los saponósidos son ictiotóxicos, es decir, son tóxicos para animales de sangre fría, sobre todo para los peces.

Las saponinas tienen elevado peso molecular y su aislamiento en estado puro ofrece ciertas dificultades. Como heterósidos que son, se hidrolizan por ácidos, dando una genina (sapogenina) y diversos azúcares y ácidos urónicos relacionados. Según la estructura de la genina o sapogenina, se conocen dos grupos de saponinas; los tipos esteroide (generalmente triterpenoides tetracíclicos) y triterpenoide pentacíclico (ver fórmulas a continuación). Ambos presentan un enlace heterosídico en el C-3 y tienen un origen biogenético común, vía ácido mevalónico y unidades isoprenoides (García E. 2008)

Figura 4. ESQUELETO ESTEROIDE

(Fernández, 1992)

II.4.1.3 Clasificación y localización

Según el número de posiciones de sustitución de los azúcares, pueden clasificarse en monodesmosídicos (el azúcar o azúcares se unen por una única posición a la genina) y bidesmosídicos (el azúcar o azúcares se unen por dos puntos a la genina). Aunque la clasificación más corriente es la que se hace según la naturaleza de la genina. Así, se distinguen entre saponósidos tri terpénicos y saponósidos esteroídicos. Ambos tienen un origen biogenético común, vía ácido mevalónico y unidades isoprenoides. Los saponósidos se pueden encontrar en órganos vegetales muy diversos. Los de carácter monodesmosídico se producen en las raíces, cortezas y semillas, mientras que los bidesmosídicos, más hidrosolubles, muestran preferencia por los tejidos de asimilación como las hojas y ramas tiernas.

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II.4.1.4 Acciones farmacológicas

Desde el punto de vista farmacológico, las drogas con saponósidos pueden tener diferentes acciones, las cuales se deben, sobre todo, a los saponósidos triterpénicos. Sin embargo, hay que tener en cuenta que, por vía oral y en dosis altas, las saponinas irritan la mucosa bucofaríngea y digestiva, causando dolor abdominal, vómitos y diarrea.

II.5.1 Alimentos funcionales o nutracéuticos Además de los macro y micronutrientes necesarios para el metabolismo, se ha

podido determinar otro tipo de compuestos conocidos como fitoquímicos los que se encuentran en materias primas y alimentos de origen vegetal y tienen efectos positivos en la salud de las personas. Los compuestos fitoquímicos son sustancias naturales presentes en los alimentos, es el caso de los polifenoles (poderosos antioxidantes) que generan beneficios importantes a la salud; están presentes en productos como el té verde, el vino tinto y el chocolate. A pesar de no encontrarse dentro de la clasificación de nutrientes esenciales para los humanos, se han aislado y estudiado, comprobándose que tienen propiedades en la promoción de la salud y en la prevención y/o tratamiento de enfermedades. Los alimentos funcionales desarrollados inicialmente en Japón fueron recibidos por el resto del mundo con mucho entusiasmo. La comida "ideal" encontró su propio campo y expandió sus posibilidades en muchas dimensiones.

En pruebas clínicas y en ensayos científicos, se ha podido establecer que evitan

la oxidación del LDL, reduciendo la incidencia de enfermedades cardiovasculares. Como los polifenoles, el reino vegetal nos ofrece una amplia variedad de otros ingredientes con efectos positivos en la salud, como evitar la deshidratación (Garcia M. 2001). II.5.1.1 Suplementos de dieta

El término “suplemento de dieta” se define como cualquier producto que se utilice con el fin de suplementar la dieta que contiene uno o más de los siguientes ingredientes: una vitamina, mineral, hierba u otro ingrediente botánico, un aminoácido; un concentrado, metabolito, constituyente, extracto o una combinación de alguno de estos ingredientes. II.6.1 Minerales

II.6.1.1 Calcio: Es el mineral más abundante en el organismo. Constituye los huesos e interviene en la coagulación de la sangre. También participa en la transmisión nerviosa y forma parte de la estructura de varias enzimas. Ayuda a mantener huesos y dientes sanos y fuertes, previene la osteoporosis. Alimentos: Queso, yogur; leche, sardinas, harina y verduras de hoja verde.

II.6.1.2 Fósforo: Constituye, junto con el calcio, los huesos y los dientes. Forma parte de sustancias bioquímicas implicadas en la obtención y transmisión de energía y material genético. Alimentos: Productos lácteos, pescado en lata, carne y aves.

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II.6.1.3 Potasio: Establece un equilibrio entre las sales y los líquidos que forman parte del organismo. Participa en el mantenimiento de la presión osmótica (dentro de la célula), manteniendo el equilibrio hidroelectrolítico y el pH de la sangre. Importante en la transmisión de los impulsos eléctricos en músculos y nervios. Alimentos: Plátano, naranja, verduras y leche. II.6.1.3 Sodio: Participa en el mantenimiento de la presión osmótica (al exterior de la célula). Interviene también en la transmisión nerviosa y en el mantenimiento del equilibrio ácido-base.

II.6.1.4 Magnesio: Indispensable para el buen funcionamiento de los músculos, nervios y huesos. Es necesario para la actividad de muchas enzimas, especialmente las que intervienen con el ATP (Adenosina trifosfato). En este proceso, el magnesio se une al ATP y no a la enzima. Alimentos: Chocolate, pasta, pan integral, marisco y verduras de hoja verde.

II.6.1.5 Hierro: Posibilita que el oxígeno llegue a todas las células como Fe2+. Esto se debe a que forma parte de la hemoglobina y de la mioglobina (que transporta oxígeno a los músculos). También forma parte de enzimas. Se puede almacenar en grandes cantidades en el cuerpo asociado a una proteína llamada ferritina. Previene la aparición de la anemia. Alimentos: Hígado, riñones, carne roja, huevos, espinacas y cereales.

II.6.1.6 Manganeso: Conforma enzimas. Alimentos: verdura y té.

II.6.1.7 Zinc: Forma parte de algunas enzimas. Está presente en todos los tejidos del cuerpo, ayuda a un normal crecimiento, desarrollo sexual y físico. Estimula la cicatrización de heridas y úlceras. Alimentos: cereales, carne de res, cerdo, derivados lácteos y verduras de hoja verde.

II.6.1.8 Cobre: Conforma enzimas. Participa en la formación de glóbulos rojos, es esencial en la absorción del hierro. Alimentos: chocolate, mariscos, legumbres, cereales e hígado. II.6.1.9 Cobalto: Desempeña un papel en la formación de la hemoglobina, junto con el cobre y el hierro e interviene en la acción de algunas enzimas y en el metabolismo de los glúcidos. (Johns M. 2003). II.7.1 Rayos X

II.7.1.1 Historia

En 1895 Wilhem C. Roentgen descubre que, cuando un haz de electrones

rápidos golpea una superficie sólida, se emite radiación que atraviesa la materia y que pueden ser difractados. Moseley demostró en 1913 que los rayos X emitidos de un elemento puro eran únicos y representativos a ese elemento. En el año de 1938 se construyó el primer espectrómetro de Rayos X. A partir de 1948 se han diseñado y utilizado varios tipos de espectrómetros de fluorescencia de rayos X.

