Articulo 3 ingeniería Metabolica

7/26/2019 Articulo 3 ingeniera Metabolica

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Ingeniera metablica deSaccharomyces cerevisiae para la

produccin de nuevos compuestos delpidos

Resumen

La levadura Saccharomycescerevisiae ha sido modifcada conxito para la produccin denumerosos metabolitos y protenasteraputicas mediante ingenierametablica, pero no se ha utilizadohasta la echa para la produccinde compuestos derivados delpidos. emos desarrollado unaestrategia de ingeniera en elmetabolismo de los lpidos en S.cerevisiae basados en tcnicas decultivo !ue se empleantpicamente para estudiosde "iognesis peroxisomal#

clulas ueron cultivadas enmedios !ue contienen $cidosgrasos como %nica uente decarbono, la cual promuevela prolieracin peroxisomal y lainduccin de enzimas relacionadascon la &'oxidacin de $cidosgrasos. (uestros resultadosindican !ue el crecimiento de lalevadura en $cidos grasos comooleato resultados en amplia

aceptacin de estos $cidos grasosa partir de los medios decomunicacin y un posterioraumento de lpidos celulares totaldel )* al +* de peso de celdaseca. -ambin mostramos !ue laco'expresin de plantadesaturases $cidos grasos ) y /012) y 0123, utilizando un $cidograso'inducible del promotor delgen peroxisomal, 4unto a los

procesos de absorcin de $cidosgrasos con la induccin de una

nueva va metablica !ue conducede $cido oleico /+56+3 a $cidolinolnico /+563. 7or %ltimo, nosmuestran !ue el cultivo de clulasde levadura en presenciade triacilgliceroles y lipasasuministrado de orma exgenapromueve una ampliaincorporacin de triglicridos de$cidos grasos en clulas delevadura. 8olectivamente, estosresultados proporcionan un marcopara la bioconversin de aceitesde ba4o costo en valor a9adidoproductos de lpidos.

Introduccin

:ngeniera metablica es un campoemergente de la biotecnologa !ueorece un enorme potencial para laproduccin de metabolitosdeseado. ;l eno!ue experimentalse basa en la manipulacin degenes endgenos o la introduccinde genes extra9os en unorganismo de inters con el fn deredistribuir las vas metablicaspara la produccin de compuestosespecfcos /Stephanopoulos,+


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modelo para el desarrollo de laingeniera metablica estrategiasorientadas hacia la produccin deciertos metabolitos y protenasteraputicas /=stergaard et al.

)>>>3. Sin embargo, se haprestado poca atencin aldesarrollo de tecnologas basadasen lpidos, principalmente debidoal ba4o contenido de lpidos de S.cerevisiae /?acob, +>>3. 2urante nuestros estudioscon S. cerevisiae, hemosobservado !ue las clulascultivadas en $cidos grasos librestales como $cido oleico !uecontienen grandes cantidades degotas lipdicas no observados enlas clulas crecen en simplesuentes de carbono como laglucosa. ;l actual estudio ueiniciado para caracterizar elcontenido en lpidos de S.cerevisiae y, adem$s, determinarsi ciertos lpidos ;nzimas demodifcacin podra ser expresadoba4o el control del promotor del

gen 7;B para modifcar lacomposicin de $cidos grasos y

producir nuevos productos delpidos.

Materiales y mtodos

Las condiciones de cultivo y de

cepas de levadura Saccharomycescerevisiae cepas AAC=++D /A1-Dade )'+ su'++,+ leu)'.++) -rp+'+ ura'+ puede+'+>>E =le3,AAF7B /A1-D pex66SG)667pgHade'I071JL'GK1 su'++,+ leu)'.++) -rp+'+ ura'+ puede+'+>>E=le3 o sus derivados /vase m$sadelante3, ueron utilizadas enestos estudios. Las clulas delevadura se mantuvieroninalteradas en C72 media /+* deextracto de levadura, peptona,)*, )*3 dextrosa agar solidifcadocon )*. 8eldas !ue contenganpl$smidos ueron mantenidos enplacas S2 /)* de dextrosa, >,@*de levadura sin base de nitrgenoamino$cidos, )* de agar3 consuplementos de amino$cidosadecuados. Solo las colonias

