17. Diagnóstico microbiológico de la infección por Helicobacter pylori

I

Procedimientos en Microbiología Clínica

Recomendaciones de la Sociedad Española de EnfermedadesInfecciosas y Microbiología Clínica

Editores: Emilia Cercenado y Rafael Cantón

Coordinador: Manuel López-BreaAutores: Teresa Alarcón

Margarita BaqueroDiego DomingoManuel López-BreaGloria Royo

ISBN: 84-609-392-0

II

INDICE:

INDICE DEL DOCUMENTO CIENTÍFICO

1. INTRODUCCIÓN2. CONSIDERACIONES CLÍNICAS

2.1. Gastritis2.2. Úlcera péptica2.3. Cáncer gástrico2.4. Linfoma gástrico tipo MALT2.5. Manifestaciones extradigestivas

3. TRATAMIENTO3.1. Indicaciones de tratamiento3.2. Pautas de tratamiento3.3. Causas del fracaso del tratamiento

4. DIAGNÓSTICO4.1. Histología y visión microscópica4.2. Prueba de la ureasa

4.2.1. Propósito4.2.2. Métodos de detección de la ureasa

4.3. Cultivo de Helicobacter pylori4.3.1. Recogida de la muestra4.3.2. Transporte y conservación de la muestra4.3.3. Procesamiento de la muestra y medios de cultivo4.3.4. Condiciones de incubación4.3.5. Criterios para interpretación de resultados

4.3.5.1. Identificación del microorganismo4.3.5.2. Subcultivos y conservación de las cepas

4.4. Métodos moleculares4.5. Prueba del aliento (urea breath test, UBT)4.6. Serología

4.6.1. Características de los métodos serológicos4.6.2. Utilidad clínica4.6.3. Recogida de la muestra4.6.4. Transporte y conservación de la muestra4.6.5. Procesamiento de la muestra4.6.6. Criterios para interpretación de resultados

4.7. Antígeno en heces4.7.1. Características de la técnica4.7.2. Recogida de la muestra4.7.3. Transporte y conservación de la muestra4.7.4. Procesamiento de la muestra4.7.5. Criterios para interpretación de resultados

5. PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS5.1. Dilución en agar5.2. Difusión con E-test®5.3. Difusión con discos5.4. Técnicas moleculares

6. BIBLIOGRAFÍA

III

ÍNDICE DE LOS DOCUMENTOS TÉCNICOS

1. PROPÓSITO Y ALCANCE2. FUNDAMENTO3. DOCUMENTOS DE CONSULTA4. MUESTRAS5. MEDIOS DE CULTIVO, REACTIVOS Y PRODUCTOS6. APARATOS Y MATERIAL7. PROCESAMIENTO8. OBTENCIÓN Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS9. RESPONSABILIDADES10. ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTO11. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO12. BIBLIOGRAFÍA

1

Procedimientos en Microbiología ClínicaRecomendaciones de la Sociedad Española de Enfermedades

Infecciosas y Microbiología Clínica

Editores: Emilia Cercenado y Rafael Cantón

17. Diagnóstico microbiológico de la infección por Helicobacter pylori. 2004

Coordinador: Manuel López-Brea

Autores: Teresa Alarcón Margarita Baquero

Diego DomingoManuel López-BreaGloria Royo

2

1. INTRODUCCIÓNHelicobacter pylori es un bacilo gramnegativo, curvadoy microaerofílico que se encuentra en la mucosagástrica del estómago humano asociado a diferentesenfermedades digestivas. H. pylori tiene unamorfología espiral en forma de sacacorchos cuando seencuentra en la mucosa gástrica y menos espiralcuando crece en medios artificiales. Presenta unasdimensiones de 0,5 a 1,0 µm de ancho y de 3 µm delargo y las características estructurales típicas de losbacilos gramnegativos, con una membrana externa.Tiene de 4 a 8 flagelos polares, fundamentales para sumovilidad, y que están recubiertos por una vaina deestructura lipídica, igual que la membrana externa, queparece tener la misión de proteger a los flagelos de sudegradación por el medio ácido. Su característicabioquímica más importante es la ureasa,considerablemente más potente que la de otrasbacterias. Tiene otras dos enzimas muy útiles para suidentificación cuando crece en medios de cultivo queson la oxidasa y la catalasa.La infección por H. pylori es una de las más comunesen el hombre y aunque ocurre en todo el mundo, esmás frecuente en los países en desarrollo y laprevalencia disminuye cuando aumenta el nivelsocioeconómico.La adquisición natural de H. pylori ocurre confrecuencia en la infancia y una vez que se establece, lainfección persiste durante toda la vida, aunque tambiénse ha descrito su eliminación natural. Se considera quesu adquisición es por contacto interpersonal, aunque elcontacto con animales o con agua contaminadatambién se han considerado ocasionalmente comofuentes potenciales de infección.

2. CONSIDERACIONES CLÍNICASCuando H. pylori coloniza la mucosa gástrica humanaproduce una gastritis superficial que puedepermanecer así durante el resto de la vida o bien, alcabo de años o décadas desarrollar un úlcera péptica(duodenal o gástrica) o una gastritis atrófica que podríaser el primer paso para la evolución a cáncer gástrico.También puede desarrollarse un tipo de linfoma, pocofrecuente, que es el linfoma gástrico tipo MALT(mucosa associated lymphoid tissue).Todavía no se conoce claramente por qué en unospacientes la enfermedad es casi asintomática mientrasque en otros se producen enfermedades digestivas dediferente gravedad. Existen factores genéticospredisponentes en el paciente, como el gruposanguíneo, el tipo de antígeno Lewis o el tipo de HLA.También existen factores ambientales como lascondiciones socioeconómicas, el consumo de tabaco ola dieta (la ingestión de sal actúa como factor agresivode la mucosa mientras que el consumo de alimentosanti-oxidantes actúa como factor protector), quepueden influir en el desarrollo de un tipo u otro deenfermedad. Por otro lado, los factores de

patogenicidad de la propia bacteria pueden tener suefecto en el desarrollo de la enfermedad.

2.1. GastritisLa gastritis que se origina después de la infección porH. pylori puede desarrollarse sin manifestaciones obien originar la expresión clínica propia de gastritisaguda (dolor epigástrico, naúseas y vómitos). Lagastritis aguda por H. pylori es un diagnóstico pocofrecuente y cuando se ha descrito ha sido trasingestión accidental o en voluntarios. Su curso es de 7a 10 días y puede evolucionar a la eliminaciónespontánea de H. pylori o, más frecuentemente, a sucronicidad.La gastritis crónica se caracteriza por infiltracióninflamatoria crónica, constituida por linfocitos y célulasplasmáticas, con presencia de folículos linfoides y ungrado variable de actividad (infiltración inflamatoriaaguda). La gastritis crónica por H. pylori es un procesodinámico que evoluciona hacia la atrofia que afecta alantro y a la mucosa transicional y se extiende endirección al cuerpo. También se puede asociar ametaplasia intestinal como respuesta a la agresióncrónica. En áreas metaplásicas no se detecta H. pyloriy la inflamación es menor que en las no metaplásicas.La atrofia y la metaplasia son dos procesos diferentesque pueden presentarse de forma independiente.

2.2. Úlcera pépticaLa asociación de H. pylori con la úlcera duodenal esclara ya que el 90-95% de los pacientes con úlceraduodenal presentan este microorganismo y la úlceracicatriza al erradicar la bacteria. Con respecto a laúlcera gástrica también existe una clara relaciónaunque sólo un 70% de este tipo de úlcera estáasociado con la presencia de H. pylori, debido a que elresto de ellas están producidas por consumo de anti-inflamatorios no esteroides.

2.3. Cáncer gástricoEn el año 1994 la Agencia Internacional para laInvestigación en Cáncer de la Organización Mundial dela Salud (IARC) incluyó a H. pylori como agentebiológico carcinógeno para el hombre (categoría 1)basándose en evidencias epidemiológicas que leasocian con cáncer gástrico.Por otra parte el papel de H. pylori en el cáncergástrico también se comprende porque la gastritiscrónica es un factor de riesgo para el desarrollo deeste tipo de cáncer. Además, el 70% de los pacientescon cáncer gástrico son positivos para H. pylori.

2.4. Linfoma gástrico tipo MALTEl 90% de los pacientes con linfoma MALT sonpositivos para H. pylori. Es un tipo de linfoma que selocaliza preferentemente en el antro del estómago,dado que es la zona donde existe más tejido linfoide.Además, varios estudios apoyan la asociación de H.

DOCUMENTO CIENTÍFICO

3

pylori con esta enfermedad puesto que tras laerradicación de la bacteria se ha observado laregresión del linfoma.

2.5. Manifestaciones extradigestivasSe ha intentado asociar la infección por H. pylori condiferentes enfermedades no digestivas comocardiovasculares (aterosclerosis, cefalea primaria,fenómeno de Raynaud primario), de piel (rosacea,alopecia areata, urticaria idiopática crónica),autoinmunes (Síndrome de Sjögren, neuropatíaisquémica óptica anterior no arterítica), hepáticas(encefalopatía hepática) y respiratorias (bronquitiscrónica, asma bronquial, cáncer de pulmón).

3. TRATAMIENTO3.1. Indicaciones de tratamientoEn los últimos años se han realizado diferentesreuniones de consenso sobre la infección por H. pylori.Entre ellas destacan la del Instituto Nacional de Saludde EE.UU. por ser el primero que recomendó eltratamiento erradicador en pacientes infectados por H.pylori y úlcera duodenal, pero también las que serealizaron en Canadá en 1997 y 1999, el ConsensoAsiático (Asia Pacific Consensus Conference, 1999), elConsenso Latino-americano (2000), el ConsensoEuropeo (Europeo: Maastrich Consensus, 1997 y2000), y el Consenso Español (1999).El Consenso de Maastrich del año 2000 considera queexiste una indicación clara de tratamiento en el casode:

(a) enfermedad ulcerosa péptica: duodenal activao cicatrizada, gástrica o complicada,

(b) linfoma MALT de bajo grado,(c) gastritis atrófica,(d) resección después de cáncer gástrico.