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En 1959 Perutz y Kendrew resuelven las estructuras proteicas de la hemoglobina y la mioglobina. A partir de 1960 se desarrollaron los modos de operación automática y el tratamiento de datos más exactos, la utilización de detectores más sensibles (estado sólido) permitieron el diseño de nuevas fuentes y estas permitieron el diseño de instrumentos portátiles. En 1990 los detectores sin ventana permitieron la detección de elementos livianos menores al boro.

II.7.1.2 Naturaleza de los rayos X

Los rayos X son radiaciones electromagnéticas cuya longitud de onda va desde unos 10 nm hasta 0,001 nm. Los rayos de mayor longitud de onda, cercanos a la banda ultravioleta del espectro electromagnético, se conocen como rayos X blandos, esta radiación es continua y surge del frenado de las partículas los de menor longitud de onda, que están más próximos a la zona de rayos gamma o incluso se solapan con ésta, se denominan rayos X duros.

Los rayos X son una radiación de electromagnética de longitud de onda corta

producida por el frenado de electrones de elevada energía o por transiciones electrónicas de electrones que se encuentran en los orbitales internos de los átomos. Éstos están formados por un amplio rango de longitudes de onda, que se conocen como rayos X blancos, para diferenciarlos de los rayos X monocromáticos, que tienen una única longitud de onda (Tertian R. 1982).

II.7.1.3 Interacción de los rayos X con la materia

En la interacción entre la materia y los rayos X existen tres mecanismos por los que éstos son absorbidos; los tres demuestran la naturaleza cuántica de los rayos X .

II.7.1.3.1 Efecto fotoeléctrico Cuando un cuanto de radiación o fotón correspondiente a la zona de rayos X

del espectro electromagnético choca contra un átomo, puede golpear un electrón de una capa interna y expulsarlo del átomo. Si el fotón tiene más energía que la necesaria para expulsar el electrón, le transferirá esta energía adicional en forma de energía cinética. Este fenómeno, denominado efecto fotoeléctrico, tiene lugar principalmente en la absorción de rayos X de baja energía.

II.7.1.3.2 Efecto Compton El efecto Compton, descubierto en 1923 por el físico y educador

estadounidense Arthur Holly Compton, es una manifestación importante de la absorción de rayos X de menor longitud de onda. Cuando un fotón de alta energía choca con un electrón, ambas partículas pueden ser desviadas formando un ángulo con la radiación incidente de rayos X. El fotón incidente cede parte de su energía al electrón y sale del material con una longitud de onda más larga. Estas desviaciones acompañadas por un cambio en la longitud de onda se conocen como dispersión Compton.

II.7.1.3.3 Producción de pares Se observa cuando se irradian elementos de masa atómica elevada con rayos X

de muy alta energía, se produce el fenómeno de producción de pares. Cuando un fotón de alta energía penetra en la capa electrónica cercana al núcleo, puede crear un par de electrones, uno con carga negativa y otro con carga positiva; los electrones

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con carga positiva se conocen también como positrones. La producción de pares es un ejemplo de la conversión de energía en masa. El fotón necesita una energía mínima de 1,2 MeV para proporcionar la masa del par. Si el fotón incidente posee más energía de la necesaria para la producción del par, el exceso de energía se cede al par de electrones en forma de energía cinética. Las trayectorias de las dos partículas son divergentes (Skoog, D. 2001). II.7.1.4 Propiedades de los rayos X

La absorción de rayos X por una sustancia depende de su densidad y masa atómica. Cuanto menor sea la masa atómica del material, más transparente será a los rayos X de una longitud de onda determinada. Cuando se irradia el cuerpo humano con rayos X, los huesos compuestos de elementos con mayor masa atómica que los tejidos circundantes absorben la radiación con más eficacia, por lo que producen sombras más oscuras sobre una placa fotográfica.

II.7.1.4.1 Ionización Depende de su longitud de onda. La capacidad de ionización de los rayos X

monocromáticos Otra característica importante de los rayos X es su poder de ionización, que es directamente proporcional a su energía. Esta propiedad proporciona un método para medir la energía de los rayos X. Cuando se hacen pasar rayos X por una cámara de ionización se produce una corriente eléctrica proporcional a la energía del haz incidente. Otros aparatos más sensibles como el contador Geiger o el centelleo miden la energía de los rayos X (48, 49).

II.7.1.4.2 Excitación El choque de un electrón o fotón X incidente con un electrón de las capas

internas del átomo, produce la expulsión de dicho electrón quedando el átomo en estado de excitado de mayor energía

Si se analizan los rayos X emitidos con un espectrómetro de rayos X cuando los

electrones han sido excitados por la radiación, se encuentran ciertas líneas definidas superpuestas sobre el espectro continuo; estas líneas, conocidas como rayos X característicos, corresponden a longitudes de onda que dependen exclusivamente de la estructura de cada átomo.

II.7.1.4.3 Emisión Un átomo en estado excitado tiende a volver inmediatamente a su estado

fundamental, para lo cual se producen saltos de electrones de niveles más externos para cubrir el hueco producido. En este proceso hay un desprendimiento de energía, igual a la diferencia de energía de los niveles entre los que se produce el salto electrónico, en forma de radiación electromagnética correspondiente a la región de rayos X.

A la excitación producida por bombardeo de electrones se le denomina

excitación primaria y a la radiación así obtenida se le llama radiación X primaria. Los tubos de rayos X son fuentes de la radiación X primaria; la radiación X primaria se produce también con la microscopía electrónica, al ser irradiada una muestra por un haz de electrones, donde se utiliza para el análisis químico de la muestra.

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Al proceso de excitación con otra radiación X se le denomina excitación secundaria, y la radiación X producida por excitación de otra radiación X se denomina radiación X secundaria o radiación de fluorescencia. Es la radiación X secundaria característica la que se utiliza para el análisis químico en los espectrómetros de fluorescencia de rayos X.

Al ser la energía de los distintos niveles electrónicos característica para cada

tipo de átomos, la radiación X emitida será característica para cada de elemento y en principio, no dependerá de la sustancia química en la que se encuentre, ya que en general, estas radiaciones están originadas por transiciones entre los niveles electrónicos internos, cuyas energías no se ven afectadas por el tipo de enlace existente (Skoog, D. 2001).

II.7.1.4.4 Emisión y espectros de rayos X Los electrones se encuentran en el átomo distribuidos en los distintos niveles y

subniveles de energía. Los electrones se sitúan en estos niveles ocupando primero aquéllos de menor energía hasta colocarse todos; a este estado de mínima energía del átomo se le denomina estado fundamental. Si ahora bombardeamos estos átomos con un haz de electrones o con fotones de rayos X, una pequeña parte de la energía se invierte en la producción del espectro característico de rayos X de los elementos que componen la muestra bombardeada. El proceso de producción de este espectro característico puede esquematizarse como se muestra en la siguiente gráfica.

