INGENIERÍA GENETICA

INGENIERÍA GENÉTICALa Ingeniería Genética es una parte de la Biotecnología que se basa en la manipulación genética de organismos con un propósito predeterminado, aprovechable por el hombre:se trata de aislar el gen que produce la sustancia e introducirlo en otro ser vivo que sea más sencillo de manipular. Lo que se consigue es modificar las características hereditarias de un organismo de una forma dirigida por el hombre, alterando su material genético.

ADN RECOMBINANTE

Las cuatro etapas básicas para construir un ADN recombinante son:

• Aislamiento del ADN• Corte del ADN• Unión del ADN• Amplificación del ADN recombinante

Este es uno de los aspectos más importantes y que consiste en determinar aproximadamente cuántos clones es necesario disponer para tener una probabilidad p de contener una secuencia determinada de ADN. Se debe asumir una representación de secuencias al azar, que cada inserto es de igual tamaño y que el tamaño genómico del organismo sea conocido. Así, si "a" es el tamaño del inserto y "b" es el tamaño del genoma (en las mismas unidades), luego una genoteca de N clones tendrá una probabilidad p de contener determinada secuencia:

TAMAÑO DE LA GENOTECA

Así por ejemplo para E. coli con un genoma de 4.2 x 103 Kb y si a = 20 Kb, si se fija p = 0.99 (99% de probabilidad de contener determinada secuencia), el valor de N será de 9.6 x 102 clones.

TAMAÑO DE LA GENOTECA

Es una colección de clones cada uno de los cuales contiene un vector al que se le ha insertado un fragmento de ADNderivado del ADN o el ARN totales de la célula o tejido.

Con el tamaño suficiente, la colección de clones debería contener, teóricamente, todas las secuencias existentes en el ADN del organismo.

Es posible buscar en la genoteca un clon con un fragmento de ADN de interés mediante métodos sensibles de detección capaces de detectar dicho fragmento entre millones de clones diferentes.1

GENOTECA (LIBRARY)

Entre los usos que se le pueden dar a una genoteca están:•El aislamiento de secuencias y genes: punto de partida para el estudio molecular. •La conservación del genoma: la excepcionalidad de una muestra biológica aconseja conservar su material genético (restos arqueológicos, especies en extinción, individuos con patologías únicas). •Estudio de la secuencia genómica: conocer la secuencia completa de un genoma implica su clonación previa.

GENOTECA (LIBRARY)

ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION

Son enzimas que tienen la propiedad de reconocer secuencias particulares de ADN y romper los puentes fosfodiéster de los ácidos nucleicos. La primera enzima de restricción fue extraída de la bacteria Haemophilus influenzae y tiene la propiedad de romper el ADN del fago lambda y el de E. coli, pero no su propio ADN. Se le denominóHind II. En las décadas siguientes se ha descrito una gran variedad de enzimas de restricción con diversas secuencias de corte para el ADN.

ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION

Las endonucleasas de restricción, también conocidas como enzimas de restricción o restrictasas, al cortar las secuencias específicas del ADN generan extremos complementarios de cadena sencilla (cohesivos, protuberantes):•Extremos protuberantes 5’-P•Extremos protuberantes 3’-OH•Que dejan extremos “romos”

El Nombre de las enzimas de restricción es la abreviatura de tres letras que se refieren al organismo de donde se identificaron seguido de un número romanoEcoRI Escherichia coliHindIII Haemophilus influenzaeHoeIII Haemophilus aegyptius

La hibridación de ácidos nucleicos (ADN ó ARN) es un proceso por el cual se combinan dos cadenas de ácidos nucleicos antiparalelas y con secuencia de bases complementarias, en una única molécula de doble cadena.

Son moléculas de ADN donde se pueden introducir in vitrootros fragmentos de ADN (gen a clonar). Estos vectores generalmente están basados en plásmidosbacterianos y en bacteriófagos (ej. Lambda ó M13). Partes de un vector de clonación•origen de la replicación que sea reconocido por la ADN polimerasa hospedante•gen reportero (marcador seleccionable, ej. resistencia a antibiótico)•replicarse en copias múltiples dentro de la célula hospedante

Los vectores de clonamiento de uso general son relativamente pequeños, puesto que son más estables (las moléculas más grandes se degradan durante los procesos de manipulación), pero su capacidad de clonación es menor.