El Consenso Español realizado en 1999 recomiendatambién tratamiento en la duodenitis erosiva y el deMaastrich considera una indicación clara paradiagnosticar y tratar:

(a) los familiares en primer grado de pacientescon cáncer gástrico,

(b) por deseo del paciente.Sería una indicación posible de tratamiento lospacientes con dispepsia funcional, con enfermedad porreflujo gastroesofágico o los pacientes que tomanAINEs aunque estos temas son más discutibles.

3.2. Pautas de tratamientoLas pautas de tratamiento para erradicar H. pyloricombinan 2 o 3 antimicrobianos junto con uncompuesto anti-ulceroso, que permite modificar el pHpara que actúe el antibiótico. Numerososantimicrobianos han demostrado actividad in vitrofrente a H. pylori. Sin embargo, cuando se hanaplicado en pautas de tratamiento han demostradoescasa actividad. Entre los antimicrobianos que hanmostrado buena utilidad clínica se encuentran:

amoxicilina, tetraciclina, metronidazol y claritromicina.La furazolidona, rifabutina o las fluoroquinolonas sonotras opciones terapéuticas.Entre los compuestos anti-ulcerosos se han utilizadocon preferencia inhibidores de la bomba de protones(IBP) (omeprazol, lansoprazol, pantoprazol, rabeprazol,esomeprazol), seguido de compuestos de bismuto(citrato de bismuto, salicilato de bismuto, RBC:ranitidina citrato de bismuto) y en mucha menorfrecuencia los antagonistas de los receptores H2(ranitidina, cimetidina, famotidina, etc).La duración de la terapia habitual ha sido de 7 a 10días, aunque algunos autores han probado pautascortas, de 3 a 5 días que incluyen 3 antibióticos y otrosrecomiendan pautas largas, de más de 10 días.Antes de iniciar una pauta de tratamiento se debeconsiderar el porcentaje de resistencia a losantimicrobianos en esa población o área geográfica.Se recomienda la pauta de tratamiento triple con unIBP y dos antimicrobianos como primera opción. Sieste tratamiento falla, se debe evitar repetir dos vecesla misma pauta y recomienda realizar estudiosmicrobiológicos antes de iniciar una nueva pauta.La primera pauta eficaz utilizada fue la "triple clásica"que asocia un imidazol (metronidazol o tinidazol) contetraciclina y amoxicilina durante dos semanas. Éstafue sustituida por otras que combinan un IBP(normalmente omeprazol) con dos antibióticos(fundamentalmente amoxicilina, claritromicina ymetronidazol). Son más fáciles y cómodas para elpaciente, logrando tasas de erradicación superiores al90%. La asociación de un IBP (generalmenteomeprazol) con claritromicina y amoxicilina (conocidacomo la OCA) es la pauta más utilizada. También sepuede utilizar una triple terapia con un IBP, amoxicilinay metronidazol. Es preferible reservar la pauta queincluye IBP con metronidazol y claritromicina como desegunda línea para evitar que se pueda desarrollarresistencia a los dos antimicrobianos.La combinación de un IBP y dos antibióticos con lassales de bismuto se conoce como "terapia cuádruple",alcanza altas tasas de erradicación pero debereservarse también para cuando fallen otras terapias.Recientemente se han propuesto pautas que asocianun IBP con fármacos como rifabutina o levofloxacino yamoxicilina, aunque con ellas se tiene todavía pocaexperiencia.

3.3. Causas de fracaso del tratamientoEn el fracaso del tratamiento pueden intervenir factoresrelacionados con el mismo tratamiento, factores delpaciente y factores de las cepas. Entre los primerospodemos citar las dosis inadecuadas, una duraciónincorrecta del tratamiento y el tipo y la dosis delinhibidor de la bomba de protones utilizado. Entre losfactores del paciente destaca el cumplimiento deltratamiento (por el elevado número de dosis, por losefectos secundarios, etc) y el país donde se realizó el

4

ensayo. Entre los factores del microorganismo es muyimportante la resistencia a los antibióticos y quizá lascaracterísticas particulares de la cepa.El desarrollo de resistencia a amoxicilina y tetraciclinaes poco frecuente. Sin embargo, la resistencia almetronidazol es muy elevada en algunas poblaciones ya la claritromicina está aumentando en diferentespoblaciones, siendo un problema cada vez mayor. Lainfección por cepas resistentes a claritromicina o ametronidazol supone una importante contrariedadporque se relaciona con fallo del tratamiento.

4. DIAGNÓSTICOPara diagnosticar la infección por H. pylori se puedenrealizar métodos invasivos (requieren endoscopia contoma de biopsia gástrica) o métodos no invasivos (norequieren endoscopia previa).A la hora de elegir uno u otro método hay que tener encuenta el objetivo del diagnóstico (epidemiológico,diagnóstico o de seguimiento), el centro en el que nosencontramos (experiencia del personal y disponibilidadde medios) y las características del paciente(prevalencia de H. pylori en la población, edad delpaciente, medicación previa, etc). No se debe olvidarque mientras que todos los métodos pueden servirpara diagnosticar la infección por H. pylori (condiferentes porcentajes de sensibilidad y especificidad),la endoscopia con toma de biopsia para estudiohistológico permite además diagnosticar el tipo deenfermedad. Por otra parte, el cultivo es imprescindiblepara conocer la sensibilidad a los antimicrobianos, conel fin de aplicar el tratamiento más efectivo en cadapaciente, pero también para conocer los porcentajesde sensibilidad en cada población.

4.1. Histología y visión microscópicaEl estudio histológico de la biopsia permite conocer laslesiones de la mucosa además de detectar la infecciónpor H. pylori. La confirmación histológica de lainflamación de la mucosa es fundamental para eldiagnóstico de la gastritis y su clasificación. Ademáspermite detectar zonas de metaplasia intestinal.Revisaremos únicamente las tinciones que se puedenrealizar desde el punto de vista microbiológico paradiagnosticar la infección por H. pylori.La técnica de tinción a partir de biopsia gástrica es unatécnica fácil, rápida, de muy bajo coste y alta utilidaden el estudio de la infección por el microorganismo. Sehan utilizado diferentes tinciones como la de Gram,Gram modificada o bien el examen en fresco utilizandoun microscopio con contraste de fases. Otras tincionesson útiles, además de para determinar el diagnósticode la infección, para conocer el grado de patologíagástrica. Entre ellas destacan las tinciones de Giemsa,carbolfuchina, Genta, la tinción triple decarbolfuchina/azul de Alcina/hematoxilina-eosina ytinciones de inmunohistoquímica.

Se han hecho modificaciones sobre las tincionespreviamente descritas, como la realizada en nuestrolaboratorio que consiste en una tinción de Grammodificada, utilizando como contracolorantecarbolfuchina y dejándola actuar durante un tiemposuperior al habitual (de 2-5 minutos).La visión microscópica tiene una sensibilidad yespecificidad menor que la del cultivo y para obtenerbuenos resultados es necesario realizar una improntadensa en el portaobjetos, lo cual se consigue bienimpregnando intensamente la biopsia a lo largo delmismo, bien colocando sobre el portaobjetos 2-3 gotasde la biopsia homogeneizada. Para conseguir unabuena sensibilidad se recomienda partir de dosbiopsias, una de antro y otra de cuerpo.

4.2. Prueba de la ureasa4.2.1. PropósitoH. pylori posee una ureasa que le capacita para lacolonización y persistencia en la cavidad gástrica. Selocaliza tanto en la membrana externa como en elespacio periplásmico y está compuesta por complejosde una estructura hexamérica. Se ha comprobado quemutantes isogénicos carentes de la enzima sonincapaces de colonizar animales de experimentación.La potencia de la ureasa es muy superior a la de otrasbacterias, incluida Proteus spp. La enzima cumple tresfunciones principales: protección frente al ácido de lamucosa gástrica, provisión de nitrógeno en forma deamonio y como factor de virulencia en la patogenia dela úlcera gástrica.El fundamento de la prueba rápida de la ureasaconsiste en detectar la presencia de la enzima de lasiguiente forma: H. pylori descompone la urea enanhídrido carbónico y amoniaco, lo cual genera un pHbásico que va a ponerse en evidencia mediante elcambio de color del medio de naranja-amarillo a rosafuerte debido a la acción del indicador de pH.

NH2-CO-NH2 ! CO2 + NH3

4.2.2. Métodos de detección de la ureasaLa prueba de la ureasa rápida se puede realizardirectamente con la muestra de biopsia gástrica,obtenida mediante endoscopia digestiva alta. Serecomiendan dos biopsias, una de cuerpo y otra deantro para el diagnóstico. Las muestras pueden serinoculadas en la misma sala de endoscopias por loque no necesitan ningún medio de transporte.Existen diferentes reactivos comerciales dirigidos adetectar la enzima a partir de biopsia. Todos elloscontienen urea a diferentes concentraciones (se estimaque hasta un máximo del 6% porque concentracionessuperiores pueden inhibir la enzima) y un indicador depH y varían en el diseño de los mismos: existen “test”de gelosa como Clotest®, HUTtest® y Hpfast® en losque la muestra se introduce en un medio semisólidoque contiene los reactivos, “tests” de membrana, en losque los reactivos están contenidos en una tira de

5

papel, como Pyloriteck® y Pronto Dry® y “tests” enmedio líquido como Helicochek®.En general son sistemas comerciales muy sencillos deutilizar y los resultados se interpretan en un intervalocorto de tiempo (media hora), observando el cambio enel color del reactivo. Los resultados de sensibilidad yespecificidad son en general superiores al 80% y 90%,respectivamente.También se puede utilizar una solución preparada enel laboratorio que contenga urea al 3-4% e indicadorde pH, sin embargo los resultados de sensibilidadpueden ser algo menores. La solución se puedepreparar con 60 g/L de urea, 0,012 g/L de rojo fenol, 2g/L de KH2PO4, 1 g/L de peptona, 5 g/L de NaCl y 10g/L de glucosa en agua destilada.