Fig 5. Variación creciente y discontinua de la absorción de Rayos X

(Tertian, 1982)

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II.7.1.5 Métodos de fluorescencia de rayos X Los espectros de rayos X característicos se excitan cuando se irradia una

muestra con un haz de radiación X de longitud de onda suficientemente corta. Las intensidades de los rayos X fluorescentes resultantes son casi 1000 veces más bajas que la de un haz de rayos X obtenido por excitación directa con electrones. El método de fluorescencia requiere de tubos de rayos X de alta intensidad, de unos detectores muy sensibles y de sistemas ópticos de rayos X adecuados.

La intensidad es un factor importante, puesto que afectará al tiempo que se

necesitará para medir el espectro. La sensibilidad del análisis, contemplada como la concentración detectable más baja de un determinado elemento en la muestra, dependerá de la relación pico-radiación de fondo para las líneas espectrales. Se presentan pocos casos de interferencia espectral, debido a la relativa simplicidad de los espectros de rayos X.

Cuando se irradia con un haz de rayos X una muestra de composición

desconocida, esta emitirá las radiaciones características de los elementos que la componen. Si podemos identificar la longitud de onda o energía de cada una de estas radiaciones características, podremos conocer los elementos que componen la muestra y si podemos medir sus intensidades, podremos conocer sus respectivas concentraciones. Esta técnica recibe el nombre de espectrometría de fluorescencia de rayos X o solamente espectrometría de rayos X (Ayala R. 2001).

II.7.1.5. 1 Reflexión total con rayos X La reflexión total del rayo ocurre cuando un haz colimado incide sobre una

superficie plana, limpia y pulida de un reflector de un material dado. La incidencia debe llevarse a cabo a un ángulo que este debajo del ángulo crítico. La muestra se coloca en el centro del reflector, el rayo colimado primario incide sobre la superficie del reflector con ángulos menores al ángulo crítico, el rayo es absorbido por la muestra y la excita de tal forma que emite radiación fluorescente. La parte del haz primario que pasa paralelamente a su superficie se absorbe completamente por un detenedor del haz (beam stopper) de acero inoxidable. Al excitar la muestra los fotones fluorescentes son introducidos al detector, pasa por el amplificador y se presentan las energías de los picos presentes en el espectro de la muestra analizada .

II.7.1.5.2 Física de la Reflexión total de Rayos X El efecto del modo de Reflexión Total de excitación en Fluorescencia de

Rayos X puede ser caracterizado por medio de sólo tres parámetros: el ángulo crítico, la reflectividad, y la profundidad de penetración. Estos parámetros fundamentales de la reflexión total son aportados por la física de la radiación electromagnética. La complejidad y el nivel de las herramientas teóricas necesarias para su descripción son determinadas por la extensión a la que son consideradas las propiedades reales de las interfaces y materiales a ser examinados.

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Experimentalmente, la Reflexión Total de Rayos X fue descubierta por Compton en 1923. Desde entonces, muchos científicos han investigado este fenómeno, experimental y teóricamente. Han sido cubiertas todas las regiones de energía, y muchos materiales han sido estudiados. La mayoría de investigaciones han estado dirigidas a la determinación de la reflectividad, y la verificación de las ecuaciones de Fresnel que relacionan la reflectividad al ángulo de incidencia oblicua. Las ecuaciones de Fresnel están basadas sobre una aproximación de la teoría clásica de la dispersión. Ellas han sido derivadas asumiendo una interfaz perfectamente plana y lisa entre medios homogéneos. Aún cuando una superficie real es, generalmente, irregular a escala microscópica, y dispersa los rayos X al mismo tiempo que los refleja, los resultados experimentales han mostrado suficiente concordancia para la aplicación particular descrita aquí. Hasta ahora, todos los instrumentos de FRXT han sido diseñados y operados sobre la base de la teoría clásica de la dispersión y de las ecuaciones de Fresnel. (Ramirez 2003).

II.7.1.6 Espectrómetro de fluorescencia de rayos X

El sistema general para la excitación, dispersión y detección de la radiación

fluorescente con un espectrómetro de cristal plano. En él, se coloca la muestra en el porta muestras, que puede girar para mejorar la uniformidad de exposición y se irradia con un haz de rayos X primarios sin filtrar, lo que provoca que el elemento presente emita sus líneas fluorescentes características. Una porción del haz fluorescente dispersada es colimada por una rendija de entrada al goniómetro y dirigida a una superficie plana del cristal analizador. Las líneas de radiación reflejadas pasan a través de un colimador auxiliar o rendija de salida hacia el detector, en donde la energía de los cuantos de rayos X se convierte en impulsos eléctricos o conteos. La rendija primaria, el cristal analizador y la rendija secundaria están colocadas en el círculo focal, de manera que la Ley de Bragg nλ = 2dsenθ siempre se cumple durante la rotación del goniómetro, ya que el detector gira a una velocidad angular el doble de la del cristal (Ramirez P. 2003).

En los últimos años ha tenido un gran desarrollo una variante que es la

espectrometría de fluorescencia de rayos X de dispersión de energías, que surge de la utilización de semiconductores, principalmente de silicio y litio, como detectores de los rayos X. La relativamente elevada resolución de estos (entre 160-180 eV) permite descomponer el espectro de fluorescencia en sus componentes monocromáticas en función de la diferencia entre sus energías, de modo que el propio detector actúa como agente separador. En este caso, el detector recibe el espectro total emitido por todos los elementos de la muestra a la vez. Para cada fotón de rayos X incidente, el detector genera un impulso eléctrico cuya altura será proporcional a la energía del fotón; los distintos impulsos eléctricos generados son separados y almacenados en función de su valor con ayuda de un analizador de altura de impulsos multicanal

II.7.1.7 Ventajas de la fluorescencia de rayos X

Entre sus ventajas, podemos destacar que su campo de aplicación es para cualquier elemento de número atómico mayor que 4 (berilio). Su simplicidad reside en que el espectro de emisión de rayos X es muy sencillo de obtener y de interpretar, por lo que la posición de las líneas no depende del tipo de compuesto ni de su estado físico.

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La facilidad y el bajo costo de los análisis, ya que no se requiere de un procedimiento de digestión, no se utilizan reactivos tóxicos, gases o productos especiales para operar el equipo o preparar las muestras.

El método no es destructivo en el sentido de que la muestra no sufre daños

durante el análisis. Las muestras analizadas pueden volver a analizarse las veces que se desee sin que sufran daños. Algunos materiales pueden deteriorarse cuando están sometidos durante largos periodos a una intensa irradiación con rayos X.

Las cantidades de muestras son mínimas (mg) y pueden encontrarse en una

gran variedad de formas, tales como sólidos, pastillas, polvos, líquidos, películas finas e incluso gases. El material puede ser metal, mineral, vegetal, cerámico, vidrio, plástico, tela, papel, etc. La forma y tamaño también puede ser muy variable. Es aplicable a un rango de concentraciones amplio, desde 0,001 % hasta 100%, en los casos más favorables. Es suficiente la construcción de una única recta de calibrado para todo el intervalo de concentraciones sin necesidad de dividirlo por zonas. La sensibilidad es mayor cuanto mayor es el número atómico del elemento presente y menores los números atómicos de los que forman la matriz.

