ingenieria metabolica -agrobiotecnologia-

Departamento de Fisiología, Biología Molecular y CelularFacultad de Ciencias Exactas y Naturales

Universidad de Buenos Aires

AgrobiotecnologíaCurso 2009

Ingeniería metabólicaAlejandro Mentaberry

Agrobiotecnología

Ingenieríametabólica

SumarioFactores relevantes en ingeniería metabólica

Modificaciones en las rutas de síntesisde hidratos de carbono

Modificaciones en las rutas de síntesisde ácidos grasos

Referencias

Modificaciones en las rutas de síntesisde aminoácidos

Modificaciones en las rutas de síntesisde hormonas

Modificación genética del metabolismo secundario

Modificaciones en las rutas de síntesis de terpenoides

Modificaciones en las rutas de síntesis de flavonoides y antocianinas

Modificaciones en las rutas de síntesis de alcaloid es

Metabolitos secundarios

Factores relevantesen ingeniería metabólica

Agrobiotecnología


Factores relevantes en ingeniería metabólica

• Conocimiento de las rutas metabólicas involucradas

• Regulación de las enzimas implicadas

• Disponibilidad de sustratos y afinidades enzimática s

• Efectos fisiológicos

• Compartimentalización subcelular de la ruta . metabólica

• Localización de la expresión en determinados . tejidos u órganos

• Regulación de la ruta metabólica durante el desarro llo . y durante el fotoperíodo

Agrobiotecnología


• Producir más cantidad del producto deseado

- Aumentar el flujo de la ruta biosintética- Inhibir el catabolismo del producto- Aumentar el número de células productoras

• Producir menor cantidad del producto deseado

- Reducir el flujo de la ruta biosintética- Aumentar el catabolismo

• Expresión de nuevos componentes

- Completar rutas metabólicas a partir de precursores de la planta por inserción de genes heterólogos

- Crear nuevas rutas metabólicas mediante inserción de genes heterólogos

Estrategias para modificar el metabolismomediante manipulación genética

Agrobiotecnología

Ingeniería

metabólica

Las técnicas disponibles permiten prolongar (4,5), ramificar (6, 7)y bloquear(8) rutas metabólicas.El flujo metabólico puede también incrementarsepor expresión constitutivade enzimasclaves (1↑)o por neutralizaciónde los mecanismosde retroalimentación por acumulaciónde producto (2*).

GF

A

H B

C

D

E

1, 1↑↑↑↑

2, 2*

4

5

6 7

3

8

Modificaciónde rutasmetabólicas medianteingenieríagenética

Agrobiotecnología


Modificaciones en las rutasde síntesis de hidratos de carbono

Agrobiotecnología


Aplicaciones de la celulosa, el almidón y otros azúcares

Toneladas métricas (millones)

190 (2004)48,5 (2000)135 (2000)

Materias primas

CelulosaAlmidón

Sacarosa

Producción mundial de hidratos de carbono

CELULOSA PAPEL, TEXTILES, FIBRAS QUIMICAMENTE MODIFICADAS, COSMETICOS, EXPLOSIVOS.

ALMIDÓN PAPEL, CARTON, MATERIAL DE CONSTRUCCION, ADHESIVOS, PLASTICOS, LAVANDERIA, COSMETICOS, FARMACOS, BIOCOMBUSTIBLES .

AZÚCARES FARMACOS, TINTURAS, PINTURAS, ADHESIVOS, JABONES, POLVOS PARA LAVAR, PLASTIFICANTES.

PRODUCTO APLICACIÓN

• Cambios de composición

- Alto contenido de almidón

- Almidón con alto y bajo contenido de amilosa

- Almidones con distinto grado de ramificación

- Almidones libres de amilopectina

• Reorientación de las rutas biosintéticas

- Obtención de ciclodextrinas a partir de almidón

- Síntesis de fructanos a partir de sacarosa

- Obtención de azúcares-alcoholes

- Obtención de trehalosa

Posibles modificaciones al metabolismo de hidratos de carbono

Agrobiotecnología


Amilosa: glucano α-1-4. Amilopectina: glucano α-1-4 glucano α-1-6AGPasa: ADP-glucosa pirofosforilasa; GBSS: almidón sintetasa unida

al gránulo; SSS: almidón sintetasa soluble; BE: enzima ramificante

Estructura de gránulos de almidón A) maíz, B) papa y C) mandioca.

Tomado de: Visser and Jacobs, Trends in Biotechnology, 1993.

Estructuras de los polisacáridos componentes del almidón

Agrobiotecnología

Ingenieríametabólica AA BB CCAA BB CC

Adaptado de: Visser and Jacobs, Trends in Biotechnol ogy, 1993.

Rutas metabólicas de algunos hidratos de carbono

sacarosa

UDP-glucosa

glucosa glucosa-6-P

fructosa

ADP-glucosaglucosa-1-P

amilosa

amilopectina

ADP

AGPasa

SSS

ATP

ADPATP

GBSSPPiATP

SSSBE

8

6

UDP PPi UTP

7

Pi

1

2,3 Pi

2, 3, 4

5

1: invertasa

2: hexoquinasa

3: hexosa-6-fosfatasa

4: glucosa-fosfato isomerasa

5: fosfoglucomutasa

6: sacarosa sintetasa

7: UDP-glucosa pirofosforilasa

8: fosforilasa del almidón

AGPasa: ADP-glucosa pirofosforilasa

GBSS: almidón sintetasa unida al gránulo

SSS: almidón sintetasa soluble

BE: enzima ramificante

sacarosa

UDP-glucosa

glucosa glucosa-6-P

fructosa

ADP-glucosaglucosa-1-P

amilosa

amilopectina

ADP

AGPasa

SSS

ATP

ADPATP

GBSSPPiATP

SSSBE

8

6

UDP PPi UTP

7

Pi

1

2,3 Pi

2, 3, 4

5

1: invertasa

2: hexoquinasa

3: hexosa-6-fosfatasa

4: glucosa-fosfato isomerasa

5: fosfoglucomutasa

6: sacarosa sintetasa

7: UDP-glucosa pirofosforilasa

8: fosforilasa del almidón

AGPasa: ADP-glucosa pirofosforilasa

GBSS: almidón sintetasa unida al gránulo

SSS: almidón sintetasa soluble

BE: enzima ramificante

Sobreexpresiónde un gen mutadode ADP-glucosa pirofosforilasade Escherichiacoli en plantasde Solanumtuberosum

• Problema:

− La fructosa 1,6-bifosfato y el Pi actúan como efectores positivo y negativo respectivamente sobre las ADP-glucosa pirofosforilasas vegetales regulando la síntesis de almidón.

• Objetivo:

− Superproducción de almidón.

• Estrategia:

− Clonar el gen glgC16 (ADP-glucosa pirofosforilasa)de Escherichia coli mutada insensible a regulación por Pi.

• Resultados:

− La enzima transgénica se procesa correctamente y es activa en las células vegetales. Se transformó tomate, tabaco y papa vía Agrobacterium tumefaciens.

t-nosglgC16p35S CPT

Tomado de: Stark et al. Science, 1992.

Agrobiotecnología


Contenido de almidón en extractos de callos de tabaco transformadoscon un gen glgC16 de Escherichia coli. Las líneas 1 a 6 expresan el

transgen; la línea 13 corresponde a una planta control no transformada.

* El porcentaje de almidón se calculó a partir de la gravedad específica.

Tomado de: Stark et al. Science, 1992.

Sobreexpresiónde un gen mutadode ADP-glucosa pirofosforilasade Escherichiacoli en plantasde Solanumtuberosum

Agrobiotecnología


Tipode tubérculo

CTP-glg16

Control

% promediode almidón*

15,4

11,4

Líneavegetal

15

21

GravedadEspecífica

1,088

1,068

SD

0,012

0,010

Tipode tubérculo

CTP-glg16

Control

% promediode almidón*

15,4

11,4

Líneavegetal

15

21

GravedadEspecífica

1,088

1,068

SD

0,012

0,010

Porcentaje promedio de almidón en tubérculos de plantas transgénicas y control

Transformación de Solanum tuberosum con un gen antisentido de la enzima ramificante del almidón

• Problema:

- El almidón de alta amilosa tiene gran demanda en la industria por sus . propiedades funcionales. Existen pocos cultivos disp onibles que lo producen.

• Objetivo:

- Producción de almidón con alta amilosa.

• Estrategia:

- Se transformaron plantas de papa con secuencias an tisentido de los genes de las enzimas ramificantes del almidón (genes sbe A y sbe B ) obtenidas de papa.

• Resultados:

- El nivel de amilosa se incrementó. El Pi se increme ntó en más de 5 veces.

Tomado de: Schwall et al. Nature Biotechnology, 2000.