4.3. Cultivo de Helicobacter pyloriEl aislamiento mediante cultivo de H. pylori es sin dudael método más especifico en el diagnóstico delmicroorganismo. No obstante su sensibilidad varíanotablemente en relación con diferentes variablescomo la recogida, transporte y almacenamiento de lamuestra, los medios de cultivo utilizados y lascondiciones de incubación (porcentaje de CO2 yhumedad, principalmente). Se puede considerar comoun método tedioso e incluso de difícil realización, perodebe efectuarse de rutina si se realiza la endoscopiaya que aporta un gran número de ventajas en elestudio de la bacteria. Entre ellas destaca elconocimiento de la sensibilidad a los diferentesantimicrobianos, la caracterización de factores devirulencia y la posibilidad del tipado de cepas con finesepidemiológicos.

4.3.1. Recogida de la muestraLa muestra más habitual para el cultivo de H. pylori esla biopsia a partir de mucosa gástrica. Elmicroorganismo se encuentra predominantemente enla parte antral del estómago, excepto en individuostratados con IBP y antihistamínicos anti-H2, en los quese encuentran densidades más grandes en el cuerpo.Se encuentra, igualmente en mayor proporción en elantro gástrico en comparación con duodeno incluso enpacientes con duodenitis. Debido a la distribuciónparcheada se recomiendan varias biopsias para elaislamiento. Para obtener resultados óptimos serequieren cuatro biopsias, si bien se acepta de unamanera general y de acuerdo con la clasificaciónmodificada de Sydney que para asegurar undiagnóstico suficiente se deben procesar para cultivoal menos una muestra de antro y, si es posible, dos decuerpo.Se han utilizado otras muestras gástricas como jugogástrico, la obtenida mediante la prueba del hilo(“string test”) y el aislamiento a partir de vómitos,aportando diferentes resultados. H. pylori se hacultivado puntualmente también de muestras

extragástricas como placa dental, esófago, recto yvejiga urinaria.Cualquier antibiótico con actividad frente a H. pylorireducirá considerablemente el número de bacterias enel estómago. Si el paciente ha estado en tratamientocon antibióticos es necesario esperar al menos cuatrosemanas tras la última dosis para obtener resultadossatisfactorios en lo que respecta al cultivo.Otro aspecto importante a tener en cuenta es lalimpieza de los fórceps con los que se realizan lasbiopsias. Estos dispositivos deben desinfectarseadecuadamente para evitar contaminaciones entre lospacientes, si bien si la desinfección es demasiadofuerte puede perjudicar la viabilidad de la bacteria.

4.3.2. Transporte y conservación de la muestraH. pylori es un microorganismo lábil y el procesamientode la muestra debe realizarse de una forma rápida unavez que esta ha sido obtenida.Si el procesamiento es inmediato se debe introducir labiopsia en un tubo estéril con 0,5 ml de suero salino, sibien otros autores recomiendan dejar la muestra sobrela pared del tubo sin introducirla en el suero. H. pyloripermanece viable en suero salino hasta 6 horas, deforma que si la siembra se realiza con posterioridad, labiopsia debe introducirse en medio de transportesemisólido para aumentar la viabilidad de la bacteriahasta 48 h si se conserva en nevera a 40C.No obstante la mejor alternativa parece ser procesar labiopsia durante las cuatro horas posteriores tras larecogida de la muestra.

4.3.3. Procesamiento de la muestra y medios de cultivoPrevia a la inoculación es conveniente realizar unahomogeneización de la biopsia bien mediante unmortero de cristal o preferiblemente con un trituradoreléctrico en un volumen pequeño de suero fisiológico.El objetivo no es romper completamente el tejido sinomejorar la liberación de las bacterias de la superficiedel mismo. Una vez realizada la homogeneización dela muestra se deben colocar dos gotas delhomogeneizado en un medio selectivo y otras dos enotro no selectivo.H. pylori es un microorganismo capaz de crecer endistintos medios de cultivo si bien requiere diferentesfactores de crecimiento. Es difícil de cultivar en mediolíquido aunque se logra con menor dificultad a partir decaldo de Brucella, cerebro-corazón, Mueller-Hinton ytripticasa soja, todos ellos suplementados connutrientes, siendo el más común el suero bovino fetal.Los medios de cultivo sólidos base más frecuentes sonagar Mueller-Hinton y agar Columbia y lossuplementos más comúnmente empleados son lasangre o derivados de ella. Otros suplementos son elsuero de caballo, lisado de eritrocitos y hemina,extracto de levadura, peptona, e Isovitalex, si bien losresultados no son mejores que los obtenidos con suerobovino fetal o sangre. Recientemente se ha mostrado

6

prometedor en el cultivo del microorganismo unextracto obtenido de cianobacterias.Dos aspectos importantes a considerar en relacióncon la sangre son, en primer lugar la cantidad utilizada,ya que un aumento en la proporción al 7-10% mejorasignificativamente el crecimiento en comparación conel 5%. En segundo lugar el tipo de sangre utilizada,encontrándose un crecimiento más denso con sangrede caballo al 10% y lisada al 7%.Con el objeto de evitar el sobrecrecimiento decontaminantes que pueden acompañar a H. pylori enla biopsia es necesaria la utilización de inhibidores queno afecten su viabilidad. H. pylori es resistente in vitroa la vancomicina, sulfametoxazol, trimetoprim,cefsulodina y polimixina B, los cuales pueden utilizarseen los medios selectivos para su aislamiento.

4.3.4. Condiciones de incubaciónH. pylori es un microorganismo microaerofílico querequiere para su crecimiento una atmósfera con lassiguientes características: 5-10% de O2, 5-10% de CO2y 80-90% de N2 a 35-37ºC, una humedad del 95% yuna incubación de hasta 10 días antes de considerarnegativo el cultivo. Estas condiciones se obtienen bienutilizando cabinas de microaerofilia o con sobrescomerciales que proporcionen las característicasanteriores. Estos últimos proporcionan resultados muybuenos pero tienen como inconveniente la necesidadde reemplazar los sobres una vez abiertas las jarras.

4.3.5. Criterios para interpretación de resultados.4.3.5.1. Identificación del microorganismo. La

identificación se realiza mediante visualización enfresco con un microscopio de contraste de fases paraver la morfología o bien mediante una tinción de Gram.Las pruebas positivas de catalasa, ureasa y oxidasaconfirman la identificación como H. pylori.

4.3.5.2. Subcultivos y conservación de las cepas.Una vez realizado el aislamiento se debe subcultivarcada 48-72 horas en medios no selectivos en lascondiciones anteriormente expuestas. Las cepas sepueden conservar en caldo tripticasa soja o infusión decerebro corazón con glicerol al 20% en congelador a –800C o en nitrógeno líquido.

4.4. Métodos molecularesEn los últimos años se han desarrollado numerosastécnicas que permiten detectar la presencia del ADNde H. pylori directamente en la biopsia gástrica perotambién en otras muestras como heces, saliva o agua.La mayoría de las técnicas se basan en la PCR, tantoclásica como en tiempo real. El objetivo de todas ellasha sido:

- detección de genes específicos de la bacteria.Permite detectar H. pylori en diferentesmuestras. Se ha utilizado el estudio del gen de laureasa (ureA o ureC), el gen 16S ARNr u otrosgenes,

- detección de factores de virulencia. Aunque sehan realizado numerosos estudios actualmenteno tienen una clara aplicación práctica pues nose puede caracterizar a una cepa como maspatógena con el fin de tratar o no, en base a lapresencia de estos genes de virulencia.

- detección de mecanismos de resistencia(principalmente a claritromicina, ver apartado 5).

4.5. Prueba del aliento (urea breath test, UBT)Es un método indirecto que se basa en la presencia dela ureasa de H. pylori. El paciente ingiere una solucióncon urea marcada isotópicamente con 13C (noradioactivo) o 14C (radioactivo) y se recoge el aliento30 minutos después de la ingestión de la solución deurea; previamente se habrá recogido otra muestra dealiento basal. Si H. pylori se encuentra en el estómago,éste hidroliza la urea gracias a su ureasa y se liberaCO2 marcado (13C o 14C) que se absorbe, difunde asangre y transporta a los pulmones y es liberado con elaliento.Los resultados se miden como la relación de 13C o14C/12C de la prueba con respecto al estándar. Tanto elsistema radiactivo como el no radiactivo presentansimilares porcentajes de sensibilidad aunquegeneralmente se prefiere el no radiactivo si se disponedel espectrómetro de masas.Estas pruebas tienen una excelente sensibilidad yespecificidad para el diagnóstico y seguimiento deltratamiento antimicrobiano con la ventaja de ser unaprueba global que valora la presencia de H. pylori en elestómago y no se ve sometido al sesgo que puedentener otras pruebas por la distribución parcheada de labacteria en el estómago. También tienen otrasventajas, como el ser una prueba no invasora y nodepender de las condiciones de transporte, ni de laexperiencia del personal técnico. La prueba del alientoindica una infección actual por la bacteria ya que enuna infección pasada el resultado sería negativo. Poresto es útil como seguimiento del tratamiento realizado4 a 6 semanas después de finalizado.Recientemente, se está utilizando un nuevo analizadorcon espectrometría de infrarrojos que permite larealización de la técnica en la consulta del clínico enpocos minutos.