El análisis simultáneo de varios elementos es posible por medio de equipos

automáticos, que disponen de monocromadores semifijos con sistemas ópticos montados en torno a un tubo de rayos X centralmente localizado alrededor de la posición de la muestra. Cada cristal se ajusta para reflejar una línea fluorescente a su detector asociado. Una unidad registradora compatible permite que ambas señales, la de rayos X y la óptica, sean registradas en el mismo dispositivo (Ayala R. 2001).

II.7.1.8 Limitaciones de la fluorescencia de rayos X

Entre sus desventajas y limitaciones, se cita la necesidad de disponer de patrones generalmente caros, aunque no se deterioran, además existe baja sensibilidad en el análisis de elementos ligeros por su baja absorción. Como la penetración es baja, pueden influir efectos de microheterogeneidad, por el tamaño de partícula y textura de la superficie, lo que supone una variación de una muestra a otra. Al establecer la técnica analítica, como ya se ha indicado, es necesario contemplar los efectos de matriz (absorción y refuerzo) por el gran número de parámetros a considerar. Por último, comentar que el coste de la instrumentación es bastante elevado, y además requiere equipo adicional (hornos, molinos, prensas, etc) para la preparación de las muestras, junto con acondicionadores de aire, componentes y accesorios caros.

Respecto a los efectos de la matriz, existen dos tipos: el efecto de absorción,

que pueden hacer que los resultados calculados sean más altos o más bajos que el elemento cuantificado; y el efecto de intensificación, que puede dar lugar, también a resultados mayores de los esperados. Este comportamiento se observa cuando la muestra contiene un elemento cuyo espectro de emisión característico se excita mediante el haz incidente y este espectro a su vez, produce una excitación secundaria de la línea analítica (Ayala R. 2001)

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PARTE III RESULTADOS METODOS DE EXTRACCION DE FLAVONOIDES Y SAPONINAS Los siguientes espectros se obtuvieron inyectando en un cromatógrafo líquido HPLC. Estos fueron tratados de forma diferente para ver la efectividad de la metodología a utilizar en la separación de los metabolitos de interés. Fig. 6 Extracto Crudo Etanólico

Fuente: FODECYT 050-2006 Inyección de 10 ul del extracto crudo de fronda de Calahuala

El espectro muestra picos de los metabolitos separados. Fig. 7 Extracto Hidrolizado lavado Acido de Fronda

Fuente: FODECYT 050-2006

Inyección de 10 ul del extracto hidrolizado y lavado con solución ácida de fronda de Calahuala. El espectro muestra mayor picos de los metabolitos separados.

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Fig. 8 Extracción supercrítica con CO2-Cosolvente etanol

Fuente: FODECYT 050-2006

Inyección de 10 ul del extracto crudo de fronda de Calahuala

El espectro muestra solo dos picos anchos de los metabolitos separados. Debido a que estos picos no tienen buena eficacia, nos indica que el ensanchamiento

de estos picos se debe a la presencia de varios metabolitos que no se separaron. Se puede observar que de las tres metodologías de extracción de los flavonoides y saponinas, se obtienen mejor eficacia y el mayor número de metabolitos en el segundo cromatograma (Fig. 7). Esto nos indica que es la mejor forma de separar y de obtener los metabolitos de estudio, ya que la hidrólisis ácida nos permite obtener las moléculas libres sin los enlaces glucidicos (azúcares).

Fracciones Separadas por Cromatografía en Columna

Esta tabla (1) nos muestra las diferentes fracciones que se colectaron al separar los extractos por medio de la técnica de cromatografía en columna. Cada una de las especies de estudio S. domingensis (rizoma, tallo y hoja) y P. pesudoaureum (rizoma y fronda), se caracterizan por presentar fracciones de diferente color, lo cual nos indica de forma cualitativa que existen diferentes metabolitos en las fracciones analizadas. El color que se observa es característico para cada molécula que se está separando por medio de esta técnica. Las sustancias empleadas como solventes de separación o fase móvil se caracterizan por ser de naturaleza polar. Sin embargo para lograr una buena separación de los diferentes metabolitos de interés (saponinas y flavonoides) se realizaron las separaciones utilizando un gradiente de polaridad, el cual consistió en aumentar de forma gradual la polaridad durante todo el proceso de separación.

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Tabla 1. Fracciones colectadas de los diferentes extractos vegetales

Especie

Origen del Extracto

Fracciones Colectadas

Smilax domingesis (Sarsaparrilla)

Hoja

1. Verde claroa

2. Verde botellaa

3. Verde oscuroa

4. Café-Verdáceoa 5. Café- Amarillentob 6. Caféb

Tallo

1. Verde pálidoa

2. Amarillo-Rojizo pálidoa

3. Naranja pálidoa

4. Anaranjadoa

5. Café pálidoa

6. Incoloroa

7. Caféb

Rizoma

1. Verde-Amarillentaa 2. Caféa 3. Rojaa 4. Rojo-pálidob 5. Incolorob

Phlebodium pseudoaerum

(Calahuala)

Fronda

1. Amarilla-Verdea

2. Café pálidoa

3. Beigea 4. Café oscurob 5. Incolorob 6. Amarilloc

Rizoma

1. Amarilla-Verdea 2. Caféa 3. Rojo intensoa 4. Rojo pálidob 5. Incolorob

Fuente: FODECYT 050-2006

(a) fase móvil acetato de etilo/etanol 3:1

(b) fase móvil etanol/agua 1:1 (c) fase móvil ácido acético/agua 1:1

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CROMATOGRAMAS HPLC DE LOS ESTANDARES

Para poder identificar las estructuras químicas de los flavonoides y saponinas presentes en las especies de estudio, se deben de conocer los tiempos de retención de cada compuesto, para ello es indispensable inyectar en las mismas condiciones de separación HPLC, los estándares correspondientes para cada uno. Fig. 9 Presenta los tiempos de retención de tres flavonoides:

1) hiperósido, 2) rutina y 3) kaemferol

Separaciones HPLC, columna Rp-18, flujo 1.0 ml/min, long. Onda 365 nm

Fuente: FODECYT 050-2006 Fig. 10 Presenta los tiempos de retención de cuatro flavonoides:

1) neoespiridina, 2) hiperósido, 3) ácido caféico y 4) rutina

Separaciones HPLC, columna Rp-18, flujo 1.0 ml/min, long. Onda 365 nm

Fuente: FODECYT 050-2006

1

2

3

1

2

3 4

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Para poder identificar los compuestos separados en cada una de las fracciones colectadas de rizoma, fronda, tallo y hoja de las dos especies de estudio. Se compararon sus respectivos tiempos de retención con los correspondientes de cada estándar. Tabla 2. Tiempos de Retención (tR) de los Estándares

ESTANDAR

tR (minutos) Cromatografía HPLC

Neoespiridina

1.6

Hiperósido

1.9

Acido Clorogénico

2.5

Acido Cafeico

3.3

Rutina

3.8

Quercetina

4.0

Kaemferol

9.0

Se inyectaron 10 ul de cada estándar, 365 nm y 1. ml/min Fuente: FODECYT 050-2006

IDENTIFICACION HPLC DE LAS FRACCIONES

Las fracciones separadas por cromatografía en columna del rizoma y fronda de la especie Phlebodium pseudoaurum, se inyectan en el cromatógrafo líquido Shimandzu prominece, 10 uL de cada fracción a un caudal de 0.8 ml/min, a una longitud de onda 280nm y en una columna Rp-18 Purospher STAR.