ueron inoculados en mediosl!uidos S2 y crecido durante lanoche a >M8 y >> rpm. Lasceldas se diluyeron en unavariedad de medios decomunicacin /vase inra3 y hacrecido a )>M8 y >> rpm en unaorma modelo cientfco N5>rerigeradosOagitador incubador dela consola. ;l cultivo a )>M8 ueescogido desde una ptima

actividad de la "rassicanapus $cidos grasos desaturase/0123 expresa la enzima en lalevadura ue observadoanteriormente a esta temperatura/2yer et al. )>>+3. Las celdas sediluyeron a >,+ =2@>> en soporteS2 y cultivados duranteaproximadamente )> h, diluida a>.) =2@>> en SIal medios /)*galactosa, >,@* de levadura base

de nitrgeno3 y cultivados duranteaproximadamente N> h, o diluido


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al +.> =2@>> en SId /* deglicerol, >,+* de dextrosa, >,@*de levadura base de nitrgeno3durante N> h. Las clulascultivadas en medio $cido oleico

/composicin, inra3 se pre'cultivados en SId durante lanoche en lugar de S2. 1l dasiguiente, las culturas sePreuerzaP a9adiendo >,+ volumende +>* y )>* de extracto delevadura, peptona y luegocultivadas durante N h. Las clulasueron cosechadas porcentriugacin y re'inoculados en+.> =2@>> en medio mineral /van

2i4Hen et al. +,+* vOv oleico, linoleicoo linolnico y apropiada, lossuplementos de amino$cidos ycultivados por N> h. Las clulasueron cultivadas a dierenteslongitudes de tiempo paraacomodar las dierencias en latasa de crecimiento de las diversasuentes de carbono. -odos loscultivos se cosechan a fnales de

registroOase estacionaria. ;nalgunos experimentos, los $cidosgrasos libres ueron sustituidos por>,+* trilinolein e incubadas con osin detergente /+* vOv de -QeenN> ' polyoxyethylenesorbitanmonopalmitate3 y lipasa /+ mgOmlde lipasa, tipo R:: aislados de8andida rugosa# Sigma3.

Determinacin del peso seco

de clulas de levadura

La extraccin de lpidos de clulasobtenidas de +>> ml de cultivo sedivide en dos porciones de N ml,uno para la determinacin delpeso de clulas de levadura seca yla otra para la extraccin de lpidosde la levadura. 7ara determinar elpeso de celda seca, las clulasueron colectadas por

centriugacin, lavadas dos vecescon agua, luego congelado a '5>M8

y con un lioflizado sistemas 0-Slyophilizer 0lexi'2ry A7. 7ara laextraccin de lpidos, clulas delevadura en la otra porcin de Nml se convirtieron a

spheroplasts por digestinenzim$tica de paredes celulares,como se ha descrito anteriormente/2yer et al. +


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grasos libres celular se incluyeronen el an$lisis composicional. La0ama se extra4eron con hexano,pasan a travs de sulato de sodioy hexano volumen ue reducida

ba4o una suave corriente denitrgeno. 0ama ueron analizadosen un eQlett 7acHard 5

Serie :: 8romatgrao de gasese!uipado con un autoin4ector y sindividir la inyeccin, un detector deionizacin de llama y un > m >,mm Supelco S7')5> columna,utilizando gas helio comotransportista. Gn programa de

temperatura de ++> a +@>M8 a+M8Omin, a +>M8 a M8, luego a)>>M8 a )),M8Omin con un fnalmantenga a , min estabaempleada. 0ama ueronidentifcados por comparacin delos tiempos de retencin a losest$ndares, utilizandobromuro heptadecanoate comopatrn interno, y el * de la 0amaue calculado sobre la base de

recuentos del $rea del pico.