Línea Actividad SBE a Contenido de amilosa a Fósforo(U.g – 1 de peso fresco) (% de almi dón total) ( µµµµg g – 1 de almidón)

Tubérculo Hoja Colorimét rico Potenciométrico

260077,0464,58 ± 1,40,01 ± 0,020,13 ± 0,04208

300080,8462,01 ± 1,40,00 ± 0,030,05 ± 0,02202

260077,4559,37 ± 5,3 0,07 ± 0,070,32 ± 0,18 201

49825,5927,75 ± 1,910,05 ± 0,03 36,38 ± 1,07 Planta control

Línea Actividad SBE a Contenido de amilosa a Fósforo(U.g – 1 de peso fresco) (% de almi dón total) ( µµµµg g – 1 de almidón)


260077,0464,58 ± 1,40,01 ± 0,020,13 ± 0,04208

300080,8462,01 ± 1,40,00 ± 0,030,05 ± 0,02202

260077,4559,37 ± 5,3 0,07 ± 0,070,32 ± 0,18 201

49825,5927,75 ± 1,910,05 ± 0,03 36,38 ± 1,07 Planta control


260077,0464,58 ± 1,40,01 ± 0,020,13 ± 0,04208

300080,8462,01 ± 1,40,00 ± 0,030,05 ± 0,02202

260077,4559,37 ± 5,3 0,07 ± 0,070,32 ± 0,18 201

49825,5927,75 ± 1,910,05 ± 0,03 36,38 ± 1,07 Planta control

a La media y el desvío estándar fueron calculados a partir de cuatro muestras.

A Vista de gránulos de una planta control con luz polarizada.B Vista de gránulos de la línea transgénica 208 con luz polarizada.C Tratamiento a 95oC durante 5 minutos y tinción con iodo de almidón

de una planta control.D Tratamiento a 95oC durante 5 minutos y tinción con iodo de almidón

de la línea transgénica 208.

Microscopía de luz de gránulos de almidón

AA

DDCC

BB

Transformaciónde Solanumtuberosumcon un gen antisentido de la enzima ramificantedel almidón

Tomdado de: Schwall G., et al. Nature Biotechnology, 2000.Agrobiotecnología


Modificaciones en las rutas de síntesis de hidratos de carbono para obtener moléculas de utilidad económica

Tomado de: Goddijn and Pen, Trends in Biotechnology, 1995.

CITOSOLVACUOLA

almidón libre de amilosa

sacarosa

fructanos

ADP-glucosaglucosa-6-fosfato

glucosa-1-fosfato

UDP-glucosa

triosa-fosfato

fructosa-6-fosfato

sacarosa

manitol

pinitol

mio-inositol

GLUCOLISIS

amilosaamilopectina

almidón

ciclodextrinas

hexosa-fosfato

triosa-fosfato

PLASTIDOPi

Pi

CO2

trehalosaCITOSOL

VACUOLA

almidón libre de amilosa

sacarosa

fructanos

ADP-glucosaglucosa-6-fosfato

glucosa-1-fosfato

UDP-glucosa

triosa-fosfato

fructosa-6-fosfato

sacarosa

manitol

pinitol

mio-inositol

GLUCOLISIS

amilosaamilopectina

almidón

ciclodextrinas

hexosa-fosfato

triosa-fosfato

PLASTIDOPi

Pi

CO2

trehalosa

1

2

3

4

5

6

1. Levano sacarasas y fructosil transferasas2. Manitol-1P-deshidrogenasa 3. Mioinositol-O-metil transferasa 4. Trehalosa sintetasa 5. Antisentido de almidon sintetasas6. Ciclodextrin-glicosil transferasas

• Ciclodextrinas

- Oligosacáridos cíclicos α-1,4 compuestos por seis (ciclodextrina α), siete (ciclosdextrina β)u ocho (ciclodextrina γ) unidades piranósicas.

- De estructura cilíndrica. Se usan como portadores de moléculas de interés o para removercompuestos indeseables.

- La expresión de ciclodextrin glicosil transferasa de Klebsiella pneumoniae en amiloplastosde papa permitió obtener ciclodextrinas α y β.

- El nivel de expresión alcanzado es de 0,001-0,01% del contenido total de almidón.

• Fructanos

- La expresión de levano sacarasa de Bacillus subtilis permitió acumular fructanoen tabaco y papa.

- El nivel de expresión alcanzado en tubérculos de papa es de 1-7% del peso secode los microtubérculos y de 1-30% en hojas.

• Alcoholes azúcares

- La expresión del gen de manitol-1-fosfato deshidrogenasa de Escherichia coli en tabaco permitió la síntesis de manitol en hojas y raíces.

- La expresión del gen de myo-inositol O-metil transferasa de Mesembryanthemun crystallinumpermitió la síntesis de pinitol en tabaco.

Otros hidratos de carbono expresados en plantas

Transformación de plantas de Solanum tuberosumcon genes de fructosiltransferasas y levanosacarasas

• Problema:

- Los fructanos y los levanos se producen en algunos órganos de las plantas y en microrganismos en pequeñas cantidades.

• Objetivo:

- Producción de fructanos y levanos en tubérculos y raíces.

• Estrategia:

- Introducción de genes bacterianos o de hongos en plantas de papa yremolacha.

AIMV cpy sac B o ftf nosAIMV cpy sac B o ftf t-nos35S 35S

35Sl35S: Promotor doble del transcripto de 35S del CaMV; AIMV: enhancer traduccional del virus AlMV;cpy: señal de transporte a vacuola de carboxipeptidasa Y de levadura; sacB: levano sacarasa de Bacillus subtilis;

ftf: fructosiltrasferasa de Streptococcus mutans; nos: terminador de nopalina sintetasa de A. tumefaciens

Tomado de: van der Meer et al. The plant cell, 1994.

Comparación de los niveles de almidón y fructano en microtubérculos de plantas transgénicasy controles

WT1 a WT4: Plantas controles; TP26, TP15, TP25 y TP11: Plantas transformadas con el gen ftf (Streptococcus mutans); KP24, KP1, KP18, KP25, KP29 y KP15: Plantas transformadas con el gen sacB (Bacillus subtilis)

Tomado de :van der Meer et al. The plant cell, 1994.


Contenido de carbohidratos en hojas en diferentes e stadíos de plantas transgénicas y control

El nivel de carbohidratos totales se determinó en hojas jóvenes (y), de edad intermedia (m) y viejas (o; casi senescentes) obtenidas de plantas control (WT) y de la línea KP29 que expresa el gen sacB de Bacillus subtilis

Comparación de los contenidosde almidón y de fructano en hojas.

Comparación de carbohidratos neutrosno estructurales totales (almidón,

glucosa, sacarosa, fructosa y fructano).


Tomado de: van der Meer et al., The Plant Cell, 1994.

Transformaciónde Beta vulgariscon el gen 1-sstde la fructosil-transferasa de Helianthustuberosus

Planta joven de remolachano transformada

• El gen de la fructosiltransferasa1-sst de Helianthus tuberosus(Topinambo o Papa de Jerusalem) fue introducido en plantas de Beta vulgaris .

• Esta enzima convierte la sacarosa en una mezcla de fructanos de bajo peso molecular (GF2, GF3 y GF4).

Planta de remolachatransformada con el gen 1-sst

Tomado de: Sevenier et al., Nature Biotechnology, 1998.

Agrobiotecnología


Transformaciónde remolachacon el gen 1-sstde la fructosil-transferasa de Helianthustuberosus

Agrobiotecnología

IngenieríaMetabólica

a) Remolacha no transformada; b) Línea transformadacon el gen 1-sst ; c) Mezcla de 20 mg/mL de glucosa

(G), fructosa (F), sacarosa (S), rafinosa (R), 1-kesto sa (GF2), nistosa (GF3) y fructofuranosil nistosa (GF4)

Cromatografía de intercambio aniónico de altapresión para detectar carbohidratos solubles

Tiempo (min)

Res

pues

ta P

AD

(un

idad

es a

rbitr

aria

s

Extractos de bulbo de raíz

Extractos de hojas

0 5 10 15 20 0 5 10 15 20

Modificaciones en las rutas de síntesisde ácidos grasos

Agrobiotecnología


Tomado de: FAO Cálculos Observatorio Agrocadenas

Producción mundial de los principales aceites y grasas(en miles de toneladas)

Puesto

1

23

4

56

7

89

1011

12

1314

15

1617

18

1920

21

22

Tipo de aceite

Aceite de soja

Aceite de palma Aceite de colza

Aceite de girasol

Manteca y gheeAceite de maní

Aceite de semilla de algodón

Aceite de cocoAceite de almendra de palma

Aceite de oliva virgenAceite y grasas hidrogenadas

Aceite de maíz

Aceite de sésamoAceite de pescado

Aceite de linaza

Aceite de ricinoOtros aceites vegetales

Aceite de oliva residual (orujo)

Manteca de karitéSebo de origen vegetal

Aceite de nueces de tung

Aceite de mostaza

Total

1990

15.386

11.4458.178

5.659

7.7953.838

3.796

3.3591.674

1.5121.940

1.323

6671.289

667

461420

138

145116

76

54

69.936

1994

17.819

14.7239.818

7.525

6.6274.783

3.690

3.0161.996

1.8062.417

1.625

6091.502

686

384454

173

166119

81

51

80.072

1998

23.123

18.30411.538

9.013

6.9315.400

3.620

3.4742.324

2.4002.262

1.911

737878

694

448442

217

176120

80

55

94.147

2002

25.790

25.08412.445

8.178

7.9255.348

4.003

3.5602.890

2.4462.503

2.017

7540

679

525454

217

184125

88

61

105.274

Part (%)

24,13

21,8912,48

8,75

7,325,00

3,78

3,382,70

2,482,37

1,95

0,750,71

0,69

0,500,45

0,21

0,180,12

0,08

0,06

100 %

Puesto

1

23

4

56

7

89

1011

12

1314

15

1617

18

1920

21

22

Tipo de aceite

Aceite de soja

Aceite de palma Aceite de colza

Aceite de girasol

Manteca y gheeAceite de maní

Aceite de semilla de algodón

Aceite de cocoAceite de almendra de palma

Aceite de oliva virgenAceite y grasas hidrogenadas

Aceite de maíz

Aceite de sésamoAceite de pescado

Aceite de linaza

Aceite de ricinoOtros aceites vegetales

Aceite de oliva residual (orujo)

Manteca de karitéSebo de origen vegetal

Aceite de nueces de tung

Aceite de mostaza

Total

1990

15.386

11.4458.178

5.659

7.7953.838

3.796

3.3591.674

1.5121.940

1.323

6671.289

667

461420

138

145116

76

54

69.936

1994

17.819

14.7239.818

7.525

6.6274.783

3.690

3.0161.996

1.8062.417

1.625

6091.502

686

384454

173

166119

81

51

80.072

1998

23.123

18.30411.538

9.013

6.9315.400

3.620

3.4742.324

2.4002.262

1.911

737878

694

448442

217

176120

80

55

94.147

2002

25.790

25.08412.445

8.178

7.9255.348

4.003

3.5602.890

2.4462.503

2.017

7540

679

525454

217

184125

88

61

105.274

Part (%)

24,13

21,8912,48

8,75

7,325,00

3,78

3,382,70

2,482,37

1,95

0,750,71

0,69

0,500,45

0,21

0,180,12

0,08

0,06

100 %

Los símbolos sólidos indican dobles enlaces ( ) y grupos funcionales ( ; hidroxilo). Los círculos indican el largo de la cadena carbonada.