Tabla 3. Fracciones del Rizoma de Phlebodium pseudoaureum

No. Fracción tR (minutos) Cromatografía HPLC

Metabolitos Identificados

1

4.0

Quercetina

2

4.0

Quercetina

3

4.0

Quercetina

4

4.0

Quercetina

5

4.0

Quercetina

Fuente: FODECYT 050-2006 El único flavonoide presente en el rizoma de Calahuala es la quercetina

su tiempo de retención corresponde con el estándar.

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Tabla 4. Fracciones de Fronda de Phlebodium pseudoaureum

No. Fracción

tR (minutos) Cromatografía HPLC

Metabolitos Identificados

1

4.0

Quercetina

2

3.3; 4.0

Acido cafeico y Quercetina

3

1.9; 4.0

Hiperósdio y Quercetina

4

3.3; 3.8

Acido cafeico y Rutina

5

3.8

Rutina

Fuente: FODECYT 050-2006 Las frondas de Calahuala se caracterizan por presentar diversos flavonoides.

El tiempo de retención corresponde con el estándar respectivo.

IDENTIFICACION HPLC DE LAS FRACCIONES Las fracciones separadas por cromatografía en columna del rizoma, tallo y fronda de la especie Smilax domingensis, se inyectan en el cromatógrafo líquido Shimandzu prominece, 10 uL de cada fracción a un caudal de 0.8 ml/min, a una longitud de onda 280nm y en una columna Rp-18 Purospher STAR. Tabla 5. Fracciones de Rizoma de Smilax domingensis

No. Fracción

tR (minutos) Cromatografía HPLC

Metabolitos Identificados

1

3.8

Rutina

2

4.0

Quercetina

3

3.8

Rutina

4

3.8

Rutina

5

3.8

Ruitna

6

4.0

Quercetina

Fuente: FODECYT 050-2006 Los flavonoides presentes en el rizoma de Zarzaparrilla son: Rutina y quercetina. El tiempo de retención corresponde con el estándar de cada uno.

36

Tabla 6. Fracciones de Tallo de Smilax domingensis

No. Fracción tR (minutos) Cromatografía HPLC

Metabolitos Identificados

1

3.8

Rutina

2

3.8

Rutina

3

3.3; 3.8

Acido Cafeico y Rutina

4

3.8

Rutina

5

3.3

Acido Cafeico

6

3.3; 3.8

Acido Cafeico y Rutina

Fuente: FODECYT 050-2006 Los flavonoides presentes en el tallo de Zarzaparrilla son: Rutina y ácido cafeico. El tiempo de retención corresponde con el estándar de cada uno. Tabla 7. Fracciones de Hoja de Smilax domingensis

No. Fracción tR (minutos) Cromatografía HPLC

Metabolitos Identificados

1

4.0; 6.0; 9.0; 11.0

Quercetina y Kaemferol

2

4.0; 6.0; 9.5; 10.5

Quercetina y Kaemferol

3

4.0; 6.0; 9.0; 11.0

Quercetina y Kaemferol

4

4

Quercetina

5

3.3; 3.8

Acido Cafeico y Rutina

6

3.3; 3.8

Acido Cafeico y Rutina

Fuente: FODECYT 050-2006 Los flavonoides presentes en la hoja de Zarzaparrilla son: Quercetina, kaemferol, rutina y ácido cafeico. El tiempo de retención corresponde con el estándar.

37

SAPONINAS DE LAS ESPECIES VEGETALES Esta tabla nos presentan los resultados obtenidos en la caracterización química en la determinación de saponinas (ensayo macro, semimicro, de coloración, precipitación y cromatografía en capa fina) para las especies vegetales S.domingensis y P. pseudoaureum. Tabla 8. Caracterización de Saponinas en los extractos vegetales MATERIA VEGETAL

Caracterización macro y semimicro de coloración y precipitación

Rf Cromatografía en capa fina

Estándar con el que Coincide

Rizoma de P. pseudoaureum

Negativo

0.48; 0.6; 0.71; 0.81

No coincide con ningún estándar

Fronda de P. pseudoaureum

Negativo

0.43; 0.81

No coincide con ningún estándar

Rizoma de S. domingensis

Positivo

0.81

No coincide con ningún estándar

Tallo de S. domingensis

Negativo

0.78; 0.93

Coincide con el estándar de ergosterol y colesterol. Se acerca al estándar de saponinas y sapogeninas

Hoja de S. domingensis

Negativo

0.21; 0.93

Coincide con el estándar de ergosterol y colesterol. Se acerca al estándar de saponinas y sapogeninas

Fuente: FODECYT 050-2006 7.5.1. Análisis de contenido mineral del Rizoma de milax domingensis Con base en los resultados de las lecturas de los espectros y las respectivas áreas de los elementos analizados, se obtuvieron las concentraciones de los minerales presentes en los rizomas, frondas, tallos y hojas de las especies Smilax domingensis y

Phlebodium pseudoaureum. En estas tablas se puede observar que los elementos Fe, Mn, Zn y Sr están presentes en bajas concentraciones y se presentan en la mayoría de las muestras analizadas. El K y Ca son los metales que se presenten en concentraciones altas, siendo los mayoritarios en las dos especies de estudio.

38

Determinación Mineral por FTRX/Especie Vegetal Phlebodium pseudoaureum

Tabla 9. Material Vegetal Cultivada: Colectado en época lluviosa (mes de julio) Material Vegetal

Vegetal Seco

K Ppm

Ca Ppm

Fe Ppm

Mn Ppm

Zn Ppm

Sr ppm

Rizoma Calahuala

0.5046g 200.19 314.15 10.65 8.32 3.50 0.93

Fronda Calahuala

0.5041g 105.48 259.16 5.14 7.64 2.24 1.75

Fuente: FODECYT 050-2006

Tabla 10. Material Vegetal Cultivada: Colectado en época seca (mes de enero) Material Vegetal

Vegetal Seco

K Ppm

Ca Ppm

Fe Ppm

Mn Ppm

Zn Ppm

Sr Ppm

Rizoma Calahuala

0.5030g 189.85 294.68 7.56 3.47 1.38 0.77

Fronda Calahuala

0.5037g 110.38 87.76 3.22 4.93 1.69 1.12

Fuente: FODECYT 050-2006

Tabla 11. Material Vegetal Silvestre: Colectado en época lluviosa (mes de julio) Material Vegetal