Fig ! vectores de "cido graso#inducible de la e$presin gnica enlevaduras %n cassette de e$presinbasada en el "cido graso de levadura#&'(!! promotor inducible fueconstruido en una serie de ba)a y altacopia de levadura *ue contienecuatro vectores lan+adera diferentes

marcadores seleccionables ,Si-ors-iy .ieter !/0/1 Christianson et al

!//234 lo *ue se traduce en ochodiferentes pl"smidos de e$presin

Construccin de vectores y

cepas de levaduraGna serie de vectores de expresinde levadura ue construido portranserencia de un ragmento de12( !ue contiene la levadura7;B++ gen promotor y terminador,separados por uncorto polylinHer de sitios derestriccin, la serie pKS delevadura vectores lanzadera/SiHorsHi y ieter +


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+ con Bba: Bho:O generar p;B++'+ /8;(@ 1KSN, SG3 y p;B++'+ /8;(@ 1KSN, L;G)3,respectivamente. 7or %ltimo, lacinta ue transerida al pKS'N) y

pKS'N) utilizando Bho:OSac: paragenerar p;B++'N) /)U, SG3 yp;B++'N) /)U, L;G)3,respectivamente.

Rectores de expresin !uecontienen levadura 7;B++'drivendesaturases $cidos grasosvegetales /2873 ueronconstruidos utilizando myc'eptopotagged 1rabidopsis thaliana 012)

y hemagluttinin /13'tagged"rassica napus 012, !ueanteriormente se utilizaban paracaracterizar desaturaselocalizacin subcelular /2yer yAullen, )>>+3 y la regulacin post'transcripcional /2yer et al. )>>+3.;l micnico'tagged 012) =K0 seligaban entre la levadura 7;B++promotor y terminador portranserencia de un ragmento

;coK:O7st: de pJS'myc012) /2yery Aullen )>>+3 similarmentedigerido p;B++'N)N. La fnal uellamado pl$smido p;B++'N)N'myc012) /)U, -rp+3. La ha'tagged012 =K0 ue clonado entre el7;B++ promotor y terminador portranserencia de un ragmento;coK:O7st: del pl$smido pJS'1"+/2yer et al. )>>+3 ala ;coK:O7st: sitios de pJS')poli.

;l pl$smido resultante sedenomina pJS')1"+. La casetegnico ue trasladado desde estepl$smido como Sal:OSac: alragmento Sal:OSac: sitios de pKS'N) para generar el pl$smidop;B++'N)'1012 /)U, L;G)3.Los pl$smidos Se transectaronseparadamente o en combinacinen AAC=++D o AAF7B en clulasde levadura usando el mtodo deacetato de litio Iietz y Voods/+


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microgramos de protenas de cadacon4unto lisado celular ueronseparados en +>* S2S'geles depoliacrilamida y te9idoscon 8oomassie K')> o

transeridos a la nitrocelulosa paraVestern blotting. 2eteccin de!uimioluminiscencia me4orada serealiz utilizando sustratoy yperflm desde 1mersham'7harmacia, descrita por elabricante. Los anticuerposutilizados en estos estudiosincluyeron el anti'ratn ham1b +)81 /+ UgOml3 /"oehringerAannheimKoche3, anti'c'

myc ratn m1b /+6+,>>>3/"ab8o3, antidolichol manosaosato sintasa m1b mouse 8'1/N UgOml3 /Aolecular 7robes3 y decabra anti'ratn con4ugado conperoxidasa de r$bano picante de:gs /+6+>.>>>3 "iosource dilucin/ :nternacional3.