Tipos deácidos grasospresentesen aceites vegetales

Adaptado de: Töpfer and Martini W. Agricultural Biotechnology, 1998.

Agrobiotecnología


22

18

16

14

12

10

erúcico

linolénico

linoleico

ricinoleico

oleico

petroselínico

esteárico

palmítico

mirístico

laurico

cáprico caprílico

8

COOH

1: ∆∆∆∆4-palmitoil-ACP desaturasa

2 y 2’: ββββ-cetoacil-ACP sintetasas

3: acil-ACP tioesterasa

4: ∆∆∆∆9-estearoil-ACP desaturasa

5: oleoil CoA elongasa

6: ∆∆∆∆12-oleoato desaturasa

7: ∆∆∆∆12-oleoato hidrolasa

8: ∆∆∆∆15-linolato desaturasa

9: ∆∆∆∆6-linolato desaturasa

Rutas biosintéticas de ácidos grasos

Adaptado de: Töpfer and Martini W. Agricultural Biotechnology, 1998.

plástidoacetil-CoA + malonil-CoA

C8:0

C12:0

C14:0

C16:0

C10:0

C18:0

∆∆∆∆9C18:1

∆∆∆∆4C18:1∆∆∆∆4C16:1

caprilato

caprato

laurato

miristato

palmitato

ricinoleatolinolatoerucato

petroselinato

oleato

estearato

3

3

3

3

3

3

33

1

2

4

α-linolenato γ-linolenato

CITOPLASMA

5 7

6

98

plástidoacetil-CoA + malonil-CoA

C8:0

C12:0

C14:0

C16:0

C10:0

C18:0

∆∆∆∆9C18:1

∆∆∆∆4C18:1∆∆∆∆4C16:1

caprilato

caprato

laurato

miristato

palmitato

ricinoleatolinolatoerucato

petroselinato

oleato

estearato

3

3

3

3

3

3

33

1

2

4

α-linolenato γ-linolenato

CITOPLASMA

5 7

6

98

2’

Composición de ácidos grasos de los aceites comestibles más comunes

Tomado de: Broun et al., Annu. Rev. Nutr., 1999.

4-110-1,5<2,00~0,318:3

<1,00<1,0<0,10,7-1,420:0

<1,00-0,500020:1

<0,50<0,50~0,222:0

00041-56012:0

0003,2-15010:0

0003,4-1508:0

000<1,206:0

00-0,1000,1-0,217:0

<0,50<0,500,1-0,416:1

7,0-147-17,88,0-194,2-1223,6-30,516:0

<0,10>0,113-230,2-0,1614:0

19-3043,7-78,219-503,4-1233,2-38,618:1

1,4-5,52,2-40,5-4,01,0-4,730,2-36,518:0

0

5-32,3

Oliva

0<0,500 24:0

44-6234-620,9-3,72,2-4,818:2

Soja Maíz Nuez Manteca de cacaoÁcido graso

Composición porcentual

4-110-1,5<2,00~0,318:3

<1,00<1,0<0,10,7-1,420:0

<1,00-0,500020:1

<0,50<0,50~0,222:0

00041-56012:0

0003,2-15010:0

0003,4-1508:0

000<1,206:0

00-0,1000,1-0,217:0

<0,50<0,500,1-0,416:1

7,0-147-17,88,0-194,2-1223,6-30,516:0

<0,10>0,113-230,2-0,1614:0

19-3043,7-78,219-503,4-1233,2-38,618:1

1,4-5,52,2-40,5-4,01,0-4,730,2-36,518:0

0

5-32,3

Oliva

0<0,500 24:0

44-6234-620,9-3,72,2-4,818:2

Soja Maíz Nuez Manteca de cacaoAcido graso

Composición porcentual

C 6:0 caproico; C 8:0 caprílico; C 10:0 cáprico; C 12:0 láurico; C 14:0 mirístico; C 16:0 palmítico; C 16:1 palmitoleico; C17:0 margárico; C 18:0 esteárico; C 18:1 oleico; C 18:2 linoleico;C 18:3 linolénico; C 20:0 araquídico; 20:1 gadoleico; C 22:0 behénico; C24:0 lignocérico

Acidos grasos no comestibles de semillas oleaginosas

Acido graso tipo

Saturado de cadena corta

Monosaturado cadena larga

ω-hidroxilado

Poliinsaturado

Conjugado

Dicarboxílico

Ésteres de ceras

Epoxi

Ejemplo

C12-láurico

C22:1-erúcico

C18:1-OH-ricinoleico

C18:3-α-linolénico

C18:3 conjugado

C6-adípico

C20, C22 éster

C18, C20 epoxi

Fuente real o potencial

cocotero, palma, Cuphea,Umbelliferae

Cruciferae, Meadowfoam,Lunaria

poroto de ricino

semilla de lino, Salvia hispanica

tung, caléndula

Umbelliferae

Jojoba

Vernonia, Crepis palaestina

• Obtención de ácidos grasos saturados

• Obtención de ácidos grasos monosaturados

• Obtención de ácidos grasos de cadena media

• Obtención de ácidos grasos con distintas sustituciones

Modificación del metabolismo lipídico

Agrobiotecnología


• Problema:

- Los aceites con alto contenido de ácidos grasos saturados como palmítico y esteárico tienen gran demanda industrial. La mayoría de las plantas producen aceites con bajo contenido de ácidos grasos saturados.

• Objetivo:

- Producción de semillas de Brassica napus y Brassica rapa con altos niveles de ácidos grasos saturados.

• Estrategia:

- Introducción de genes antisentido de la estearoil-ACP desaturasa de Brassicarapa.

napin 3´35S npt II tml 3´ napin 5´ anti-desat anti-desatACP 5´ ACP 3´BI BD

Construcción con dos copias en antisentido del gen de la estearoil-ACP desaturasa. napin 5’ y napin 3’: promotor y terminador de napina; ACP 5’ y ACP 3’: promotor y terminador de la proteína transportadora de ácidos grasos.

Tomado de: Knutzon. et al., PNAS, 1992.

Transformación de Brassica con un genantisentido de la estearoil-ACP desaturasa

Composición de ácidos grasos de dos clases de semil las obtenidas de plantas de la línea transgénica 3242-T-1 de Brassica rapa.

Transformación de Brassicacon un gen antisentidode estearoil-ACP desaturasa

Tomado de: Knutzon et al., PNAS, 1992.

Agrobiotecnología


Por

cent

aje

Transformación de Brassica con un gen antisentidode estearoil-ACP desaturasa

Contenido de estearatoy de estearoil-ACP desaturasaen semillas derivadas de la línea transgénica 3242-T-1y de plantas controlde Brassica rapa

Las barras representan el porcentaje de estearato de cada semilla individual. Debajo de los graficos de barras se observan los Western blotscorrespondientes revelados con un anticuerpo contra estearoil-ACP desaturasa.

Tomado de: Knutzon et al., PNAS, 1992.

21161913

3242609031080

4,44,66,76,4

10,612,116,423,5

Transformaciónde Arabidopsis thaliana conel gen de 12:0 acil-ACP-tioesterasa de Umbellulariacalifornica

• Problema:- Los ácidos grasos saturados de cadena media son utilizados

en la industria cosmética. No se los encuentran en grandes cantidades en semillas de cultivos extensivos.

• Objetivo:- Producción de semillas de Arabidopsis thaliana con altos

niveles de ácidos grasos saturados de cadena media.

• Estrategia:- Se transformó Arabidopsis thaliana con un gen de la 12:0

acil-ACP-tioesterasa de Umbellularia californica, que interrumpe la elongación para producir ácido láurico .

Planta

21

1619

13

Act. TE /semilla (mU)

324

260903

1080

12:0 /semilla(nmol)

4,4

4,66,7

6,4

12:0 (% molde AG totales)

10,6

12,116,4

23,5

Acumulación de ácido láurico en líneas individuales d e Arabidopsis thaliana transformadas con el gen de la 12:0 acil-ACP-tioeste rasa

Tomado de: Voelker et al., Science, 1992.