Vegetal Seco

K Ppm

Ca Ppm

Fe Ppm

Mn Ppm

Zn Ppm

Sr ppm

Rizoma Calahuala

0.5063g 166.31 224.46 5.1 ND ND ND

Fronda Calahuala

0.5033g 49.26 178.67 1.73 5.58 1.22 4.84

Fuente: FODECYT 050-2006

Tabla 12. Material Vegetal Silvestre: Colectado en época seca (mes de enero) Material Vegetal

Vegetal Seco

K Ppm

Ca Ppm

Fe Ppm

Mn Ppm

Zn Ppm

Sr ppm

Rizoma Calahuala

0.5206g 67.21 53.40 3.54 2.24 0.91 1.13

Fronda Calahuala

0.5092g 79.27 62.20 0.96 ND 4.08 ND

Fuente: FODECYT 050-2006

39

Determinación mineral por TFR / Especie Vegetal Smilax domingensis

Tabla 13. Material Vegetal Cultivado: Colectado en época lluviosa (mes de julio)

Material Vegetal

Vegetal Seco

K ppm

Ca Ppm

Fe ppm

Mn ppm

Zn ppm

Sr ppm

Rizoma Zarzaparrilla

0.5080g 74.06 91.07 0.91 0.08 0.29 ND

Tallo Zarzaparrilla

0.5085g 223.55 115.04 4.9 0.11 0.5 0.38

Hoja Zarzaparrilla

0.5030g 142.34 252.19 4.7 0.31 0.71 1.21

Fuente: FODECYT 050-2006 Tabla 14. Material Vegetal Cultivado: Colectado en época seca (mes de enero)

Material Vegetal

Vegetal Seco

K ppm

Ca ppm

Fe ppm

Mn ppm

Zn ppm

Sr Ppm

Rizoma Zarzaparrilla

0.5054g 49.90 65.04 2.04 1.21 1.36 2.57

Tallo Zarzaparrilla

0.5094g 57.34 33.21 2.99 ND 0.61 0.16

Hoja Zarzaparrilla

0.5072g 68.24 147.5 1.65 0.27 1.47 1.17

Fuente: FODECYT 050-2006 Tabla 15. Material Vegetal Silvestre: Colectado en época lluviosa (mes de julio)

Material Vegetal

Vegetal Seco

K ppm

Ca Ppm

Fe ppm

Mn ppm

Zn ppm

Sr Ppm

Rizoma Zarzaparrilla

0.5039g 46.66 61.51 1.15 0.15 0.48 0.19

Tallo Zarzaparrilla

0.5045g 61.81 80.12 1.04 0.36 0.47 ND

Hoja Zarzaparrilla

0.5049g 79.27 62.2 0.96 ND 4.08 0.28

Fuente: FODECYT 050-2006

40

Tabla 16. Material Vegetal Silvestre: Colectado en época seca (mes de enero)

Material Vegetal

Vegetal Seco

K ppm

Ca Ppm

Fe ppm

Mn ppm

Zn ppm

Sr ppm

Rizoma Zarzaparrilla

0.5043g 14.26 8.57 0.48 ND 0.25 ND

Tallo Zarzaparrilla

0.5022g 55.11 127.64 3.37 ND 0.33 ND

Hoja Zarzaparrilla

0.5082g 25.36 30.96 1.18 0.05 0.23 0.14

Fuente: FODECYT 050-2006

Cada especie vegetal fue colectada en época seca (enero) y en época lluviosa (julio); así también se determinó el contenido mineral para cada especie por su forma de crecimiento cultivadas colectadas en la “Eco Parcela el Cacaotal” Retahuleu y silvestre o natural colectadas en la “Finca Sábana Grande” Escuintla. Para la determinación del contenido mineral, se utilizó material vegetal seco (aproximadamente 0.5 g) de cada uno, los cuales fueron determinados de forma cuantitativa, previa a su respectiva digestión ácida vía húmeda.

41

III.1 DISCUSION DE RESULTADOS

Las figuras 6, 7 y 8 nos muestran que hay diferencias en la técnica a utilizar para lograr una buena separación de los metabolitos de estudio (flavonoides y saponinas) haciendo un lavado ácido a cada uno de los extractos de los rizomas, frondas, tallos y hojas para las especies P. pseudoaureum y S. domingensis. El lavado ácido nos permite disociar los enlaces glicosídicos entre las moléculas de los flavonoides y las saponinas presentes en las especies de estudio y de esta forma lograr la mejor separación de cada metabolito. La figura 7 nos presenta el espectro que tiene el mayor número de picos, lo cual corresponde a cada uno de los extractos hidrolizados con lavado ácido, que nos ayuda a separar cada uno de los flavonoides que forman enlaces glucídicos y nos permite separar de forma individual cada flavonoide estudiado.

Las fases móviles utilizadas en la cromatografía en columna para separar cada

compuesto en las dos especies de estudio se caracterizan por aumentar en orden creciente su polaridad, lo cual nos permite una mayor afinidad con los flavonoides y saponinas presentes en cada especie vegetal (rizoma, fronda, tallo y hoja). La fase móvil del inciso c (acido acético/agua 1:1, combina el efecto polar con la fuerza ácida, efecto que nos permite colectar la última fracción de hoja y fronda relativamente resistente al efecto de las fases móviles preliminares. Las fracciones 1 y 2 para fronda y rizoma de P. pseudoaureum se caracterizan por tener el mismo color, lo cual nos indica que el o los metabolitos presentes en esta especie son los mismos. En las tablas 3 y 4 para la especie vegetal P. pseudoaureum se inyectaron 5 fracciones del rizoma y cinco de la fronda. Se puede observar que el flavonoide quercetina es el único flavonoide que se encuentra presente en el rizoma y que la fronda se caracteriza por tener diferentes tipos de flavonoides: quercetina, ácido cafeico, hiperósido y rutina.

En las tablas 4, 6 y 7 para la especie vegetal S. domingensis se inyectaron 6 fracciones del rizoma, seis del tallo y seis de la hoja. Se puede observar que los flavonoides rutina y quercetina se concentran en el rizoma, mientras que los tallos y las hojas de esta especie vegetal contienen a los flavonoides: rutina y ácido cafeico.

Cada flavonoide fue separado por su afinidad con la fase móvil agua con

ácido fosfórico (99.7 ; 0.3 V/V), acetonitrilo y metanol con gradiente lineal. Esta fase estacionaria se caracteriza por ser polar y por lo tanto tiene un afinidad muy alta con la estructura de la quercetina que es polar.

Al comparar los flavonoides de la dos especies se puede observar que el flavonoide quercetina, se puede utilizar como marcador químico para P. pseudoaureum; pues este compuesto es el único que se encuentra presente tanto en el rizoma como también en la fronda de esta especie vegetal. El flavonoide rutina se puede utilizar como marcador químico para S. domingensis; pues este compuesto es el único que se encuentra presente en el rizoma, tallo y hojas de esta especie vegetal.