4.6. Serología4.6.1. Características de los métodos serológicosLos métodos serológicos se basan en la detección deanticuerpos específicos frente a H. pylori en suero,saliva u orina. La serología es útil en el estudio depoblaciones seleccionadas, sin embargo, su principalproblema radica en que no puede diferenciar lainfección activa de la exposición previa almicroorganismo. El rendimiento de las pruebasserológicas puede verse afectado por el métododiagnóstico considerado como referencia (goldestándar), la clase de anticuerpo, el tipo de antígeno y

7

la técnica serológica utilizada, así como por lapoblación estudiada.H. pylori provoca una respuesta inmunitaria, tanto localcomo sistémica. El sistema inmune responde con unaumento transitorio de IgM, seguido de un aumento deanticuerpos de los tipos IgG e IgA que persistendurante la infección. Puesto que los anticuerpos IgMse detectan sólo transitoriamente, tienen poco valorpara el diagnóstico. La principal respuesta sistémica esde tipo IgG por lo que la detección de estosanticuerpos es la más utilizada para el diagnóstico.La prevalencia de anticuerpos tipo IgG en adultossanos en España es alta, por lo que su detección en eldiagnóstico de la infección por H. pylori origina unelevado porcentaje de falsos positivos y por tanto,hacen falta técnicas complementarias para llegar a undiagnóstico correcto. Un meta-análisis de 21 sistemascomerciales de detección de IgG mostró unasensibilidad del 85% y una especificidad del 79%. Encuanto al valor diagnóstico de la IgA, existendiscrepancias entre los autores y no parece añadirmayor eficacia a la determinación de anticuerpos IgG.Se han utilizado varias clases de antígenos, que vandesde células enteras o sonicadas hasta antígenosparcial o altamente purificados (ureasa, etc.). Ladetección de anticuerpos específicos contra algunasproteínas del microorganismo, como CagA y VacApuede tener especial interés en estudios sobrevirulencia. Puesto que la detección de anticuerposdepende del antígeno utilizado, considerando laheterogeneidad genética de H. pylori y las variacionesgeográficas, algunos autores recomiendan el uso demezclas de antígenos procedentes de varias cepaspara mejorar la sensibilidad de estas técnicas así comosu valoración en cada medio.La técnica más utilizada es el EIA cuantitativo, quepermite, además del diagnóstico primario, lamonitorización del tratamiento. Los métodosserológicos cualitativos muestran peores resultados ylos métodos rápidos no se recomiendan. Las técnicasque detectan anticuerpos en saliva y en orina sonatractivas, ya que estas muestras son fáciles deobtener, pero en ellas, la concentración de anticuerposes más baja que en suero. Los resultadosprometedores de algunos trabajos no se hanconfirmado en estudios multicéntricos por lo que no serecomiendan en el diagnóstico.Los métodos basados en la técnica del Western Blotse utilizan para el estudio de la respuesta frente aantígenos concretos, como CagA y VacA.4.6.2. Utilidad clínicaMientras los estudios serológicos son de indudablevalor para conocer la epidemiología de este patógeno,su valor en el diagnóstico debe interpretarse concautela ya que existe una elevada seroprevalencia enpoblaciones sanas, por lo que en nuestro medio, losresultados positivos para adultos pueden ser noconcluyentes.

Una importante ventaja de los métodos serológicos, esque sus resultados no se ven afectados por eltratamiento reciente con antibióticos o inhibidores de labomba de protones, que pueden inducir falsosnegativos con otros métodos.El Grupo de Consenso Europeo para el Estudio deHelicobacter recomienda la realización de técnicasserológicas en el ámbito de atención primaria, enpacientes menores de 45 años con síntomas dedispepsia y sin signos de "alarma" (anemia, pérdida depeso, etc.). En atención especializada, no existeconsenso sobre la utilidad de la serología comométodo de filtrado preendoscópico.En menores de 12 años, la sensibilidad de la serologíaes demasiado baja para utilizarse como cribado.Puesto que la especificidad está entorno al 90%, unresultado positivo podría considerarse diagnóstico deinfección por H. pylori en este grupo de pacientes.En caso de hemorragia digestiva, la serología es unade las técnicas más sensibles, pero también planteaproblemas de especificidad y de bajo valor predictivonegativo, por lo que no debe emplearse como únicométodo diagnóstico de la infección por H. pylori encaso de úlcera péptica sangrante.En la monitorización de la respuesta al tratamiento, ydebido al lento descenso del título de anticuerpos (3-6meses) no es ésta la técnica de elección, sin embargo,varios estudios han mostrado que los EIA cuantitativospueden ser útiles en algunos casos.La eficacia de la serología en el seguimiento de larespuesta al tratamiento se relaciona directamente conel nivel de anticuerpos pretratamiento y el tiempo deseguimiento entre las muestras pre y postratamiento.Se recomienda realizar pruebas cuantitativas con losdos sueros del paciente (pre y postratamiento)analizados simultáneamente. En pacientes con altostítulos pretratamiento se observa un descensosignificativo en el título de anticuerpos después de 3-6meses de tratamiento efectivo. Este descenso deanticuerpos sólo se mantiene en pacientes curados.Existen diferentes métodos comerciales que se basanfundamentalmente en la detección de IgG medianteELISA. Son muy útiles para la realización de estudiosepidemiológicos. Cada uno de los métodos tienedistinta sensibilidad y especificidad.

4.6.3. Recogida de la muestraLas técnicas serológicas se realizan con una muestrade suero que se debe recoger y procesar de acuerdocon la normas microbiológicas habituales (Recogida,transporte y procesamiento general de muestras en ellaboratorio de Microbiología, PNT-RTP-01, SEIMC2003).

4.6.4. Transporte y conservación de la muestraLas muestras de suero deben transportarse yconservarse según la normativa habitual (Recogida,transporte y procesamiento general de muestras en el

8

laboratorio de Microbiología, PNT-RTP-01, SEIMC2003).

4.6.5. Procesamiento de la muestraLas muestras de suero deben procesarse según lanormativa habitual (Recogida, transporte yprocesamiento general de muestras en el laboratoriode Microbiología, PNT-RTP-01, SEIMC 2003).

4.6.6. Criterios para interpretación de resultadosLos criterios de interpretación de los resultadosdependen de cada uno de los equipos comerciales ypor lo tanto es necesario seguir rigurosamente lasrecomendaciones de cada fabricante.

4.7. Antígeno en heces4.7.1. Características de la técnicaEs un método directo no invasivo que permite ladetección de antígeno de H. pylori en muestras deheces. Existen varios sistemas comerciales quepermiten detectar la presencia de antígeno en hecescon anticuerpos policlonales o monoclonales y puedenexistir pequeñas diferencias entre ellos.Se ha descrito como válida para establecer eldiagnóstico inicial, verificar la eficacia del tratamientoen las cuatro o seis semanas posteriores a surealización y comprobar la reaparición de unainfección. Se trata de un ensayo cualitativo (nocuantitativo). La técnica aporta una información muyvaliosa por la fácil obtención y conservación de lasmuestras, se puede realizar en cualquier laboratorio demicrobiología y no necesita la colaboración delpaciente (como en el caso de la prueba del aliento). Esmuy útil en niños pequeños. Puede utilizarse tantopara el diagnóstico de colonización por H. pylori comopara el seguimiento después del tratamientoerradicador.El primer equipo comercializado fue el PremierPlatinum HpSA (Meridian diagnostics) consiste en unatécnica de enzimoinmunoanálisis preparado conanticuerpos policlonales anti-H. pylori. Presentaexcelente especificidad pero existen datos variables desensibilidad (de 57,7% a 96,6% según los estudios).El equipo FemtoLab (Connex, Munich, Germany)también comercializado con el nombre Amplified-IDEAa-HpSTAR (Dako, Glostrup, Denmark) consisteen una técnica de enzimoinmunoanálisis realizado conanticuerpos monoclonales anti-H. pylori que presentamejores resultados de sensibilidad (de 88 a 98%según los estudios).Recientemente se ha desarrollado un sistema deinmunocromatografía ImmunoCard STAT HpSA(Meridian Diagnostics) realizado con anticuerposmonoclonales que presenta valores de sensibilidad de73 a 96% aunque todavía está poco estudiado.Por lo tanto, en función de los estudios actualmentedisponibles, el sistema más recomendable es elsistema de EIA con anticuerpos monoclonales por sus

mejores resultados en cuanto a sensibilidad de latécnica y por la buena reproducibilidad.4.7.2. Recogida de la muestraLa muestra para detección de antígeno es unamuestra de heces que debe recogerse y conservarsesegún la normativa habitual (Recogida, transporte yprocesamiento general de muestras en el laboratoriode Microbiología, PNT-RTP-01, SEIMC 2003).

4.7.3. Transporte y conservación de la muestraLas muestras de heces deben transportarse yconservarse según la normativa habitual (Recogida,transporte y procesamiento general de muestras en ellaboratorio de Microbiología, PNT-RTP-01, SEIMC2003).

4.7.4. Procesamiento de la muestraLas muestras de heces deben procesarse según lanormativa habitual (Recogida, transporte yprocesamiento general de muestras en el laboratoriode Microbiología, PNT-RTP-01, SEIMC 2003).

4.7.5. Criterios para interpretación de resultadosLos criterios de interpretación de los resultados varíansegún los equipos comerciales y por lo tanto esnecesario seguir rigurosamente las recomendacionesde cada fabricante.

5. PRUEBAS DE SENSIBILIDAD AANTIMICROBIANOSLa determinación de la sensibilidad in vitro de H. pylori alos agentes antimicrobianos es importante ya que laresistencia primaria o adquirida a varios antibióticos seasocia con la ausencia de erradicación de la bacteria enel estómago.Actualmente existe una recomendación del NacionalCommittee for Clinical laboratory Standards (NCCLS)que aconseja el método de dilución en agar y establecepuntos de corte para claritromicina. Sin embargo, laBritish Society for Antimicrobial Chemotherapy (BSAC)recomienda difusión con E-test. Por último, la difusióncon disco también se ha utilizado por diferentes autores.

5.1 Dilución en agarEs el método de referencia pero no aplicable de formarutinaria para cada cepa aunque es válido paraconfirmar los resultados obtenidos por otros métodos yrealizar estudios con el objeto de conocer la tasa globalde resistencia en un área determinada. La metodologíaque recomienda el NCCLS es la siguiente:

- Medio: Mueller-Hinton agar suplementado con 5%de sangre de carnero (de más de 2 semanas).

- Inóculo: Preparar un 2 de MacFarland (1x107 a1x108 ufc/mL) en solución salina a partir de unsubcultivo de 72 horas de H. pylori en agarsangre.

9

- Incubación: 3 días en atmósfera microaerofílicaproducida con sobre generador de gas válido paraCampylobacter.

- Se debe utilizar la cepa control H. pylori ATCC43504 para la que existen límites aceptables devalor de CMI de: amoxicilina (0,016-0,12 mg/L),claritromicina (0,016-0,12 mg/L), metronidazol(64-256 mg/L), telitromicina (0,06-0,5 mg/L) ytetraciclina (0,12-1,0 mg/L).

- El punto de corte de resistencia a claritromicina serecoge en la tabla 1, considerando que elantibiótico se utiliza en una de las pautasaprobadas por la FDA junto con un inhibidor de labomba de protones o ranitidina-citrato de bismuto.