Resultados

8a captacin de "cidos grasospor S cerevisiae

S. cerevisiae clulas ueroncultivadas en la presencia dem%ltiples uentes de carbono, los$cidos grasos o solos, paradeterminar los eectos de losmedios sobre la absorcin y laasimilacin de composicin de$cidos grasos de los medios decrecimiento. Las clulas delevaduras cultivadas en lagalactosa contenan cantidadesba4as del total de los lpidoscelulares, !ue se distribuyenprincipalmente en osolpidos yneutrales racciones lipdicas /0ig.)3. 1dicin de $cido oleico a lagalactosa media condu4o a unpe!ue9o aumento en el total delpidos celulares y un aumento de

triacilglicerol y contenido de$cidos grasos libres se observ. ;l

incremento en el contenido de$cidos grasos celulares ue m$s

Fig 2 8a absorcin de "cidos grasosde los medios de cultivo porSaccharomyces cerevisiae y elsubsiguiente aumento en el total dela levadura el contenido lipdico Cepade levadura MM#929 fue crecido en

medios l*uidos *ue contengangalactosa4 galactosa y oleato4 gliceroly oleato4 oleato o solos :cido oleicofue incluido en los medios decomunicacin en el ;4!< ,v=v34cuando se agregan 'l panel inferiormuestra los sobrenadantes obtenidosdespus de la centrifugacin de losmedios para eliminar las clulas de lalevadura 'l panel central muestra elcontenido en lpidos totales declulas de levadura cultivada en losrespectivos medios de comunicacin

'l panel superior muestra unrepresentante >8C separacin de ? @gde lpidos obtenidos de cada e$tractolipdico de levadura &osiciones delpidos est"ndares son mostradas a lai+*uierdaA >56 triacilglicerol4 FF5 los"cidos grasos libres4D56 diacylglycerol fosfolpido4 &8>odos los e$perimentos se llevaron acabo al menos tres veces

pronunciado cuando las clulasueron cultivadas en una mezcla

de glicerol y $cido oleico /0ig. )3.8ultivo de S. cerevisiae en medios


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!ue contienen $cido oleico como%nica uente de carbono, sinembargo, result en m$s extensade oleato de absorcin a travs delos medios de comunicacin, con

un aumento de siete veces entotal contenido en lpidos celularesaproximadamente del )* al +*de peso de celda seca. -L8separacin de lpidos obtenidos de$cido oleico'crecido clulas revel!ue la mayora de los $cidosgrasos ueron esterifcadosen triglicridos. 1dem$s, lacantidad de $cidos grasos librescelular ue sustancialmente menor

en comparacin con otras uentesde carbono, especialmentemezclas de galactosaOoleato yglicerolOoleato. 8ultivo de S.cerevisiae en medios !uecontienen $cido linoleico olinolnico como %nicas uentes decarbono dieron resultadossimilares a los cultivados en $cidooleico /resultados no mostrados3

Las clulas cultivadas en S.cerevisiae galactosa mediaexhiben una simple composicinde $cidos grasos dominado por elpalmtico/+@6>3, palmitoleic /+@6+3,este$rico /+56>3 y =leico /+56+3$cidos /0ig. 3. La inclusin de$cido oleico en la galactosa omedios de glicerol se tradu4o en unaumento en la teleona celular

$cido oleico /+56+3 y la reduccindel contenido de $cido palmitoleic/+@6+3. 8recimiento en $cido oleicocomo %nica uente de carbonoprovocado incluso una mayorincorporacin de $cido oleico, !uerepresenta aproximadamente el


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palmtico ue anormalmente alto,representando m$s del N>* deltotal de $cidos grasos /datos nomostrados3. ;sto sugiere !ue lalipasa hidroliza preerentemente

la raccin palmitoil uera deldetergente, !ue ue a9adido endiez veces por encima deltriacilglicerol en los medios decrecimiento. La incubacin declulas de levadura en presenciade trilinolein y lipasa, sindetergente, dieron lugar a unaabsorcin de $cido linoleicocomparable al observado cuandoel $cido linoleico se present como

un $cido graso libre en los mediosde comunicacin /0ig. N3. 1s pues,la inclusin de un detergente no esni necesario ni deseable para lahidrlisis y la absorcin de lostriglicridos de los $cidos grasos.