42

En todas las fracciones inyectadas no fueron detectas las saponinas, por lo

cual se procedió a caracterizarlas por cromatografía en capa fina. De acuerdo a los resultados (tabla 8) de los ensayos macro y semi micro de coloración y precipitación para la determinación de saponinas para la materia vegetal fronda y rizoma de P.

pseudoaureum analizada dio un resultado negativo para la prueba de espuma. Para la especie vegetal S, domingensis, solamente el rizoma presentó resultado positivo para la prueba de espuma, sin embargo esta prueba pude dar falsos resultados por lo cual es importante confirmarlo por cromatografía en capa fina. Los estándares que se corrieron para identificar las saponinas fueron: Saponinas, sapogeninas, beta sitosterol, estigmasterol, ergosterol y colesterol, sin embargo los Rf fueron diferentes y ninguno de ellos coincidió con cada muestra analizada (rizomas, frondas, tallos y hojas) para cada una de las dos especies vegetales. En cuanto a los resultados del análisis del contenido mineral por fluorescencia total de rayos X, para las dos especies de estudio el rizoma, fronda, tallo y hojas presentan al K y el Ca como los minerales mayoritarios. Sin embargo, en la “Ecoparcela el Cacaotal” se observaron mayores concentraciones de Ca, lo que se considera se debe en parte al pH reportado (5.5) en el suelo para esta localidad, ya que éste aumenta la solubilidad de las sales de calcio. El alto contenido de K encontrado se debe a que es un catión altamente soluble, por lo tanto, de fácil absorción por el rizoma, en especial cuando el suelo es húmedo y su concentración puede variar dependiendo de la edad de la planta, ya que así serán sus requerimientos nutricionales, condiciones climáticas y cambios estacionales. Los micronutrientes Fe, Mn, Zn y Sr, se presentan en concentraciones bajas debido a que ellos no son de vital importancia en el crecimiento de la planta y además la concentración de estos elementos puede variar con la madurez de la planta y periodo estacional. El mineral Sr no fue detectado en algunos rizomas y tallo de S.

domingensis y en rizoma y fronda de P. pseudoaureum. Respecto a la posibilidad de utilizar las dos especies vegetales P.

pseudoaureum y S. domingensis como nutracéutico, se compararon los valores de contenido mineral recomendados para la dieta (RDAs) en los siguientes elementos: K y Ca. Se encontró que, con base en las tablas de valores de requerimientos nutricionales de minerales de Fennema (14); estos minerales se encuentran dentro de los RDAs en los diferentes órganos analizados para cada especie vegetal. En el caso del Fe, los valores estuvieron dentro de los rangos recomendados únicamente en los casos de tallo y fronda de P, pseudoaureum. Sin embargo, es importante recalcar que estos datos son los que se reportan para la planta cruda y que pueden haber variaciones de acuerdo a la forma de ingesta y a la biodisponibilidad de estos elementos en el cuerpo humano.

43

PARTE IV IV.1 CONCLUSIONES 1.- Se caracterizaron químicamente los flavonoides: rutina, quercetina, hiperósido y ácido cafeico y las saponinas: ergosterol y colesterol, presentes en las especies Smilax domingensis y Phlebodium pseudoaureum. 2.- Los flavonoides quercitina para la especie vegetal Phlebodium pseudoaureum. y la rutina para la especie vegetal Smilax domingensis, pueden ser utilizados como marcadores químicos, ya que cada uno de ellos se encuentra presente en los diferentes órganos de estas dos especies. 3.- Se desarrolló metodología analítica HPLC y GC masas que permitió estandarizar extractos de rizoma, fronda, tallo y hoja de Smilax domingensis y Phlebodium

pseudoaureum. 4.- Se cuantificaron en partes por millón (ppm) los minerales: K, Ca, Fe, Mn, Zn y Sr, presentes en los rizomas y follaje de Smilax domingensis y Phlebodium

pseudoaureum por el método de fluorescencia total de rayos X. 5.- Se evaluó el potencial de estas dos especies vegetales como fitoterápicos o nutraceuticos, por sus flavonoides, saponinas y minerales presentes en cada una. 6.- Se acepta la hipótesis planteada.

44

IV.2 RECOMENDACIONES 1.- Incluir la variable sexo dentro del estudio, dado a que la especie Smilax

domingensis es dioica, este factor puede influir en las características morfológicas y químicas del rizoma y follaje. Ya que puede metabolizar y acumular en su estructura celular un determinado flavonoide que pueda favorecer la reproducción de dicha especie. 2.- Utilizar extractos no etanolicos para evaluar los diversos flavonoides y saponinas presentes en las dos especies de estudio, ya que la mayoría de flavonoides están unidos a diversos azucares formando enlaces glucídicos. 3.- Realizar estudios de biodisponibilidad de K, Ca, Fe, Mn, Zn y Sr en las especies Smilax domingensis y Phlebodium pseudoaureum para evaluar su uso potencial como nutracéutico. Asimismo, se recomienda realizar más estudios sobre la toxicidad del rizoma, tallo y hojas, para evaluar la seguridad en el uso de la especie como alimento. 4.- Realizar estudios de caracterización química para diversas especies vegetales que tienen alto potencial como nutracéutico, que se utilizan como alimento o medicina natural y que además se cultivan en diferentes regiones de nuestro país. 5.- Formular y desarrollar a nivel nacional productos naturales a base de extractos que cumplan con las especificaciones de calidad y que puedan ser utilizados para el tratamiento de diversos problemas de salud de la población en general. 6.- Proponer mecanismos de síntesis para los marcadores químicos quercetina y rutina de las especies vegetales Smilax domingensis y Phlebodium pseudoaureum. 7.- Cuantificar los flanvoides y saponinas presentes en otras especies nativas cultivadas en el país que puedan tener un elevado potencial como alimento o nutraceutico.

45

IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 1- Adams, C.D. 1972. Flowering Plants of Jamaica. University of the West Indies.

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48

IV.4

ANEXOS

49

IV.4.1 Cromatogramas HPLC, de las diferentes fracciones de cada especie vegetal

Fig. 11 Estándar de Neoespiridina

tR = 1.6 minutos Fuente: FODECYT 050-2006

Fig. 12 Estándar de Acido Clorogénico

tR = 2.5 minutos Fuente: FODECYT 050-2006

Fig. 13 Estándar de Hiperósido

tR = 1.9 minutos Fuente: FODECYT 050-2006

50

Fig. 14 Estándar de Acido Cafeíco

tR = 3.3 Fuente: FODECYT 050-2006

Fig. 15 Estándar de Rutina

tR = 3.8 Fuente: FODECYT 050-2006

Fig. 16 Estándar de Quercetina

tR = 4.0 Fuente: FODECYT 050-2006

51

Fig. 17 Estándar de Kaemferol

tR = 9.0 Fuente: FODECYT 050-2006

IV.4.2 Cromatogramas HPLC de las fracciones del Rizoma de Calahuala

Fig. 18 Fracción 1. Rizoma Calahuala

Fuente: FODECYT 050-2006

Fig. 19 Fracción 2. Rizoma Calahuala

Fuente: FODECYT 050-2006

52

Fig. 20 Fracción 3. Rizoma Calahuala

Fuente: FODECYT 050-2006

Fig. 21 Fracción 4. Rizoma Calahuala

Fuente: FODECYT 050-2006

Fig. 22 Fracción 5. Rizoma Calahuala

Fuente: FODECYT 050-2006

53

IV.4.3 Cromatogramas HPLC de las fracciones de Fronda de Calahuala Fig. 23 Fracción 1 de Fronda Calahuala