5.2. Difusión con E-testEs un método cuantitativo para realizar las pruebas desensibilidad in vitro basado en la difusión. El métododel epsilómetro está especialmente recomendado enorganismos exigentes y cuando se deben probarpocos microorganismos o pocos antibióticos. Tienediferentes ventajas sobre los métodos tradicionales dedilución en agar, dilución en caldo o difusión en agar.La correlación de este método con la dilución en agarno es buena cuando se estudia metronidazol. LaBritish Society for Antimicrobial Chemotherapy (BSAC)recomienda:

- Medio de cultivo: Mueller-Hinton o Wilkins-Chalgren suplementado con 5-10% de sangre decaballo.

- Inóculo: resuspender colonias de un cultivo de 2 a3 días de incubación en agua destilada estéril yajustar a un 3 de McFarland, e inocular lasuperficie de una placa con una torundaempapada en esta suspensión. Aplicar la tira deE-test después de dejar que se seque el inóculoaplicado.

- Incubación: a 35ºC en microaerofília durante 3 a 5días y leer la CMI como el punto en el que existeuna inhibición completa del microorganismo.

- Los puntos de corte de resistencia se muestranen la tabla 1.

5.3. Difusión con discosEs el método más fácil y barato para determinar lasensibilidad in vitro, pero no hay muchos estudios decorrelación entre los valores de CMI y los diámetros deinhibición en el caso de H. pylori, por lo que no es elmétodo más adecuado. Teniendo en cuenta que elmétodo de dilución en agar no es aplicable de rutina yel método del E-test es caro y que también seobservan discrepancias con metronidazol, McNulty en2002 realizó una revisión de los estudios en los que sehabía utilizado difusión con disco, recomendando:

- Medio de cultivo: Mueller-Hinton o Columbiasuplementado con 5 a 10% de sangre (decaballo o carnero).

Tabla 1. Puntos de corte recomendados por laNCCLS o por la BSAC.

NCCLS BSACMétodo Dilución en agar E-test

Punto corte (mg/L) Punto corte (mg/L)S I R S R

Amoxicilina <1 >2Claritromicina <0.25 0.5 >1 <1 >2Tetraciclina <2 >4Metronidazol <4 >8

- Inóculo: preparar un inóculo de un 4 deMcFarland (108 ufc/mL) a partir de un cultivo demenos de 4 días de incubación.

- Concentración de discos y puntos de corte: parametronidazol recomienda utilizar un disco de 5µg y considera resistente si el halo es <16 mm,intermedio si 16-21 mm y sensible si >21 mm.En las cepas con sensibilidad intermedia serecomienda la realización de un método dedeterminación de CMI. Para claritromicina espreferible la utilización de un disco de 2 µgconsiderando resistente cuando no existe halode inhibición. También se puede utilizar un discode 15 µg de claritromicina y considerar resistentesi el halo es de <18 mm.

5.4 Técnicas molecularesLa resistencia a la claritromicina se produce por unamutación puntual en el ARN ribosomal 23S en laposición 2142 (cambio de adenina por guanina ocitosina) o en la posición 2143 (cambio de adenina porguanina). Se han desarrollado diversas técnicasmoleculares para detectar esta resistencia, que se hanutilizado en cepas cultivadas in vitro pero tambiéndirectamente en muestras de biopsia gástrica.La detección de las mutaciones que confierenresistencia a claritromicina en H. pylori se ha realizadomediante PCR. Se amplifica un fragmento de 1,4 Kpbcorrespondiente al dominio V de la región 23S delARNr y se detecta la mutación en A2142G y A2143Gtras digestión con las enzimas MboII y BsaI,respectivamente.También se han utilizado técnicas de secuenciación,de PCR “mismatcheada”, de PCR y ensayo de unióncon oligonucleótido (PCR-OLA) y de hibridación tantoen fase sólida (LiPA) como en líquida. Recientementese ha utilizado con éxito la PCR en tiempo real; estaúltima permite detectar cualquier tipo de mutación en laregión de la sonda y el proceso se realiza en 1 hora.La ventaja de las técnicas moleculares es la rapidez enobtener resultados y la excelente correlación con lasensibilidad obtenida por métodos fenotípicos. Laprincipal desventaja es que sólo sirve para detectarresistencia a macrólidos y que se requieredisponibilidad de este tipo de técnicas en ellaboratorio.

10

6. BIBLIOGRAFÍAGeneral

1. Asaka M, Dragosics BA. Helicobacter pylori and gastricmalignancies. Helicobacter 2004; 9:35-41.

2. Glupczynski Y. Diagnóstico microbiológico de lainfección por Helicobacter pylori. En Helicobacter pylori:retos para el siglo XXI. Microbiología, clínica ytratamiento. Manuel López-Brea (editor). Prous Science,Barcelona 1999, pp. 41-54.

3. Makristathis A, Hirschl AM, Lehours P, Megraud F.Diagnosis of Helicobacter pylori infection. Helicobacter2004; 9:7-14.

4. Malfertheiner P, Megraud F, O,Morain C, et al. TheEuropean Helicobacter pylori Study Group (EHPGS).Current concepts in the management of Helicobacterpylori infection. The Maastrich 2-2000 Consensus report.Aliment Pharmacol Ther 2002; 16:167-180.

5. Megraud F, Lamouliatte H. The treatment of refractoryHelicobacter pylori infection. Aliment Pharmacol Ther2003; 17:1333-1343.

6. NIH Consensus Conference. Helicobacter pylori in pepticulcer disease. NIH Consensus Development Panel onHelicobacter pylori in peptic ulcer disease. JAMA 1994;272:65-69.

7. Sainz R, Borda F, Dominguez E, Gisbert JP.Helicobacter pylori infection. The Spanish consensusreport. The Spanish Consensus Conference Group. RevEsp Dig 1999; 91:777-784.

8. Versalovic J, Fox JG. Helicobacter. En: Murray PR,Baron EJ, Jorgensen JH, Pfaller MA, Yolken RH. Manualof Clinical Microbiology (8 Ed). ASM Press Washington,2003 pp. 915-928.

EspecíficaUreasa rápida

1. Laine L, Lewin D, Naritoku W, Estrada R, Cohen H.Prospective comparison of commercially available rapidurease tests for the diagnosis of Helicobacter pylori.Gastrointest Endosc 1996; 44:523-526.

2. Morio O, Rioux-Leclercq N, Pagenault M, Corbinais S,Ramee MP, Gosselin M, Bretagne JF. Prospectiveevaluation of a new rapid urease test (Pronto Dry) for thediagnosis of Helicobacter pylori infection. GastroenterolClin Biol 2004; 28:569-573.

Cultivo1. Fresnadillo Martínez MJ, Rodríguez Rincón M, Blázquez

de Castro AM, García Sánchez E, García Sánchez JE,Trujillano Martín I, Cordero Sánchez M, Alvarez AlvarezP, Paz Bouza J, García-Rodríguez JA. Comparativeevaluation of selective and nonselective media forprimary isolation of Helicobacter pylori from gastricbiopsies. Helicobacter 1997; 2:36-39.

2. Ndip RN, MacKay WG, Farthing MJ, Weaver LT.Culturing Helicobacter pylori from clinical specimens:review of microbiologic methods. J Pediatr GastroenterolNutr 2003; 36:616-622.

Serología1. Herbrink P, Van Doorn LJ. Serological methods for

diagnosis of H. pylori infection and monitoring oferadication therapy. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2000;19:164-173.

2. Vakil N, Vaira D. Non-invasive tests for the diagnosis ofH. pylori infection. Rev Gastroenterol Dis 2004; 4:1-6.

Antígeno en heces1. Andrews J, Marsden B, Brown D, Wong VS, Wood E,

Kelsey M. Comparison of three stool antigen tests forHelicobacter pylori detection. J Clin Pathol 2001; 56: 769-771.

2. Koletzko S, Konstantopoulos N, Bosman D, Feydt-SchmidtA, van der Ende A, Kalach N, Raymond J, Russmann H.Evaluation of a novel monoclonal enzyme immunoassayfor detection of Helicobacter pylori antigen in stool fromchildren. Gut 2003; 52: 804-806.

Sensibilidad1. Domingo D, Alarcón T. Mecanismo de resistencia a

antibióticos en Helicobacter pylori. En Helicobacter pylori:retos para el siglo XXI. Microbiología, clínica y tratamiento.Manuel López-Brea (editor). Prous Science, Barcelona1999, pp. 307-325.

2. Lascols C, Lamarque D, Costa JM, Copie-Bergman C, LeGlaunec JM, Deforges L, Soussy CJ, Petit JC, Delchier JC,Tankovic J. Fast and accurate quantitative detection ofHelicobacter pylori and identification of clarithromycinresistance mutations in H. pylori isolates from gastricbiopsy specimens by real-time PCR. J Clin Microbiol 2003;41:4573-4577.

3. López-Brea M, Alarcón T. Sensibilidad a losantimicrobianos en la infección por Helicobacter pylori. EnHelicobacter pylori: retos para el siglo XXI. Microbiología,clínica y tratamiento. Manuel López-Brea (editor). ProusScience, Barcelona 1999, pp. 281-305.

4. McNulty C and the PHLS Helicobacter Working Group.Helicobacter pylori susceptibility testing by disc diffusion. JAntimicrob Chemother 2002; 49:601-609.

5. NCCLS. 2004. Performance standards for antimicrobialsusceptibility testing. 14th informational supplement.NCCLS document M100-S14 (M7). NCCLS, Wayne, Pa.

6. Versalovic J, Osato MS, Spakovsky K, Dore MP, Reddy R,Stone GG, Shortridge D, Flamm RK, Tanaka SK, GrahamDY. Point mutations in the 23S rRNA gene of Helicobacterpylori associated with different levels of clarithromycinresistance. J. Antimicrob. Chemother 1997; 40:283-286.

DOCUMENTO TECNICO

PNT-HP-01CULTIVO E IDENTIFICACIÓN DE Helicobacter pylori

ELABORADO REVISADO Y APROBADOJefe de Servicio

Nombre/Firma Fecha Nombre/Firma Fecha

EDICIÓN FECHA ALCANCE MODIFICACIONES

01 Edición inicial

COPIA REGISTRADA Nº. ...........ASIGNADA A.................................................