Agrobiotecnología


- Se observó un alto contenido de ácido láurico con descenso concomitante de algunos ácidos grasos de cadena larga.

Se determinó la composición de ácidos grasos por cromatografía gas-líquido en 100 semillas maduras de cada planta. Barras verdes:

Plantas controles. Barras violetas: Línea transgénica 3828-13.

• Resultados:

Tomado de: Voelker et al., Science, 1992.

Transformaciónde Arabidopsis thaliana conel gen de 12:0 acil-ACP-tioesterasa de Umbellularia californica

Agrobiotecnología


8:0 C10:0 C12:0 C14:0 C16:0 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 C22:1

Colza [+ a. erúcico] 3 1 17 14 9 50Colza [–a. erúcico] [Canola] 4 2 62 22 10 0ClTEg100 1 3ClTEg200 7 15ChTE 11 27UcTE 50CtTE 25Bc∆∆∆∆9DES 0.7Bc∆∆∆∆9DESas 40Bn∆∆∆∆12DES(fad2)as 83Bn∆∆∆∆12DES(fad2)as X IMC 129 88ScKAS elong X Canola 20

• El aceite producido por Brassica napus posee en un alto contenido de ácido erúcico que no resulta adecuado para uso alimentario.

• Con la inhibición de la expresión de la oleoil-CoA -elongasa se redujo a 0 la cantidad de ácido erúcico, con el consecuente aumento de ácido oleico. El aceite obtenido resulta comestible y fue denominado aceite de canola ( canadian oil ).

Alteraciones porcentuales en el perfil de ácidos grasos de Brassica napus

ClTEg100 y ClTEg200: genes de acil-[ACP] tioesterasa de Cuphea lanceolata; ChTE: gen de acil-[ACP] tioesterasa de Cuphea hookeriana; UcTE: gen de acil-[ACP] tioesterasa de Umbellularia californica; CtTE: gen de acil-[ACP] tioesterasa de Carthamus tinctorius; Bc∆9DES: gende ∆9 desaturasa de Brassica rapa (campestris); Bc∆9DESas: gen antisentido de ∆9 desaturasa de Brassica rapa; Bn∆12DES(fad2)as: genantisentido de ∆12 desaturasa de Brassica napus; Bn∆12DES(fad2)as x IMC129: planta Bn∆12DES(fad2)as cruzada con el mutante IMC129

de colza; ScKAS elong x Canola: gen de la β-cetoacil-[ACP] sintetasa de la elongasa de Somodnsia chinensis cruzada con Canola

Adaptado de: Töpfer and Martini. Agricultural Biotechnology, 1998.

Modificaciones en las rutasde síntesis de aminoácidos

Agrobiotecnología


1. Alteración de la regulación de la ruta de síntes is de aminoácidos esenciales.

2. Expresión tejido específica de proteínas con mejor composición aminoacídica.

3. Modificación de la secuencia de proteínasde reserva.

Muchas semillas, frutas o turbérculos que se utilizan para alimentación animal o humana son deficientes en aminoácidos esenciales. En particular, se busca incrementar el contenido de lisina en los cereales y el de metionina en las leguminosas.

Existen diversas estrategias para cambiar la composición aminoacídica :

Posibles estrategiaspara modificar el contenido de aminoácidos esenciales

Agrobiotecnología


Modificación de la biosíntesis de aminoácidos esenciales para eliminar la retroalimentación por acumulación de producto

Tomado de: Tabe and Higgins, Trends in Plant Science, 1998.

aspartatoaspartatokinasa

inhibición por feedback inhibición por

feedback

DHDPS

múltiples pasos enzimáticos

treonina

isoleucina metioninalisina

DHDPS: dihidrodipicolinato sintetasa



feedback

DHDPS


treonina





feedback

DHDPS


treonina



La síntesis de lisina, treonina, isoleucina y metio nina ocurre a nivel del cloroplasto

Transformación de soja con los genes DHDPS de Corynebacterium (dapA) y AK de Escherichia coli (lysC)

• Problema:

- En soja y en colza el contenido de lisina es del 7,2% y 12%, respectivamente

• Objetivo:

- Incrementar el contenido de lisina en semillas de soja y colza por la introducción de genes de enzimas insensibles a la regulación por lisina.

• Estrategia:

- Utilizar los genes DHDPS de Corynebacterium glutamicum (dapA) y AK mutado de Escherichia coli (lysC) insensibles a regulación.

• Resultados:

- La expresión del gen dapA produce un incremento de lisina libre unas 100 veces mayor en canola y de hasta 25% más en soja. La expresión de ambos genes, aumentó varios cientos de veces los niveles de lisina libre y hasta 5 veces el total de lisina en semillas de soja.

Pv 3´35S gus tnos Pv 5´ Pv 5´ Pv 3´dapActs cts lysC

Tomado de: Falco et al., Biotechnology, 1995.Pv 5’ y Pv 3’: promotor y terminador de faseolinacts: péptido señal de transporte al cloroplasto

Se extrajeron los aminoácidos libres de 10 semillas segregantes R1 para cada línea transgénicay se determinó su composición. Se compara la línea A2396 (barras sólidas) con la línea A2396 (barras vacías). Ambas líneas expresan los dos transgenes. Se indica la determinación de GUS, DHDPS y AK.

Contenido de lisina libre en semillas individuales de soja

Transformación de soja con los genes DHDPS de Corynebacterium (dapA) y AK de Escherichia coli (lysC)

Tomado de: Falco et al., Biotechnology, 1995.

Los nivelesde aminoácidos sulfurados en todas las semillas mencionadas varían entre diferentes variedades;sólo se mencionan las más relevantes en el contextode modificar la composición de proteínas vegetales.

Contenido de metionina de distintas especies y modificación de la composición proteica en cultivos de interés

Tomado de: Tabe and Higgins, Trends in Plant Science, 1998.

No determinada

18

Proteína tipo Proteína Contenido de Conte nido de metionina metionina

( g 100 . g-1 proteína)a (% de residuos )

Proteínas de Proteína de arveja 0,8 semilla Proteína de lupino 0,6 No determinada

Proteína de soja 1,2 No determinada

Proteínas Zeína de maíz de 21 kDa 37 28 ricas en Albumina 2S B. excelsa 23 metionina Albúmina de girasol 20 16

Cultivo Gen introducidoIncrementode proteína

Incrementode metionina

Maíz Zeína rica en medionina de 10 kDa 0,9 % 30 %

Tabaco Albúmina 2S de B. excelsa 8 % 30 %

Canola Albúmina 2S de B. excelsa 4 % 33 %

Soja Albumina 2S de B. excelsa 10 % 50 %

Haba Albumina 2S de B. excelsa 4,8 % 100 %

Lupino Albúmina 2S de H. annus 5 % 100 %

Arveja Albúmina 2S de H. annus 2-5 % -----

Garbanzo Albumina 2S de H. annus 2-5 % -----

Niveles de albúmina 2S acumulados en semillas de canoladeterminados por ELISA a distintos tiempos luego de la floración.

• La albúmina 2S de B. excelsa contiene 18,8 % de metionina

- El gen 2S se expresó bajo un promotor específico de semilla(promotor de faseolina) y se introdujo en plantas de canola vía Agrobacterium.

- Se muestra la acumulación de albúmina 2S durante el desarrollo de las semillas.

- Se extrajeron las proteínas solubles totales a los 19, 22, 26, 29, 32, 36 y 40 días luego de la antésis y se las analizó por PAGE y ELISA.

Transformación de Brassica napus con el gen de la albúmina 2S de Bertholletia excelsa (nuez del Brasil)

% d

e al

bum

ina

2S

de n

uez

del B

rasi

l

Los números entre paréntesis corresponden a las desviaciones estándar. La columna pARC12 muestra los datos para una planta control transformada con el vector vacío. Las columnas B10-6 y B13-1 muestran datos de líneas transgénicas que expresan el gen de la albúmina 2S de B. excelsa.

• Las semillas de canola transgénica acumulan 1,7- 4,0 % de albumina 2S de B. excelsa y pueden contener hasta 33 % más metionina que los controles

• Las semillas de tabaco contienen aproximadamente 16 ,5 % más de metionina que los controles

3,52(0,39)

2,94(0,12)

2,64(0,14)

metionina

B13-1B10-6pARC12

3,60(0,23)

Tob

3,54(0,13)

pARC12

4,47(0,31)

3

4,31(0,31)

3,95(0,14)

4,74(0,16)

metionina

673432

Los números entre paréntesis corresponden a las desviaciones estándar. Tob y PARC12 representan proteínas de plantas control (tabaco no transformado o transformado con el vector vacío). Las columnas 3, 32, 34 y 67 corresponden a líneas transgénicas de tabaco que expresan la albúmina 2S de B. excelsa.

Transformación de Brassica napus con el gen de la albúmina 2S de Bertholletia excelsa (Nuez del Brasil)

Transformación de Solanum tuberosum con el gen de laalbúmina AmA1 de semillas de Amaranthus hypocondriacus

• Problema:

- El valor nutritivo de Solanum tuberosum está limitado por el contenido de aminoácidos sulfurados, lisina y tirosina.

• Objetivo:

- Introducir una proteína con una composición balanceada en términos de aminoácidos esenciales.

• Estrategia:

- Introducir el gen AmA1 de la albúmina de Amaranthus hypocondriacus enSolanum tuberosum. Se expresó el gen en forma constitutiva o tubérculo específica (pSB8 y pSB8G respectivamente).