Fuente: FODECYT 050-2006

Fig. 24 Fracción 2. Fronda Calahuala

Fuente: FODECYT 050-2006

Fig. 25 Fracción 3. Fronda Calahuala

Fuente: FODECYT 050-2006

54

Fig. 26 Fracción 4. Fronda Calahuala

Fuente: FODECYT 050-2006

Fig. 27 Fracción 5. Fronda Calahuala

Fuente: FODECYT 050-2006

IV.4.4 Cromatogramas HPLC de las fracciones del Rizoma de Zarzaparrilla

Fig. 28 Fracción 1. Rizoma Zarzaparrilla

Fuente: FODECYT 050-2006

55

Fig. 29 Fracción 2. Rizoma Zarzaparrilla

Fuente: FODECYT 050-2006

Fig. 30 Fracción 3. Rizoma Zarzaparrilla

Fuente: FODECYT 050-2006

Fig. 31 Fracción 4. Rizoma Zarzaparrilla

Fuente: FODECYT 050-2006

56

Fig. 32 Fracción 5. Rizoma Zarzaparrilla

Fuente: FODECYT 050-2006

Fig. 33 Fracción 5. Rizoma Zarzaparrilla

Fuente: FODECYT 050-2006

IV.4.5 Cromatogramas HPLC de las fracciones del Tallo de Zarzaparrilla

Fig. 34 Fracción 1. Tallo Zarzaparrilla

Fuente: FODECYT 050-2006

57

Fig. 35 Fracción 2. Tallo Zarzaparrilla

Fuente: FODECYT 050-2006

Fig. 36 Fracción 3. Tallo Zarzaparrilla

Fuente: FODECYT 050-2006

Fig. 37 Fracción 4. Tallo Zarzaparrilla

Fuente: FODECYT 050-2006

58

Fig. 38 Fracción 5. Tallo Zarzaparrilla

Fuente: FODECYT 050-2006

Fig. 39 Fracción 6. Tallo Zarzaparrilla

Fuente: FODECYT 050-2006

IV.4.6 Cromatogramas HPLC de las fracciones de Hojas de Zarzaparrilla

Fig. 40 Fracción 1. Hoja de Zarzaparrilla

Fuente: FODECYT 050-2006

59

Fig. 41 Fracción 2 Hoja Zarzaparrilla

Fuente: FODECYT 050-2006

Fig. 42 Fracción 3 Hoja Zarzaparrilla

Fuente: FODECYT 050-2006

Fig. 43 Fracción 4 Hoja Zarzaparrilla

Fuente: FODECYT 050-2006

60

Fig. 44 Fracción 5 Hoja Zarzaparrilla

Fuente: FODECYT 050-2006

Fig. 45 Fracción 6 Hoja Zarzaparrilla

Fuente: FODECYT 050-2006

61

IV.4.7 Fig. 46 Curva de Calibración Multi-elemental

Elementos: S, K, Ca, V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Ga, As, Se, Hg, Pb, Rb, Y y Sr.

Fuente: FODECYT 050-2006

IV.4.8 Fig. 47 Espectro de Rayos X de Rizoma de Zarzaparrilla

Elementos detectados, K, Fe y Zn.

Fuente: FODECYT

62

IV.4.9 SEPARACION DE LOS FLAVONOIDES Y SAPONINAS

POR CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA

Fig. 48 Empaquetamiento de la columna

Las columnas de vidrio fueron empacadas con sílica gel

Fig. 49. Colecta de Fracciones

Las fracciones se colectaron en frascos de vidirio color ambar

63

IV.4.9 EQUIPOS HPLC Y TFRX

Fig. 50 Cromatografo Líquido HPLC

Cromatógrafo Shimandzu prominence

Fig. 51 Espectrometro de Fluorescenica de Rayos X

64

PARTE V

INFORME FINANCIERO

65

AD-R-0013

DÉCIMA CONVOCATORIA

LINEA FODECYT Nombre del Proyecto: Caracterización química y análisis del contenido mineral de Smilax

domingensis y Phlebodium pseudoaureum

Número del Proyecto: 50-2006 Investigador Principal: Lic. Rodolfo Marineli Orozco

Monto Autorizado: Q292,580.20

Fecha de Inicio y Finalización: 01/06/2006 al 31/01/2008 18 meses PRÓRROGA AL 28/02/2008

Grupo Renglon Nombre del Gasto Asignacion

Presupuestaria

TRANSFERENCIA En Ejecuciòn

Menos (-) Mas (+) Ejecutado Pendiente de

Ejecutar

1 SERVICIOS NO PERSONALES

181 Estudios, investigaciones y proyectos de factibilidad Q 133,482.00 Q 119,858.00 Q 13,624.00

121 Publicidad y propaganda Q 1,000.00 Q 1,000.00

122 Impresión, encuadernación y reproducción Q 3,000.00 Q 3,000.00 133 Viáticos en el interior Q 6,400.00 Q 360.00 Q 6,040.00

163 Mantenimiento y reparación de equipo médico-sanitario y de Laboratorio Q 3,100.00 Q 3,100.00 Q -

2 MATERIALES Y SUMINISTROS 261 Elementos y compuestos químicos Q 20,000.00 Q 20,535.40 Q 16,000.00 Q 11,084.69 Q 4,379.91 262 Combustibles y lubricantes Q 1,000.00 Q 320.00 Q 680.00

66

264 Insecticidas, fumigantes y similares Q 1,000.00 Q 1,000.00 Q - 268 Productos plásticos, vinil y pvc Q 2,000.00 Q 908.00 Q 1,092.00 269 Otro productos químicos y conexos Q 16,000.00 Q 16,000.00 Q - 272 Productos de Vidrio Q 3,000.00 Q 1,750.13 Q 1,249.87

295 Útiles menores médico-quirúrgicos y de laboratorio Q 5,000.00 Q 3,635.40 Q 8,635.40 Q -

297 Útiles, accesorios y materiales eléctricos Q 3,000.00 Q 950.00 Q 2,050.00

3 PROPIEDAD, PLANTA, EQUIPO E INTANGIBLES

321 Maquinaria y equipo de producción Q 15,000.00 Q 15,000.00 Q -

323 Equipo, médico-sanitario y de Laboratorio Q 28,000.00 Q 61,000.00 Q 88,978.97 Q 21.03

329 Otras Maquinarias y Equipo Q 25,000.00 Q 25,000.00 Q - GASTOS DE ADMÓN. (10%) Q 26,598.20 Q 26,598.20 Q - Total Q 292,580.20 Q 80,635.40 Q 80,635.40 Q 259,443.39 Q 33,136.81 MONTO AUTORIZADO Q 292,580.20 Disponibilidad Q 32,136.81

(-) EJECUTADO Q 259,443.39 SUBTOTAL Q 33,136.81 (-) CAJA CHICA TOTAL POR EJECUTAR Q 33,136.81