Este documento es propiedad del Servicio de Microbiología del Hospital .......................... La información en élcontenida no podrá reproducirse total ni parcialmente sin autorización escrita del Responsable. Las copias noregistradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios.

DOCUMENTO TÉCNICO

Fecha:PNT-HP-01

Servicio de Microbiología

Hospital...........................

Cultivo e identificación deHelicobacter pylori Edición Nº 01 Página 2 de 4

1. PROPÓSITO Y ALCANCEEl objetivo de este documento es normalizar elprocesamiento de muestras para el diagnósticomicrobiológico de la infección por Helicobacter pylorimediante cultivo, técnica de ureasa rápida y técnicasde visión microscópica. Se describe el tipo demuestra, su procesamiento en el laboratorio, lascondiciones de cultivo y los métodos deidentificación.

2. FUNDAMENTOH. pylori es una bacteria gramnegativamicroaerofílica que coloniza el estómago del 50% dela población mundial y está relacionada con laproducción de gastritis, úlcera péptica, linfoma MALTy cáncer gástrico. El cultivo del microorganismo apartir de biopsias gástricas permite además derealizar el diagnóstico microbiológico de la infección,el conocimiento de los determinantes de virulencia,sensibilidad a antimicrobianos y la posibilidad detipado de cepas con fines epidemiológicos.

3. DOCUMENTOS DE CONSULTA- Normas de bioseguridad: La actuación del

personal y las medidas a tomar frente a losriesgos relacionados con la exposición a agentesbiológicos está regulada por el Real Decreto (RD)664/97 y la adaptación contenida en la Orden de25 de marzo de 1998.

- Recogida, transporte y procesamiento general demuestras en el laboratorio de Microbiología (PNT-RTP-01) SEIMC 2003.

4. MUESTRAS4.1. VOLANTE DE PETICIÓNEl volante de petición que acompaña a cada muestradebe ser estrictamente cumplimentado y en eldeberá constar la filiación, edad, número de historia,servicio de procedencia, tipo de muestra (de formamuy específica), tratamiento previo y diagnóstico delpaciente, así como el código del clínico que realiza lapetición.

4.2. RECOGIDA DE LA MUESTRALa muestra para el cultivo de H. pylori debe serbiopsia gástrica. Se deben cultivar al menos unabiopsia de antro y dos de cuerpo gástrico.

4.3. TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN DE LAMUESTRALos resultados del cultivo están en dependencia dela demora en el transporte y de las condiciones deconservación de la muestra.

- Procesamiento inmediato o menor a 6 horas:introducir la muestra en un tubo de plástico quecontenga 0,5 ml de suero salino al 0,8%. Labiopsia puede quedar sumergida en el suero o

quedar adherida en la superficie del tubo.Mantener el tubo en nevera a 40C.

- Procesamiento posterior a 6 horas tras laobtención de la muestra: introducir la muestra enmedio de transporte semisólido de Stuart yconservar en nevera hasta el cultivo.

4.4. CRITERIOS DE ACEPTACIÓN Y RECHAZODeben ser cuidadosamente observadas lassiguientes incidencias relacionadas con la muestra:1ª Defectos encontrados en la identificación de lamisma: etiquetado erróneo e inadecuada oincompleta cumplimentación de la hoja de petición.2ª Mala conservación (temperatura inapropiada,muestras en medio no apropiado).3ª Muestras con aspecto de mala conservación(biopsias secas).Todas estas incidencias deben ser comunicadas alclínico correspondiente, indicando el procesamientoo no de la muestra e incidiendo en la interpretaciónde los resultados si se llevara a cabo el mismo.

5. MEDIOS DE CULTIVO, REACTIVOS YPRODUCTOS5.1. MEDIOS DE CULTIVO NO SELECTIVOSAgar Columbia con 10% de sangre caballo o corderoAgar chocolate con 1% de IsovitalexColumbia agar con 10% de yema de huevo, 1%Isovitalex y 0,04% de cloruro de trifenil tetrazoliumAgar de cerebro y corazón con 10% de suero bovinofetal, 1% de extracto de levadura y 0,04% de clorurode trifenil tetrazolio

5.2. MEDIOS DE CULTIVO SELECTIVOSAgar de Wilkins-Chalgren con 10% de sangre(caballo o cordero) y suplemento antibiótico.Agar Columbia con 10% de sangre (caballo ocordero) y suplemento antibiótico.Agar Pylori (BioMerieux). Medio comercial quecontiene suero de caballo, extracto de levadura ysuplemento antibiótico, diseñado para aislamientoprimario de H. pylori.

5.3. REACTIVOS Y PRODUCTOSSistemas comerciales generadores de atmósferamicroaerofílicaColorantes para tincionesReactivos para realización de las pruebas deoxidasa, catalasa y ureasa

6. APARATOS Y MATERIALNeverasCabina de microaerofilia o jarras de anaerobiosisCabina de seguridad biológicaMicroscopio ópticoCongeladores de –80ºCSistema de nitrógeno líquidoHomogeneizador eléctrico, de teflón o de vidrioOtro materialAsas desechablesTorundas de algodónPortaobjetos, cubreobjetos

Fecha:PNT-HP-01


Hospital...........................


GuantesTubos estériles de polipropileno de 10 mlMechero incinerador

7. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA7.1 PREPARACIÓN E INOCULACIÓN DE LAMUESTRAHomogeneizar la muestra en un volumen de 0,5 mlde suero salino mediante un homogeneizadoreléctrico a 10.000 r.p.m. durante 10-20 segundos obien mecánicamente con un homogenizador deteflón durante 1 minuto.Inocular 2-4 gotas del homogeneizado en 2 placascon medio selectivo y 2 placas con medio noselectivo. Esparcir el inóculo por toda la superficie dela placa.

7.2. CONDICIONES DE INCUBACIÓNIncubar una placa inoculada en medio selectivo yotra en no selectivo en jarras de microaerofiliautilizando generadores comerciales. Las jarras seincubarán a 35-370C durante un periodo de 10-14días.Incubar una placa inoculada en medio selectivo yotra en medio no selectivo en un incubador de CO2 al10% y 95% de humedad, a 370C durante un periodode 10-14 días.

7.3. OBSERVACIÓN DE LOS CULTIVOS EIDENTIFICACIÓN DEL MICROORGANISMOExaminar los cultivos cada 24 horas tras el tercer díade incubación.Las colonias sospechosas (gris claro, pequeñas ybrillantes) deben identificarse de la siguiente manera:

1. Visión en fresco2. Tinción de Gram3. Prueba de la ureasa. Inocular varias colonias

del microorganismo en 0,25 ml de caldo deurea e incubar a 370C. A los pocos minutos sepodrá observar un color rojo.

4. Prueba de la oxidasa. Transferir variascolonias a una tira de oxidasa o a un papel defiltro impregnado en dihidro-cloruro deN,N,N´,N´ tetrametil-p-fenilendiamina al 1%.Una reacción azul oscura indica la presenciade la enzima oxidasa.

5. Prueba de la catalasa. Inocular un asa concolonias en una gota de H2O2 al 3%depositada en un portaobjetos. La formaciónde burbujas indica una prueba de catalasapositiva.

7.4. SUBCULTIVO DEL MICROORGANISMOPuede llevarse a cabo de dos maneras:

1) Preparar una suspensión densa delmicroorganismo, obtenido a partir de cultivopuro, en caldo BHI o solución salina e inoculardos gotas de la misma en placas no selectivasy esparcirlas siguiendo la metodología delapartado PROCESAMIENTO DE LAMUESTRA. Incubar en ambientemicroaerofílico. Tiene como inconveniente la

contaminación por cualquier microorganismoexistente en el cultivo inicial, pero se obtieneun subcultivo con una gran cantidad demicroorganismo.

2) Realizar un subcultivo directamente con el asao con un hisopo de algodón estéril recogiendotoda la biomasa de un aislamiento de H. pylorien cultivo puro e inocularlo en un medio noselectivo. Incubar en ambiente microaerofílico.De esta forma la densidad de microorganismoen el subcultivo es menor pero se evitancontaminaciones.

Tras 48-72 horas de incubación puede hacerse usode los mismos para diferentes requerimientos(conocimiento de la sensibilidad a antimicrobianos,caracterización de factores de virulencia, etc.)

7.5. ALMACENAMIENTO DE LAS MUESTRAS Y DELAS CEPAS AISLADASCon el objeto de futuros estudios tanto las muestras(biopsias) como los aislamientos de H. pyloriobtenidos, pueden almacenarse durante largosperiodos de tiempo.

- Conservación de la muestra: introducir la biopsiaen un criotubo que contenga 0,5 ml de BHI con20% de glicerol e incubar bien a –800C , bien ennitrógeno líquido a –1960C.- Conservación de los aislamientos de H. pylori:

a) Subcultivar la cepa en dos placas de agarno selectivo

b) Recoger tras 48 horas de incubación todoel crecimiento observado e inocularlo en 2-3 ml de BHI con 20% de glicerol.

c) Distribuir en criotubos (alícuotas de 0,5 ml)y congelar a –80ºC o nitrógeno líquido a

–196ºC.

7.6. PROCESAMIENTO DE MUESTRAS PARA LAPRUEBA DE LA UREASA RÁPIDA7.6.1. Objetivo y fundamento de la prueba de laureasaDetección de la ureasa del microorganismo a partirde muestra de biopsia gástrica. La enzima produceCO2 y NH4 a partir de urea, lo cual se traduce en uncambio de color debido a la presencia de unindicador de pH.7.6.2. Realización de la pruebaInocular la muestra de biopsia gástrica en el reactivopara la detección rápida de ureasa. Los reactivosutilizados pueden ser comerciales o preparados en ellaboratorio y están reflejados en el documentocientífico.La inoculación se puede realizar tanto en la sala deendoscopias como en el laboratorio de microbiología,lo más rápidamente posible.7.6.3. Lectura e interpretación de los resultadosUn cambio en el color del medio de amarillo-naranjaa rosa-fucsia se considera una reacción positiva. Lalectura se debe realizar en un intervalo de tiempoque oscila entre 5 minutos y una hora.No obstante cada fabricante debe especificarclaramente las escalas de colores para la

Fecha:PNT-HP-01


Hospital...........................


interpretación de cada prueba y los tiempos delectura, con el objeto de obtener los mejoresresultados de sensibilidad y especificidad.