• Resultados:

- Se observaron incrementos en prácticamente todos los aminoácidos. Las plantas transgénicas contienen más proteína en los tubérculos en comparación con los de las plantas control.

nptII tnospnos AmA135S tnosBD BI

nptII tnospnos AmA1pGBSS tnosBD BI

pSB8

pSB8G

Tomado de: Chakraborty et al., PNAS, 2000.

Composición de aminoácidosde tubérculos de las plantas

transgénicas de papa pSB8G-5 y pSB8-3en comparación con la de las plantas

controles no transformadas.

Transformación de plantas de papaCon el gen AmA1 de Amaranthus hypocondriacus. Características

de los tubérculos de plantas transgénicas (derecha) y controles (izquierda).

El histograma muestra la cantidad de veces en que se incrementó el contenido de cada aminoácido en las plantas transgénicas respecto de los controles.

Transformación de Solanum tuberosum con el gen de laalbúmina AmA1 de semillas de Amaranthus hypocondriacus

Tomado de: Chakraborty et al., PNAS, 2000.

Modificaciones en las rutasde síntesis de hormonas

Agrobiotecnología


Tomado de: Stearns and Glick, Biotechnology Advances, 2003.

Modificacionesgenéticaspara controlarla síntesisdel etileno

metionina

S-adenosil metionina

ácido 1-aminociclopropano-1-carboxílico(ACC)

etileno

ACC sintasa

ACC oxidasaACC deaminasa(Pseudomonas spp )

αααα-cetobutirato + NH3

Agrobiotecnología


Transformación de especies de interés para controlar la síntesis de etileno

• Problema:

- El tiempo requerido para la comercialización de flores y frutos se reduce debido a la producción de etileno que acelera su maduración y/o senescencia.

• Objetivo:

- Inhibir la producción de etileno para retardar la maduración y la senescencia.

• Estrategia:

- Introducir el gen antisentido de la ACC-sintetasa o de la ACC-oxidasa, o el gen de la ACC-deaminasa de Pseudomonas para reducir la síntesis de etileno. Se transformaron melón, tomate, clavel, brócoli y tabaco con dichas construcciones.

• Resultados:

- En melones se obtuvo una inhibición en la producción de etileno. Las plantas controles produjeron hasta un 340% más de etileno que las plantas transgénicas.

tnos35S npt II tnos 35s´ ACC-oxidasa

Tomado de: Stearns and Glick, Biotechnology Advances, 2003.Agrobiotecnología


AA

BBBB

Melones obtenidos a partir de plantas transformadas con el gen antisentido de la ACC-oxidasa de manzana (AS1)y control a los15 d postcosecha

A: cortes de melones control y transgénico AS1B: Aspecto externo de melones

control y transgénico AS1

Plantas de claveltransformadas con un gen antisentido de la ACC oxidasa

Planta transgénica (izquierda) Planta control (derecha).


Agrobiotecnología


A: fruto de planta control mantenida en aire por 60 días. B: fruto de planta transgénica mantenida en aire por 78 días. C: fruto de planta transgénica mantenida en atmósferade 10 ppm de etileno por 78 días. D: frutos de planta no transformada mantenidos en aire. E: frutos de planta transgénica mantenidos en aire. F: frutos de planta transgénica mantenidos en atmósfera de 10 ppm de etileno. G y H: fruto de planta no transformaday de planta transgénica respectivamente mantenidos a 20oC en aire por 138 días.

Genes antisentido de ACC sintetasa

Genes antisentidoACC oxidasa

Expresión de un gen de ACC deaminasa

Distintas vías utilizadas para lograr la inhibición reversible de la maduración de tomate

Tomado de: Theologis, Current Opinion in Biotechnology, 1994.


Agrobiotecnología


A CB

FED

HG

• Problema:

- Las flores comienzan su senescencia una vez polinizadas.

• Objetivo:

- Evitar la senescencia por la inducción de síntesis de citoquininas.

• Estrategia:

- La isopentenil transferasa es la enzima limitante en la síntesis decitoquininas. Su sobreexpresión durante la senescencia incrementael nivel de citoquinina y retrasa este proceso.

Transformación de Petunia hybrida con el gen de isopentenil transferasa bajo un promotor específico de senescencia

tnosiptpSAG12

Tomado de: Chang et al., Plant Physiology, 2003.

Transformación de Petunia hybrida con el gen de isopentenil transferasa bajo un promotor específico de senescencia

• Resultados:- Las líneas transformadas retrasaron su senescencia de las flores

de 6 a 10 días luego de la polización respecto a las controles.

Tomado de: Chang et al., Plant Physiol., 2003.

Flores controles sin transformar

0 24 48 72 96 120Flores psag12-ipt

0 24 48 72 96 120

144 168 192 216 240 264

Flores controles sin transformar

0 24 48 72 96 120Flores psag12-ipt

0 24 48 72 96 120

144 168 192 216 240 264

Metabolitos secundarios

Agrobiotecnología

Ingeniería

metabólica

La producción de metabolitos secundarios:

- No es necesaria para el crecimiento y desarrollo de la planta per se y no forma parte de las principales estructuras celulares.

- Distribuidos en forma especie-específica.

- Depende de condiciones determinadas .de control hormonal.

- Es paralela al desarrollo de tejidos especializado s .y órganos (raíces, tallos, hojas y glándulas).

- La biosíntesis y acumulación suele estar .. fuertemente compartimentalizada a nivel . intracelular, celular, de tejidos y de órganos.

- La biosí ntesis puede ser inducida por estreses . abióticos ( radiación UV, presión osmó tica, metales . pesados, etc.) bióticos (elicitores microbianos: . oligosacáridos, proteínas, metiljasmonato, etc).

Agrobiotecnología

Ingeniería

metabólica

Los metabolitossecundariosno son esencialesper se paralas funciones vitalesde las plantas

Propiedades biológicas de importancia ecológica

- Protección contra herbívoros y microorganismos:fitoalexinas y fitoanticipinas

- Atracción de polinizadores y animales que dispersan semillas: pigmentos y esencias volátiles

- Agentes alelopáticos: aleloquímicos que influyen en la competencia entre diferentes especiesde plantas

- Estreses abióticos: pigmentos y osmolitos que protegen de la radiación UV, presión osmótica, toxicidad de metales pesados, etc.

Los metabolitossecundariosson necesariospara la supervivenciaen el ecosistema

Agrobiotecnología

Ingeniería

metabólica

El metabolismo secundario regulamuchas de las relacionesde la planta con el medio circundante

Concepto general

Las plantascomo fuentede metabolitos secundarios de interés comercial

Agrobiotecnología

Ingeniería

metabólica

• Potencial:

- 75% de las nuevas estructuras químicas descubiertas provienen de las . plantas.

- Sólo se tiene buen conocimiento de 5.000 de las 250.000-300.000 . especies vegetales que se creen existentes en el planeta.

- 25% de los medicamentos de las industrias farmacéuticas son de origen . vegetal.

- 75% de la población mundial utiliza la medicina tradicional que consiste

. principalmente en el uso de extractos provenientes de plantas.

• Metabolitos secundarios de importancia económica:

- Compuestos que determinan la calidad de los alimentos (color, sabor y . aroma).

- Compuestos que determinan la calidad de las plantas ornamentales . (color y aroma).

- Compuestos utilizado en la producción comercial de colorantes, . fragancias e insecticidas.

- Compuestos de uso medicinal con actividad antioxidante y antitumoral.

Ejemplos de terpenoidesproducidosen plantas Se conocen

unos 25.000 terpenoidespresentesen plantas

Agrobiotecnología

Ingeniería

metabólica

AzadiractinaA ( antinutriente de insectos) αααα-Ecdisona

(disruptor de la muda de insectos)

Ecogenina( aglicona de una saponina;

detergente)

Digitoxigenina( aglicona de digitoxina; tratamiento

de congestiones cardíacas)

Taxol( droga anticancerígena)

Forbol( irritante y co-carcinogénico)

AzadiractinaA ( antinutriente de insectos)

Costunólido( repelente de insectos ;

antinutriente de mamíferos)

Ejemplos de fenólicos derivados de fenilpropanoides

Unos 8.000 fenólicosse forman en las plantas por las rutas del ácido shikímico o del malonato/acetato

Granos de café

Corteza de canela

cinnamaldehido

ácido clorogénico

gingeroles

Rizoma de ginger

Pimiento rojo y negro

piperina

norhidrocapsaicina

capsaicina

Agrobiotecnología

Ingeniería

metabólica

Ejemplos de alcaloides producidos en vegetales

Se han caracterizado unos 12.000 alcaloides en plantas

Hyoscyamus niger Atropina Rauwolfia serpentina Ajmalina

Cocaína

CafeínaCoffea arabicaErythroxylon coca

Cinchona officinalis

Quinina

Hyoscyamus niger Atropina Rauwolfia serpentina Ajmalina

Cocaína

CafeínaCoffea arabicaErythroxylon coca

Cinchona officinalis

Quinina

Algunas de las medicinas más importantes o sus precursores derivados de plantas y sus ventas en el 2002

Nombre Tipo Origen Uso terapéutico Alcaloides: ventas proyectadas para el 2002: 4045 m illones US$ Hiosciamina, escopolamina