;xpresin de lpido';nzimas demodifcacin en la levadurausando un $cido graso'genpromotor inducible

1 la par de los procesos deabsorcin de $cidos grasos enclulas de S. cerevisiae y la

Fig B composicin en "cidos grasosde S cerevisiae clulas cultivadas enpresencia de diferentes fuentes decarbono Clulas de S cerevisiae,cepa MM#9293 fueron cultivadas enmedios *ue contienen indicaronfuentes de carbono4 entonces lasclulas de levadura fueroncosechadas y la composicin de"cidos grasos determinada utili+ando

la cromatografa de gases 8a Famase prepararonutili+ando methanolic.C8 celular paraasegurarse de *ue los "cidos grasoslibres se incluyeron en el an"lisiscomposicional 8os valores indicados

representan el promedio y ladesviacin est"ndar de cuatroe$perimentos independientes 8asbarras representan palmtico,vaco34 palmitoleic ,sombreado34este"rico ,rayas diagonales34 oleico4linoleico ,slida3 ,rayas diagonaleshacia aba)o34 linolnico ,manchas3

expresin de enzimas demodifcacin de lpidos, $cidosgrasos vegetales desaturases ) y /012), 0123 ueron expresados

en clulas de levadura con el $cidograso'inducible 7;B++ promotordel gen de la levadura. ;l 7;B++gen codifca una protena /7ex++73!ue est$ implicado en laprolieracin de peroxisomes enrespuesta a ciertas se9alesambientales /;rdmanny "lobel +


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Fig 9 Inuencia de una lipasainespeccos en la absorcin de"cidos grasos en un medio decrecimiento *ue contengan

triglicridos 8as clulas de levadura,cepa MM#9293 fueron cultivadas enla presencia de "cido linoleico,gratis34 8in ,>ri8in trilinolein34detergente ,!< v=vpolyo$yethylenesorbitanmonopalmitate # >Eeen 9;3 o lipasa,! mg=ml34 y luego se e$tra)eron loslpidos y la composicin de "cidosgrasos determinada utili+ando lacromatografa de gases Contenido de"cido linoleico en levadura lpidos esmostrado 8os valores representan la

media y la desviacin est"ndar detres e$perimentos independientes

el cuarto doplasmic endopl$smico/2yer y Aullen )>>+3. ;l eptopodesaturases ueron marcados yexpres individualmente o encombinacin, en S. cerevisiaeceldas usando el 7;B++ 7romotor,entonces los niveles de protena

ueron evaluados por an$lisis deVestern blot. ;l micnico'0ad)protena ue detectado en lisadosobtenidos de clulas cultivadastanto en dextrosa y $cido oleicomediano /0ig. 3. Kesultadossimilares ueron observados porha'0ad obtenido a partir declulas cultivadas en dextrosa y$cido linoleico /el substratofsiolgico de la 0123. 8o'

expresin de myc'0ad)'0ad y haprovocado la aparicin de ambas

protenas dentro de las clulas dela levadura /0ig. 3. ;xpresin de la012) yOo 012 no inWuye en lacantidad de estado estacionariodolichol manosa osato sintasa,

una protena marcadora de lalevadura de la membrana reticularretculo orazdovsHy y ;AK/ +


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carbono producido sustancialincorporacin de $cido oleico enlevadura de lpidos, representandoel


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grasos. Gn componente clave eneste proceso ue el cultivo declulas de levadura en medios !uecontienen $cidos grasos como%nica uente de carbono, !ue

aumenta la absorcin de $cidosgrasos libres y se tradu4o en unaumento de siete veces en elcelular total contenido lipdico.1un!ue el crecimiento de S.cerevisiae en $cidos grasos como%nica uente de carbono induce laprolieracin de peroxisomes y lasenzimas asociadas de la &'oxidacin de $cidos grasos, lasclulas de levadura crecen muy