7.7. PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRA PARAVISUALIZACIÓN MICROSCÓPICA7.7.1. Objetivo de la visualización de H. pylori enmucosa gástricaDiagnosticar de una forma sencilla y rápida lainfección por el microorganismo mediante la visiónmicroscópica de la morfología helicoidal en muestrasde biopsia gástrica.7.7.2. Tipo de muestra, transporte y almacenamientode la mismaLa muestra utilizada es biopsia gástrica. Si esposible, deben procesarse dos muestras (una deantro y otra de cuerpo gástrico) exclusivamente parala técnica de tinción. Si esto no es posible, lasmuestras procesadas para cultivo deben utilizarsepara las técnicas de tinción.El transporte y almacenamiento de las biopsias sedeben realizar de la misma forma que se especificaen el apartado de CULTIVO.7.7.3. Visualización de H. pylori a partir de biopsia1º Sobre un porta limpio previamente desengrasadose debe proceder eligiendo una de estas dostécnicas:

a) Colocar 2-3 gotas del homogeneizado de labiopsia descrito en el sub-apartado dePROCESAMIENTO DE LA MUESTRA delapartado de CULTIVO en el portaobjetos.Dejar secar.

b) Realizar una impronta arrastrando la biopsiamediante una torunda por toda la superficiedel portaobjetos.

Es preferible la opción a).2º Fijar con calor con mechero tipo Bunsen.3º Realizar la tinciónPueden utilizarse las técnicas de tinción referidas enel apartado DIAGNÓSTICO DE LA INFECCIÓN PORH. PYLORI MEDIANTE TÉCNICAS DE TINCIÓN DEBIOPSIA GÁSTRICA del Documento Científico, sibien recomendamos la técnica de tinción de Grammodificada que se indica a continuación:

- Añadir cristal violeta durante 1 minuto- Lavar con agua del grifo- Fijar con lugol durante 1 minuto- Lavar con agua del grifo- Decolorar con alcohol-acetona durante 5-10

segundos- Lavar con agua del grifo- Añadir carbol fuchina durante 5 minutos- Lavar con agua del grifo

Visualizar con el microscopio de 100 aumentosutilizando aceite de inmersión.7.7.4. Visualización en microscopio de contraste defases1º Añadir 1-2 gotas de homogeneizado de la biopsiay 1 gota de suero salino en un portaobjetos.2º Cubrir la preparación con un cubreobjetos.3º Examinar con el objetivo de 40 aumentos delmicroscopio de contraste de fases.

8. OBTENCIÓN Y EXPRESIÓN DE RESULTADOSSi se obtiene el cultivo de H. pylori y se logra laidentificación definitiva se debe informar junto con lasensibilidad a antimicrobianos habituales (PNT-HP-04). Si se observan los microorganismosgramnegativos curvados en la tinción realizada apartir de muestras de biopsia gástrica pero no serecupera en cultivo se debe informar de la siguienteforma: Presencia de bacilos gramnegativos curvadoscompatibles con Helicobacter pylori. Un resultado dela prueba de ureasa rápida positivo sin ninguna otraprueba positiva se debe valorar con precaución.

9. RESPONSABILIDADESLos técnicos de laboratorio serán los responsablesde la realización de las técnicas. El facultativo tendrála responsabilidad de la interpretación de losresultados y la validación de los informes emitidos.

10. ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTONo existe un procedimiento internacionalmenteaceptado para el procesamiento de las muestras parael cultivo de Helicobacter pylori. El procedimientodescrito se basa en la experiencia de losinvestigadores que han trabajado en este tema y en labibliografía recomendada.

11. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTOLa contaminación excesiva de la muestra con floraorofarÍngea puede impedir el crecimiento de H. pyloriincluso en los medios selectivos. La incubaciónprolongada de las placas en medios microaerofílicoscon alta tasa de humedad puede favorecer elcrecimiento de hongos contaminantes que dificultano imposibilitan el cultivo del microorganismo.El tratamiento antimicrobiano previo a la obtenciónde la muestra puede alterar los resultados de loscultivos.Otras bacterias que produzcan ureasa puedenpositivizar falsamente la prueba de la ureasa. Deigual forma esto puede ocurrir en pacientes conúlcera sangrante.

12. BIBLIOGRAFÍA1. Fresnadillo MartÍnez MJ, RodrÍguez RincÓn M,

BlÁzquez de Castro AM, GarcÍa Sánchez E, GarcíaSánchez JE, Trujillano Martín I, Cordero Sánchez M,Alvarez Alvarez P, Paz Bouza J, García-Rodríguez JA.Comparative evaluation of selective and nonselectivemedia for primary isolation of Helicobacter pylori fromgastric biopsies. Helicobacter. 1997; 2: 36-39.

2. Hua J, Yeoh KG, Ng HC, Zheng PY, Lim SG, Ho B.Improving the success of culturing Helicobacter pylorifrom gastric biopsies. Microbios 1998; 96: 95-101.

3. Laine L, Lewin D, Naritoku W, Estrada R, Cohen H.Prospective comparison of commercially available rapidrease tests for the diagnosis of Helicobacter pylori.Gastrointest Endosc 1996; 44: 523-526.

4. Piccolomini R, Di Bonaventura G, Festi D, Catamo G,Laterza F, Neri M. Optimal combination of media forprimary isolation of Helicobacter pylori from gastricbiopsy specimens. J Clin Microbiol. 1997; 35: 1541-1544.

PNT-HP-02DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE LA INFECCIÓN POR Helicobacter pylori




01 Edición inicial



DOCUMENTO TÉCNICO

Fecha:PNT-HP-02


Hospital...........................Serología Helicobacter pylori

Edición Nº 01 Página 2 de 2

1. PROPÓSITO Y ALCANCEEste documento pretende ser una guía de losmétodos serológicos para el estudio de anticuerposfrente a Helicobacter pylori, siguiendo lasrecomendaciones del documento científico. Puestoque es imposible describir detalladamente todos losmétodos serológicos disponibles actualmente,expondremos un procedimiento genérico, que puedaservir de guía para que cada laboratorio confeccionesu PNT teniendo en cuenta su práctica habitual.

2. FUNDAMENTOLos métodos serológicos se basan en la detecciónde anticuerpos específicos frente a H. pylori,generalmente de tipo IgG. Estos métodos puedenutilizarse para el diagnóstico de la infección, elposible seguimiento serológico de la respuesta altratamiento así como para conocer la prevalencia deanticuerpos frente a este microorganismo.

3. DOCUMENTOS DE CONSULTA- Normas de bioseguridad: la actuación del


- Manuales de instrucciones de los distintosequipos comerciales utilizados en cadalaboratorio.

4. MUESTRASEstas determinaciones deben realizarse en suero oen plasma.Cada laboratorio debe protocolizar la forma deidentificación, transporte al laboratorio yconservación de las muestras hasta realizar ladetección de anticuerpos y debe rechazarse lasmuestras que no cumplan estos protocolos.No se aceptará suero hemolítico ni hiperlipémico.Como para el control del tratamiento es importanterealizar estudios cuantitativos de sueros del mismopaciente a lo largo del tiempo, es importanteconservar una alícuota congelada de cada muestra.

5. REACTIVOS Y PRODUCTOSTodos los ensayos son de origen comercial, por loque el manejo y la conservación de los reactivos seajustarán a las instrucciones del fabricante.

6. APARATOS Y MATERIALEn función de las características del sistemaempleado y de las condiciones de cada laboratorio,estas determinaciones se realizarán en sistemasautomatizados o de forma manual.

7. PROCESAMIENTOCada laboratorio debe describir detalladamente lospasos a seguir para realizar el ensayo, desde ladescongelación de los sueros y el atemperamientode los reactivos hasta las diluciones a realizar, loscontroles, etc. Deben respetarse las instrucciones delfabricante.

8. OBTENCIÓN Y EXPRESIÓN DE RESULTADOSPara la aceptación de los resultados, esimprescindible la validación del ensayo en funcióndel resultado de los controles y los criteriosestablecidos por el fabricante.Para minimizar la variabilidad interensayo, a la horade estudiar la variación en el título de anticuerpos enun paciente a lo largo del tiempo, deben analizarsesimultáneamente todos los sueros del paciente (pre ypostratamiento).Una vez validado un ensayo, se genera un resultadoque se ha de informar de un modo interpretado.


10. ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTODebido a que la prevalencia de anticuerpos frente aH. pylori en población sana de cada zona influye enel valor predictivo de estos sistemas, es necesariovalidar cada equipo comercial a nivel local.

11. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTOSe debe establecer el rango de linealidad de lastécnicas cuantitativas.

12. BIBLIOGRAFÍA1. Herbrink P, van Dorn LJ. Serological methods for

diagnsis of Helicobacter pylori infection andmonitoring of eradication therapy. Eur J. ClinMicrobiol Infect Dis 2000; 19: 164-173.

2. Loza E, Alomar P, Bernal A, Harto A, Pérez JL,Picazo JJ, et al. Procedimientos en MicrobiologíaClínica, Seguridad en el Laboratorio de MicrobiologíaClínica, 2000. Coordinadora: Elena Loza, Ed. JJPicazo. Sociedad Española de EnfermedadesInfecciosas y Microbiología Clínica, Madrid.

PNT-HP-03DETECCIÓN DE ANTIGENO EN HECES DE Helicobacter pylori




01 Edición inicial



DOCUMENTO TÉCNICO

Fecha:PNT-HP-03


Hospital...........................

Detección de antígeno enheces


1. PROPÓSITO Y ALCANCEEste documento pretende describir el procesamiento,lectura e interpretación de la técnica de detección deantígeno de H. pylori en heces. Existen variossistemas comerciales que permiten detectar lapresencia de antígeno en heces con anticuerpospoliclonales y con anticuerpos monoclonales ypueden existir pequeñas diferencias entre ellos, eneste protocolo se describen las características deuno de ellos y será necesario la adaptación delprotocolo a cada laboratorio si es necesario.