Alcaloides del tropano Solanaceas Anticolinérgicos

Camptotecina Alcaloide indólico Camptotheca acuminata

Antineoplásico

Capsaicina Alcaloide fenilalquilamino Capsicum spp. Analgésico local Codeína, morfina Alcaloide opiáceo Papaver somniferum Analgésico Colchicina Alcaloide isoquinolinico Colchicum autumnale Antigota Galantamina Alcaloide isoquinolinico Leucojum aestivum Inhibidor coliesterasa Pilocarpina Alcaloide imidazólico Pilocarpus jaborandi Colinérgico Nicotina Alcaloide pirrolidínico Nicotiana spp. Terapia antitabaco Quinina Alcaloide quinolínico Cinchona spp. Antimalárico Quinidina Alcaloide quinolínico Cinchona spp. Cardiotónico Reserpina Alcaloide indólico Rauwfolia serpentina Antihipertensivo, psicotrópico Vinblastina, vincristina

Alcaloide indólico Catharanthus roseus Antineoplásico

Yohimbina Alcaloide indólico Apocynaceae, Rubiaceae

Afrodisíaco

Terpenos y esteroides: ventas proyectadas para el 2 002: 12400 millones US$ Artemisinina Lactona sesquiterpénica Artemisia annua Antimalárico Diosgenina, Esteroides Dioscorea spp. Hormonas esteroidales Taxol Diterpenos Taxus brevifolia Glicósidos: ventas proyectadas para el 2002: 9230 m illones US$ Digoxina, digitoxina Glicósidos esteroidales Digitalis spp. Cardiotónico Sennósidos A y B Antracenos Cassia angustifolia Laxante Otros: ventas proyectadas para el 2002: 5014 millon es US$ Ipecac Mezcla de alcaloides de

ipecacuana Cephaelis ipecacuanha

Emético

Podophyllotoxina Lignanos Podophyllum peltatum Antineoplásico

Antitumoral

Manipulación genética del metabolismo secundario

Agrobiotecnología

Ingeniería

metabólica

• Se ha estudiado bien el metabolismo secundario de unas pocas plantas; los metabolitos secundarios son especie-específicos.

• Existe un conocimiento limitado de las vías debiosíntesis, tanto a nivel de sus componentes como a nivel regulatorio.

• Se han aislado pocos genes y en muchos casosse desconocen las funciones de las proteínascodificadas por los mismos.

• Existe un riesgo potencial de toxicidad en alimento sasociado con el aumento o producción de nuevosmetabolitos.

• Se requiere conocer el perfil exacto de losmetabolitos (metaboloma) que produce una planta modificada genéticamente. Los métodosde análisis están actualmente en desarrollo.

Limitaciones para la manipulación genética delmetabolismo secundario

Agrobiotecnología

Ingeniería

metabólica

Se requieren conocimientos sobre:

• Intermediarios y productos finales de las rutasbiosintéticas

• Enzimas que regulan las rutas biosintéticas

• Pasos limitantes, enzimas alostéricas, vías competitivas de la ruta biosintética principal

• Compartimentalización subcelular de las rutasbiosintéticas

• Células o tejidos productores específicos

• Rol que cumple el metabolito secundario enla planta

Requerimientos para la manipulación genética delmetabolismo secundario

Agrobiotecnología

Ingeniería

metabólica

Factores de transcripción

• Permiten la modificación del metabolismoinduciendo o reprimiendo un subconjuntode genes estructurales dentro de una vía metabólica específica.

Los factoresde transcripción pueden utilizarse como herramientas para la modificacióndel metabolismo secundario

Ejemplos:

• Familias de factores de transcripción R. . y C1 (regulación positiva de la síntesis de . antocianinas en maíz)

• Factores de transcripción de tipo C1 . (regulación negativa de la síntesis de . flavonoides por Myb4 en frutilla)

Agrobiotecnología

Ingeniería

metabólica

Ventajas y limitaciones del uso de factores de transcripción:

• Permite la activación o inhibición simultáneade los genes involucrados en una vía metabólica.

• Evita efectos no deseados producidospor la existencia de pasos limitantesen la vía metabólica.

• Permite la modulación del flujo de una ruta metabólica sin un conocimiento profundode los componentes que la conforman.

• Se limita a modificar vías metabólicaspreexistentes sin originar nuevas rutas.

Los factoresde transcripción pueden utilizarse como herramientas para la modificacióndel metabolismo secundario

Agrobiotecnología

Ingeniería

metabólica

• Modificación de la síntesis de terpenoides

- Alteración de las fragancias y sabores de los alimentos

- Producción y sobrexpresión de vitaminas- Producción de compuestos farmacológicos

• Modificación de la síntesis de flavonoides

- Producción de compuestos nutracéuticos- Modificación de la coloración floral

• Modificación de la síntesis de alcaloides

- Aumento y producción de compuestosfarmacológicos

- Modificación de la calidad de los alimentos

Blancos de la manipulación genética del metabolismo secundario

Agrobiotecnología

Ingeniería

metabólica

Terpenoides

Agrobiotecnología

Ingeniería

metabólica

Terpenoides• Monoterpenos

- Esencias volátiles de flores y frutos- Aceites esenciales de hierbas y especias- Compuestos defensivos

• Sesquiterpenos

- Aceites esenciales de hierbas y especias- Compuestos defensivos- Repelentes de herbívoros

• Diterpenos

- Acidos de resinas coníferas y legumbres- Drogas farmacológicas

• Triterpenos

- Compuestos defensivos- Repelentes de herbívoros- Drogas farmacológicas

• Tetraterpenos

- Carotenoides

Agrobiotecnología

Ingeniería

metabólica

• Problema:Los tomates sin aroma son percibidos por el público como productos de baja calidad. El aroma está determinado por la relación azúcares/ácido cítrico y por unos 400 compuestos volátiles.

• Solución:Aumento del nivel de s-linalol, un alcohol monoterpeno preponderante en el aroma y sabor del tomate.

• Estrategia:Transformación con el gen heterólogo de la s-linalol sintetasa (LIS) de Clarkia breweri bajo la dirección del promotor E8, específico del estadío tardío de maduración del tomate.

Aumentode los nivelesde s-linalolpor modificación de la vía de los monoterpenos

Se transformaron 2 variedades de tomate con poco aroma:UC82B: variedad de tomate para procesadoCB3: variedad de tomate fresco

t-tmlLinalol sintetasa pE8

Se transformaron 2 variedades de tomate con poco aroma:UC82B: variedad de tomate para procesadoCB3: variedad de tomate fresco

t-tmlLinalol sintetasa pE8 t-tmlLinalol sintetasa pE8Agrobiotecnología

Ingeniería

metabólica

Linalol: alcohol monoterpeno acíclico presente en l os tomates frescos que le otorga un aroma dulce y flor al.

Se desvió la vía de los terpenoides que lleva a la formación de carotenoides por sobrexpresión de la linalol sintetasa en

plástidos, lo que lleva a la producción de s-linalol.

Aumentode los nivelesde s-linalolpor modificación de la vía de los monoterpenos

gAgrobiotecnología

Ingeniería

metabólica

La modificación de la vía de los monoterpenos en tomate produce un aumento de los niveles de s-linalol pero no de su enantiómero r-linalol

Presencia de s-linalol y 8-hidroxilinalol en tomates transgénicos maduros

Composición enantiomérica del linalol acumulado en los tomates transgénicos

Tomado de: Lewinsohn et al., Plant Physiol., 2001.

• Se observa la producción de s-linalol en las dos variedades de tomates transgénicos; las plantas control no producen este compuesto.

• El nivel de carotenoides y otros terpenoides no se ha modificado sustancialmente.

Líneas

CB3 Transgénica LIS

CB3 Control

UC82B Transgénica LIS

UC82B Control

γγγγ-tocoferol

10,45 (0,31)

11,07 (0,09)

11,83 (0,34)

10,40 (0,98)

αααα-tocoferol

8,49 (0,82)

7,02 (0,09)

7,45 (0,75)

6,40 (1,82)

ββββ-caroteno

5,53 (0,56)

3,00 (0,48)

3,35 (0,60)

4,80 (0,14)

S-linalol

0,31 (0,01)

0,00 (0,00)

0,25 (0,05)

0,00 (0,00)

µµµµg g -1 peso fresco ( ±±±± DE)

Niveles de s-linalol y otros terpenoides en tomates maduros de plantas control y transgénicas para linalol sintetasa

Tomado de: Lewinsohn et al., Plant Physiol., 2001.

Los monoterpenos son los principales componentes del aceite esencial de la familia de la menta (Lamiaceae),

siendo el mentol y la mentona los principales monoterpenos (50 y 10-30%, respectivamente) presentes

en el aceite esencial de Mentha piperita.

Mentha piperita (menta)

Tomado de: Katzer, http://www-ang.kfunigraz.ac.at/~katzer/engl/generic_frame.html?Ment_pip.html

Modificaciónde la composición del aceite esencial deMentha piperita

Agrobiotecnología

Ingeniería

metabólica

• Problemas:La falta de luz, sequedad y altas temperaturas favorecen laproducción y acumulación de los monoterpenos mentofuranoy pulegona en el aceite esencial de menta. Estos componentes disminuyen el aroma y gusto de la menta.

• Solución:Disminuir la acumulación de metabolitos indeseables comomentofurano, y maximizar la producción de mentol.

• Estrategia:- Sobrexpresión de la enzima 1-deoxi-xilulosa-5-fosfato reductoisomerasa (DXR).

- Supresión de la expresión de la enzima mentofurano sintetasa (MFS) por expresión transcriptos antisentido del del gen de MFS.