bien en esta uente de carbono,con un tiempo de duplicacin deaproximadamente )> h. ;stoproporciona un amplio margen detiempo para la modifcacin de lacomposicin de $cidos grasos portransgenically'expresadas lasenzimas. :normacin signifcativaen los cambios fsiolgicosasociados con el crecimiento de S.cerevisiae sobre los $cidos grasos

pueden ser obtenidos a partir delos estudios de Jal et al. /+> vecescuando las clulas se cultivan en$cido oleico como %nica uente de

carbono /Aarshall et al.+


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remodelar la composicin de$cidos grasos, coherente con laintroduccin de una nueva vametablica !ue conduce de $cidooleico /+56+3 a $cido linolnico

/+563 /-abla +3. -ambinexpresamos la planta desaturases$cidos grasos en una cepa de S.cerevisiae perturbado en el 7;Bgen. ;l 7;B gen codifca elreceptor para la mayora de lasprotenas destinadas a la matrizperoxisomal y celdas !ue carecende este gen son incapaces decrecer en $cidos grasos como%nica uente de carbono debido a

su incapacidad para degradar los$cidos grasos /Subramani et al.)>>>3. La 4ustifcacin para larealizacin de nuestrosexperimentos en un 7;B'perturbado cepas de levadura ue!ue, en ciertas estrategias deingeniera en el metabolismo delos lpidos, puede preverse !ue el$cido graso deseado productosfnales podra ser selectivamente

hidrolizado de membranas ydirigidos por la degradacin dentrode ;ccleston y =hlroggeperoxisomes / +>3. ;n tales casos, la ingenierade lpidos podra realizarse encepas de levadura alterada en sucapacidad para degradar los$cidos grasos por completo. Losresultados presentados en elcuadro + indican !ue elmetabolismo de los lpidos sepueden realizar experimentos deingeniera en 7;B'perturbado S.cerevisiae clulas !ue se cultivanen dextrosa como una uente decarbono, con productos $cidosgrasos acumular a nivelescomparables a los observados enlas clulas de tipo salva4eexpresando las enzimas de las

plantas. Sin embargo, laincapacidad de los 7;B'

perturbado en clulas de levadurapara sobrevivir en los $cidosgrasos como %nica uente decarbono podran limitar suutilizacin a ingeniera de lpidos

estrategias centradas en laconversin de lpidos levadurasendgenas, en lugar de lpidossuministrados de orma exgena,en nuevos productos de lpidos.1lternativamente, 7;B'perturbado en clulas de levadura!ue se podra seguir dise9ado paraevitar esta limitacin. 7or e4emplo,constitutivos, alto nivel deexpresin acil'8o1 graso ligasas

podra permitir la absorcinrobusto y asimilacin de los $cidosgrasos de los medios decrecimiento, aun cuando unauente adicional de carbono, comola dextrosa, est$ incluido en losmedios de comunicacin. 7or%ltimo, uno de nuestros ob4etivos alargo plazo es desarrollar unsistema de expresin microbianospara la bioconversin de aceites

vegetales de ba4o costo enproductos de valor a9adido. Losaceites vegetales se componenprincipalmente de triacilglicerolesy S. cerevisiae normalmente esincapaz de crecer en estoscompuestos como uente decarbono. 1!u, nos demuestran!ue la inclusin de una lipasainespecfca en medios !uecontienen triglicridos acilita lahidrlisis y posterior absorcin delos $cidos grasos en S. cerevisiaeclulas /0ig. N3. ;sto sugiere !ue S.cerevisiae podra ser dise9adopara secretar grandes cantidadesde lipasa para la descomposicinde los triglicridos y laincorporacin de componentes de$cidos grasos. ;sas cepas de S.cerevisiae ha sido descrito

previamente /=HHels +


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cultivo descrito a!u, y laexpresin de los genes por tanto laincorporacin de $cidos grasos ysu modifcacin, podr$ permitir lautilizacin a escala industrial de S.

cerevisiae de bioconversin deba4o costo de las materias primasen productos de valor agregado delpidos.


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