2. FUNDAMENTOSe trata de una técnica de enzimoinmunoensayo enformato de placas de microtitulación basada enanticuerpos monoclonales. Permite establecer eldiagnóstico inicial, verificar la eficacia del tratamientoen las cuatro o seis semanas posteriores a surealización y comprobar la reaparición de unainfección. Es un ensayo cualitativo, no cuantitativo.Actualmente el diagnóstico y el seguimiento de lainfección por H. pylori se realiza por métodosinvasores como la endoscopia y por métodos noinvasores como la serología (detección deanticuerpos) y la prueba aliento (UBT), pero enalgunos casos puede estar recomendada unatécnica que utilice una muestra fácil de obtener yconservar, que se pueda realizar en cualquierlaboratorio de microbiología y que no necesite lacolaboración del paciente (como en la prueba delaliento).



- Manual de instrucciones del equipo comercialutilizado en cada laboratorio.

4. MUESTRASSe realiza con muestras de heces que pueden serfrescas o congeladas a –20ºC.

5. REACTIVOS Y PRODUCTOSLos ensayos son de origen comercial, por lo que elmanejo y la conservación de los reactivos seajustarán a las instrucciones del fabricante.

6. APARATOS Y MATERIALEn función de las características del sistemaempleado y de las condiciones de cada laboratorio,estas determinaciones se realizarán en sistemasautomatizados o de forma manual.

7. PROCESAMIENTO

Los pocillos de la placa de microtitulación estánrecubiertos de anticuerpos monoclonales contraantígenos de H. pylori. Se elabora una suspensiónde material fecal y anticuerpos monoclonalesmarcados con peroxidasa (conjugado enzimático). Elmaterial sobrenadante se coloca en los pocillos. Trasun tiempo de incubación de 60 minutos, si existenantígenos de H. pylori se unen tanto a losanticuerpos de la placa de ensayo como a losmarcados con peroxidasa, formando un complejotipo “sandwich”.Después de eliminar el conjugado no adheridolavando la placa, se coloca en los pocillos unsustrato incoloro (tetrametilbencidina) que esoxidado por la peroxidasa formando un producto decolor azul que virará a amarillo después de añadiruna solución de parada de la reacción.Interpretación: la intensidad de color se determinapor espectrofotometría en los 15 minutos siguientesa la interrupción de la reacción, en un lector deplacas de microtitulación, con una longitud de ondade 450 nm y de referencia a 620 nm.

8. OBTENCIÓN Y EXPRESIÓN DE RESULTADOSLos resultados se interpretan en función de unumbral ya establecido.


10. ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTOSiendo la endoscopia el método de elección para elcultivo y para la determinación de la sensibilidad alos antibióticos de H. pylori así como para loshallazgos anatomopatológicos hay circunstancias enlas que su realización puede presentar algunasdificultades como la inaccesibilidad de la técnica o elcoste económico.Es en estos casos cuando esta técnica aporta unainformación muy valiosa por la facilidad de suobtención y conservación de las muestras:- Se puede realizar en cualquier laboratorio demicrobiología.- No necesita la colaboración del paciente como enel caso de la detección de ureasa por la prueba delaliento por lo que es muy útil en niños pequeños.- Es útil tanto para el diagnóstico de colonización porH. pylori como para el seguimiento después deltratamiento erradicador.

11. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTOSe ha descrito menor sensibilidad y especificidad dela técnica en pacientes con cirrosis.

12.BIBLIOGRAFÍA

Fecha:PNT-HP-03


Hospital...........................

Detección de antígeno enheces


1. Cullen KP, Broderick BM, Javaram J, Flynn B,O”Connor HJ. Evaluation of the Helicobacter pyloristool antigen tests in routine clinical practice. Ir Med J2002; 95:305-306.

2. Kato S, Ozawa K, Okuda M, Fujisawa T, Kagimoto S,Konno M, Maisawa S, Iinuma K. Acuracy of stoolantigen test for diagnosis of childhood Helicobacterpylori infection, a multicenter Japanese study. Am JGastroenterol 2003; 98: 296-300.

3. Perri F, Manes G, Neri M, Vaira D, Nardone G.Helicobacter pylori antigen tests and 13-C urea breathtest in patients after erradication treatments. Am JGastroenterol 2002; 97: 2756-2762.

PNT-HP-04DETECCIÓN DE RESISTENCIA A ANTIMICROBIANOS EN Helicobacter pylori




01 Edición inicial



DOCUMENTO TÉCNICO

Fecha:PNT-HP-04


Hospital...........................

Detección de resistencia aantimicrobianos en H. pylori


1. PROPÓSITO Y ALCANCEEste documento pretende ser una guía de losprincipales métodos utilizados para detectar laresistencia a antimicrobianos en Helicobacter pylori:métodos fenotípicos (E-test y difusión con disco).

2. FUNDAMENTOLa resistencia a determinados antimicrobianos(metronidazol, claritromicina) es un factor de riesgo defallo de tratamiento por lo que está recomendadodeterminar la sensibilidad in vitro para elegir el régimenantimicrobiano mas apropiado.Se recomienda determinar la actividad in vitro deamoxicilina y tetraciclina por motivosepidemiológicos. También se puede determinar laactividad de otros antimicrobianos que pueden tenerutilidad clínica en éste microorganismo(fluoroquinolonas, rifabutina, nitrofurantoina).Si no se dispone de la sensibilidad in vitro antes deiniciar la primera pauta de tratamiento, sí esimprescindible realizarlo cuando ha habido uno o dosfallos. Los métodos fenotípicos tienen la ventaja deque están más estandarizados y sirven para probarcualquier antimicrobiano aunque tienen comodesventaja que requiere varios días para la obtenciónde resultados.



- NCCLS. 2004. Performance standards forantimicrobial susceptibility testing. 14th

informational supplement (aerobic dilution).NCCLS document M100-S14. NCCLS, Wayne,Pa.

4. MUESTRASLa mayoría de las técnicas de detección deresistencia se realiza sobre el microorganismocultivado en medios artificiales.

5. MEDIOS DE CULTIVO, REACTIVOS YPRODUCTOSMedios de cultivo: Mueller Hinton agar suplementadocon 7% sangre de caballo o carnero.

Discos de antibióticos: claritromicina 15 µg,metronidazol 5 µg, amoxicilina 10 µg, tetraciclina 30µg.E-test: claritromicina, metronidazol, amoxicilina,tetraciclina.

6. APARATOS Y MATERIALNeverasCabina de microaerofilia, jarras de anaerobiosis oestufa de CO2

Cabina de seguridad biológicaCongeladores de –80ºCAsas desechablesTorundas de algodón

7. PROCESAMIENTOUtilizar un cultivo reciente de H. pylori, de no más de 4días, para preparar el inóculo. Resuspender coloniasde un cultivo de 2 a 3 días de incubación en soluciónsalina estéril y ajustar a un 3 de la escala deMcFarland, e inocular la superficie de una placa conuna torunda empapada en esta suspensión. De formaalternativa se puede utilizar una torunda para recogerel cultivo de media placa de agar del microorganismobien crecido y extenderlo directamente sobre lasuperficie del medio de cultivo. Se recomiendaMueller-Hinton o Wilkins-Chalgren suplementado con5-10% de sangre de carnero o caballo.Después de dejar que se seque el inoculo aplicado sepueden aplicar las tiras de E-test (una por placa de 10cm) o los discos (no mas de 3 discos por placa lo masalejado posible uno de otro).Las placas se incubarán a 35ºC en condiciones demicroaerofilia durante 3 a 5 días. Se realizará lalectura a los 3 días de incubación y si no es posibleleer con claridad las zonas de inhibición se re-incubará durante 2 días más. Se leerá la CMI por elmétodo de E-test como el punto en el que la zonadonde existe inhibición completa del microorganismocruza con la tira, y en el caso de la técnica de difusióncon discos, los halos de inhibición de los discos conlos antimicrobianos.

8. OBTENCIÓN Y EXPRESIÓN DE RESULTADOSEn el caso de los métodos fenotípicos obtendremosun valor de CMI o unos milímetros del halo deinhibición que permitirá clasificar al microorganismocomo sensible, resistente o intermedio de acuerdocon la siguiente tabla:

TABLA

Método E-test Difusión discoPunto corte (mg/L) Punto corte (mm)S I R S I R

Amoxicilina <1 >2Claritromicina <0,25 0,5 >1 >19 mm <18 mmTetraciclina <2 >4Metronidazol <4 >8 >21 mm 16-21 mm <16 mm

S: sensible; I: intermedio; R: resistente

Fecha:PNT-HP-04


Hospital...........................

Detección de resistencia aantimicrobianos en H. pylori



10. ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTOLa técnica de dilución en agar recomendada por laNCCLS no es aplicable de rutina por lo que se hadescrito el procedimiento de difusión con disco y delE-test basándose en la experiencia de losinvestigadores que han trabajado en este tema y enla bibliografía recomendada.

11. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTOEs necesario disponer del microorganismo cultivadoy con un inóculo abundante para realizar lasensibilidad a antimicrobianos. Se ha observado unabuena correlación clínica entre los resultadosobtenidos por las técnicas fenotípicas y la respuesta

a los tratamientos que incluyen claritromicina, sinembargo la correlación en el caso de metronidazoles menor.

12. BIBLIOGRAFÍA

1. King A. Recommendations for susceptibility tests onfastidious organisms and those requiring specialhandling. J Antimicrob Chemother 2001; 48 (supl1):77-80.

2. McNulty C and the PHLS Helicobacter WorkingGroup. Helicobacter pylori susceptibility testing bydisc diffusion. J Antimicrob Chemother 2002; 49:601-609.

3. NCCLS. 2004. Performance standards forantimicrobial susceptibility testing. 14th informationalsupplement (aerobic dilution). NCCLS documentM100-S14 (M7). NCCLS, Wayne, Pa.

17. Diagnóstico microbiológico de la infección por Helicobacter pylori

Documents

Transcript of 17. Diagnóstico microbiológico de la infección por Helicobacter pylori