Tomado de: Katzer, http://www-ang.kfunigraz.ac.at/~katzer/engl/generic_frame.html?Ment_pip.html

Modificaciónde la composición del aceite esencial deMentha piperita

Agrobiotecnología

Ingeniería

metabólica

Desregulación de la síntesis de monoterpenos para modificar la composición de aceites esenciales de Menta piperita

DXR: 1-deoxi-xilulosa-5-fosfato reductoisomerasaMFS: mentofurano sintetasa

Niveles de ARNm de 1-deoxixilulosa-5-fosfato reductoisomerasa en plantas transgénicas y control

Hojas inmaduras Hojas maduras

De las plantas transgénicas, la mayoría presentó un fenotipo normal, y algunas presentaron una pigmentación anormal (sugiriendo inhibición de la síntesis de clorofila) y en mosaico. La utilización de un promotor constitutivo permitió la expresión del gen dxr en hojas jóvenes y maduras de plantas transgénicas. Por el contrario, en las

hojas maduras de plantas no transformadas la expresión de este gen se encuentra normalmente reprimida.

Modificado de: Mahmoud et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2001.

• En las plantas DXR, la producción total del aceite esencial se incrementó en un 50% y se observó un aumento en los niveles de mentol.

• En las plantas MFS, la producción total del aceite esencial fue similar a la de las plantas control. Los niveles de mentofurano y pulegona disminuyeron y los de mentol aumentaron.

Modificado de: Mahmoud et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 98: 8915-8920, 2001.

Composición de aceites esenciales en plantas transgénicas y control de Menta piperita

DXRSENTIDO

MFSANTISENTIDO

Porcentaje

Planta

Salvaje

DXR6

DXR32

DXR46

MFS1

MFS3

MFS7

Mentona

45,9

45,0

46,1

45,3

35,0

63,7

53,5

Pulegona

8,0

6,1

5,7

1,7

0,2

0,7

0,8

Mentofurano

16,8

15,7

12,5

5,1

2,5

2,5

2,5

Mentol

6,9

12,7

13,9

27,0

23,1

12,7

19,5

Porcentaje

Planta

Salvaje

DXR6

DXR32

DXR46

MFS1

MFS3

MFS7

Mentona

45,9

45,0

46,1

45,3

35,0

63,7

53,5

Pulegona

8,0

6,1

5,7

1,7

0,2

0,7

0,8

Mentofurano

16,8

15,7

12,5

5,1

2,5

2,5

2,5

Mentol

6,9

12,7

13,9

27,0

23,1

12,7

19,5

Planta

Salvaje

DXR6

DXR32

DXR46

MFS1

MFS3

MFS7

PlantaPlanta

SalvajeSalvaje

DXR6DXR6

DXR32DXR32

DXR46DXR46

MFS1MFS1

MFS3MFS3

MFS7MFS7

Mentona

45,9

45,0

46,1

45,3

35,0

63,7

53,5

MentonaMentona

45,945,9

45,045,0

46,146,1

45,345,3

35,035,0

63,763,7

53,553,5

Pulegona

8,0

6,1

5,7

1,7

0,2

0,7

0,8

PulegonaPulegona

8,08,0

6,16,1

5,75,7

1,71,7

0,20,2

0,70,7

0,80,8

Mentofurano

16,8

15,7

12,5

5,1

2,5

2,5

2,5

MentofuranoMentofurano

16,816,8

15,715,7

12,512,5

5,15,1

2,52,5

2,52,5

2,52,5

Mentol

6,9

12,7

13,9

27,0

23,1

12,7

19,5

MentolMentol

6,96,9

12,712,7

13,913,9

27,027,0

23,123,1

12,712,7

19,519,5

• Hierba aromática utilizada en la medicina tradicional china para el tratamiento de la fiebre.

• Unica fuente de artemisina, sesquiterpenocon actividad contra Plasmodium falciparum, parásito que es el agente causal de la malaria.

Artemisia annua L.Expresióndel gende la farnesil difosfato sintetasaen Artemisia annua L.

Agrobiotecnología

Ingeniería

metabólica

Problema:

Aparición de cepas de Plasmodium falciparumresistentes a las tradicionales drogas antimaláricas

Objetivo:

Desarrollo de fuentes alternativas de drogasantimaláricas

Solución:

Obtención de plantas transgénicas de Artemisia annua L. que expresen altos niveles de artemisina.

Estrategia:

Sobrexpresión de la enzima farnesil difosfato sintetasa (FDS) de Gossipium arboreum en plantas de Artemisia annua L.

Expresióndel gende la farnesil difosfato sintetasaen Artemisia annua L.

t-nosFarnesil difosfato sintetasa35S CaMV

Agrobiotecnología

Ingeniería

metabólica

Tomado de: Chen et al., Plant Science, 2000.

Transgénica Control

Se observa un aumento de 2-3 veces de artemisina en plantas transgénicas.

Expresióndel gende la farnesil difosfato sintetasaen Artemisia annua L.

Agrobiotecnología

Ingeniería

metabólica

Problema:

• Las deficiencias en distintas vitaminas afectan a muchos millones de personas que se alimentancon dietas restringidas.

• Particularmente, la carencia de vitamina A,cuyo precursor es el β-caroteno, causa ceguera, xeroftalmia y muerte prematura.

• Se estima que 124 millones de niños padecen estadeficiencia a escala mundial y sólo en el sudeste asiático 250.000 niños quedan ciegos cada año por esta causa.

Expresión y sobreproducción de provitamina Aen plantas de Oryza sativa

Agrobiotecnología

Ingeniería

metabólica

Solución:

• En términos generales, muchos cultivos alimentarios podrían ser suplementados con vitaminas, lo quepermitiría cubrir fácilmente los requerimientosalimentarios mínimos.

• Una posible solución es sobrexpresar pro-vitamina Aen alimentos básicos de las poblaciones carenciadas,tales como el arroz.

• En el caso de la vitamina A, la administración de su precursor, el β-caroteno (pro-vitamina A) tieneventajas sobre el producto final porque puede acumularse en el organismo sin efectos nocivos.

• Las rutas de síntesis de vitaminas pueden ser introducidas en las especies que no las poseenen la medida en que se conozcan bien las enzimas participantes.

Expresión y sobreproducción de provitamina Aen plantas de Oryza sativa

Agrobiotecnología

Ingeniería

metabólica

Estrategia:

• El arroz produce geranil-geranil difosfato, precursor de los β-carotenos, pero carecede las enzimas correspondientesa esta ruta biosintética.

• Se sobrexpresaron enzimas que completan la vía biosintética del β-caroteno que no están presentes en arroz.

• Para producir la pro-vitamina A en arroz,la planta fue transformada con los genes de fitoeno desaturasa de Erwinia uredovora y de fitoeno sintetasa y licopeno ciclasa de Narcissus pseudonarcissus

La ruta de síntesis de β-caroteno fue introducida en arroz por transformación con genes heterólogos

t-nosFitoeno desaturasaCaMV35S t-nosFitoeno desaturasaCaMV35S

t-nosFitoeno sintetasaglutelina t-nosFitoeno sintetasaglutelina

t-nosLicopeno ciclasaCaMV35S t-nosLicopeno ciclasaCaMV35S

Desarrollo de líneas de “Golden Rice” que cumplan con las regulaciones para consumo humano

Análisis de carotenoides en semillas T1 control y transgénicas

pmi: fosfomanosa isomerasapsy: fitoeno sintetasa, crtl: fitoeno desaturasa bacterianaSSU-ps: péptido señal de la subunidad menor de la RUBISCO

-1: promotor de glutelina

35Spmi psy crtlGt-1 35S ps

pmi: fosfomanosa isomerasapsySSU-ps: péptido señal de la subunidad menor de la RUBISCO35S: promotor de 35S del CaMV; Gt-

35Spmi psy crtlGt-1 35S psps

Tomado de: Hoa et al., Plant Physiology, 2003.

IR 64 control (A) y transgénicas (B a F)

Taipei 309 control (G) y transgénicas (H)Taipei 309 control (G) y transgénicas (H)

BA

C D

FE

G H

Flavonoides

Agrobiotecnología

Ingeniería

metabólica

Flavonoides• Los flavonoides son un grupo diverso formado

por compuestos polifenólicos de bajo peso molecular .

• Se producen principalmente en la epidermis de las hojas, frutos, semillas y flores.

• En las plantas cumplen diversas funciones:

- Protección contra luz UV (pigmentos UV-B)- Atracción de polinizadores- Defensa contra patógenos (fitoalexinas) o plagas

(compuestos antinutricionales)- Activadores de los genes de nodulación- Fertilidad y germinación del polen

• Son importantes componentes de la dieta debidoa sus efectos benéficos en la salud humana y animal :

- Antioxidantes (quercetina y epicatequina)- Antitumorales (genisteína)- Antiarterioescleróticos- Antiinflamatorios

Agrobiotecnología

Ingeniería

metabólica

Biosíntesis de flavonoides

Los flavonoides se clasifican en cinco grupos según su estructura central (aglicona)

Estructuras de las antocianinas

Pelargonidina

Delphinium

DelfinidinaCianidina

Pelargonium Rosa

• La producción de flores de corte se ha convertido en una industria en el siglo XX y la floricultura continúa en expansión.

• Se han obtenido variedades con características deseables, tales como color, forma, arquitectura floral, vida en el vaso y resistencia a patógenos por mejoramiento clásico. Un obstáculo de este proceso es el reservorio genético limitado existente para cada especie individual.