VECTORES DE CLONADO

Características de los plásmidos: •Son pequeños (miles de pares de bases) •generalmente portan solo uno o algunos genes •son circulares •tienen un único origen de replicación•no móviles

Características como vector de clonado:• sitios únicos de corte para enzimas de restricción• gran número de copias (por eliminación de laregión de control)•marcadores que permitan su reconocimiento

VECTORES DE CLONADOPLASMIDOS: moléculas de DNA que se encuentran en bacterias y se replican en forma independiente del cromosoma

Nomenclatura utilizada para los plásmidos usados como vectores:pBR322p significa plásmidoBR identifica investigadores ó laboratorio; en este caso significa Bolívar y Rodríguez322 identifica al plásmido en particular

pEMBL8p significa plásmidoEMBL identifica al laboratorio European Molecular BiologyLaboratory8 identifica al plásmido en particular

pBR322

Electroporación es un proceso para aumentar la permeabilidad de la membrana mediante la aplicación de un campo eléctrico

VECTORES DE EXPRESIÓN

La clonación directa, en un vector normal sin modificación molecular (plásmido bacteriano), no suele asegurar que el gen de interés se vaya a expresar correctamente ni en concentración adecuada, en particular cuando se procede a clonar genes de especies alejadas filogenéticamente, deben considerarse algunas características para el diseño de VECTORES DE EXPRESIÓN adecuados.

CARACTERISTICAS DE UN VECTOR DE EXPRESIÓN

1- La naturaleza de las secuencias de inicio y final de la transcripción (promotores-operadores, terminadores).2- Las señales para el comienzo de la traducción, especialmente sitios de unión del ribosoma y codón de inicio de la traducción.3- La eficiencia de la traducción, lo que puede incluso llevar a emplear codones sinónimos adaptados a la abundancia de los correspondientes ARNt del huésped.4- La estabilidad de la proteína recombinante en la célula huésped.5- La localización celular de la proteína a expresar (secreción al citoplasma o al exterior, retención en el espacio periplásmico).6- El número de copias del gen clonado

A

B

C

D

C’

B1 B1

B2B2

C’’

AQ

634

AQ

664

AQ

9543

AQ

9544

Segmento de ADN cortado con las enzimas PstI y EcoRI

Mapa de restricción.

Las enzimas de restricción pueden utilizarse para localizar marcadores en un cromosoma.

HIBRIDACION SOUTHERN (SOUTHERN BLOT)

COMPARACION ENTRE TRANSFERENCIAS

SOUTHERN, NORTHERN Y WESTERN

Verificación por Southern blot

silvestre

1. Aislar y cortar DNA con ER2. Separar los fragmentos en una

electroforesis3-4.Transferir los fragmentos a

una membrana 5.Hibridar los fragmentos con una

sonda marcada6.Detectar los fragmentos por el

Marcaje de la sonda

genotipos

+ ER

mutante

AMPLIFICACION DE UNA SECUENCIA DE ADN ESPECIFICA

REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA(PCR)

AMPLIFICACION DE UNA SECUENCIA DE ADN ESPECIFICA

REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA(PCR)

HOSPEDEROS PARA UN ADN RECOMBINANTE

El microorganismo huésped más usado en ingeniería genética es la bacteria Escherichia coli. Sin embargo, para muchos experimentos se debe recurrir a otros huéspedes, como la bacteria Bacillus subtilis, las levaduras Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris entre las más usadas. Así mismo se requiere del uso de células vegetales y células animales de insectos o de mamífero.

MEJORAMIENTO DE CEPAS MICROBIANAS

Recuperación encultivo líquido

plaqueo

Fermentación

Ensayo de actividad

Revisar la actividadde las cepas exitosas

Analizar nuevamente las cepas exitosas

(screening secundario)Preservación

Post-test

Scale up

Cultivo sumergido

Reinicio del proceso

Mutagénesis

MODIFICACION DE CELULAS VEGETALES

AGROBACTERIUM METHOD

DNA withdesired trait

DNA in Plasmid

Bacterial transfer of DNAAgrobacterium

Chromosome

Plant Cell

Acceleration of particlesto plant cells

DNA coating on microscopicmetal particles

DNA PARTICLE GUN METHOD

Plant Cell

Métodos de Transformación:Insertando genes en células vegetales

De la célula modificada a la planta viva

callus culturecallus culture

plantletsplantlets

cellcell

De la célula modificada a la planta viva

Genes Control Plant Traits

Protein

Insect control

Disease control

Processing improvements

Quality improvements

Climatic tolerance

Weed control

Genes code for production of proteinsProteins influence specific plant characteristics

Extended shelf-life tomato(FlavrSavr Tomato)

Herbicide resistant soybean(Roundup Ready Soybean)

OMG – Organismo genéticamente modificado

Genes Control Plant Traits

Bacillus thuringensis Lepidopteran ControlTransformed Plant

Bt gene Bt toxin expression pest control

Agriculture Products On the Market

Source: USDA

Insect resistant cotton

Insect resistant corn

Normal Transgenic

Bt toxin kills the European corn borertoxin gene from a bacteriaRootworm GM approved (2/26/03)

Bt toxin kills the cotton boll wormtoxin gene from a bacteria