• Se pueden alterar los caracteres agronómicosy ornamentales si se conocen los genes apropiados y si existen métodos de transformación para estas especies.

• Una vez obtenidas las variedades transgénicas,su viabilidad comercial depende de la estabilidady mantenimiento en el tiempo del fenotipo modificad o.

Modificación genética del color en flores

Agrobiotecnología

Ingeniería

metabólica

Modificaciónde la coloraciónfloral en petuniapor expresióndel gen de la dihidroflavonol-4-reductasa (dfr)

Cultivar transgénico queexpresa el gen dfr de maíz

Tomado de: Mol et al., Tredns in Biotechnology,1995.

La expresión del gen de dihidroflavonol-4-

reductasa ( dfr) de maíz en una línea de petunia

que acumula dihidrokemferol debido a dos mutaciones en los

genes de flavonol3’ hidroxilasa ( f3’h) y

flavonol 3’-5’ hidroxilasa(f3’5’) induce la síntesis

del pigmento pelargonidina,

de color ladrillo.

Agrobiotecnología

Ingeniería

metabólica

• En los 90, los investigadores de la compañía austra liana Florigene clonaron los genes de dos enzimas de petu nia que producen el pigmento azul delfidinidina: la fla vonoide 3’5’ hidroxilasa (F3’5’H) y la dihidroflavonol reduc tasa (DRF).

pH vacuolar alcalino Delfinidina = azul

pH vacuolar ácido Delfinidina = rosa

• Obtuvieron rosas transgénicas estables pero las flo res no eran azules debido al pH vacuolar ácido de la rosa.

• Finalmente, la compañía logró transformar claveles ( Dianthuscarophyllus ) obteniendo seis variedades comerciales de claveles transgénicos que van desde el lila hasta e l violeta.

La rosa azul: una promesapendiente de la biotecnología de plantas ornamentales

Agrobiotecnología

Ingeniería

metabólica

Los flavonoides se clasifican en cinco grupos según su estructura central (aglicona)

Biosíntesis de flavonoles y antocianinas

Claveles transgénicos con diferentes coloraciones d e azul comercializados por Florigene

Transformación de Dianthus carophyllus con los genes flavonoide3’5’ hidroxilasa y dihidroflavonol reductasa de Petunia hybrida

• Objetivo:

Mejorar la capacidad nutritiva del fruto del tomateaumentando los niveles de flavonoles en su pulpa

• Estrategia:

Activación de la vía de síntesis de los flavonoides por expresión de los factores de transcripción C1 (familia

. MYB) y L1 (familia MYC) de maíz en fruto de tomate.

Incremento del nivel de flavonoles en tomate porsobrexpresión de factores de transcripción

Agrobiotecnología

Ingeniería

metabólica

Pe8: promotor E8 de tomatePds35S: promotor 35S CaMV dobleTrbc: terminador transcripción subunidad menor de rubiscoTnos: terminador transcripción de nopalina sintetasa de Agrobacterium

Pe8: promotor E8 de tomatePds35S: promotor 35S CaMV dobleTrbc: terminador transcripción subunidad menor de rubiscoTnos: terminador transcripción de nopalina sintetasa de Agrobacterium

L1

L1

L1

El uso de dos factores de transcripción permite la activación simultánea de la vía de síntesis de flavonoles en tomate

Líneas transgénicas(No de serie)

100200

25003000500

Transgén

35SC1E8LC35SC1/E8LCE8C1/E8LC

Producción de flavonoidesen pulpa de tomate

--++

• Ambos factores de transcripción son requeridos para activar la vía de síntesis de flavonoides en la pulpa de tomate.

• Se observa un aumento de la actividad antioxidante de los tomates transgénicos 35SC1/E8LC debido a la acumulación de los flavonoles kemferoly naringenina. Se obtuvieron resultados

similares con la construcción E8SC1/E8LC

Tomado de: Bovy et al., Plant Cell, 2002.

35SC1/E8LC

cont

rol

Alcaloides

Agrobiotecnología

Ingeniería

metabólica

• Existe un gran interés comercial en incrementarel contenido de ciertos metabolitos secundariosde uso medicinal en las plantas que los producen.

• El alcaloide del tropano escopolamina es un important e anticolinérgico presente en varias plantas Solanácea s.

• Atropa belladona produce altos niveles hiosciaminay muy poca escopolamina.

• La enzima que realiza la conversión entre estos dos compuestos (hiosciamina 6 ββββ-hidroxilasa) fue aislada de Hioscyamus niger.

Modificaciónde la síntesis de alcaloidesen Atropa belladona

Hiosciamina 6 β-Hidroxihiosciamina Escopolamina

Hiosciamina6 β-hidroxilasa

H6H

Hiosciamina6 β-hidroxilasa

H6H

Agrobiotecnología

Ingeniería

metabólica

• Estrategia:

Transformación de Atropa belladona con el genque codifica la enzima hiosciamina hidroxilasa (H6H)de Hyosciamus niger bajo la regulación del promotor constituvo 35S de CaMV.

t-nosH6H Hyosciamus niger 35S CaMV

Modificaciónde la síntesis de alcaloidesen Atropabelladona

• Objetivo:

Aumentar la expresión de escopolamina, importante droga anticolinérgica, en Atropa belladona.

Agrobiotecnología

Ingeniería

metabólica

Modificación de la síntesis de alcaloides en Atropa belladona

• Más del 92% del total de los alcaloides presentes en hojas, tallos y raíces principalesde las plantas control es hiosciamina.

• Las plantas transgénicas T0 y T1 expresaron casi exclusivamente escopolaminaen las partes aéreas. En las raíces la conversión a escopolamina no fue tan eficiente.

Tomado de: Yun et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992.

• Problema:

- Existe una creciente demanda de café descafeinado debido a los efectos adversos que la cafeína produce en personas sensibles.

- La obtención de café descafeinadopor métodos industriales es caray el café pierde sabor.

Desarrollode plantasde café con bajo nivelde cafeína

• Objetivo:

- Obtención de plantas de café (Coffea canephora)que produzcan menos cafeína

• Estrategia:

- Disminución de la expresión de la enzima teobromina sintetasa por ARN de interferencia. La secuencia 3´ no codificante del gen CaMXMT1 se utilizó para diseñar fragmentos cortos y largos de ARNi.

Agrobiotecnología

Ingeniería

metabólica

En la biosíntesis de la cafeína están involucradas tres N-metiltransferasas:

- CaXMT1 teobromina sintetasa- CaMXMT1 teobromina sintetasa- CaDXMT1 cafeína sintetasa

• Se obtuvo una reducción de hastaun 70% en los niveles de cafeína.

Salvaje ARN-S

Desarrollo de plantas de café con bajo nivel de cafeína

Tomado de: Ogita et al., Nature, 2003.

reducción de teobromina del 30-80%

reducción de cafeína del

50-70%

Conclusionesy perspectivas • La sobrexpresión de uno o mas genes de una vía metabólica

puede resultar en un aumento en la producciónde un determinado metabolito.

• En otros casos, dicha sobrexpresión resulta en la acumulaciónde compuestos no deseados o inhibe la acumulación delcompuesto que se desea sobrexpresar.

• Se requiere una mejor caracterización de las enzimas que intervienen en las rutas del metabolismo secundario:especificidad, cofactores requeridos, regulación, control porretroalimentación de producto.

• La inducción de toda una ruta metabólica por sobrexpresiónde factores de transcripción ha demostrado ser eficientey marca una tendencia en el futuro de la ingeniería metabólica.

• Los conocimientos adquiridos en el futuro permitirán establecermodelos de flujo metabólico en plantas superiores similares a los desarrollados en el caso de los microorganismos.

Agrobiotecnología

Ingeniería

metabólica

Referencias 1. Stearns, J.C. and Glick, B.R. Transgenic plants with altered ethylene biosynthesis or perception. Biotechnology Advances, 21:193-210, 2003.

2. Drexler, H., Spiekermann, P., Meyer, A., Domergue, F., Zank, T., Sperling, P., Abbadi, A., and Heinz, E. Metabolic engineering of fatty acids for breeding of newoilseed crops: strategies, problems and first results. Journal of Plant Physiology, 160:779-802, 2003.

3. Ritsema, T. and Smeekens, S. Engineering fructan metabolism in plants. Journal ofPlant Phisiology,160:811-820, 2003.

4. Galili, G., and Hofgen, R. Metabolic engineering of amino acids and storageproteins in plants. Metabolic Engineering, 4:3-11, 2002.

5. Verpoorte, R. and MemelinK, J. Engineering secondary metabolite production in plants, Current Opinion in Biotechnology, 13:181-187, 2002

6. Della Penna, D. Plant metabolic engineering. Plant Physiology, 125:160-163, 2001.

7. Martin, C. Transcription factors and the manipulation of plant traits. Current Opinion in Biotechnology, 7:130-138, 1996.

8. Mahmoud, S. and Croteau, R. Strategies for transgenic manipulation of monoterpene biosynthesis in plants. Trends in Plant Science, 8:366-373, 2002.

9. Giuliano, G., Aquilani, R. and Dharmapuri, S. Metabolic engineering of plant caroternoids. Nature, 5:406-409, 2000.

10. Mol, J., Cornish, E., Mason, J. and Koes, R. Novel coloured flowers. Current Opinion in Biotechnology, 10:198-201, 1999.Agrobiotecnología

Ingeniería

metabólica

ingenieria metabolica -agrobiotecnologia-

Documents

Transcript of ingenieria metabolica -agrobiotecnologia-